KR20010047973A

KR20010047973A - 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 에스2 세포로부터재조합 엔도스타틴을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20010047973A
Application number: KR1019990052420A
Authority: KR
Inventors: 정인식
Original assignee: 정인식
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 1999-11-24
Publication date: 2001-06-15
Also published as: KR100327979B1

Abstract

본 발명은 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster) S2 세포를 이용하여 효율적으로 재조합 엔도스타틴을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 마우스 엔도스타틴 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드로 안정하게 형질전환시킴으로써 기존의 다른 발현시스템에 비해서 훨씬 높은 수율로 재조합 엔도스타틴을 효율적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.

Description

형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 에스2 세포로부터 재조합 엔도스타틴을 제조하는 방법{Manufacturing method of recombinant endostatin from transformed Drosophila melanogaster S2 cells}

본 발명은 드로소필라 멜라노개스터 S2(Drosophila melanogasterSchneider 2) 세포를 이용하여 재조합 엔도스타틴을 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 마우스 엔도스타틴 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드로 안정하게 형질전환시킴으로써 재조합 엔도스타틴을 효과적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.

엔도스타틴은 앤지오스타틴과 더불어서 최근에 세계적인 관심이 집중되고 있는 항암제로서, 이들의 항암작용은 암세포의 혈관생성을 억제함으로써 암세포에 대한 영양공급을 차단하여 결국 암세포의 증식을 억제하는 기전에 의해 나타나는 것으로 밝혀져 있다. 특히 엔도스타틴과 앤지오스타틴은 기존의 항암제가 대부분 암세포를 직접 공격하여 항암효과를 나타내는 반면에 암세포로의 혈액공급을 차단함으로써 암세포를 제거할 수 있을 뿐 아니라 재발까지도 방지한다는 잇점을 가지며, 더구나 거의 대부분의 암세포에 대하여 항암효능을 나타낸다는 놀라운 잇점으로 인하여 관심이 집중되고 있다.

이중에서 엔도스타틴은 콜라겐 18α의 C-말단 단편으로서, 항암제로서 사용할 수 있는 그의 주된 작용기전이 되는 효과적이고 자연적인 혈관형성억제 작용은 이미 문헌에 공지되어 있다(참조: O'Reilly, MS, Boehm, T, Shing, Y, Fukai, N, Vasios, G, Lane, WS, Flynn, E, Birhead, JR, Olsen, BR and Folkman, J, Cell 88: 277-285, 1997). 또한, 엔도스타틴은 생체외에서 내피세포의 성장을 억제하는 것으로도 알려져 있다(O'Reilly 등, 1997, 상기 참조). 정제된 재조합 엔도스타틴의 조직투여는 생체내에서 확립된 암세포의 성장과 전이를 억제하는 것으로 확인되었다(O'Reilly 등, 1997, 상기 참조; Blezinger, P, Wang, J, Gondo, M, Quezada, A, Mehrens, D, Frech, M, Singhal, A, Sullivan, S, Rolland, A, Ralston, R and Min, W, Nature Biotechnol 17: 343-348, 1999).

이러한 유용한 약제학적 활성물질로서의 엔도스타틴은 대장균, 스포도프테라, 프루지퍼르다 21, 피치아패스토리스에서 생산하는 연구가 수행되었지만 발현양이 적어서 효율적인 생산시스템의 개발이 필요하였다. 따라서, 엔도스타틴을 효과적으로 공급하기 위하여 최근에는 유전공학적인 방법의 이용이 시도되고 있다. 예를들어, 오레일리 등은 대장균(E. coli) 및 스포도프테라 프루지퍼르다(Spodoptera frugiperda) 21에서 엔도스타틴을 발현시키는 방법을 제시하였으며(O'Reilly 등, 1997, 상기 참조), 보엠 등은 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 엔도스타틴을 발현시켰다(참조: Boehm, T, O'Reilly, MS, Keough, K, Shiloach, J, Shapiro, R and Folkman, J, Biochem Biophys Res Comm 252: 190-194, 1998; Boehm, T, Pirie-Shepherd, S, Trinh, LB, Shiloach, J and Folkman, J, Yeast 15(7), 563-567, 1999). 또한, 블레징거 등은 인간의 내피세포에서 엔도스타틴을 발현시킬 수 있음을 보고하였다(Blezinger 등, 1999, 상기 참조).

