NO323623B1 - Isolert og renset TNF-<alfa>-omdannende enzym (TACE)-polypeptid med evnen til a omdanne TNF-<alfa> fra formen pa 26 kD til formen pa 17 kD, isolerte og rensede antistoffer, fremgangsmate for pavisning av den TACE-inhiberende aktivitet til et molekyl, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertcelle, fremgangsmate for fremstilling av et TNF-<alfa>-omdannende enzym (TACE)- polypeptid, anvendelse av TNF-<alfa>-omdannende enzym (TACE)- polypeptid for fremstilling av et medikament for behandling av tumorer, inflammasjon eller fertilitetsforstyrrelser. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen er rettet mot isolert og 'renset TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid med evnen til å omdanne TNF-a fra formen på 26 kD til formen på 17 kD, isolerte og rensede antistoffer, fremgangsmåte for påvisning av den TACE-inhiberende aktivitet til et molekyl, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertcelle, fremgangsmåte for fremstilling av et TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid, anvendelse av TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid for fremstilling av et medikament for behandling av tumorer, inflammasjon eller fertilitetsforstyrrelser.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Tumornekrosisfaktor-a(TNF-a, også kjent som cachec-tin) er et pattedyrprotein med evnen til å indusere ulike virkninger i flere celletyper. TNF-a ble innledningsvis kjennetegnet ved dets evne til å forårsake lysering av tumorceller og produksjon av aktiverte celler, slik som mononukleære fago-cytter, T-celler, B-celler, mastceller og NK-celler. Det er to former for TNF-a, en type II-membranprotein med relativ molekylmasse på 26.000 (26 kD) og en oppløselig form'på 17 kD frembrakt fra det cellebundende protein ved hjelp av proteolytisk kløyving. TNF-a er en hovedformidler av vertsresponsen mot gram-negative bakterier. Lipopolysakkarid (LPS, også kalt endotoksin), avledet fra celleveggen til gram-negative bakterier er en sterk stimulator av TNF-a-syntese. Ettersom de skadelige virkningene nå kan være resultat av en overproduksjon eller en underregulert produksjon av TNF-a er svært alvorlig, betydelige anstrengelser har vært gjort for å kontrollere eller regulere serumnivået av TNF-a. En viktig del av anstrengelsene for effektivt å kontrollere TNF-a-nivåene har vært å forstå mekanismen ved TNF-a-biosyntese.

Mekanismen for sekresjon av TNF-a har tidligere ikke vært redegjort. Kriegler et al. Cell. 53:45 (1988) har antatt at TNF-a-"sekresjon" skyldtes forandring av det membranbundne molekyl på 2 6 kD ved hjelp av ett til da ukjent proteolytisk enzym eller protease. Sucderi et al. J. Immunology, 243:168

(1989) foreslo at frigjøring av TNF-a fra humane leukocytt-celler var avhengig av én eller flere serinproteaser, f.eks. en leukocyttelastase eller trypsin. En serinproteaseinhibitor, p-toluensulfonyl-L-argininmetylester, var funnet å undertrykke frigjøring av humanleukocytt-TNF-a på en konsentrasjonsavhen-gig måte. Scuderi et. al. foreslo at en argininmetylester konkurrerer om argininbindingssetet i enzymets reaktive senter og på denne måte blokkerer hydrolyse. Lysin og fenylalanin-analoger av inhibitoren viste seg ikke å ha likhet med argininmetylesteren. Det ble imidlertid aldri vist at denne forbindelse virket ved inhibering av en protease som kløyver TNF'en på 26 kD. Mer nylig er det rapportert at metall-proteaseinhibitorer blokkerer frigjøring av TNF fra THP-1-celler. Se Mohler et al. Nature 370:218 (1994); Gearing et al., Nature, 370:555 (1994).

De fleste, men ikke alle proteaser gjenkjenner en spesifikk aminosyresekvens. Enkelte proteaser gjenkjenner primært rester lokalisert N-terminalt for den kløyvde binding, enkelte gjenkjenner rester lokalisert C-terminalt for den kløyvde binding og enkelte proteaser gjenkjenner rester på begge sider av den kløyvde binding. Metallproteaseenzymer gjør anvendelse av et bundet metallion, generelt Zn<2+>, for å kata-lysere hydrolysen av peptidbindingen. Metalloprotease er involvert i ødeleggelse av sammenføyning (matriksmetallpro-tease), blodtrykksregulering (angiotensinomdannende enzym) og regulering av peptidhormonnivåer (nøytral endopeptidase-24.11).

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter et isolert og renset TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid med evnen til å omdanne TNF-a fra formen på 26 kD til formen på 17 kD, kjennetegnet ved at det omfatter en amino-syresekvens som er minst 80 % identisk med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR. 9.

Videre omfatter oppfinnelsen isolerte og rensede antistoffer, kjennetegnet ved at de binder til polypeptidet ifølge oppfinnelsen.

Også omfattet er en fremgangsmåte for påvisning av den TACE-inhiberende aktivitet til et molekyl, kjennetegnet ved at den omfatter blanding av molekylet med et substrat, inkubering av et polypeptid ifølge oppfinnelsen med blandingen og krpmatografisk fastsettelse av substratkløyvingsgraden. •Oppfinnelsen omfatter også en isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved at den er utvalgt fra gruppen bestående av: (a) nukleinsyre .som koder for polypeptidet ifølge foreliggende

.... oppfinnelse

(b) et cDNA omfattende nukleotidene 52-2472 i SEKV. ID NR. 1; (c) en nukleTrisyre som i det minste er 80 % identisk med nukleinsyren i (a) eller (b) og som koder for et polypeptid som forandrer TNF-a fra formen på 26 kD

til formen på 17 kD; og

(d) en nukleinsyre som er degenerert som følge av den genetiske kode til en nukleinsyre som angitt i (a), (b) eller (c) og som koder for et biologisk aktivt TNF-a-omdannende enzym (TACE).

Videre omfatter oppfinnelsen en ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den dirigerer ekspresjonen av en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en vertscelle, kjennetegnet ved at den er transfektert eller transformert med ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av en vertscelle ifølge oppfinnelsen under betingelser som-fremmer ekspresjon, og utvinning av polypeptidet fra kulturmediet.

Til slutt omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid ifølge oppfinnelsen for' fremstilling.av et medikament for behandling av tumorer, inflammasjon eller fertilitetsforstyrrelser.

Foreliggende oppfinnelse omfatter biologisk aktivt TNF-a-omdannende enzym ("TACE") i form av et isolert og renset polypeptid. Dessuten er oppfinnelsen rettet mot isolerte nuk-leinsyrer som koder for TACE og ekspresjonsvektorer omfattende et cDNA som koder for TACE. Innen rammen av oppfinnelsen er vertsceller som.er transfektert eller transformert med ekspresjonsvektorer som omfatter et cDNA som koder for TACE og fremgangsmåter for produksjon av TACE ved hjelp av dyrking av slike vertsceller under betingelser som bidrar til uttrykk av TACE. Rensing av TACE, antistoffer og særlig monoklonale antistoffer mot TACE er et aspekt av oppfinnelsen. Dessuten er analyser der TACE anvendes for å screene etter potensielle inhibitorer derav og fremgangsmåter for anvendelse av TACE som terapeutisk middel for behandling av sykdommer formidlet av cellebundet TNF-a eller andre molekyler omfattet av oppfinnelsen. Andre fremgangsmåter for anvendelse av TACE ved utformingen av inhibitorer derav er også et aspekt ved oppfinnelsen.

Isolert og renset metalloprotease ifølge oppfinnelsen har evnen til å omdanne TNF-a fra den membranbundne form på 26 kD til formen på 17 kD, som har en molekylvekt på mellom ca. 66 kD og ca. 97 kD. cDNA-sekvensen til TACE er vist SEKV. ID NR. 1. Det isolerte og rensede TNF-a^omdannende enzym ("TACE") omfatter aminosyrene 18-824 i SEKV. ID. NR. 2.

Inhibering av TACE hemmer frigjøring av TNF-a til serum og andre ekstracellulære områder ...TACE-inhibitorer kan derfor anvendes klinisk ved behandling av tilstander kjennetegnet ved overproduksjon eller oppregulert produksjon av TNF-a. En særlig anvendbar TACE-inhibitor for visse patologiske tilstander ville selektivt hemme TACE uten å virke inn på TNF-(5 (også kjent som lymfotoksin)-serumnivåer. Overproduksjon eller uregulert produksjon av TNF-a har vært implisert i visse tilstander og sykdommer, f.eks. systemisk betennelsesrespons-syndrom, reperfusjonsskade, kardiovaskulær sykdom, infeksiøse sykdommer, slik som HIV-infeksjon og HIV-neuropati, obstet-riske eller gynekologiske forstyrrelser, inflammatorisk sykdom/autoimmunitet, allergiske/atopiske sykdommer, ondartede tilstander, transplantater, der i blant organtransplantatav-visning eller transplantat- mot -vertsykdom kan genitale, der-matologiske, neurologiske, nyre-, oksisitets- og metabolske/- idiopatiske sykdommer.

