CN112342201A

CN112342201A - 一种通过CRISPR/Cas9制备的猪伪狂犬病弱毒株及其应用

Info

Publication number: CN112342201A
Application number: CN202011219180.4A
Authority: CN
Inventors: 徐高原; 张华伟; 侯真真; 周明光; 郝根喜; 陈波; 金建云; 陈章表; 方玉林
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-11-04
Also published as: CN112342201B

Abstract

本发明涉及一种通过CRISPR/Cas9制备的猪伪狂犬病弱毒株及其应用。本发明通过CRISPR/Cas9系统敲除猪伪狂犬病毒株的US7、US8、US9和US2的基因片段得到一种猪伪狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB‑1，经实验验证，猪伪狂犬病弱毒株HB‑1在保留了免疫原性的同时，毒性大幅度降低，在制备成疫苗后安全性好，不会引起仔猪发病，同时经过免疫接种后，对仔猪的保护率达到100％。本发明提供的猪伪狂犬病弱毒株HB‑1为临床上针对猪伪狂犬病的防控以及猪伪狂犬病病毒在猪群中的清除提供物质基础和技术支撑，具有广阔的应用前景。

Description

一种通过CRISPR/Cas9制备的猪伪狂犬病弱毒株及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种通过CRISPR/Cas9制备的猪伪狂犬病弱毒株及其应用。

背景技术

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种高度接触性传染病。该病多发生于寒冷、气温多变的春、冬季，有一定的季节性。猪伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属，基因组为线性双链DNA，可编码70～100种蛋白质。US7与US8基因形成复合体US7/US8，与病毒在神经系统中的侵袭和扩散密切相关，是影响PRV生长的功能成分。US9是一个C-末端锚定的II型膜蛋白，是PRV顺行传导的基因。US2是病毒复制的非必需基因，对PRV噬斑形成至关重要。

目前，对猪伪狂犬病的防控，主要是通过疫苗接种预防。现有技术已研制出猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗、灭活疫苗、基因缺失弱毒疫苗和基因缺失灭活疫苗，而病毒载体重组疫苗和基因疫苗尚处于实验室研究阶段。基因缺失疫苗已经在生产中发挥着重要的作用，尤其在美国和欧洲一些发达国家的PRV根除计划中功不可没。猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗的优势主要表现在毒力基因缺失，安全性高，不易发生毒力返强，能诱导体液免疫和细胞免疫，免疫原性强，保护时间长；可用于疫苗免疫动物与自然感染动物的鉴别诊断。

猪伪狂犬病病毒是引起猪伪狂犬病的病原，能感染不同年龄段猪只，导致流产、死胎、种猪不育、断奶仔猪和育肥仔猪呼吸症状，对生猪养殖业造成巨大的危害。由于猪伪狂犬病病毒的变异，猪伪狂犬病难以得到有效控制，带来巨大的经济损失。传统经典弱毒活疫苗PRV Bartha K61不能针对当前流行性PRV变异毒株提供完全免疫保护。为了防控当前流行的伪狂犬病，快速研制针对当前流行的PRV变异毒株的疫苗成为疫苗研发工作的当务之急。

发明内容

为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种通过CRISPR/Cas9制备的猪伪狂犬病弱毒株及其应用，该基因缺失弱毒株在保留猪伪狂犬病毒株免疫原性的同时较高程度上降低了其毒力，安全性高，对PRV变异株具有良好的免疫保护效果，可作为防治伪狂犬病疫苗候选株。

此外，本发明使用CRISPR/Cas9高效的基因编辑工具技术对当前流行的PRV变异毒株进行快速基因编辑，敲除了猪伪狂犬病病毒PRV HB株US7、US8、US9和US2四个基因，构建四基因缺失弱毒疫苗的候选株PRV HB-1株(△US7/US8/US9/US2)。该方法相较于传统的同源重组方法，大幅度提高了基因编辑效率，缩短疫苗研发周期，更好地预防当前流行毒株。现有技术目前常采用低温传代和药物筛选致弱快速制备猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株的方法，但是这些方法操作繁琐、研发周期长、重组效率相对较低；与本技术相比，工作量加倍，并且需对培养箱持续降温，以达到基因缺失的目的，与本方案使用sgRNA相比，敲除效率相对较低。