그러나, 이러한 유전공학적 방법들도 단지 초기 임상실험에 필요한 상당량의 수용성 엔도스타틴 조차도 충족시킬 수 없을 정도의 양으로 엔도스타틴을 생산하였다. 따라서, 엔도스타틴을 효과적으로 생산하는 효율적인 발현시스템을 개발하고자 하는 요구가 본 기술분야의 전문가들에게 절실하였다.

이에 본 발명자는 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있는 여러가지 세포주들을 이용하여 엔도스타틴의 발현을 연구하였으며, 그 결과 특정한 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster) 세포주가 이러한 목적을 효과적으로 달성할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명자는 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 엔도스타틴의 cDNA가 삽입된 발현플라스미드로 형질전환시키고 배양함으로써 엔도스타틴을 효율적으로 생성시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

도 1은 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster) S2 세포가 재조합 엔도스타틴을 발현할 수 있도록 형질전환시키는데 사용되는 발현플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His의 모식도이다.

도 2는 형질전환되지 않은 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포 및 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포에서 엔도스타틴의 발현을 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블럿 분석(B)에 의해 조사한 결과를 나타낸 것이다(M은 분자량 마커, 레인 (1)은 형질전환되지 않은 세포의 세포부분, 레인 (2)는 형질전환되지 않은 세포의 배지부분, 레인 (3)은 형질전환된 S2 세포의 세포부분, 레인 (4)는 형질전환된 S2 세포의 배지부분, 화살표는 재조합 엔도스타틴을 지시함).

도 3은 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 배양하여 배지부분으로부터 정제된 His-표지된 엔도스타틴을 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블럿 분석(B)에 의해 조사한 결과를 나타낸 것이다(M은 분자량 마커, 레인 (1) 및 (2)는 각각 형질전환된 S2 세포의 배지부분을 친화성 정제하기 전 및 후의 결과를 상대적으로 보여준다. 화살표는 재조합 엔도스타틴을 지시함).

도 4는 형질전환된 S2 세포의 T-플라스크 배양시에 시간에 따른 세포의 성장과 엔도스타틴 발현의 변화를 나타낸 것이다. (A)에서는 0.5mM(○), 1mM(□) 또는 2mM(△)의 CuSO₄농도에서 배양을 유도한 후의 세포농도를 배양시간에 따라 도식화하였다. (B)에서는 5일 및 7일의 배양기간 후의 재조합 엔도스타틴의 발현을 웨스턴 블럿 분석에 의해 조사한 결과를 나타낸다. 레인 (1), (2) 및 (3)은 각각 0.5, 1 및 2mM의 CuSO₄로 5 및 7일의 배양기간 동안 배양을 유도한 후에 형질전환된 세포에서의 전체 단백질 생산을 상대적으로 나타낸다. 레인 (4)는 0.2㎍의 정제된 재조합 엔도스타틴을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 이용하여 재조합 엔도스타틴을 효율적으로 제조하는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 마우스 엔도스타틴 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드로 안정하게 형질전환시킴으로써 재조합 엔도스타틴을 효과적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 재조합 엔도스타틴을 발현시키기 위해 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 형질전환시키는데 사용되는 것으로 마우스 엔도스타틴을 코드화한 이종유전자가 삽입되어 있는 신규한 재조합 플라스미드를 제공한다.