Inhibitorer av TACE vil forebygge kløyving av cellebundet TNF-a for derved å redusere nivået av TNF-a i serum og vev. Foreliggende oppfinnelse omfatter en slik utførelsesform og omfatter en fremgangsmåte for hemming av kløyving av TNF-a fra cellemembraner hos et pattedyr omfattende administrering til et slikt pattedyr av en effektiv mengde av en forbindelse som hemmer den TNF-a-proteolytiske aktivitet til et enzym omfattende sekvensen til aminosyrene fra 18 til 671 til 824 i SEKV. ID NR. 2. I tillegg omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av et pattedyr med en sykdom kjennetegnet ved en overproduksjon eller en oppregulert produksjon av TNF-a, omfattende administrering til pattedyret av et preparat omfattende en effektiv mengde av en forbindelse som hemmer den TNF-a-proteolytiske aktivitet til et enzym omfattende sekvensen med aminosyrene 18-824 i SEKV. ID NR. 2. Slike inhibitorer vil være av signifikant klinisk anvendelighet og kunne være potensielle terapier for behandling av ovennevnte TNF-a-relaterte forstyrrelser. Isolering og rensing av TACE ville tilveiebringe en signifikant fordel ved anstrengelsene av å utvikle hemmere av slike enzymer og behandlingen av.TNF-a-for-bundede sykdommer og kunne særlig føre til anvendelse av TACE i seg selv som et terapeutisk middel for visse fysiologiske forstyrrelser. F.eks. i forbindelse med TNF-a kunne andre cytokiner i tillegg til cytokinreseptorer og flere adhesjonsproteiner frigjøres fra celleoverflaten ved hjelp av TACE eller relaterte proteaser. TACE kan administreres for å modulere eller fjerne celleoverflatecytokiner, cytokine reseptorer og adhesjonsproteiner forbundet med tumorcellevekst, betennelse eller fertilisering.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Et cDNA som koder for humant TNF-a-omdannende enzym ("TACE") ble isolert og er vist i SEKV. ID NR. 1. Oppdagelsen av cDNA'et som koder for humant TACE muliggjør konstruksjon av ekspresjonsvektorer omfattende nukleinsyresekvenser som koder for TACE; vertsceller transfektert eller transformert med ekspresjonsvektorene; biologisk aktivt humant TACE i form av isolerte og rensede proteiner; og antistoffer som er immunreaktive med TACE.

Isolerte og rensede TACE-polypeptider ifølge oppfinnelsen er anvendbare for påvisning av den TACE-inhiberende aktivitet til et molekyl. Ved en slik fremgangsmåte som omfatter rutinemessige og vanlige teknikker blandes et molekyl med ukjent TACE-inhibitorisk aktivitet med et substrat og inkuberes med et TACE-polypeptid. Utstrekningen av substrat-kløyving kan så påvises ved hjelp av kromatografi.

TACE-polypeptider ifølge oppfinnelsen er dessuten anvendbare for den strukturbaserte utformingen av en TACE-inhibitor. En slik utforming vil omfatte trinnene med påvisning av den tredimensjonale struktur til et slikt TACE-polypeptid, analyse av den tredimensjonale struktur til de mulige bindingsseter for substrater, syntese av et molekyl som inkorporerer et beskyttende reaktivt sete og påvisning av den TACE-inhiberende aktivitet til molekylet.

Antistoffer som er immunreaktive med TACE og særlig monoklonale antistoffer mot TACE er gjort tilgjengelige gjennom foreliggende oppfinnelse..Slike antistoffer kan være anvendbare ved inhibering av TACE-aktivitet in vivo og for påvisning av tilstedeværelse av TACE i en prøve.

Med begrepet "TACE" som anvendt heri, menes en familie av polypeptider som har evnen til å forandre den cel-lemembranbundne form av TNF-a på 26 kD (som omfatter et intracellulært område, i et membranområde og et ekstracellulært område) til den oppløselige form på 17 kD som omfatter de 156 C-terminale restene til TNF-a-proteinet. TACE omfatter proteiner som har aminosyresekvensen 18 til 824 i SEKV. ID NR. 2, i tillegg til de proteinene som har en stor grad av likhet (minst 80 % og mer foretrukket 90 % homologi) med aminosyresekvensen 18 til 824 i SEKV. ID NR. 2 og der proteinene er biologisk aktive. TACE refererer seg dessuten til de biologisk aktive genproduktene av nukleotidene 52-272 i SEKV. ID NR. 1. Ytterligere omfattet av begrepet "TACE" er de membranbundne proteinene (som omfatter et intracellulært område, et membranområde og et ekstracellulært område) og oppløselige eller avkortede proteiner som primært omfatter den ekstracellulære del av proteinet, som har bevart den biologiske aktivitet og som har evnen til å sekreres. Spesifikke eksempler på slike oppløselige proteiner er de som er omfattet av sekvensen til aminosyrene 18-671 i SEKV. ID NR. 2. Avkortede versjoner er de med mindre enn den ekstracellulære delen av proteinet og som f.eks. omfatter aminosyrene 18-477 i SEKV. ID NR. 2, eller som omfatter i det vesentlige hele de cytoplasmatiske domene, det vil si aminosyrene 215 til 477 i SEKV. ID NR. 2.

Isolert og renset TACE ifølge oppfinnelsen har en molekylvekt på mellom ca. 66 kD og ca. 97 kD som bestemt ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Mer spesifikt ble TACE funnet å ha en molekylvekt på ca. 80 kD som bestemt ved hjelp av SDS-PAGE.

Med begrepet "isolert og renset" som anvendt heri, menes at TACE i det vesentlige er fri for nærvær av andre proteiner eller polypeptider, f.eks. i form av et rensings-produkt av rekombinant vertscellekultur eller i form av et renset produkt fra en ikke-rekombinant kilde. Med begrepet "i det vesentlige renset" som anvendt heri, menes en blanding som inneholder TACE og som i det vesentlige ikke er assosiert med andre proteiner eller polypeptider, men med nærvær av kjente proteiner som kan fjernes ved anvendelse av et spesifikt antistoff og der i det vesentlige renset TACE har bevart biologisk aktivitet. Med begrepet "renset TACE" menes enten den "isolerte og rensede" form av TACE eller den "i det vesentlige rensede" form av TACE, som begge er beskrevet heri.

Med begrepet "biologisk aktivt" når det refereres til TACE, menes at TACE har evnen til å omdanne 26 kD-celleformen av TNF-a til 17 kD-formen.

Men en "nukleotidsekvens" menes et polynukleotid-molekyl i form av et separat fragment eller i form av en bestanddel av en større nukleinsyrekonstruksjon som er avledet fra DNA eller RNA som er isolert minst en gang i i det vesentlige ren form (dvs. som ikke inneholder kontaminerende endogene bestanddeler) og i en mengde eller konsentrasjon som muliggjør identifisering, manipulering og gjenvinning av dets nukleotidsekvenser ved hjelp av vanlige biokjemiske fremgangsmåter (slik som de beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratiry, Cold Spring Harbor, NY (1989). Slike sekvenser tilveiebringes fortrinnsvis i form av en åpen leseramme uavbrutt av interne ikke-translaterte sekvenser eller introner som vanligvis er til stede i eukaryote gener. Ikke-translaterte DNA-sekvenser kan være til stede i 5' eller 3' ende av en åpen leseramme der disse ikke interfererer med manipulasjon eller ekspresjon av det kodende område.

Med en "TACE-variant" som anvendt heri, menes et polypeptid som i det vesentlige er homologt til nativt TACE, men som har en aminosyresekvens som er forskjellig fra den til nativt TACE (human, murin eller andre pattedyrarter) på grunn av en eller flere delesjoner, inversjoner eller substitusjoner. Den varierte aminosyresekvens er fortrinnsvis minst 80 % identisk med en nativ TACE-aminosyresekvens. Mest foretrukket minst 90 % identisk. Den prosentvise likhet kan f.eks. bestemmes ved sammenligning av sekvensinformasjon ved anvendelse av GAP-computerprogrammet, versjon 6.0 beskrevet av Devereux et al. ( Nucl. Acids Res. 12:381, 1984) og tilgjengelig fra University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). GAP-programmet anvender iinjeoppstillingsmetoden til Needleman og Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), revidert av Smith og Waterman ( Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Foretrukne standardparametre for GAP-programmet omfatter: (1) en enhetlig sammenligningsmatriks (inneholdende en verdi på 1 for likheter og 0 for ulikheter) for nukleotider og en avveid sammenligningsmatriks fra Gribskov og Burgess, Nucl. Acids Res. 24:6745, 1986, som beskrevet av Schwartz og Dayhoff, red. At-las of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, s. 353-358, 1979; (2) en straff på 3,0 for hvert gap og en ytterligere straff på 0,10 for hvert sym-bol i hvert gap; og (3) ingen straff for gap i ender.