本发明猪伪狂犬基因缺失弱毒株HB-1接种伪狂犬阴性仔猪后，所有仔猪临床症状均表现正常，且产生较高的中和抗体水平，即该毒株作为疫苗接种仔猪能够产生有效保护，说明该猪伪狂犬基因缺失HB-1株能够作为防治伪狂犬病的疫苗候选株。

本发明对得到的猪伪狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB-1进行了生物保藏，其保藏信息如下：

保藏编号为：CCTCC NO:V202051；分类命名为：猪伪狂犬病病毒PRV HB-1株；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：中国武汉武汉大学；保藏日期为：2020年8月26日。

本发明进一步对猪伪狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB-1的生理特征进行鉴定，结果如下：

猪伪狂犬病病毒PRV HB-1株为猪伪狂犬病病毒HB株的毒力基因缺失株，是双链DNA病毒，遗传稳定。将PRV HB-1株在ST细胞上连续传代30个代次，应用PCR检测，缺失位置均保持稳定，未发生突变。

猪伪狂犬病病毒PRV HB-1株较猪伪狂犬病病毒HB株在细胞上的毒力大大降低，相同接种滴度下在传代细胞上猪伪狂犬病病毒PRV HB-1株使细胞破裂形成病变的时间比猪伪狂犬病病毒HB株晚4-6h，且形成的空斑平均面积小于亲本毒株，差异显著，但增殖曲线相似，最高病毒滴度差异不显著。与猪伪狂犬病病毒HB株相比，猪伪狂犬病病毒PRV HB-1株对靶动物致病力大大降低。作为病毒，其繁殖需要在易感细胞内进行。

本发明进一步提供用于鉴定所述猪伪狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB-1的引物对，其特征在于，包括如下核苷酸序列的引物：

18-US7/US2-F：5’-ACCACCGCCGCGCCGGGCGTCTCGCGCCAC-3’；

18-US7/US2-R：5’-GGCCAGCGAGCCGGGGGAGATCTCCGAGGA-3’。

本发明进一步提供所述猪伪狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB-1在对于猪伪狂犬病的免疫防护中的应用。

本发明进一步提供所述猪伪狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB-1在制备用于免疫猪伪狂犬病的药物中的应用，例如将猪伪狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB-1应用于疫苗制备，将猪伪狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB-1病毒液与冻干保护剂混合后进行冻干制备得到猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株弱毒疫苗。

本发明进一步提供CRISPR/Cas9系统中用于编辑猪伪狂犬病毒株的gRNA，所述gRNA的靶序列为所述猪伪狂犬病毒株的US7、US8、US9和US2的基因片段，例如所述gRNA包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明进一步提供包含所述gRNA的生物材料，以是表达盒、载体或转基因细胞。

本发明进一步提供一种猪伪狂犬病弱毒株的构建方法，包括：敲除猪伪狂犬病毒株的US7、US8、US9和US2的基因片段。

优选使用CRISPR/Cas9系统进行基因片段的敲除，优选使用pX335载体，优选针对猪伪狂犬病弱毒株HB进行基因片段的敲除

本发明还提供了一种快速区别野毒株与四基因缺失弱毒株HB-1感染的检测方法。通过检测动物体US8抗体水平，来快速区别出该动物体野毒株与猪伪狂犬基因缺失弱毒株HB-1的感染。