본 발명은 또한 상기한 바와 같은 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 고애스펙트 회전벽용기(high aspect rotating-wall vessel)를 사용하여 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 배양하여 생산된 재조합 엔도스타틴을 특히, 간단한 일단계 Ni^2＋-킬레이트화 친화성 정제방법에 의해서 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 엔도스타틴을 발현시키기 위해 사용되는 숙주세포인 드로소필라 멜라노개스터 S2(Drosophila melanogaster Schneider 2) 세포는 유전공학 분야에서 광범하게 이용되고 있는 초파리속(Drosophila)에 속하는 세포주의 하나로서 공지되어 있는 세포주이다. 그러나, 지금까지 엔도스타틴의 발현을 위해 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포주를 사용한 예는 없었다. 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포주는 이미 문헌에 공지되어 있으며(참조: “Drosophila Cells in Culture”, Guy Echalier, 1997, Academic Press, U.S.A.) 인비트로겐사(Invitrogen Corp. CA, U.S.A.)로부터 용이하게 입수할 수 있다.

본 발명에서 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포에서 엔도스타틴을 발현시키기 위하여 사용되는 재조합 플라스미드는 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His이다. 이 플라스미드는 지금까지 알려지지 않았던 신규한 엔도스타틴 발현용 재조합 플라스미드이며, 그의 구조는 도 1에 나타내었다. 이 엔도스타틴 발현용 재조합 플라스미드인 pMT/BiP/E-V5-His는 공지의 플라스미드인 pMT/BiP/V5-His 및 pETKH-1로 부터 유전공학 분야에서 통상적인 방법에 따라 용이하게 작제할 수 있다. 엔도스타틴 발현용 재조합 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His의 제조에 관하여는 이하의 실시예에서 더욱 상세히 설명된다.

본 발명에 따르면 또한, 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 엔도스타틴 발현용 재조합 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His로 형질전환시키고, 이렇게 하여 수득된 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 이러한 형질전환 및 배양에는 목적하는 엔도스타틴을 고수율로 효과적으로 발현시킬 수 있기만 하면 유전공학 분야에서 통상적인 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 특히 바람직하게는 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포는 넌크(Nunc) T-플라스크 또는 고애스펙트 회전벽용기를 이용하여 배양한다. 고어스펙트 회전벽용기는 마이크로중력을 모방하기 위하여 NASA에 의해 고안된 것으로, cancer research, in-vitro toxicology test, tissue engineering 등에 관련한 부착성, 비부착성 세포의 배양에 폭넓게 이용되고 있으며 단일항체 및 형질전환된 동물, 곤충세포에서의 재조합 단백질의 생성을 증가시킬수 있는 것으로 알려져 있다. HARV는 일반적으로 교반기를 이용한 생물반응기에서 생겨나는 전단과 파동을 최소한으로 감소시킴으로서 포유동물 세포에서 정지상태의 환경을 공급하며(참조: Goodwin, TJ, Prewett, TL, Wolf, DA and Spaulding, GF, J Cell Biochem 51(3): 301-311, 1993), 또한 HARV는 스포도프테라 프루지퍼르다 Sf9 세포배양시 생존능력을 연장시키는 것으로 보도되었다(참조: Cowger, NL, O'Connor, KC and Bivind, JE, Enzyme Microb Technol 20: 326-332, 1997). 본 발명에서 이와 같은 HARV를 발현플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His에 의해 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2의 배양에 이용함으로써 다른 배양방법에 비해 엔도스타틴의 비생산량(specific content)을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 이러한 목적을 달성하기 위하여 사용되는 여러가지 물질 및 구체적인 처리조건은 이하의 실시예에 의해 명료하게 설명된다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하고 설명하기 위해 제시되는 것일 뿐이며, 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

형질전환을 위해 사용되는 숙주세포, 플라스미드 및 효소의 준비

엔도스타틴을 발현시키기 위해 사용되는 숙주세포인 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포는 invitrogen사에서 구입한 10IMS(insect medium supplement, Sigma)를 함유하는 M3 배지(Shields and Sang M3 insect medium, Sigma)로 넌크(Nunc)(T-75, Denmark) 플라스크를 이용하여 27℃에서 배양하였다.

