CN100436582C - 一种源于水稻的病原菌侵染和伤害诱导性基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了从水稻中克隆的一种蛋白酶抑制剂基因启动子片段，该启动子具有病原菌侵染和伤害，以及化学物质可诱导表达特点。本发明同时提供了含有该启动子驱动的可嵌合感兴趣基因的双元表达载体，及其在抗病抗虫危害中的应用。

Description

一种源于水稻的病原菌侵染和伤害诱导性基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的讲涉及一种源于水稻的稻瘟菌侵染可诱导性蛋白酶抑制剂基因5’端调控序列，更具体地说涉及稻瘟菌侵染和伤害诱导表达型的一种水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因启动子序列，该序列的核苷酸组成如SEQ ID NO：1所示，本发明还进一步涉及使用上述启动子或由该启动子衍生的一个、几个片段或其组合(衍生变体)，启动相关DNA序列表达所进行的抗病抗虫基因工程的应用。

技术背景

水稻是世界上最主要的粮食作物之一。在我国，稻米的生产和供应是关系国计民生的大事，因此提高水稻的产量和质量十分重要。病害是限制水稻增产和稳产的重要原因之一，而其中由稻瘟病造成的减产可高达30％(Baker B，Zambryski P等Science，1997.276：726～728)，所以控制稻瘟病的危害是提高水稻产量和质量的重要方面。尽管杀菌剂的应用可以成功控制一些病害，但是长期和过量的使用农药可以影响人类的健康并带来环境污染；传统的高产与抗病育种在提高水稻产量和质量方面的重要性虽然勿容置疑，但也存在抗病非持久性等问题，即大面积种植、推广单一品种往往造成对病原菌的选择压力，会导致病害的流行(IanR.Crute等，The Plant Cell，1996，8：1747～1755，Baker B，Zambryski P等Science，1997.276：726～728)。

随着分子植物病理学和分子生物技术的发展，利用植物抗病基因、防卫基因与信号传导基因或其它来源的基因，通过转化植物的方法可以获得抗病或耐病植株，但这些基因的表达大多采用组成型表达的启动子(如35S启动子)(Rommens CM等，Curr.Opin.Biotechol.，2000，11：120～125；Bol，J.F等，Annu.Rev.Phytopatholo.1990，28：113～138)。组成型启动子可以超量表达某些基因(如防卫基因)，但这些基因(如HR基因)的组成型表达往往对植物具有破坏性(de Wit P.J.G.M.，Annu.Rev.Phytopatholo.，1992，30：391～418)。理想的抗病分子操作应该是植物只有在受到病原菌侵染危害时快速表达防卫反应，从而阻止病原菌扩展，甚至将其杀死。Peng(Integrated Resource Management for SustainableAgriculture，1994，pp450～453)设想利用稻瘟菌诱导型启动子驱动抗病相关基因表达，以缓解抗病表达过程中植物受害的程度。迄今为止利用上述策略进行抗病的工作大多仅限在实验阶段(P.Coutos-Thévenot等，J.Exper.Bot.，2001，52：901～910)，其中主要原因是缺乏可供应用的病原菌侵染可诱导表达的有效启动子，因此，要开展分子抗病育种关键任务之一是从植物中获得病菌侵染非特异诱导表达基因的启动子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种由稻瘟菌侵染诱导表达的水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因5’端调控序列，并且该序列或由其一部分、几部分或组合可用于调控目的基因或有用基因在水稻叶片受破坏或病虫危害或化学物质刺激时的表达。

本发明的另一个目的是提供由蛋白酶抑制剂基因5’端调控序列或其衍生变体驱动的相关目的基因表达的双元载体，一种含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或由该DNA序列的部分片段或片段经缺失、碱基改变、碱基添加或再次分离的一部分、几部分或其组合构建的双元表达载体，是一种具有启动子活性的片段在病原菌侵染诱导下能够驱动目的基因的转录和表达的双元表达载体。具体的讲是由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或由该DNA序列的部分片段或片段经缺失、碱基改变、碱基添加的衍生变体或再次分离的一部分、几部分或其组合的序列，任选其中之一DNA序列片段嵌合到去掉35S具有相关目的基因的双元表达载体pCAMBIA1301上构建的一种双元表达载体。本发明还提供了一种由含有上述任意一DNA序列的双元表达载体转化微生物获得的重组微生物。具体涉及一种重组微生物是由双元表达载体转化了的根癌农杆菌。以及它们这些重组微生物在植物抗病抗虫育种中的应用。由以上所述的具有启动子活性的DNA序列片段构建的，含有任选其一的DNA序列片段的双元表达载体转化微生物获得重组微生物，这种获得重组微生物的技术是本领域一般技术人员能够实现的。