Varianter kan omfatte konservativt substituerte sekvenser, noe som betyr at en gitt aminosyrerest er byttet ut med en rest med lignende fysiokjemiske karakteristika. Konservative substitusjoner er godt kjent ifølge teknikkens stand og omfatter substitusjon av en alifatisk rest med en annen, slik som Ile, Val, Leu, eller Ala med en annen, eller substitusjoner av en polar rest med en annen, slik som mellom Lys og Arg; Glu og Asp; eller Gin og Asn. Vanlige prosedyrer og fremgangsmåter kan anvendes for å lage og anvende slike varianter. Andre slike konservative substitusjoner, f.eks. substitusjoner av hele områder med lignende hydrofobisitetskarakteristika er godt kjent og utføres rutinemessig. Naturlig forekommende TACE-varianter .er også omfattet av oppfinnelsen. Eksempler på slike varianter er proteiner som er et resultat av alternativ mRNA-spleisingshendelser eller fra proteolytisk kløyving av TACE-proteinet, hvori den TACE-proteolytiske evne er bevart. Alternativ spleising av mRNA kan gi et avkortet, men biologisk aktivt TACE-protein, slik som en naturlig forekommende oppløselig, form av proteinet, f.eks. som vist i SEKV. ID NR. 4. Varianter som skyldes proteolyse omfatter f.eks. forandringer ""i den N- eller C-terminale ende etter uttrykk i ulike vertscelletyper som følge av proteolytisk fjerning av en eller flere terminale aminosyrer fra TACE-proteinet (generelt fra 1-5 terminale aminosyrer) ..

Som beskrevet ovenfor tilveiebringer oppfinnelsen isolerte og rensede eller homogene TACE-polypeptider, både rekombinante og ikke-rekoarbinante. Varianter og derivater av native TACE-proteiner som har bevart den ønskede biologiske aktivitet kan erholdes ved hjelp av mutasjoner i nukleotidsekvenser som koder for native TACE-polypeptider. Forandringer i den native aminosyresekvens kan oppnås ved hjelp av enhver av flere vanlige fremgangsmåter. Mutasjoner kan introduseres i særskilte loci ved hjelp av syntetiserte oligonukleotider inneholdende en mutert sekvens flankert av restriksjonsseter som muliggjør ligering til fragmenter av den native sekvens. Etter ligering koder den resulterende rekonstruerte sekvens for en analog med den ønskede aminosyreinversjon, substitusjon eller delesjon.

Alternativt kan oligonukleotiddirigert setespesifikke mutageneseprosedyrer anvendes for å tilveiebringe et forandret gen hvori forutbestemte kodoner kan forandres ved hjelp av substitusjon-, delesjon eller inversjon. Eksempelvise, fremgangsmåter for utførelse av forandringene beskrevet ovenfor er beskrevet av Walder et al. ( Gene 42:133, 1986); Bauer et al.

( Gene 37:73, 1985); Craik ( BioTechnique. Januar 1985, 12-19); Smith et al. ( Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press 1981); Kunkel ( Proe. Nati. Acad. Sei USA 82:488, 1985); Kunkel et al. ( Methods in Enzymol. 254:367); og US patent nr. 4 518. 584 og 4 737 462.

TACE kan modifiseres for å danne TACE-derivater ved hjelp av dannelse av kovalente eller aggregatkonjugater med andre kjemiske rester, slik som glykosylgrupper, polyetylenglykol (PEG)-grupper, lipider, fosfat, acetylgrupper og lignende. Kovalente derivater av TACE kan fremstilles ved binding av de kjemiske rester til funksjonelle grupper på TACE-aminosyresidekjeder eller i den N-terminale eller C-terminale ende av et TACE-polypeptid eller det ekstracellulære domene derav. Andre TACE-derivater innen rammen av oppfinnelsen omfatter kovalente eller aggregatkonjugater av TACE eller dets fragmenter med andre proteiner eller polypeptider, slik som ved hjelp av syntese i rekombinant kultur i form av N-terminale eller C-terminale fusjoner. Konjugatet kan f.eks. omfatte en signal- eller lederpolypeptidsekvens (f.eks. a-fak-torlederen fra Saccharomyces) i den N-terminale ende av TACE-polypeptidet. Signal- eller lederpeptidet dirigerer kotransla-sjonelt eller posttranslasjonell overføring av konjugatet fra dets syntesesete til et sete inne i eller utenfor cellemembranen eller celleveggen.

TACE-polypeptidkonjugater .kan omfatte peptider tilsatt for å lette rensing og identifisering av TACE. Slike peptider omfatter f.eks. poly-His eller antigenidentifiserings-peptidene beskrevet i US patentnr. 5 Oll 912 og i Hopp et al., Bio/ Technology 5:1204, 1988.

Oppfinnelsen omfatter dessuten TACE-polypeptider med eller uten nativt glykosyleringsmønster. TACE uttrykt i gjær eller pattedyrekspresjonssystemer (f.eks. C0S-7-celler) kan være like eller ubetydelig forskjellig fra et nativt TACE-polypeptid med hensyn til molekylvekt og glykosylerings-mønster, avhengig av valg av ekspresjonssystem. Ekspresjon av TACE-polypeptider i bakterieekspresjonssystemer, slik som E. coli tilveiebringer ikke-glykosylerte molekyler. Glykosylgrupper kan fjernes ved hjelp av vanlige fremgangsmåter, særlig de som gjør anvendelse av glykopepsidase. Generelt kan glykosyl-ert TACE inkuberes med et molart overskudd av glykopepsidase (Boehringer Mannheim).

Like DNA-konstruksjoner som koder for ulike addisjoner eller substitusjoner av aminosyrerester eller - sekvenser, eller delesjoner av terminale eller interne rester, eller sekvenser som det ikke er behov for biologisk aktivitet er omfattet av oppfinnelsen. N-glykosyleringsseter i det ekstracellulære TACE-domene kan f.eks. modifiseres til å utelukke glykosylering, for å tillate ekspresjon av en analog med redusert karbohydrat i pattedyr- og gjærekspresjons-systemer. N-glykosyleringsseter i eukaryote polypeptider er kjennetegnet ved en aminosyretriplett Asn-X-Y, hvori X er enhver aminosyre bortsett fra Pro og Y er Ser eller Thr. Egnede substitusjoner, addisjoner eller delesjoner av nukleotid-sekvensen som koder for disse tripletter vil resultere i forebyggelse av binding av karbohydratrester i ASn-sidekjeden. Forandring av et enkelt nukleotid, valgt slik at Asn f.eks. er byttet ut med en annen aminosyre er tilstrekkelig for å inaktivere et N-glykosyleringssete. Kjente fremgangsmåter for inaktivering av N-glykosyleringsseter i proteiner.omfatter de beskrevet i US patent nr. 5 071 972 og EP 276 846.

I et annet eksempel, kan sekvenser som koder for Cys-rester som ikke er viktige for biologisk aktivitet forandres til å føre til at Cys-rester fjernes eller byttes med andre aminosyrer og for på denne måte å forebygge dannelse av urik-tige intramolekylære disulfidbroer etter renaturering. Andre ekvivalenter fremstilles ved hjelp av modifisering av lignende dibasiske aminosyrerester for å forsterke ekspresjon i gjær-systemer hvorved KEX2-proteaseaktivitet er til stede. EP 212 914 beskriver anvendelsen av setespesifikke mutageneser for å inaktivere KEX-2 proteaseprosesserende seter i et protein. KEX2-proteaseprosesserende seter inaktiveres ved fjerning, tilsetning eller substituering av rester for å forandre Arg-Arg, Arg-Lys og Lys-Arg-par for å fjerne tilstedeværelsen av disse lignende basiske restene. Lys-Lys-par er betydelig mindre mottakelig for KEX2-kløyving og forandring av Arg-Lys eller Lys-Arg til Lys-Lys representerer en konservativ og foretrukken tilnærming for inaktivering av KEX2-seter.