엔도스타틴의 발현을 위해 숙주세포인 S2 세포에 도입되는 재조합 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His의 제조를 위해 사용되는 플라스미드 pMT/BiP/V5-His(3.6kb)는 인비트로겐사(Invitrogen Corp. CA, U.S.A.)로 부터 용이하게 입수할 수 있으며, 메탈로티오네인(methallothionein) 프로모터, BiP 시그날 서열, V5 에피토프 표지(tag) 및 폴리히스티딘 부위를 함유하고 있다. 또한, 형질전환을 수행하기 위하여 구조적 드로소필라 코피아(DrosophilaCopia) 5' LTR 프로모터의 조절하에 박테리아 하이그로마이신 B 포스포트랜스페라제 유전자를 함유하는 선별플라스미드 pCoHygro(Invitrogen 사)를 사용하였다.

마우스 엔도스타틴을 코드화하는 cDNA가 삽입되어 있는 출발 플라스미드로는 플라스미드 pETKH-1(ATCC, 63404)를 사용하였으며, 이 플라스미드를 제조하고 증식시키기 위한 첫번째 숙주로는 대장균 JM109(Takara, Japan)를 사용하였다. 대장균 JM109 세포는 37℃에서 교반하면서 ㎖ 당 50㎍의 앰피실린을 함유하는 LB 배지(1트립톤, 0.5효모추출물 및 0.5NaCl, pH 7.3)에서 통상적인 방법으로 배양하고 유지시켰다(Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. “Molecular Cloning; a laboratory manual.” Cold spring Harbor. NY: Cold spring Harbor Laboratory Press. 1989.). 이하의 실시예에서 제한효소들은 각각 이들의 제조자인 프로메가사(Promega, U.S.A.) 또는 타카라사(Takara, Japan)에 의해 제시된 사용지침에 따라 이용하였다.

이하의 실시예에서 웨스턴 블럿(Western blot) 분석은 래믈리 방법(Laemmli, UK, Nature 227: 680-685, 1970)에 따라 SDS-PAGE를 사용하여 단백질 표본에 대하여 수행하였다. 즉, 겔상에서 전기영동한 단백질들을 니트로셀룰로즈상에 전이시키고, 마우스 안티-V5(Invitrogen사) 다세포군항체와 반응시킨 후에, 토끼 안티-마우스 IgG 알칼리성 포스파타제 결합체(1:1000, v/v)로 표지하였다. TBS buffer를 이용한 세척과정을 거친 후에 BM 자색(purple) AP 기질용액(Boehringer Mannheim)을 첨가하였고 증류수 또는 TBS buffer로 반응을 정지시켰다.

실시예 1

발현 플라스미드의 제조

올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 마우스의 엔도스타틴 cDNA를 함유하는 플라스미드 DNA, pETKH-1(ATCC, 63404)로부터 94℃로 30초동안 denaturation시키고, 54℃로 30초 동안 annealing시키고, 72℃로 30초 동안 attenuation시키는 과정을 30번 반복하여 마우스 엔도스타틴 서열을 증폭시켰다. 이때 센스 프라이머는 5'-AGATCTCATACTCATCAGG-3'이었고, 안티센스 프라이머는 5'-CTCGAGTTTGGAGAAAGAG-3'이었으며, PCR 단계는 50㎕의 PCR 혼합물(Takara사)을 이용하여 열순환기(Thermal Cycler)(PR Biosystems사, USA)로 실행하였다. 이렇게 하여 증폭된 엔도스타틴 유전자를 Easytrap Kit(Takara사, Japan)로 분리하여 pGEM-T 벡터(Promega사)내에 T4 DNA ligase로 4℃에서 12시간동안 ligation시켜 삽입한 후 pGEM-T-E를 수득하고, DNA 서열화로 엔도스타틴의 cDNA 서열이 정확하게 삽입되어 있는지를 확인하였다.