本发明提供了从水稻中克隆的一段DNA片段，该片段或其衍生的变体与报告基因相连构成融合基因，经重新导入水稻时可以启动报告基因的病原菌、伤害以及化学物质刺激下的诱导性表达，该序列包含在SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列中。根据本发明首选的是水稻蛋白酶抑制剂5′端调控序列中1到2051bp的片段以及在此序列基础上由渐变缺失获得的具有启动子活性的片段，报告基因选取的是GUS基因。

本发明的进一步提供的调控序列驱动的与将要表达的感兴趣的目的基因嵌合的DNA序列，以及含该融合序列的双元载体。本发明的感兴趣目的基因嵌合DNA序列中，首选的所要表达的基因是直接抑制、破坏病原菌与害虫生存的基因，抗性基因、防卫基因、信号传导基因以及能在水稻等植物中表达的可有效控制病虫害的异源基因(如无毒基因，反义RNA等)。

本发明还提供一种培育抗病植株的方法，依据本发明所提供的双元载体嵌合感兴趣的基因(如上述选取的基因)构建一种含有所述的双元表达载体的重组微生物，所述重组的微生物其中是重组根癌农杆菌。通过所述的含有双元表达载体转化了的微生物导入植物中而获得抗病的或耐病的植株，一个首选的实施方案是利用农杆菌EHA105介导的方法转化水稻。这种利用重组微生物转化的途径都是本领域一般技术人员可以做到的。

本发明提供了从水稻中克隆的一种蛋白酶抑制剂基因5’端调控序列，该序列的启动子活性首选的由稻瘟菌侵染诱导，并基本首先在受害叶片表达。表达的时间动态大致为：活体接种4小时的叶片开始有相关mRNA的转录，8-12小时开始上升，36小时达到最高。在一个优选实施例中，该序列包含在SEQ ID NO：1中。

本说明书中术语5’端调控序列为从转录起始位点(如碱基为A，并记为1)开始的5’端上游序列，这段序列包含控制下游基因表达的重要顺式调控元件。同时包括从转录起始位点A到下游翻译起始位点ATG之间的序列，其碱基的改变对启动子的功能没有明显影响，为方便其与相关基因的连接可改变部分碱基的种类和数目(如设计合适的酶切位点)，在一个较佳的实施例中，从A  到ATG  之间的序列为ACCCCCCAGTACAACCATGGTGA中.....指示部分.矩形框指示部分为添加的NcoI酶切位点。

本发明中DNA片段的“克隆”是指从自然界天然水稻基因组中分离出的，可以不经任何改变直接单独利用的一段启动子序列。依据本发明的序列，可以设计上下游一对引物，通过PCR技术简单再次获得，也可以利用其标记探针从水稻基因组文库中筛选获得，甚至可以用经典的酶法或化学方法合成获得，这些途径都是本领域一般技术人员可以做到的。

本发明中的蛋白酶抑制剂基因5’端调控序列的“衍生变体”指在SEQID NO：1序列中1到2051bp之间序列的基础上，经片段缺失、碱基改变、碱基添加或再次分离的一部分、几部分或其组合。本发明给出了MPP2026、MPP 1284、MPP 1131、MPP 1030、MPP 931、MPP 774、MPP 714、MPP 641、MPP 406系列具有不同特点的启动子活性的衍生变体

本发明中的蛋白酶抑制剂基因5′端调控序列及其衍生变体的启动子活性可以通过在启动子下游嵌合报告基因GUS，以GUS的表达情况得以确认。一个较佳的实施例是利用Jerfferson等(EMBO J.，1987，6：3901～3907)建立的成熟的方法。