Nukleinsyresekvenser innen rammen av oppfinnelsen omfatter isolerte DNA- og RNA-sekvenser som hybridiserer til de native TACE-nukleotidsekvensene beskrevet heri under betingelser med moderat eller høy stringens og som koder for biologisk aktivt TACE. Betingelser i form av moderat stringens, som kjent av vanlige fagfolk på området og som er definert av Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 red. Vol. 1, s. 1,101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, omfatter anvendelse av en forvaskoppløsning bestående av 5 X SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) og hybridiserings-betingelser på ca. 50 °C - 60 °C, 5 X SSC, over natt, for-rinnsvis 55 °C. Betingelser med høy stringens omfatter høyere hybridiserings- og vaskingstemperaturer. En fagmann på området vil vite at temperaturen og saltkonsentrasjonen i vaskeoppløs-ningen kan justeres dersom dette er nødvendig ifølge faktorer, slik som probelengden.

Som følge av den kjente degenereringen av den genetiske kode hvori mer enn ett kodon kan kode for samme aminosyre kan en DNA-sekvens variere fra det som er vist i SEKV. ID NR. 1 og fortsatt kode for et TACE-protein med aminosyresekvensen i SEKV. ID NR. 2. Slike varierende DNA-sekvenser kan være et resultat av stille mutasjoner (f.eks. som skjer i løpet av PCR-amplifisering) eller som kan være produktet av utilsiktet mutagenese av en nativ sekvens.

Oppfinnelsen tilveiebringer således ekvivalent isolerte DNA-sekvenser som koder for biologisk aktivt TACE, utvalgt fra (a) det kodende område til et nativt pattedyr-TACE-gen; (b) cDNA omfattende nukleotidsekvens vist i SEKV. ID NR. 1; (c) DNA som har evnen til å hybridisere til et DNA ifølge (a) under moderate stringensbetingelser og som koder for biologisk aktivt TACE; og (d) DNA som er degenerert som et resultat av den genetiske kode til et DNA som er definert i (a), (b) eller (c) som koder for biologisk aktivt TACE. TACE-proteiner som er kodet av slike DNA-ekvivalente sekvenser er omfattet av oppfinnelsen.

DNA som tilsvarer DNA-sekvensen i SEKV. ID NR. 1 vil hybridisere under moderate stringens- eller høye stringensbetingelser til den dobbelttrådete native DNA-sekvensen som koder for polypeptider omfattende aminosyresekvensene fra 18 - Xaa i SEKV. ID NR. 2, hvori Xaa er en aminosyre fra 671 til 824. Eksempler på TACE-proteiner som er kodet av slikt DNA omfatter, men er ikke begrenset til, TACE-fragmenter (opp-løselige eller membranbundede) og TACE-proteiner omfattende inaktivert(e) N-glykosyleringssete(er), inaktivert KEX2-proteaseprosesseringssete(er) eller konservativ(e) amino-syresubstitusjon(er), som beskrevet ovenfor. TACE-proteiner som er kodet av DNA avledet fra andre pattedyrarter, hvori DNA<1>et vil hybridisere under moderate eller høye stringensbetingelser til den komplementære tråd til cDNA'et i SEKV. ID NR. 1 også ble omfattet.

Alternativt kan TACE-bindende proteiner, slik som anti-TACE-antistoffene ifølge oppfinnelsen, bindes til en fast fase slik som en kolonnekromatografimatriks eller et lignende substrat egnet for identifisering, separering og rensing av celler som uttrykker TACE på deres overflate. Binding av TACE-bindende proteiner til en fast bindende overflate kan utføres ved hjelp av enhver fremgangsmåte, f.eks. kan magnetiske mik-rokuler belegges med TACE-bindende proteiner og holdes i inku-beringskaret ved hjelp av et magnetfelt. Cellesuspensjonsblan-dinger kan bringes i kontakt med den faste fase som har TACE-bindende proteiner på. Celler med TACE på overflaten binder til det fikserte TACE-bindende protein og ubundne celler kan så vaskes bort. Denne affinitetsbindingsfremgangsmåte er anvendbar for rensing, screening eller separering av slike TACE-uttrykkende celler fra løsning. Fremgangsmåter for frigjøring av positivt selekterte celler fra den faste fase er kjent ifølge teknikkens stand og omfatter f.eks. anvendelse av enzymer. Slike enzymer er fortrinnsvis ikke-toksiske og ikker skadelige for cellene og dirigeres fortrinnsvis mot kløyving av den celleoverflatebindende partner.

Alternativt kan blandinger av celler som er antatt å inneholde TACE-uttrykkende celler først inkuberes med et biotinylert TACE-bindende protein. Inkuberingsperioder varer vanligvis minst i en time for å sikre tilstrekkelig binding til TACE. Den resulterende blanding føres så gjennom en kolonne pakket med avidinbelagte kuler, hvorved den høye af-finiteten biotin har for avidin tilveiebringer binding av TACE-bindende celler til kulene. Anvendelse av avidinbelagte kuler er kjent ifølge teknikkens stand. Se Berenson, et al. J. Cell Biochem., 10D:239 (1986). Vask av ubundet materiale og frigjøring av de bundete celler utføres ved anvendelse av vanlige fremgangsmåter. - . Ved . fremgangsmåten beskrevet ovenfor er egnede TACE-proteiner anti-TACE-antistoffer og andre proteiner som har evnen til binding av TACE med høy affinitet. Et foretrukket TACE-bindende protein er et anti-TACE-monoklonalt antistoff, f.eks. oppnådd som beskrevet i eksempel 4. ..TACE-polypeptider kan eksistere i form av oligomerer, slik som kovalentbundne eller ikke-kovalentbundete dimerer eller trimeref. Oligomerer kan bindes ved hjelp avdisulfid-bindinger dannet mellom cysteinrester. på ulike TACE-polypeptider. Ved en utførelsésform av oppfinnelsen er en TACE-dimer dannet ved fusjon av TACE til- .Fc-området til et antistoff (f.eks. IgGl) på en måte som ikke interfererer med den biologiske aktivitet til TACE. Fc-polypeptidet fusjoneres fortrinnsvis til den C-terminale ende til et oppløselig TACE (omfattende kun det ekstracellulære domene). Generell fremstilling av fusjonsproteiner omfatter heterologe polypeptider fusjonert med ulike deler av anti-stoff-avledede polypeptider (deriblant Fc-domene) er beskrevet, f.eks. av Ashkenazi et al.

( PNAS USA 88:10535, 1991) og Bryn et al. Nature. 344:677, 1990). En genfusjon som koder for TACE:Fc-fusjonsproteinet innsettes inn i en egnet ekspresjonsvektor. TACE:Fc-fusjons-proteinene tillates å settes sammen på en lignende måte som antistoffmolekyler, hvorved interkjededisulfidbindinger dannes mellom Fc-polypeptider, noe som gir divalent TACE. Dersom fus-jonsproteinene iages med både tunge og lette kjeder til et antistoff er det mulig å danne én TACE-oligomer med så mange som fire TACE-ekstracellulære områder. Alternativt kan man binde to oppløselige TACE-domener med en peptidkobler.

Rekombihante ekspresjonsvektor inneholdende .en nukleinsyresekvens som koder for TACE kan fremstilles ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. Ekspresjonsvektorene omfatter en TACE-DNA-sekvens operativt bundet til egnede transkripsjonene eller translasjonene regulatoriske nukleotidsekvenser, slik som de avledet fra et pattedyr- mikrobielt-, viralt-eller insektgen. Eksempler på regulatoriske sekvenser omfatter transkripsjonene promoterer, operatører eller enhancere, et mRNA-ribosomalt bindingssete og egnede sekvenser som kontrollerer transkripsjons- og translasjonsinitiering og -termin-ering. Nukleotidsekvenser er "operativt bundet" når den regulatoriske sekvens forholder seg funksjonelt til TACE-DNA-sekvensen . En promoternukleotidsekvens er således operativt bundet til en TACE-DNA-sekvens dersom promoternukleotidsekven-sen kontrollerer transkripsjonen av TACE-DNA-sekvensen. Evnen til å replikere i de ønskede vertsceller, vanligvis gitt i form av et replikasjonsorigo og et seleksjonsgen hvorved transformanter identifiseres, kan dessuten innføres i ekspresjonsvektoren.

Sekvenser som koder for egnede signalpeptider som ikke er naturlig forbundet med TACE kan dessuten innføres i ekspresjonsvektorer. En DNA-sekvens til et signalpeptid (se-kretorisk leder) kan f.eks. fusjoneres i leseramme til TACE-sekvensen slik at TACE translateres innledningsvis som et fus-jonsprotein omfattende signalpeptidet.. Et signalpeptid som er funksjonelt i de ønskede vertsceller forsterker ekstracellulær sekresjon av TACE-poiypeptidet. Signalpeptidet kan kløyves fra TACE-polypeptidet etter sekresjon avTACE fra cellen.