플라스미드 pMT/BiP/V5-His(Invitrogen사)를 37℃, 2시간동안 제한효소 BglII 및 XhoI로 분해시켰다. 또한, 상기에서 수득한 pGEM-T-E를 역시 37℃, 2시간동안 제한효소 BglII 및 XhoI로 분해시켜 엔도스타틴의 cDNA를 함유하는 BglII-XhoI 단편을 얻었다. 이렇게하여 수득한 pGEM-T-E의 BglII-XhoI 단편을 상기의 플라스미드 pMT/BiP/V5-His의 BglII 및 XhoI 절단부위 사이에 4℃, 12시간 T4 DNA ligase로 ligation시켜 삽입하여 목적하는 엔도스타틴 발현용 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His를 수득하였다. 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His의 구조는 도 1에 나타내었다. 재조합 발현플라스미드 pMT/Bip/E-V5-His에서 유전자 삽입이 적합한 방향으로 되었는지와 판독프레임은 제한효소 지도작성과 DNA 서열결정에 의해 확인하였다.

실시예 2

드로소필라 멜라노개스터 S2 세포의 형질전환

리포펙틴을 이용하여 상기에서 제조된 엔도스타틴 발현용 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His 및 pCoHygro(19:1의 비율)로 이하에 기술하는 바와 같은 방식에 따라 성장하는 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 이용하여 형질전환시켰다. 우선, 형질전환 배지를 만들기 위해서 플라스미드 DNA와 리포펙틴 시약(Gibco BRL사, USA)을 각각 IMS가 없는 M3 배지로 DNA:3㎍, lipofectin:15㎍이 되도록 희석시킨 후, 1:5(v/v)의 비로 혼합시켰다. 형질전환 배지를 상온에서 15분 동안 반응시키고, 2시간 전에 6-웰 플레이트에 미리 분주해 놓은 IMS가 없는 M3 배지내의 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포(3×10⁶세포/웰)에 DNA, lipofectin, medium mixture 1.5㎖를 웰에 가하였다. 플레이트를 24시간 동안 27℃ 배양기에서 배양한 후에, 리포펙틴을 제거하기 위해 웰내의 배지를 10IMS가 함유되었으나 항생제는 존재하지 않는 M3 배지로 교환하고, 이 배지 내에서 27℃ 배양기에서 5일 동안 더 세포를 배양하였다. 그후, 세포들을 5,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여, 형질전환된 숙주세포를 분리하였다. 이어서 분리된 숙주세포를 10IMS와 ㎖당 300㎍의 하이그로마이신 B가 함유되어 있는 선별 M3 배지 1.5㎖에 다시 부유시켰다. 선별배지를 5일 간격으로 교체해 주면서 하이그로마이신 B를 이용하여 4주의 선별기간을 거친 후에 형질전환된 폴리클로날 세포군집을 선별하였다. 하이그로마이신 B는 선별기간 후에도 일상적으로 내내 배지에 유지시켰다.

이렇게 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포가 엔도스타틴을 안정적으로 발현하는지 여부를 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 분석법에 의해 조사하였다. 1mM의 CuSO₄를 이용하여 형질전환된 S2 세포의 배양을 유도한 후에 24시간 동안의 유전자 발현을 분석하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다. SDS-PAGE는 pMT/BiP/E-V5-His를 포함하는 형질전환된 S2 세포가 형질전환되지 않은 세포의 배양에 의해서는 관찰되지 않는 25kDa의 분자량을 갖는 새로운 단백질을 발현함을 보여주었다(도 2A). 마우스 안티-V5 다세포군항체(Invitrogen사)를 이용한 웨스턴 블럿 분석에 의해서는 이와 같이 축적된 단백질이 새롭게 발현된 엔도스타틴임을 확인하였고(도 2B), 그의 분자크기는 V5와 His의 C-말단 표지를 함유하는 융화된 엔도스타틴의 예견된 분자량과 비슷한 것으로 판단되었다. 재조합 엔도스타틴은 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포의 안과 밖(배지)에 존재하는데, 밀도측정 스캔닝(densitometric scanning)에 의하면 분비된 엔도스타틴(즉, 배지부분에 존재하는 엔도스타틴)이 전체 엔도스타틴 생산의 약 84를 차지함을 보여주었다. 즉, 형질전환된 S2 세포는 발현된 엔도스타틴을 효과적으로 세포외(배지내)로 분비하는 것이다. 형질전환되지 않은 S2 세포 내외에서는 재조합 엔도스타틴이 검출되지 않았다. 이 결과는 형질전환된 S2 세포에서의 엔도스타틴의 발현이 이 세포내에 이입된 엔도스타틴의 cDNA를 함유하는 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His에 의한 것임을 시사하는 것이다.