本发明提供的一种双元表达载体，这种载体含有病原菌侵染和伤害诱导型启动子，启动子下游可以嵌合使用者所感兴趣的将要表达的目的基因。这些基因根据来源可以是水稻中既存的，也可以是水稻之外的可表达的异源基因(如无毒基因等)，或是植物中分离的抗病基因、信号传导基因、防卫基因及其相关基因，或者防卫过程中的关键酶类或蛋白的基因，或者具有直接或间接杀菌作用的植保素合成基因或关键酶类基因，也可以是从稻瘟菌中分离的无毒基因或和稻瘟菌寄生密切相关的基因的反义RNA，进一步可以是动物或微生物中分离的具有抗病或抗虫性的活性物质的基因或合成它们的酶类的基因。根据功能主要是直接抑制病原菌或害虫生长的蛋白或抗性物质的基因、以及一般实验者均可以从相关方向的科技文献、数据库或手册中选取这些感兴趣的目的基因。构建本发明中的表达载体技术是本领域的普通技术人员容易掌握的，可依据Maniatis等(分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室，1990)或Sambrook等(分子克隆实验指南，1989)等文献的相关内容进行操作。

本发明还提供了启动子顺式元件所在的大致区段范围，为此构建了从其5端逐级缺失的衍生变体，并嵌合到去掉35S的双元载体pCAMBIA1301(Jerfferson教授提供)的GUS基因之前，以上操作都是本领域技术人员常用的基本方法，优选的方案是设计携带合适的方便连接的酶切位点的引物，用PCR技术从原始序列中扩增获得。

本发明中抗病双元表达载体的导入水稻的方法在本领域是简单易行的，也是本领域一般技术人员可做到的。上述启动子或其衍生变体的活性检测以及利用该启动子进行有针对性的抗病分子操作，都不可避免的要在植物系统中进行，一个优选的实施方案是采用农杆菌介导的方法(Hiei等，Plant J.1994，6：271～282；Hiei等，Plant Mol.Biol.，1997，35：205～218)将其导入水稻中；实验者也可根据自己的熟练程度灵活的选用以下转化方法：原生质体融合法、基因枪法轰击法、电激法、PEG法、叶盘法等(Horsch等，Science，1984，234：496；Barton等，Cell，1983，32：1033；Liu等Acta Phytophysiol.Sin，21：195～205；Horsch等Science，227：1229)

根据本发明的启动子有活性的其它衍生变体，在转基因完成后，从抗性愈伤到生根后移入自然环境(如田间)的组织培养期间，转化组织或个体有类似组成型表达的活性，这是由于组织培养基中激发活性成分或组培期间其同自然植株的差异(如类似损伤)所致，在移入田间恢复后即基本失去。

本发明提供的各种序列可以用作分子标记探针，可以用作在水稻中再分离该序列，也可以用于其它植物的相关调控序列，这些都是本发明的范围。

根据本发明的5′端调控序列的特点，可进行培育具有广谱的抗病抗虫的植物。

根据本发明的5′端调控序列的特点，可利用SEQ ID NO：1中-931至-774的序列抑制目的基因的表达，从而有针对性的对目的基因进行功能开发。

以下通过附图进一步说明本发明

附图说明

附图1，健康水稻叶片与接种稻瘟菌后水稻叶片的BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因表达的DD-PCR结果。图示说明：泳道1、3、5是以健康水稻叶片为材料的DD-PCR结果，泳道2、4、6是以接种稻瘟菌后水稻叶片为材料的DD-PCR结果。箭头A为差异条带。

附图2，水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因受稻瘟菌侵染后的表达动态的Northern分析。图示说明：0、4、8、12、36为接种时间，单位为小时(h)，A为接种稻瘟菌非亲合小种131、B为接种稻瘟菌亲合小种007的BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因表达动态。

附图3，水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因5′端调控序列及其衍生变体与报告基因GUS嵌合的双元载体示意图。

附图4，构建水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因5′端调控序列及其从5′端渐变缺失的衍生变体所需PCR引物对。P135、p136、p137、p138、p139、p140分别为扩增MPP2026、MPP1030、MPP931、MPP774、MPP714、MPP641 BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因5′端调控序列及其渐变缺失体的引物对。MPP2026～MPP406代表启动子或5′端调控序列的名称，其中数字为5′端起始位置。在本说明书中启动子及其5′端调控序列衍生变体或含有这些片段的转基因植株均以相应符号表示。

附图5，水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因从5′缺失的衍生变体的电泳分析。图示说明：M为DNA分子量标准，其它从左向右依次为MPP 2026、MPP 1284、MPP 1131、MPP 1030、MPP 931、MPP 774、MPP714、MPP 641、MPP 406。

附图6，侵染诱导型BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因启动子驱动的可嵌合感兴趣基因病原菌、害虫危害可诱导表达型双元载体结构示意图。