Egnede vertsceller for ekspresjon av TACE-polypeptider omfatter prokaryoter, gjær- eller høyere eukaryote celler. Egnede klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterie-, sopp-, gjær- og pattedyrvertsceller er f.eks. beskrevet i Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). Cellefrie translasjonssys-temer kan også anvendes for å produsere TACE-polypeptider ved anvendelse av RNA avledet fra DNA-konstruksjoner beskrevet heri.

Prokaryoter omfatter gram-negative eller gram-positive organismer, f.eks. E. coli eller Bacilli. Stabile prokaryote vertsceller for transformasjon omfatter f.eks. E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium og ulike andre arter innen slektene Pseudomonas, Streptomyces, og Staphyloco-ccus. I en prokaryot vertscelle, slik som E. coli kan et TACE-polypeptid omfatte en N-terminal metioninrest for å lette ekspresjon av det rekombinante polypeptid i den prokaryote vertscelle. Den N-terminale Met kan kløyves fra det uttrykte rekom-

binante TACE-polypeptid.

Ekspresjonsvektorer for anvendelse i prokaryote vertsceller omfatter generelt ett eller flere fenotypisk selekterbare markørgener. Et fenotypisk selekterbart markørgen er f.eks. et gen som koder for et protein som overfører antibiotikaresistens eller som supplerer et autotroft behov. Eksempler på anvendbare ekspresjonsvektorer for prokaryote vertsceller omfatter de avledet fra kommersielt tilgjengelige plasmider, slik som kloningsvektoren pBR322 (ATCC 370017). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetrasyklinresis-tens og tilveiebringer således enkle fremgangsmåter for identifisering av transformerte celler. For å konstruere en ekspresjonsvektor ved anvendelse av pBR322 settes en egnet promoter og en TACE-DNA-sekvens inn i pBR322-vektoren. Andre kommersielt tilgjengelige vektorer omfatter f.eks., pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA).

Vanlige anvendte promotersekvenser for rekombinante prokaryote vertscelleekspresjonsvektorer omfatter p-laktamase (penicillinase), laktosepromotersystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978; og Goeddel et al., Nature 281:544, .1979), tryp-tofan (trp)-promotersystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; og EP-A-36776) og tac-promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 412, 1982). Et særlig anvendbart prokaryot vertscelleekspresjonssystem gjør anvendelse av en fag-X pL-promoter og en cI857ts termolabil repressorsekvens. Plasmid-vektorer tilgjengeliggjør fra American Type Culture Collection som inkorporerer derivater av X PL-promoteren omfatter plasmid pHUB2 (resistent i E. coli-stamme JMB9 (ATCC 37092)) og pPLc28 (resistent i E. coli RR1 (ATCC 53082)).

TACE-polypeptider kan alternativ uttrykkes i gjær-celler, fortrinnsvis fra Saccharomyces-slekten (f.eks. S. cerevisiae). Andre gjærslekter, slik som Pichia, K Lactis eller Kluyveromyces, kan også anvendes. Gjærvektorer vil ofte inneholde en replikasjonsorigisekvens fra et 2u gjærplasmid, en autosomalt replikerende sekvens (ARS), et promoterområde, sekvenser for polyadenylering, sekvenser for transkripsjons-terminering og et selekterbart markørgen. Egnede promotersekvenser for gjaervektorer omfatter, blant annet promoterer for metallotionein,3-fosfoglyseratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2013, 1980) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968 og Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvat dekarboksylase, fosfofruktokinase, glykose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglycerat rautase, pyruvat kinase, triosefosfatisomerase, fofoglukose-isomerase og glukokinase. Andre egnede vektorer og promotere for anvendelse ved gjærekspresjon er i tillegg beskrevet i (Hitzeman, EPA-73,657 eller i Fleer et. al.; Gene, 107:285-195

(1991); og van den Berg et. al., Bio/' Technology, 8:135-139

(1990) . Et annet alternativ er den glukoseansvarlige ADH2-promoteren beskrevet av Russel et al. ( J. Biol. Chem. 258:2614, 1982) og Beier. et al. ("Nature 300:124, 1982). Skyt-telvektorer som kan replikere i både gjær og E. coli kan konstrueres ved innsetting av DNA-sekvenser fra pBR322 for seleksjon og replikasjon i E. coli (Amp<r->gen og replikasjonsorigo) inn i de ovenfor beskrevne gjærvektorer.

Gjær-a-faktorledersekvensen kan anvendes for å diri-gere sekresjon av et TACE-polypeptid. a-faktorledersekvensen settes ofte inn mellom promotersekvensen og den strukturelle gensekvens. se f.eks. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:5330, 1984; US patent nr. 4 546 082; og EP 324 274. Andre ledersekvenser som er egnet for å fremme sekresjon av rekombinante polypeptider fra gjærverter er kjent for fagfolk på området. En ledersekvens kan modifiseres nær dets 3' ende til å inneholde ett eller flere restriksjonsseter. Dette vil fremme fusjon av ledersek-vensen til det strukturelle gen.

Gjærtransformasjonsprosedyrer er kjent for fagfolk på området. En slik prosedyre er beskrevet av Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:1929, 1978. Hinnen et al.-prosedyren selekterer for Trp<+->transformanter i et selektivt medium, hvori det selektrive medium består av 0,67 % gjær-nitrogenbase, 0,5 % casaminosyrer, 2 % glukose, 10 ug/ml adenin og 20 ug/ml uracil.

Gjærvertsceller transformert med vektorer inneholdende ADH2-promotersekvensen kan dyrkes for å indusere ekspresjon i et "rikt" medium. Et eksempel på et rikt medium er ett som består av 1 % gjærekstrakt, 2 % pepton og 1 % glukose supplert med 80 ug/ml adenin og 80 ug/ml uracil. Derepresjon av ADH2-promoteren skjer når glukose er oppbrukt i mediet.

Pattedyr- eller insektvertscellekultursystemer kan også anvendes for å uttrykke rekombinante TACE-polypeptider. Baculovirussystemer for produksjon av heterologe proteiner i insektceller er beskrevet av Luckow og Summers, Bio/ Technology 6:41 (1988). Etablerte cellelinjer med pattedyropprinnelse kan også anvendes. Eksempler på egnede pattedyrvertscellelinjer omfatter COS-7-linjen fra apenyreceller (ATCC CRL 1651) (Glu-zman et al., Cell 23:115, 1981), L-celler, C127-celler, 3T3 celler (ATCC CCL 163), kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler, HeLa-celler og BHK (ATCC CRL 10)-celleliner og CV-l/EBNA-1-cellelinjen avledet fra den afrikanske grønnapenyrecellelinjen CVKATCC CCL 70) som beskrevet av McMahan et al. ( EMBO J. 10:2821, 1991) .

Transkripsjonale og translasjonale kontrollsekvenser for pattedyrvertscelleekspresjonsvektorer kan tas ut av virale genomer. Vanligvis anvendte promotersekvenser og enhancersek-venser er avledet fra polyomavirus, adenovirus 2, apevirus 4 0 (SV40), og humancytomegalovirus. DNA-sekvenser avledet fra SV40 viralt genom, f.eks. SV40 replikasjonsorigo, tidlig og sen promoter, enhancer, spleise og polyadenyleringsseter kan anvendes for å tilveiebringe andre genetiske elementer for ekspresjon av en strukturell gensekvens i en pattedyrverts-celle. Virale tidlige og sene promotere er særlig anvendbare ettersom begge lett kan erholdes fra et viralt genom i form av et fragment som også kan inneholde et viralt replikasjonsorigo (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Mindre eller større SV4 0-fragmenter kan også anvendes, forutsatt at ca. 250 bp av sekvensen som strekker seg fra Hind III-sete til Bgl I-sete lokalisert hvori SV40 viralt replikasjonsorigosete er inkludert.

Eksempelvise ekspresjonsvektorer for anvendelse i pattedyrvertsceller kan konstrueres som beskrevet av Okayama og Berg ( Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Et anvendbart system for stabil høynivåekspresjon av pattedyr cDNA i murine C127-pattedyrepitelceller kan lages i det vesentlige som- beskrevet av Cosman et ål. ( Mol. Immunol. 23:935, 1986). En anvendbar høyekspresjonsvektor, PMLSV N1/N4, beskrevet av Cosman et al., Nature 312:168, 1984 .er deponert som ATCC 39890. Ytterligere anvendbare pattedyrekspresjonsvektorer er beskrevet i EP-A-0367566.og i _US patentsøknad nr. 07/701 415 innlevert 16. mai 1991. Vektorene kan avledes fra retrovirus. På plassen for den native signalsékvensen kan en heterolog signalsekvens til-føres, slik som signalsékvensen til IL-7 beskrevet i US patent nr. 4 965 195; signalsékvensen for IL-2-reseptor beskrevet i Cosman et al., Nature 312:168 (1984); IL-4-signalpeptidet beskrevet i EP 367 566; type I-IL-l-reseptorsignalpeptidet beskrevet i US patent 4 968 607; og type II-IL-l-reseptorsignalpeptidet beskrevet i EP 460 846.