本发明通过敲除猪伪狂犬病毒株的US7、US8、US9和US2的基因片段制备得到一种猪伪狂犬病弱毒株HB-1，具备如下有益效果：

1、本发明制备得到的猪伪狂犬病弱毒株HB-1株在保留了其免疫原性的同时毒力较弱，通过人工接种感染靶动物发现，该毒株对靶动物的毒力降低，不致病，使用后仅短期排毒，无法形成潜伏感染和再激活，因此安全性高，为临床上针对猪伪狂犬病的防控以及猪伪狂犬病病毒在猪群中的清除提供物质基础和技术支撑，具有广阔的应用前景。

2、本发明所制备的基因缺失株稳定性好，细胞传代30代，未发生变异，PCR鉴定缺失基因US7、US8、US9和US2未发生回复突变，遗传特性十分稳定。

3、本方案所制备的基因缺失株为实验室通过基因工程技术敲除猪伪狂犬病野生病毒HB株的US7、US8、US9和US2而获得，在自然环境中并不存在，因此靶动物不可能自然感染该病毒，无潜在危险性。

4、本方案选用悬浮ST细胞制备制苗用病毒液，为高效率生产疫苗提供了保障。

5、本方案采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，提高了对PRV基因组的敲除效率。相较于传统的同源重组方法，提高了病毒多基因缺失疫苗构建效率，减少了重组病毒纯化的工作量并降低了时间成本。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的gRNA和Cas9蛋白重组质粒构建流程图；

图2为本发明实施例1提供的gRNA构建测序验证结果；图中，A为pX335-Cas9n-US7gRNA；B为pX335-Cas9n-US2gRNA；

图3为本发明实施例1提供的US7/US8/US9/US2基因缺失同源臂质粒构建流程图；

图4为本发明实施例1提供的pSK-US7/US2(L/R)酶切鉴定结果；图中，M为DNA分子质粒标准5K；1-5为上游同源臂片段酶切鉴定；6-10为下游同源臂片段酶切鉴定；

图5为本发明实施例2提供的猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株的细胞病变结果；图中，A为转染的细胞病变组；B为未转染的空白对照组；

图6为本发明实施例2提供的猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株的空斑纯化鉴定结果；图中，A为第一轮空斑纯化；B为第二轮空斑纯化；C为第三轮空斑纯化；M：DNA分子质量标准5K；+：阳性对照；—：阴性对照；1-10：待检样品；

图7为本发明实施例2提供的猪伪狂犬病病毒缺失HB-1株的一步生长曲线结果；

图8为本发明实施例2提供的猪伪狂犬病病毒株HB-1株的遗传稳定性鉴定结果；图中，M：DNA分子质量标准2K；+：阳性对照；—：阴性对照；1：F1；2：F5；3：F10；4：F15；5：F20；6：F25；7：F30；

图9为本发明实施例4提供的免疫组和对照组ELISA检测gB抗体水平结果；

图10本发明实施例4提供的免疫组和对照组中和抗体检测结果；

图11本发明实施例4提供的免疫组和对照组仔猪攻毒后体温变化结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 gRNA和Cas9蛋白表达重组质粒与US7/US8/US9/US2基因缺失同源臂质粒的构建

1.1 gRNA和Cas9蛋白表达重组质粒的构建

a)使用BbsⅠ酶切Cas9蛋白表达质粒pX335-cas9n，进行胶回收；b)根据缺失基因(US7、US8、US9和US2)序列，利用在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)，设计靶向缺失片段的single guideRNA(gRNA)序列；c)合成单链DNA引物，引物退火；d)连接，将退火引物通过连接、转化构建到线性化Cas9蛋白表达质粒pX335-Cas9n上，其中表1为用于扩增出gRNA的引物序列，图1为gRNA和Cas9蛋白重组质粒构建流程图，图2为gRNA构建测序验证结果。图中，A为pX335-Cas9n-US7gRNA；B为pX335-Cas9n-US2gRNA。