실시예 3

세포배양과 유전자 발현 분석

27℃에서 넌크(T-75) 플라스크내에서 상기 실시예 2에서 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포(3-4×10⁶세포)를 10IMS와 ㎖당 300㎍의 하이그로마이신 B를 함유하는 M3 배지 5㎖ 내에서 8일 동안 27℃ 배양기에서 배양하였다. 또한, 마이크로중력을 모방하기 위해 상기와 동일한 M3 배지로 완전히 채워진 10㎖ 고애스펙트 회전벽용기(HARV, Synthecon, Houston, TX) 내에서, 상기 실시예 2에서 수득한 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포(3-4×10⁶세포)를 5일 동안 27℃에서 10rpm으로 회전시키면서 배양하였다. 이 실험에서는 10㎖의 M3 배지를 함유하는 넌크(T-75) 플라스크를 대조구로 사용하였다. 두가지 형태의 배양은 모두 2 회 걸쳐 수행하였으며, 배양을 시작한 직후에 0.5mM의 CuSO₄로 엔도스타틴의 발현을 유도하였다.

형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 두가지 배양형태로 각각 5일 동안 배양한 후에 배양액을 5분 동안 3000rpm에서 원심분리하여 세포를 분리시켰다. 상등액은 세포외에서의 재조합 단백질을 확인하는데 이용하였다. 세포 부분은 용해완충액(lysis buffer)(50mM 트리스-Cl (pH 8.0), 150mM NaCl, 0.02나트륨아자이드, 100㎍/㎖ PMSF, 1㎍/㎖ 아프로티닌 및 1트리톤 X-100) 안에서 1시간 동안 진탕하고, 37℃의 수욕에서의 반응과 더불어 -70℃ 냉동고에서의 반응을 통해 3회의 동결-해동 사이클을 반복 시행하였다. 세포의 이물질들을 제거하기 위해서 세포추출물을 15분 동안 14,000rpm에서 원심분리한 후에 그 상등액은 세포내의 재조합 단백질의 존재 여부를 확인하기 위해 이용하였다. 다른 식으로 명시된 것 이외에 새포내의 추출물의 혼합액은 전체 단백질 생산을 분석하기 위해 사용하였다.

재조합 엔도스타틴을 생산하기 위해 형질전환된 드로소필라 S2 세포(3-4×10⁶세포)를 2회에 걸쳐 넌크 T-플라스크와 고애스펙트 회전벽용기(HARV)에서 동시에 5 일 동안 배양한 후에 세포의 성장과 엔도스타틴의 생산량을 각각 정제된 엔도스타틴 대조구와 비교하여 웨스턴 블럿 분석으로 평가하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에서 보는바와 같이, 5일간의 배양 후에 T-플라스크에서 형질전환된 S2 세포의 최종농도는 12-20×10⁶세포/㎖였으며, HARV에서는 S2 세포가 부유상태에서 5-7×10⁶세포/㎖의 최종농도로 성장하였다. 이 결과로부터 HARV에서 세포들은 더 느리게 성장함을 알 수 있으며, 이러한 느린 성장속도는 S2 세포가 HARV에 있어서의 모방된 마이크로중력 환경에 적응하는 유도기(lag phase)에 기인하는 것으로 판단된다. 또한, T-플라스크와 HARV에서 재조합 엔도스타틴의 생산량은 각각 대략 17-22 및 9-13㎎/ℓ로, T-플라스크에서의 배양이 더 높은 농도의 엔도스타틴을 생산하였으나, 한 세포당 엔도스타틴의 생산량은 T-플라스크에서 보다는 HARV에서 오히려 더 높음을 알 수 있었다. 따라서, HARV 환경은 세포성장과 재조합 단백질 생산을 유지할 수 있는 것으로 판단된다.