附图7，病原菌侵染和伤害诱导型启动子驱动的GUS基因表达的转基因水稻叶片在接种稻瘟菌等处理后GUS表达活性柱状示意图。图示说明：各种处理为零时间处理和水、SA、JA、伤害、稻瘟菌处理后12小时的叶片和上部未处理叶片。

附图8，稻瘟菌侵染诱导型启动子驱动的GUS基因表达的转基因水稻叶片在接种稻瘟菌后GUS表达的组织染色照片。图示说明：MPP2026～MPP406为转基因水稻接种后8到36小时的GUS染色照片，MPP-W为无启动子空载体的转基因水稻GUS染色照片。

具体实施方案

为了更好地理解本发明，以下结合具体的实施例作以说明，但并非用来限制本发明。

实施例1

稻瘟菌侵染诱导的水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因及其5′端上游调控片段的克隆

1.稻瘟菌侵染可诱导型水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂cDNA的克隆

准备爱知旭品种水稻，待4-5叶抽出时，活体接种稻瘟菌，分别在0、4、8、12、36取发病叶片，立即液氮冷冻后保存，并做Northern分析确认诱导动态(附图2)，根据Northern分析的诱导动态留取36小时的样品(记为P样品)。同时，取未接种的健康植株叶片(记为H样品)同样方法保存备用。

分别抽取P和H的总RNA，经DNA酶消化混杂的DNA后，用SuperscripII Kit合成cDNA，cDNA再用RNAse H除去残存的RNA，即可以用作PCR扩增的模板。

扩增产物经聚丙烯电泳后可以压膜并放射自显影(附图1)，然后切取在接种叶片中的差异表达cDNA条带，经二次PCR扩增后回收并克隆到T-easy载体上，测序结果在GenBank数据库中作BLAST处理，推测为一种水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因的部分片段，如序列表SEQ IDNO：2所示

2.5′端上游调控片段的克隆

用放射性同位素P32标记上述克隆的蛋白酶抑制剂cDNA，筛选水稻基因组文库。经亚克隆，酶切鉴定以及测序确认，克隆获得了5′端上游DNA片段，该DNA片段的核甘酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

实施例2

稻瘟菌侵染可诱导型水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因5′端上游调控片段的一系列衍生变体的获得

蛋白酶抑制剂基因5′端上游调控片段放入数据库进行检索，并用软件分析，推测其潜在的顺式元件位置，然后在这些位置之前设计携带合适酶切位点的PCR引物(附图4)，以克隆的原始序列为膜板扩增出5′端上游调控片段的一系列衍生变体(附图5)

实施例3

5′端上游调控片段及其一系列衍生变体的与GUS基因嵌合的双元载体构建

上述5′端上游调控片段及其一系列衍生变体的PCR产物进一步克隆到T-easy载体中，分别对双元载体pCAMBIA1301和克隆到T-easy上的衍生变体用相同的限制性内切酶进行双酶切，限制性内切酶的选择按照PCR引物上设计携带的双酶切位点进行。两组双酶切后的产物经葡聚糖凝胶电泳分开后，切取目标DNA片段的凝胶块，分别用回收试剂盒回收：(1)双元载体pCAMBIA1301是切去原来35S的剩余部分，(2)T-easy载体是回收切下的启动子和其衍生变体部分。最后按一定比例分别将回收的(1)(2)两部分混合并用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，并经酶切鉴定和测序确认。获得的启动子及其衍生变体为：MPP2026(-2026bp，转录起始位点A记为1，其上游第一个碱基为-1以下同)，MPP 1030(-1030bp)，MPP 910(-910bp)，MPP 774(-774bp)，MPP 714(-714bp)MPP 641(-641bp)。MPP 1284(-1284bp)，MPP 1131(-1131bp)和MPP 406(-406bp)从MPP 2026出发，并分别经EcoI、SalI和XbaI单酶切，经自连获得(附图5)。

实施例4

稻瘟菌侵染诱导型水稻蛋白酶抑制剂基因启动子驱动GUS表达的嵌合基因转化水稻

1.双元载体转化农杆菌EHA105

分别将上述双元载体质粒DNA用电激法导入EHA105感受态细胞，28℃培养到形成单菌落。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/mlKanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16hr，直接对菌液进行PCR鉴定。