表1 gRNA引物序列

1.2 US7/US8/US9/US2基因缺失同源臂质粒构建

a)通过PCR、酶切、连接的方法，使用EcoRⅠ和XhoⅠ将长为1303bp的US7上游同源臂序列连入真核表达载体pBluescriptⅡSK(+)的多克隆位点上。得到中间重组质粒pBluescript II SK(+)-US7(L)，简称pSK-US7(L)；b)通过PCR、酶切、连接的方法，使用SpeⅠ和NotⅠ将长为665bp的US2下游同源臂序列连入中间重组质粒pSK-US7(L)，得到US7/US8/US9/US2基因缺失的同源臂重组质粒pSK-US7/US8/US9/US2(L/R)，简称pSK-US7/US2(L/R)，其中图3为同源臂重组质粒pSK-US7/US2(L/R)的构建流程图，图4为pSK-US7/US2(L/R)的酶切鉴定结果；其中，M为DNA分子质粒标准5K；1-5为上游同源臂片段酶切鉴定；6-10为下游同源臂片段酶切鉴定)。

实施例2猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株(△US7/US8/US9/US2)的获得

本实施例通过实施例1制备得到的重组质粒pX335-Cas9n-US7gRNA和pX335-Cas9n-US2gRNA来敲除猪伪狂犬病病毒变异毒株PRV HB株的US7、US8、US9和US2的基因片段，具体流程如下：

在分离得到猪伪狂犬病病毒变异毒株HB株后，将构建的pSK-Cas9n-US7gRNA、pSK-Cas9n-US2gRNA用脂质体转染的方法共转入ST细胞中，待出现细胞病变后(病变结果如图5所示)，收集细胞培养上清，将转染产物接ST细胞，收获产生病毒噬斑的细胞液，用低熔点琼脂糖进行空斑纯化，病变后随机挑取10个空斑，使用检测引物(如表2所示)对US7/US8/US9/US2进行PCR扩增，以鉴别重组毒株和野生毒株。如图6所示，毒株PRV HB株可以扩出US7/US8/US9/US2野生型序列3900bp，猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株(△US7/US8/US9/US2)扩增出US7/US8/US9/US2基因序列580bp。

表2检测引物序列

将最终三轮纯化得到的重组病毒株确定为猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株(△US7/US8/US9/US2)F0代(孔板纯化鉴定结果如图6所示)。

本实施例进一步将猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株和亲本毒株PRV HB株分别以0.01MOI接种于ST细胞，分别在接毒后0、12、24、36、48、60h取样测定各时间点的TCID₅₀。以上试验重复3次，并以接毒后的时间为横坐标以相对病毒滴度lg TCID ₅₀/ml为纵坐标绘制病毒的一步生长曲线(图7)，对猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株(△US7/US8/US9/US2)增殖情况进行分析。

将猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株(△US7/US8/US9/US2)在ST细胞上连续传代30个代次，每5代对US7/US8/US9/US2缺失序列进行检测，并进行TCID₅₀测定，对猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株(△US7/US8/US9/US2)的遗传稳定性进行分析，表3为不同代次HB-1株的TCID₅₀检测结果，图8为猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株的遗传稳定性鉴定结果，由表3和图8可知，本实施例所制备的猪伪狂犬病弱毒株稳定性好，细胞传代30代，未发生变异，PCR鉴定缺失基因US7、US8、US9和US2未发生回复突变，遗传特性十分稳定

表3不同代次HB-1株的TCID₅₀检测结果(TCID₅₀/ml)

本实施例进一步将猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株(也就是猪伪狂犬病弱毒株HB-1)进行生物保藏，保藏信息如下：

猪伪狂犬病病毒PRV HB-1株较猪伪狂犬病病毒HB株在细胞上的毒力大大降低，相同接种滴度下在传代细胞上伪狂犬病毒PRV HB-1株使细胞破裂形成病变的时间比猪伪狂犬病病毒HB株晚4-6h，且形成的空斑平均面积小于亲本毒株，差异显著，但增殖曲线相似，最高病毒滴度差异不显著。与猪伪狂犬病病毒HB株相比，猪伪狂犬病毒PRV HB-1株对靶动物致病力大大降低。作为病毒，其繁殖需要在易感细胞内进行。