T-플라스크 및 HARV에서 형질전환된 S2 세포의 성장과 재조합 엔도스타틴의 생산

배양형태	세포성장	엔도스타틴 생산
배양형태	초기세포농도(×10⁶세포/㎖)	최종세포농도(×10⁶세포/ ㎖)	함량(㎎/ℓ)	비함량(㎍/10⁶세포)
실험 I	T-75	3	12	17	1.4
실험 I	HARV	3	5	9	1.8
실험 II	T-75	4	20	22	1.1
실험 II	HARV	4	7	13	1.9

또한, T-플라스크에서 다양한 농도(0.1, 0.5, 1, 2, 4 및 8mM)의 CuSO₄로 안정하게 형질전환된 S2 세포의 배양을 24시간 동안 유도하였다. CuSO₄에 의한 유도는 0.5-2mM의 광범위한 농도에서 최적 범위를 가지며, 이것은 웨스턴 블럿 분석에 의해서 측정된 결과와 일치한다(결과 표시하지 않음). SDS-PAGE 분석에 의해, 형질전환된 S2 세포에서 발현된 재조합 엔도스타틴은 25kDa의 분자량을 갖는 것으로 확인되었다. CuSO₄에 의해 세포의 배양을 유도하지 않은 상태에서 모든 세포는 매우 낮거나 확인할 수 없을 정도의 소량으로 엔도스타틴을 발현하였다.

또한, 상기 언급한 T-플라스크에서의 배양과 동일한 방법에 따라 실시예 2에서 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 상이한 농도의 CuSO₄의 존재하에서 배양하여 형질전환된 S2 세포의 성장과 엔도스타틴의 발현에 대하여 세가지 다른 농도(0.5mM, 1mM 및 2mM)의 CuSO₄유도가 미치는 효과를 조사하는 연구를 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 0.5 및 1mM의 CuSO₄농도에서는 형질전환된 S2 세포가 성장하지만 2mM의 CuSO₄농도에서는 성장이 중단된다. 또한, 0.5mM의 CuSO₄로 7일간 유도한 후에 엔도스타틴의 축적량은 최고에 달하는 것을 알 수 있다. 이 시기에 재조합 엔도스타틴의 생산량은 웨스턴 블럿 분석상에서 정제된 엔도스타틴 대조구와 비교하여 약 24㎎/ℓ로 측정되었다. 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포로부터 이러한 엔도스타틴의 발현 수준은 배큘로바이러스에 의해 감염된 스포도프테라 프루지퍼르다 21 세포로부터 마우스 엔도스타틴의 발현(1-2㎎/ℓ)에 대해 보고(참조: O'Reilly, MS, Boehm, T, Shing, Y, Fukai, N, Vasios, G, Lane, WS, Flynn, E, Birhead, JR, Olsen, BR and Folkman, J, Cell 88: 277-285, 1997)된 것보다 훨씬 더 높은 수준이다. 이 결과는 배큘로바이러스에 의한 곤충세포 발현시스템에 비해 재조합 단백질생산을 위한 드로소필라 세포 발현시스템의 잠재적 우월을 입증하는 것이다.