Et isolert og renset TACE-protein ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av rekombinante ekspresjonssystemer som beskrevet ovenfor eller renses fra naturlig forekommende celler. TACE kan i det vesentlige renses i form av indikasjon av et enkelt proteinbånd etter analyse ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). En fremgangsmåte for produksjon av TACE omfatter dyrkning av vertsceller transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens som koder for TACE under betingelser som er tilstrekkelige for å fremme ekspresjon av TACE. Deretter gjenvinnes fra TACE kulturmediet elier celleekstrakter, avhengig av anvendt ekspresjonssystem. Som kjent for en fagmann på området vil prosedyrer for rensing av rekombinant protein variere i hen-hold til slike faktorer som typen av vertsceller som er anvendt og hvorvidt eller ikke det'rekombinante protein.sekreres inn i kulturmediet. Når ekspresjonssystemer som sekrerer det rekombinante protein anvendes kan f.eks. kulturmediet først konsentreres ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentrasjonsfilter, f.eks. en Amicon eller Millipore Pellicon ultrafiltreringsenhet1 Etter konsentrasjonstrinnet kan konsentratet tilføres til en renselsesmatriks, slik som et gelfiltreringsmedium. Alternativt kan et anionbytterresin anvendes, f.eks. en matriks eller et substrat med påhengte dietylaminoetyl (DEAE)-grupper. Matriksene kan være akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre typer som vanligvis anvendes ved proteinrensing. Alternativt kan et kationbytter-trinn anvendes. Egnede kationbyttere omfatter ulike uoppløse-lige matrikser omfattende sulfopropyl- eller karboksymetyl-grupper. Sulfopropylgrupper er foretrukket. Til slutt kan ett eller flere reversert fasehøyprestasjonsvæskekromatografi (RP-HPLC)-trinn ved anvendelse av hydrofobt RP-HPLC-medium (f.eks. silikagel med påhengte metyl- eller andre alifatiske grupper) anvendes for ytterligere å rense TACE. Enkelte eller alle av de foregående rensingstrinn i ulike kombinasjoner er godt kjent og kan anvendes for å tilveiebringe et isolert og renset, rekombinant protein.

I tillegg til rekombinant redusert TACE kan TACE isoleres og renses fra en aktivert monocyttcellelinje, THP-1. THP-l-celler produserer vanligvis mer TNF-a enn HL-60-celler og er en foretrukken kilde for TACE. Andre kilder for TACE kan anvendes og TACE kan også finnes i andre, celletyper som produserer TNF-a. Etter at en kilde for TACE er.identifisert kan TACE isoleres og renses først eventuelt å stimulere cellekil-den til å produsere TNF-a. Stimulering trenger ikke å være nødvendig, men det kan imidlertid gjøres ved anvendelse av teknikken som er godt kjent ifølge teknikkens stand. Så høs-tes, vaskes cellene og plasmamembraner isoleres ifølge vanlige fremgangsmåter. I en særlig foretrukken fremgangsmåte for isolering av plasmamembranene er fremgangsmåte nummer tre som beskrevet i Maeda et. al., Biochim. et Biophys. Acta, 731:115