实施例3猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株弱毒疫苗的制备方法

1.细胞制备

1.1细胞复苏与增殖：将悬浮型ST种子细胞从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴锅中迅速溶解，常温下1000r/min离心5min，弃上清。用ST细胞培养基重悬细胞，使细胞初始密度为0.5～0.7×10⁶个/ml。在37℃、120r/min含5％CO₂水平摇床中培养48h后，细胞密度达4.0～6.0×10⁶个/ml。

1.2一级反应器培养：当摇瓶中的细胞密度达4.0～5.0×10⁶个/ml时，转入一级生物反应器，补加ST细胞培养基使细胞初始密度为0.5～0.7×106个/ml。生物反应器培养参数：温度37℃、pH值7.0、转速50r/min、溶氧(DO)40％。

1.3二级生物反应器培养：待一级生物反应器中的细胞密度达到4.0～5.0×10⁶个/ml时，将细胞转入二级生物反应器，补加ST细胞培养基，使细胞初始密度为0.5～0.7×10⁶个/ml。生物反应器培养参数：温度37℃、pH值7.0、转速50r/min、溶氧(DO)40％。

1.4病毒接种：当二级生物反应器中细胞密度达到4.0～6.0×10⁶个/ml时，用ST细胞培养基稀释至细胞密度为2.0×10⁶个/ml，以0.3MOI的剂量将毒种接种于反应器中。生物反应器培养参数：温度37℃、pH值7.0、转速50r/min、溶氧(DO)40％。

1.5收获：接毒后24h，当细胞活率＜20％时收获病毒液，2～8℃离心取上清，即为猪伪狂犬病毒基因缺失HB-1株病毒液。取样进行病毒含量测定，病毒含量应≥10^8.5TCID₅₀/ml。

1.6纯化：将离心后的猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株病毒液，先经孔径0.65μm中空纤维澄清过滤，再用500KD中空纤维超滤浓缩10倍，然后取样进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，最后经凝胶层析纯化，纯化后取样进行病毒含量测定，病毒含量≥10^8.9TCID₅₀/mL。

2.疫苗的配制和冻干

制备的各项指标经检验合格的猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株病毒液与冻干保护剂(组成成分为明胶和蔗糖)以体积比7：1的比例混匀后，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株弱毒疫苗，于-20℃保存。

实施例4猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株弱毒疫苗的动物实验

1.仔猪的安全性试验

选取7日龄伪狂犬阴性仔猪(gB、gE抗体均为阴性)20头，随机分为A、B、C、D三组，每组5头，接种方式均为滴鼻接种。组A接种实施例3制得的猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株弱毒疫苗10^6.0TCID₅₀/头，组B接种猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株弱毒疫苗10^5.0TCID₅₀/头，组C接种接种PBS作为空白对照，组D猪伪狂犬病病毒变异毒株HB株10^5.0TCID₅₀/头，连续观察21天。结果显示，组A、B、C中所有仔猪临床症状均表现正常，无体温升高现象，且无死亡。组D试验仔猪4头出现发热症状，体温升至40.5℃及以上，且至少持续3日，2头死亡。说明该疫苗对仔猪安全性好(表4)。

表4猪伪狂犬病毒基因缺失HB-1株弱毒疫苗对仔猪的安全性试验结果

注：“-”表示无异常

2.免疫保护效力试验

选取10头PRV阴性的14日龄健康断奶仔猪，随机分为2组，每组5头，隔离饲养。组A每头颈部肌肉注射1ml猪伪狂犬病病毒基因缺失HB-1株弱毒疫苗(10^6.0TCID₅₀/头)为PRVHB-1株免疫组，组B注射PBS作为空白对照组。免疫保护力检测指标：