실시예 4

재조합 엔도스타틴의 정제

엔도스타틴의 정제를 위한 모든 처리단계는 4℃에서 수행하였다. 제조자의 지침에 따라 His-결합 키트(His-Bind Kits; Novagen 사)를 이용하여 마이크로원심분리관 안에서 상기 실시예 3에서 수득한 폴리히스티딘-표지된 엔도스타틴을 후술하는 바와 같이 간단한 일단계 Ni^2＋-킬레이트화 친화성 정제방법에 의해서 정제하였다. 즉, His-결합 수지 슬러리를 증류수를 사용하여 간단히 세척하고 충전완충액(charge buffer; 50mM NiSO₄)을 이용하여 수지에 Ni^2＋양이온을 고정화시켰다. 그후, 5mM의 이미다졸을 함유하는 결합완충액으로 수지를 평형화시키고 실시예 3에서 수득한 배양액의 배지부분과 4℃에서 1시간 동안 세척하여 반응시켰다. 약하게 결합된 단백질들은 결합완충액으로 세척하여 제가하였고 여전히 수지에 결합된 오염 단백질들은 이미다졸의 농도를 100mM 까지 증가시킨 후 세척 완충액으로 세척하여 제거하였다. 1M의 이미다졸을 함유하는 완충액으로 재조합 폴리히스티딘-표지된 단백질 산물을 마지막으로 유리시켰다.

분리된 단백질인 엔도스타틴의 순도는 SDS-PAGE 및 은염색에 의해 분석하였으며, 그 결과는 도 3A에 나타내었다. 또한, 웨스턴 블럿 분석에 의해 정제된 단백질이 목적하는 엔도스타틴과 동일함을 입증하였다(도 3B). 질산은으로 염색된 SDS-PAGE 겔에서 보여지는 오염 단백질이 없는 총 4㎍의 정제된 폴리히스티딘-표지된 엔도스타틴(엔도스타틴-V5-His6)은 8㎖ 배양액의 배지부분에서 얻어졌다. His-표지는 Cu^2＋, Ni^2＋, Co^2＋또는 Zn^2＋와 높은 친화력을 지니는 여섯개의 히스티딘 잔기들로 구성된 짧은 부분이며, 금속킬레이트 친화성 크로마토그라피를 이용하여 복합단백질의 혼합물로부터 융화산물이 분리되도록 만들어 준다(Arnold, FH, Biotechnol 9: 151-156, 1991). 어느 정제단계 전 배양액의 배지부분에 대한 투석과정은 성공적인 친화성 정제를 가능하도록 만들어주었다(도 3의 레인 2). 투석과정 없이 배양액의 배지부분을 사용했을 때, 친화성 정제작업이 잘 이루어지지 않았다. 이것은 아마도 잔여유도체(CuSO₄)가 폴리히스티딘-표지된 엔도스타틴과 더 강한 공동 복합체를 형성했기 때문에 금속킬레이트 친화성 정제가 방해를 받는 것으로 판단된다.

본 발명은 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포를 엔도스타틴 발현플라스미드인 pMT/BiP/E-V5-His를 사용하여 형질전환시켜 엔도스타틴을 효율적으로 발현, 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다. 지금까지 형질전환된 드로소필라 멜라노개스터 S2 세포에서 엔도스타틴을 발현시킨 예는 보고된 바 없으며, 본 발명에 따라 배큘로바이러스에 의한 곤충세포 발현시스템에 비해 월등히 우수한 엔도스타틴의 발현시스템으로서 드로소필라 세포 발현시스템의 잠재적 가능성이 입증된다.

Claims

드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster) S2 세포를 엔도스타틴 발현용 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His로 형질전환시키고, 배양함을 특징으로 하여 재조합 엔도스타틴을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His가 플라스미드 pMT/BiP/V5-His 및 pETKH-1로부터 제조되는 방법.
제 1 항에 있어서, 배양을 넌크 T-플라스크 또는 고애스펙트 회전벽용기를 이용하여 수행하는 방법.
제 1 항에 있어서, 생산된 재조합 엔도스타틴을 Ni^2＋-킬레이트화 친화성 정제방법에 의해 정제하는 방법.
엔도스타틴 cDNA를 함유하는 엔도스타틴 발현용 재조합 플라스미드 pMT/BiP/E-V5-His.