(1983); bortsett fra at ditiotreitol ikke bør inkluderes i denne fremgangsmåten etter det ble påvist at ditiotreitol blokkerer TACE-aktivitet. Proteiner fra cellemembranen kan så oppløses ved suspensjon av membranpreparatet i en fortynnende oppløsning av ikke-ionisk detergent, etterfulgt av en kort homogenisering. Fosfolipider kan så ekstraheres ved anvendelse av vanlige fremgangsmåter. Det er mulig å anvende en affinitetskolonne omfattende et TACE-bindende protein for affinitetsrensing av uttrykte TACE-polypeptider. TACE-polypeptider kan fjernes fra en affinitetskolonne ved anvendelse av vanlige fremgangsmåter, f.eks. i en elueringsbuffer med mye salt for så å dialyseres i en buffer med mindre salt for anvendelse eller ved hjelp av forandring av pH eller andre komponenter avhengig av anvendt affinitetsmatriks. Eksempel 4 beskriver en fremgangsmåte for anvendelse av TACE ifølge oppfinnelsen for å generere monoklonale antistoffer rettet mot TACE. Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur isoleres vanligvis ved hjelp av en innledningsvis ødeleggelse av vertscellene, sentrifugering, ekstraksjon fra cellepelleter dersom det er et uoppløselig polypeptid, eller fra super-natantvcesken dersom det er et oppløselig polypeptid, etterfulgt av ett eller flere trinn med konsentrasjon, utsalting, ionebytte, affinitetsrensing eller størrelseseksklusjons-kromatografi. RP-HPLC kan til slutt anvendes for endelige rensingstrinn. Mikrobeceller kan ødelegges ved hjelp av enhver egnet fremgangsmåte,. der i blant frysetinésyklus, sonikering, mekanisk ødeleggelse eller ved anvendelse av cellelyserings-midler. Transformerte gjærvertsceller anvendes fortrinnsvis for å uttrykke TACE i form av et sekrert polypeptid for å lette rensing. Sekrert, rekombinant polypeptid fra en gjær-vertscelle fermentering kan renses ved hjelp av fremgangsmåter som er lik de beskrevet av Urdal et al. ( J. Chromatog. 296:111, 1984) . Urdal et al. beskriver to sekvensielle, revers-fase HPLC-trinn for rensing av rekombinant, humant IL-2 på en preparativ HPLC-kolonne. Antisense eller sensoligonukleotider omfattende en enkelttrådet nukleinsyresekvens (enten RNA eller DNA) som har evnen til å binde til en mål-TACE mRNA-sekvens (danne en dupleks) eller så kan TACE-sekvensen i den dobbelttrådete DNA-heliksen (som danner en trippel heliks) fremstilles ifølge oppfinnelsen. Antisense- eller sensoligonukleotider, ifølge oppfinnelsen, omfatter et fragment av det kodende område til TACE-cDNA. Et slikt fragment omfatter generelt minst ca. 14 nukleotider, fortrinnsvis fra ca. 14 til ca. 30 nukleotider. Evnen til å danne et antisense- eller sensoligonukleotid, basert på en cDNA-sekvens for et gitt protein er f.eks. beskrevet i Stein og Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 og van der Krol et al., BioTechniques 5:958, 1988. Binding av antisense- eller sensoligonukleotider til målnukleinsyresekvenser fører til dannelse av komplekser som blokkerer translasjon (RNA) eller transkripsjon (DNA) på en eller flere måter, deriblant forsterket degradering av duplek-sene, prematurterminering av transkripsjon eller translasjon eller på andre måter. Antisensoligonukleotidene kan således anvendes for å blokkere ekspresjon av TACE-proteiner. Antisense- eller sensoligonukleotider omfatter dessuten oligonukleotider med modifiserte sukker-fosfodiesterryggrader (eller andre sukkerbindinger, slik som de beskrevet i WO91/06629) og hvori slik sukkerbindinger er resistente mot endogene nukle-aser. Slike oligonukleotider med resistente sukkerbindinger er stabile in vivo (dvs. de har evnen til å motstå enzymatisk degradering), men bevare sekvensspesifisitet for å ha evnen til å binde til målnukleotidsekvenser. Andre eksempler på sens- eller antisensoligonukleotider omfatter de oligonukléo-tidene som er kovalente bundet til organiské rester, slik som de beskrevet i WO 90/10448 og andre rester som økt affinitet til oligonukleotidet for en målnukleotidsekvens, slik som poly-(L-lysin). Dessuten kan fortsatt interkalerende midler, slik som ellipticin og alkylerende midler eller metallkomplek-ser bindes til sens- eller antisensoligonukleotider for å modifisere bindingsspesifisitéter til antisense- eller sens-oligonukleotidet for målnukleotidsekvensen. Antisense- eller sensoligonukleotider kan introduseres inn i en celle inneholdende målnukleinsyresekvensen ved hjelp av enhver genoverføringsmetode, deriblant f.eks. CaP04-formidlet DNA-transfeksjon, elektroporering eller ved anvendelse av genoverføringsvektorer, slik som Epstein-Barr-virus. Antisense- eller sensoligonukleotider introduseres fortrinnsvis inn i en celle inneholdende målnukleotinsyresekvensen ved insersjon av antisense- eller sensologonukletidet inn i en egnet retrovirusvektor, cellen bringes i kontakt med retro-virusvektoren inneholdende den innsatte sekvens, enten in vivo eller ex vivo. Egnede retrovirusvektorer omfatter, men er ikke begrenset til, murin retrovirus M-MuLV, N2 (en retrovirus avledet fra M-MuLV) eller dobbeltkopivektorene kalt DCT5A, DCT5B og DCT5C (se PCT søknad US 90/02656). Sens- eller antisensoligonukleotider kan også introduseres inn i en celle inneholdende målnukleotidsekvensen ved dannelse av et konjugat med et ligandbindende molekyl, som beskrevet i WO 91/04753. Egnede ligandbindende molekyler omfatter, men er ikke begrenset til, celleoverflatereseptorer, vekstfaktorer, andre cytokiner eller andre ligander som binder til celleoverflatereseptorer. Konjugering av det ligandbindende molekyl bør fortrinnsvis ikke i det vesentlige inter-ferere med evnen det ligandbindende molekyl har til å binde til dets tilsvarende molekyl eller reseptor, eller blokkere overføring av sens- eller antisensoligonukleotidet eller dets konjugerte utgave inn i cellen. Alternativt kan et sens- eller antisensoligonukleotid introduseres inn i en celle inneholdende målnukleinsyresekvens ved dannelse av et oligonukleotidlipidkompleks, som beskrevet i WO 90/104 448. Dette sens- eller antisensoligonukleotid-lipidkomplekset dissosieres fortrinnsvis innen cellen ved hjelp av en endogen lipase. Isolert og renset TACE eller et fragment derav, og særlig det ekstracellulære domene til TACE kan også være anvendbart i seg selv som et terapeutisk middel for regulering av nivåene av visse celleoverflateproteiner. I tillegg til TNF-a kan andre cytokiner i tillegg til cytokine reseptorer og flere adhesjonesproteiner frigjøres fra celleoverflaten ved hjelp av TACE eller relaterte proteaser. TACE eller et fragment derav, særlig det ekstracellulære domene til TACE kan administreres for å modulere eller fjerne celleoverflatecytokiner, cytokine reseptorer og adhesjonsproteiner forbundet med tumorcellevekst, betennelser eller fertilisering. TACE kan formuleres inn i farmasøytiske preparater ifølge kjente fremgangsmåter når det anvendes som et terapeutisk middel. TACE kan kombineres i blanding, enten i form av den eneste aktive bestanddel eller med andre kjente aktive bestanddeler, med farmasøytisk egnede fortynningsmidler (f.eks. Tris-HCl, acetat, fosfat), konserveringsmidler (f.eks. Timerosal, ben-zylalkohol, parabener), emulgatorer, oppløsningsmidler, adjuvanser og/eller bærere. Egnede bærere og deres formu-leringer er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. "red..1980. Mack Publishing Co. Slike preparater kan dessuten .innenoTdé TACE i kompleks med polyetylenglykol (PEG), metallionér eller inkorporert inn i polymere forbindelser, slik som pol-yeddiksyre, polyglykolsyre, hydrogeler, etc. eller inkorporeres i .llposomer, mikroemulsjoner, miceller, unilamel-lære-eller multilamellære vehikler, eukaryote spøkelser eller sferoblaster. - Slike preparater vil influere på den fysiske tilstand, oppløselighet, stabilitet, grad av in vivo-fri-gjøring og grad av in vivo- fjerning av TACE. .TACE"-.kan analyseres ved anvendelse av enhver av flere metalloproteaseånalyser kjent ifølge teknikkens stand. Generelt kan TACE analyseres ved anvendelse av et peptidsubstrat som representerer det naturlige kløyvingssete til TNF-a. For å påvise kløyvingen av et substrat ved hjelp av TACE kan f.eks. substratet merkes med en fluorescerende gruppe på en side av kløyvingssetet og med en fluorescerenslukkende gruppe på mot-satt side av kløyvingssetet. Etter kløyving av TACE elimineres slukkingen for på denne måte å tilveiebringe et påviselig signal. Substratet kan alternativt merkes med en kolometrisk frigjørende gruppe som absorberes sterkere etter kløyving. Alternativt kan substratet ha en tioestergruppe syntetisert inn i kløyvingssetet til substratet slik at etter kløyving med TACE er tiolgruppen fortsatt til stede og kan med letthet påvises ved anvendelse av vanlige fremgangsmåter. En særlig foretrukket fremgangsmåte for påvisning av TACE-aktivitet i en prøve, er beskrevet i eksempel 1 nedenfor. Andre fremgangsmåter for påvisning av TACE-aktivitet kan anvendes uten å måtte gjøre unødvendig eksperimentering. En kvantitativ analyse med hensyn til. TACE., .som dessuten er beskrevet i eksempel 1 nedenfor, kan også anvendes der analysen omfatter inkubering av peptidsubstratet ved ca. 1 mM med TACE ved 37 °C for en fastsatt tidsperiode; stopp av reaksjonen ved tilføring av en syre eller metallchelator; og påvisning av kløyvingsnivået ved hjelp av HPLC-analyse. Innen rammen av oppfinnelsen kan TACE og peptider basert på aminosyresekvensen til TACE anvendes for å.fremstil-le antistoffer som spesifikt binder TACE. Et eksempel på et slikt antistoffpreparat er beskrevet i eksempel 4. Med begrepet "antistoffer" er det ment å omfatte polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer, fragmenter derav, slik som F(ab')2 og Fab-fragmenter i tillegg til enhver bindingspartner som er rekombinant fremstilt. Antistoffer er angitt å ha spesifikk binding dersom de binder TACE med ka større enn eller lik ca. IO<7> M"<1>. Affiniteter til bindingspartnere eller antistoffer kan med letthet påvises ved anvendelse av vanlige fremgangsmåter, f.eks. de beskrevet i Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sei., 51:660 (1949). Polyklonale antistoffer kan lett genereres fra ulike kilder, f.eks. hest, ku, geit, sau, hund, kylling, kanin, mus eller rotter, ved anvendelse av fremgangsmåte som er godt kjent ifølge teknikkens stand. Generelt kan renset TACE eller et peptid basert på aminosyresekvensen til TACE som er for-målstjenelig konjugert administreres topisk til vertsdyret Ved hjelp av parenteral injeksjon.. Immunogenisitetén til TACE kan forsterkes ved anvendelse av.en adjuvans, -f..eks. Freund's fullstendige eller ufullstendige adjuvans.. Etter innsprøy-tingsimmuniseringer samles små serumprøver og testes med hensyn til reaktivitet mot TACE eller TACE-peptider. Eksempler på ulike analyser som kan anvendes for slik påvisning omfatter de beskrevet i: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Lane (red.), Cold Spring Harbor Laoratory Press, 1988; i tillegg til fremgangsmåter, slik som motstrømsimmunoelektroforese (CIEP), radioimmunanalyse, radioimmunutfelling, "enzyme-linked immuno-sorbent assays" (ELISA), dot blot analyser og "sandwich" analyser, se US patent nr. 4 376 110 og 4 486 530. Monoklonale antistoffer kan med letthet fremstilles ved anvendelse av velkjente fremgangsmåter, se f.eks. prosedyrene beskrevet i US patent nr. 32 011, 4 902 614, 4 543 439 og 4 411 993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimen-sion in Biological Analyses, Plenum Press,1 Kennett, McKearn, og Bechtol (red.), 1980; I korte trekk injiseres vertdyrene, slik som mus, intraperitonealt minst én gang og fortrinnsvis minst to ganger i intervaller på ca. 3 uker med isolert og renset TACE eller konjugert TACE-peptid, eventuelt i nærvær av en adjuvans. Museserum analyseres så ved hjelp av vanlig dot blot teknikk eller antistoffinnfanging (ABC) for å bestemme hvilket dyr som er best til å fusjonere. Omtrent 2 til 3 uker senere gis musen en intravenøs innsprøytning av TACE eller konjugert TACE-peptid. Senere avlives musen og miltceller fusjoneres med kommersielt tilgjengelige myelomceller, slik som Ag8.653 (ATCC) ifølge etablerte fremgangsmåter. I korte trekk vaskes myelomcellene flere ganger i medium og fusjoneres til musemiltceller i en grad på ca. tre miltceller til en myelomcelle. Fusjonsmidler kan være et hvert egnet middel anvendt ifølge teknikkens stand, f.eks. polyetylenglykol (PEG). Fusjoner plates ut på plater inneholdende medium som tillater selektiv vekst av de fusjonerte celler. De fusjonerte celler kan så tillates å gro i ca 8 dager. Supernatanter fra de resulterende hybridomer samles og tilføres til en plate som først er dekket med geitantimuse lg. Etter flere vasker til-settes merking, slik som <125>I-TACE til hver brønn etterfulgt av inkubering. Positive brønner kan så påvises ved hjelp av autoradiografi. Positive kloner kan dyrkes i satsvise kulturer og supernatanter renses deretter over en protein-A-kolonne (Pharmacia) . De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen kan produseres med anvendelse av alternative fremgangsmåter, slik som de beskrevet av Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990). Likeledes kan bindingspartnere konstrueres ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker for å innføre de ulike områdene til et gen som koder for et antistoff som binder spesifikt. Slik teknikk er beskrevet i Larrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989). Andre typer av "antistoff" kan produseres ved anvendelse av informasjonen tilveiebrakt heri sammen med kunnskap ifølge teknikkens stand. F.eks. er humaniserte antistoffer som har evnen til å spesifikt binde TACE også omfattet av oppfinnelsen. Når antistoffene mot TACE er isolert og renset kan de anvendes for å påvise tilstedeværelse av TACE i en prøve ved anvendelse av etablerte analysefremgangsmåter. Videre kan antistoffene ifølge oppfinnelsen anvendes terapeutisk for å binde TACE og hemme dets aktivitet in vivo. Renset TACE ifølge oppfinnelsen vil lette oppdagelsen av inhibitorer av TACE og således inhibitorer av overskuddsvis frigjøring av TNF-a. Anvendelsen av et renset TACE-polypeptid for screening av potensielle inhibitorer derav er viktig og kan faktisk eliminere muligheten av interfererende reaksjoner med forurensninger. En slik screeningsanalyse for påvisning av TNF-a-inhibitorisk aktivitet av et molekyl vil vanligvis omfatte blanding av det potensielle inhibitormolekyl med et egnet substrat, inhibering av TACE som i det minste er vesentlig renset med blandingen og påvise mengden av substratkløyving, f.eks. som beskrevet ovenfor. Mens ulike egnede substrater kan lages for anvendelse ved analysen, anvendes fortrinnsvis et peptidylsubstrat, der substratet omfatter aminosyresekvensen Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser (SEKV. ID NR. 5).. TACE-polypeptider kan i tillegg også anvendes for ■ strukturbasert konstruksjon av TACE-inhibitorer. Slike strukturbaserte konstruksjoner er også kjent som "rasjonell medikamentkonstruksjon". TACE-polypeptidene kan analyseres tredim-ensjonalt, f.eks. ved hjelp av røntgenstrålekrystallografi, kjernemagnetisk resonans eller homologimodellering, hvorved alle er godt kjente fremgangsmåter. Anvendelsen av strukturell TACE-informasjon ved molekylære moduleringssoftwaresystemer for å bidra ved inhibitorkonstruksjon og inhibitor-TACE-inter-aksjon er også omfattet av oppfinnelsen. Ved slik computer-beregnet modulering og medikamentkonstruksjon kan det anvendes informasjon, slik som kjemiske konformasjonsanalyser, elektro-statisk potensial til molekylene, proteinfolding, etc. F.eks. er de fleste konstruksjoner av klassespesifikke inhibitorer til metalloproteaser fokusert på forsøk på å danne komplekser eller binde det katalytiske sinkatom. Syntetiske inhibitorer konstrueres vanligvis slik at de inneholder en negativt ladet rest hvorved en serie av andre grupper konstruert for å passe inn i spesifisitetsfordypningene til den spesifikke proteasen. En spesifikk fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen omfatter analyse av den. tredimensjonale struktur til TACE med hensyn til sannsynlighet for bindingsseter for substrater, syntese av et nytt molekyl som innfører et antatt reaktivt sete og analyse av det nye molekyl som beskrevet ovenfor.