免疫后连续14d观察临床症状(精神、食欲)；

免疫后7d进行1次前腔静脉采血(至攻毒后14d)，用anti-gB ELISA(IDEXX)检测gB抗体水平；

免疫后第21d，进行前腔静脉采血，并使用本项目基因缺失毒株的亲本株PRV HB株在细胞上进行中和试验检测中和抗体水平；同时A、B组使用PRV HB株滴鼻攻毒，攻毒剂量为10^7.0TCID₅₀/头。

攻毒后观察21d，测量体温，记录症状，统计发病率和死亡率。

结果显示，免疫接种后试验猪精神食欲正常，免疫后第21d PRV HB-1株免疫组仔猪产生较高的gB抗体水平(图9)；免疫后第21d PRV HB-1株免疫组仔猪产生较高的中和抗体(图10)，在细胞水平上能有效中和PRV HB株病毒；攻毒后对照组出现体温升高、精神沉郁、食欲废绝、共济失调等典型的伪狂犬病发病症状，在7日内全部死亡(图11)；PRV HB-1株免疫组在攻毒后仅仅出现轻微发热，体温不超过41.0℃，仔猪第4天相继恢复体温和食欲，免疫组仔猪无死亡，获得100％保护，说明猪伪狂犬病毒基因缺失HB-1株(也就是猪伪狂犬病弱毒株HB-1)作为疫苗接种仔猪能够产生有效保护。

对比例1

本对比例采用和通过和实施例1和实施例2相同的方法通过CRISPR/Cas9系统敲除伪狂犬病病毒HB株的毒力基因US7、US8，使这两个毒力基因缺失表达，得到一种猪伪狂犬病弱毒HZ株。在将猪伪狂犬病弱毒HZ株制备成疫苗采用和实施例4相同的实验进行保护力和免疫原性验证时，发现该毒株虽具有较高的免疫原性，但在仔猪上进行的致病力检测结果显示，试验仔猪4/5出现发生典型猪伪狂犬的症状；体温升高，41℃持续3天以上；有呼吸症状；摇头晃脑的神经症状，说明猪伪狂犬弱毒HZ株未能对仔猪产生很好的保护性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种通过CRISPR/Cas9制备的猪伪狂犬病弱毒株及其应用

<130> KHP201114598.1

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgatgg tggcgcgcga cgtgacccgg ctccccgcgg ggctcctcct cgccgccctg 60