2.根癌农杆菌介导的水稻转化

准备水稻未成熟种子，经表面消毒后挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB)上，暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基(NB)上，在相同条件下继代培养5天左右；或者准备水稻成熟胚愈伤组织，挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。挑选状态较好的愈伤组织与适量农杆菌悬浮液(OD 0.3-0.5)共培养15-20分钟，转入固体共培养基上，26℃黑暗培养2-3天。将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天至长出抗性愈伤组织。从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/LHygromycin的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，经过15-25天左右，长出绿点。30-40天后进一步分化出小苗。当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右，在温室内移栽入土。

实施例5

5′端上游调控片段及其一系列衍生变体启动子活性的鉴定及分析

GUS活性的检测采用组织染色法和表达量确定法：将选取的转基因材料进行无菌水表面清洗，用无菌吸水纸吸干后浸入GUS染色液(Jefferson，EMBO J.，1987，6：3901～3907)，抽气5分钟后放28℃，200rpm摇床上反应30分钟到过夜，然后在70％或100％的乙醇内脱色漂洗直至显色。

材料的准备分抗性愈伤、生根培养基上的转基因苗、移入大田中7到15天的转基因苗三种情况分别进行：前两种情况不经处理直接染色；大田中的苗采用稻瘟菌接种处理，接种方法一是在剪取上部幼嫩叶片上点接稻瘟菌悬浮液，另一是选取一部分单株的一片幼嫩叶片在活体上接种(为防止稻瘟菌的传播或导致转基因苗整株死亡，具体做法为：将无菌小滤纸片浸在稻瘟菌悬浮液中，然后取出带菌的滤纸片并立即贴于水稻叶片正面并用保鲜膜封好)。对接种12小时的叶片进行GUS染色，以确定稻瘟菌的侵染诱导性于GUS的表达关系。结果显示：所有结构的转基因材料在移入大田之前都表现出一定的GUS表达，但当移入大田7-10天后则失去这种类似组成型的表达，原因可能和抗性愈伤处于脱分化状态或培养基中的某些成分影响所致。

为了精确了解各调控片段与病原菌、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、伤害等诱导因素处理的关系，选取转基因水稻苗分别进行处理(每处理至少选取5个独立转化植株)，并在处理12小时后采样抽提蛋白进行GUS活性定量。GUS表达量的确定采用Martin T等的方法(In：Gallagher SR(ed)GUS protocol Using the GUS gene as a reporter of gene expression.SanDiego：Academic Press，23～43)。具体做法为：取50mg叶片试样，加入200μl抽提缓冲液，冰浴中充分研磨，8000g离心10分钟，留取上清液。然后一部分用Bradford法确定总蛋白含量，另一部分取10μl加90μl4MUG(2mM)在200rpm摇床上37℃反应2小时，最后添加碳酸钠溶液(0.2M)终止反应并放4℃以备GUS活性测定。

综合克隆的水稻BowmanBirk蛋白酶抑制剂基因的表达动态(Northern分析)(图2)以及GUS组织染色与定量的两方面结果可以得出：离体接种稻瘟菌的叶片中，所有产生GUS表达的叶片都表现4小时有一定表达，8小时表达增加，48表达最高，表现出GUS表达与稻瘟菌侵染诱导性的关系，但不同的基衍生变体结构表现出以下不同的类型：(1)MPP2026与MPP1284的GUS表达没有明显的区别，都表现一定表达，但表达量较低(2)含MPP1131和MPP1030结构的转基因苗在离体接种时其GUS表达较(1)的要弱，说明其缺少了和稻瘟菌诱导有关的顺式调控元件。(3)MPP910的GUS活性已经降到痕量水平，但是MPP774、MPP714、MPP641却表现出GUS的稻瘟菌侵染诱导性高水平表达，只是表达有减小的趋势。这里着重强调两个方面，一是MPP910的上游区段可能存在抑制基因表达的序列；一是MPP774、MPP714或MPP641可能含有启动子活性的主要成分，明显的特征是在稻瘟菌侵染诱导12小时MPP774的表达量大约是35S启动子的3倍，如果根据Northern分析结果分析(附图2)，其在36小时的表达量要更高.(4)MPP406的表达对于稻瘟菌诱导关系较小，接种与否基本不影响GUS  的表达，说明与稻瘟菌诱导有关的调控元件基本在-406的上游，而在-406到-1存在基本的启动子调控元件(附图7和附图8)。