accctggccg ccctgacccc gcgcgtcggg ggcgtcctct tcaggggcgc cggcgtcagc 120

gtgcacgtcg ccggcagcgc cgtcctcgtg cccggcgacg cgcccaacct gacgatagac 180

gggacgctgc tgtttctgga ggggccctcg ccgagcaact acagcgggcg cgtggagctg 240

ctgcgcctcg accccaagcg cgcctgctac acgcgcgagt acgccgccga gtacgacctc 300

tgcccccgcg tgcaccacga agccttccgc ggctgcctgc gcaagcgcga gccgctcgcc 360

cggcgcgcgt ccgccgcggt ggaggcgcgc cggctgctgt tcgtctcgcg cccggcctcg 420

ggggacgcgg ggtcgtacgt gctgcgggtc cgcgtgaacg ggaccacgga cctctttgtg 480

ctgacggccc tggtgccgcc gagggggcgc cccgtcccca cgtcgccgcc cgcggacgag 540

tgccggcccg tcgtcggatc gtggcacgac agcctgcgcg tcgtggaccc cgccgaggac 600

gccgtgttca ccacccagcc cccgcccgag cccgagccgc cgacgacccc cgcgcccccc 660

cgggggaccg gcgccacccc cgagccccga tcggacgagg aggaggaggg tgacgcggag 720

acgacgacgc cgacgctgac cccggcgccc gggaccctgg acgcgaacgg cacgatggtg 780

ctgaacgcca gcgtcgtgtc gcgcgtcctg ctcgccgccg ccaacgccac ggcgggcgcc 840

cggagccccg ggaagatagc catggtgctg gggcccacga tcgtcgtcct cctgatcttc 900

ctgggcggga tcgcctgcgt ggcccggcgc tgcgcgcgga atcgcatcta ccggccgcga 960

cccgggcgcg gatcggcggt ccatgcggcg cccccgcggc gcccgccccc caaccccgtc 1020

gccggggcgc ccgtccccca gcccaagatg acgttggccg agctgcgcca gaagctcgcc 1080

accatcgcag aagaacaata a 1101

<210> 2

<211> 1493

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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accgaggccc cgagcctctc cgccgagacg accccgggcc ccgtcaccga ggtcccgagt 120

ccctcggccg aggtctggga cgacctctcc accgaggccg acgacgatga cctcaacggc 180

gacctcgacg gcgacgaccg ccgcgcgggc ttcggctcgg ccctcgcatc cctgagggag 240

gcgcccccgg cccatctggt gaacgtgtcc gagggcgcca acttcaccct cgacgcgcgc 300

ggcgacggcg ccgtgctggc cgggatctgg acgttcctgc ccgtccgcgg ctgcgacgcc 360

gtgtcggtga ccacggtgtg cttcgagacc gcgtgccacc cggacctggt gctgggccgc 420

gcctgcgtcc ccgaggcccc ggagatgggc atcggcgact acctgccgcc cgaggtgccg 480

cggctccggc gcgagccgcc catcgtcacc ccggagcggt ggtcgccgca cctgagcgtc 540

ctgcgggcca cgcccaacga cacgggcctc tacacgctgc acgacgcctc ggggccgcgg 600

gccgtgttct ttgtggcggt gggcgaccgg ccgcccgcgc cggcggaccc ggtgggcccc 660

gcgcgccacg agccccgctt ccacgcgctc ggcttccact cgcagctctt ctcgcccggg 720

gacacgttcg acctgatgcc gcgcgtggtc tcggacatgg gcgactcgcg cgagaacttt 780

accgccacgc tggactggta ctacgcgcgc gcgcccccgc ggtgcctgct gtactacgtg 840

tacgagccct gcatctacca cccgcgcgcg cccgagtgcc tgcgcccggt ggacccggcg 900

tgcagcttca cctcgccggc gcgcgcgcgg ctggtggcgc gccgcgcgta cgcctcgtgc 960

agcccgctgc tcggggaccg gtggctgacc gcctgcccct tcgacgcctt cggcgaggag 1020

gtgcacacga acgccaccgc ggacgagtcg gggctgtacg tgctcgtgat gacccacaac 1080

ggccacgtcg ccacctggga ctacacgctc gtcgccaccg cggccgagta cgtcacggtc 1140

atcaaggagc tgacggcccc ggcccgggcc ccgggcaccc cgtggggccc cggcggcggc 1200

gacgacgcga tctacgtgga cggcgtcacg acgccggcgc cgcccgcgcg cccgtggaac 1260

ccgtacggcc ggacgacgcc cgggcggctg tttgtgctgg cgctgggctc cttcgtgatg 1320

acgtgcgtcg tcgggggggc catctggctc tgcgtgctgt gctcccggcg ccgggcggcc 1380

tcgcggccgt tccgggtgcc gacgcgggcg cggacgcaca tgctctctcc ggtgtacacc 1440

agcctgccca cgcacgagga ctactacgac ggcgacgacg acgacgacga gga 1493

<210> 3

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggacacgt ttgaccccag cgcccccgtc ccgacgagcg tctcgaaccc ggccgccgac 60

gtcctgctgg cccccaaggg accccgctcc ccgctgcgcc cccaggacga ctcggactgc 120

tactacagcg agagcgacaa cgagacgccc agcgagttcc tgcgccgcgt gggacgccgg 180

caggcggcgc gtcggagacg ccgccgctgc ctgatgggcg tcgcgatcag cgccgccgcg 240

ctggtcatct gctcgctgtc cgcgctactc gggggcatcg tcgccaggca cgtgtag 297

<210> 4

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggggtga cggccatcac cgtggtcacg ctgatggacg gggccgggcg catccccgcc 60