实施例6抗病双元载体的构建

该双元载体是在实施例3的基础上构建的。此处仅以由MPP2026而来的抗病双元载体的构建过程为例，其它一系列启动子的衍生变体均可按此法获得。将MPP2026质粒用BstEII酶切6小时，然后用T4 DNApolymerase补平，酚仿抽提后溶于双蒸无菌水中用NcoI酶切，即获得可嵌合抗病相关基因的双元载体。即将嵌合的基因在5′端可以带有既有的或后来增加的NcoI位点接头，其3′端应该是平滑末端。另外，为了可以嵌合各类基因，可以用BstEII和NcoI双酶切后补平，即将嵌合的基因应不含ATG密码子，并鉴定连入方向(附图6)。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种源于水稻的病原菌侵染和伤害诱导性基因启动子及其应用

<130>彭友良2003

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2051

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>1

cttgaggatg cacgttgtgc tattggcgat gcacacaacg agttctaccc tgaccctctg   60

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tcctatatgt gtgcatgcat atatacgcgt ggcaatggat cggaggcctc cacgtgctct    1920

tatcctcatg caagtcagca tttgtgattg ggtaagggcg cgctatacat attagtcggt    1980

cgatctctat ctataaatat taaccactcg acccatcact aacacccaca ccccccagta    2040

caaccaagat g                                                         2051

<210>2

<211>1050

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>2

gctacttcca ccatcctgct cttcctcctc gccggcctcg ccgccgccca cggcgacggc     60

gacaccacca tccgtctccc cagcgacggc gccaaagcat cacgaccacg cgccgccaaa    120

ccatgggact gctgcgacaa catcgagatc tcccggctaa tgatctaccc gccactgtac    180

cgctgcaacg acgaggtgaa gcagtgcgcc gccgcctgca aggagtgcgt ggaggcgccc    240

ggcggcgact tcaacggcgg cgccttcgtc tgcagtgact ggttctcgac ggtggacccc    300

ggccccaagt gcacggcggc gctggatggg ctgtcgatgg agaagccgtg gaagtgctgc    360

gacaacatcg agcggctgcc gacgaagacc aacccgccgc agtggcgctg caacgacgag    420

ctggagccca gccagtgcac cgccgcgtgc aagtcgtgcc gggaggcgcc ggggccattc    480

ccggggaagc tcatctgcga ggacatctac tggggcgccg acccgggccc cttctgcacg    540

ccgcggacat ggggagattg ctgcgacaag gccttctgca acaagatgaa cccgccgacc    600

tgccgctgca tggacgaggt gaaggagtgc gccgacgcgt gcaaggattg ccagcgcgtg    660

gagtcgtcgg agccgcctcg ctacgtctgc aaggaccgct tcaccggcca tcccggcccc    720

gtgtgcaaac cccgagcgga gaactagcta gctacagatg atcgatgatc gatctgtgtg    780

tccatcaata aaactcgccc tagcttgcag ctagctgatc gttcgttcga tcattcagag    840

ttggtatagc tagaggctag agcttagctc catccagatt tttcagtgct ctgcagcttt    900

tgtgcatctt gcatgctttg ttagtttgtg tgctccatgt gtgtgggtgt gtttgtctct    960

gttcgcttgt gtggaccatg aggaaaaata aaataaatat gcaatgcaag cgtggatatg   1020

taccccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                    1050

Claims (8)

1.一种从水稻克隆的具有病原菌侵染和伤害诱导性启动子活性的一段蛋白酶抑制剂基因5’端上游的调控DNA，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的DNA衍生的变体MPP 774，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1的-774位核苷酸至作为转录起始位点的1位核苷酸所示。

3.权利要求1所述的DNA衍生的变体MPP 714，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1的-714位核苷酸至作为转录起始位点的1位核苷酸所示。

4.权利要求1所述的DNA衍生的变体MPP 641，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1的-641位核苷酸至作为转录起始位点的1位核苷酸所示。

5.一种含有由权利要求1所述的DNA或权利要求2-4任一项所述的变体的双元表达载体。

6.根据权利要求5所述的双元表达载体，是由权利要求1所述的DNA或权利要求2-4任一项所述的变体嵌合到去掉35S具有相关目的基因的双元表达载体pCAMBIA1301上构建的一种双元表达载体。

7.一种含有权利要求5或6所述的双元表达载体的重组微生物。

8.根据权利要求7所述的重组微生物，是一种由权利要求5或6所述的双元表达载体转化了的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。

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