ttcgtgggcg aggcgcaccc ggacctgtgg aaggtgctca ccgagtggtg ctacgcgtcg 120

atggtgcagc agcggcgcgc cgccgacgag aactcgccgc ggcagcacgt ggtgctgcgc 180

tcctcggaga tctcccccgg ctcgctggcc ctgctgccgc gcgccgtgcg ccccgtcgtg 240

cggacgcggt ccgaccccac ggcgccgttc tacatcacca ccgagacgca cgagctgacg 300

cggcgccccc cggcggacgg ctcgaagccc ggggagcccc tcaggatcag cccacccccg 360

cggctggaca cggagtggtc gtccgtcctg aacgggatcc agtacctgaa ctcgggggcc 420

cggggcacgg cccccgtcca cctgtggatc ctgggcgccg ccgacctctg cgaccaggtg 480

ctcctggccg cctcccgcag caccgccgcc ggagcctccc acgcccagac gggcgcgcgc 540

ctgacccggc gccggcccgg gctgacggac gccgacgccc tggacgtgat cgtcgccggg 600

atccaggcga cccgcgccat gttcgcgcgg gtccacaacc gctcctggcg ccacgccggc 660

gagtggacgg aggccctgca tgcccagatc gtgacccggg gcgacgtgcg ccggcgccga 720

ggcgggcgcg gcaacggacg cgagcgcgcc ccgcgatgta ccatctccta g 771

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accaccgccg cgccgggcgt ctcgcgccac 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggccagcgag ccgggggaga tctccgagga 30

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caccgtacga ccccgcgtcc cccg 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaaccggggg acgcggggtc gtac 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccgggggt gacggccatc accg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccggtga tggccgtcac cccc 24

Claims

1.一种通过CRISPR/Cas9制备的猪伪狂犬病弱毒株HB-1，其特征在于，所述猪伪狂犬病弱毒株HB-1的保藏编号为：CCTCC NO:V202051。

2.权利要求1所述猪伪狂犬病弱毒株HB-1在对于猪伪狂犬病的免疫防护中的应用。

3.权利要求1所述猪伪狂犬病弱毒株HB-1在制备用于免疫猪伪狂犬病的药物中的应用。

4.一种猪伪狂犬病疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述猪伪狂犬病弱毒株HB-1和佐剂。

5.根据权利要求4所述猪伪狂犬病疫苗，其特征在于，所述佐剂为冻干保护剂，所述冻干保护剂为明胶和蔗糖。

6.用于鉴定权利要求1所述猪伪狂犬病弱毒株(Pseudorabies virus)HB-1的引物对，其特征在于，包括如下核苷酸序列的引物：

18-US7/US2-F：5’-ACCACCGCCGCGCCGGGCGTCTCGCGCCAC-3’；

18-US7/US2-R：5’-GGCCAGCGAGCCGGGGGAGATCTCCGAGGA-3’。

7.一种用于编辑猪伪狂犬病毒株的gRNA，其特征在于，所述gRNA的靶序列为猪伪狂犬病毒株的US7、US8、US9和US2的基因片段；

所述猪伪狂犬病毒株优选为猪伪狂犬病毒株HB，和/或，所述gRNA的靶序列优选包括如SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列。

8.包含权利要求6所述引物对，和/或，权利要求7所述gRNA的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

9.一种猪伪狂犬病弱毒株的制备方法，其特征在于，包括：

敲除猪伪狂犬病毒株的US7、US8、US9和US2的基因片段。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，通过CRIS PR/Cas9系统敲除所述猪伪狂犬病毒株的US7、US8、US9和US2的基因片段；

所述CRISPR/Cas9系统优选使用pX335载体，和/或，所述猪伪狂犬病毒株优选为猪伪狂犬病毒株HB。