EKSEMPEL 1

Rensing av TNF-a-omdannende enzym

Foreliggende eksempel beskriver en fremgangsmåte for rensing av TACE. TACE ble isolert og renset fra membranene til den humane monocyttcellelinje, THP-1 (ATCC nr. TIB 202) som ble stimulert til å produsere TNF-a. THP-l-celler ble valgt fordi de produserer mer TNF-a enn HL-60-celler, en mer vanlig brukt human monocyttcellelinje. Ca 120 milliarder celler ble stimulert ved anvendelse av prosedyren tidligere beskrevet av Kronheim et al., Arch. Biochem. Biophys. 269:698 (1992). Cellene ble høstet ved hjelp av sentrifugering to timer etter stimulering. De innhøstede cellene ble vasket minst to ganger med Hanks-balanserte saltoppløsning og plasmamembraner ble isolert ifølge fremgangsmåte nummer tre som beskrevet av Maeda et alt., Biochim. et Biophys. Acta, 731:115 (1983), bortsett fra at ditiotreitol ikke ble brukt, ved anvendelse av 1,25 ml homogeniseringsbuffer per ml cellepellet. Det ble fastslått at den vanlige prosedyren til Maeda et al., med anvendelse av ditiotreitol ikke ga forbindelser med TACE-aktivitet (en analyse med hensyn til TACE-aktivitet er beskrevet nedenfor). Proteiner ble så oppløst ved resuspensjon av membranpreparatet i en oppløsning av 1 % oktylglukosid, lOmM Tris-HCL(pH 8), 1 mM MgC12 og 30 mM NaCl og kort homogenisert med en Brinkman homogenisator (to ganger fem sekunder hver gang). Fosfolipider ble så ekstrahert ved tilsetning av fire volumenheter iskald (0 <oC>) aceton; etter en inkubering ved 4 °C i 30 minutter ble det acetonekstraherte materialet sentrifugert ved 1500 rpm i 10 minutter i en H1000B-rotor.

Kromatografi

Pelletmateriale ble oppløst i 450 ml buffer A (buffer A omfatter 10 mM Tris-HCl(pH 7,5) og 1 % oktylglukosid (vekt i forhold til volumprosent)) og tilført en 120 ml kolonne med DEAE-Sepharose fast strømning (Pharmacia) med 4 ml per minutt. Kolonnen ble så vasket med 360 ml buffer A med 6 ml per minutt og protein ble så eluert med en økende gradient av NaCl(0-0,3M) i buffer A tilført med 6 ml per minutt over en tidsperiode på 40 minutter. TACE ble eluert med en NaCl-konsentrasjon på ca. 50 til 150 mM.

TACE ble på dette punkt opprinnelig påvist ved hjelp av dets evne til å kløyve rekombinant TNF-a på 26 kD fusjonert med "flag"(T.P. Hopp, et al., Bio Technology, 6:1204

(1988) sekvensen på 8 aminosyrer i den aminoterminale enden. Genet som koder for humant TNF-a ble spleiset med DNA som koder for flag-sekvensen og denne konstruksjon ble plassert i pPL3 vektoren C. Maliszewski et al., Molec. Immunol., 25:429

(1987). Proteinet ble så uttrykt i en proteasemanglende stamme av E. coli (R.T. Libby et al., DNA, 5:221 (1987) der det var funnet nødvendig å forebygge degradering av forløperen av bakterien. Etter fjerning av vekstmedium ble bakterien resuspendert i 30 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM. EDTA og suspensjonen ble så sonikert i ca. 30 sekunders. Materialet ble så sentrifugert ved 20.000 rpm i en SS34-rotor i 30 minutter, supernatantfraksjonen ble kastet og pelleten ble resuspendert i 8 M urea i 10 mM Tris-HCl (pH8). Materialet ble homogenisert med 25 slag i en "Dounce"-homogenisator og så sentrifugert med 20.000 rpm i en SS34-rotor i 30 minutter. Supernatantfraksjonen, inneholdende forløper TNF-a, ble så dialysert fire ganger mot 10 mM Tris-HCl (pH 8).

Materialet ble inkubert i 37 °C i minst 4 timer med TACE eluert fra DEAE-Sepharose, behandlet med 1 mM B-metoksy-succinyl-Ala-Ala-Val-klor-metylketon, 10 ug/ml leupeptin og 1 mg/ml al-proteaseinhibitor, alle kommersielt tilgjengelige. N-teminal ende av det resulterende produkt på 17 kD ble funnet å være autentisk med TNF-a. Etter den innledningsvise identifisering av TNF-a på denne måten ble det funnet at enzymet også kløyver et peptid på 8 rester som representerte segmentet Leu<73->Al<a74->Gln<75->Ala<76->4-Val77-Arg<78->Ser<79->Ser<80> (SEKV. ID NR. 5) fra TNF-a. Hvori viser kløyvingsetet. På bakgrunn av denne observasjon ble en kvantitativ analyse laget: Peptidet i 1 mM ble inkubert med enzymet av 37 °C i en fikseringstidsperiode i nærvær av. 0,1 mM diklorisocoumarin, 1 mM metoksysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-klorometylketon, 10 ug/ml leupeptin, 10 uM bestatin og 1 mg/ml al-proteaseinhibitor (Sigma), alle kommersielt tilgjengelige. Reaksjonen ble så stoppet ved tilføring av syre eller en metallchelator. Kløyvingsgraden til peptidet, som gjenga mengden av tilstedeværende TACE, ble påvist ved å tilføre blandingen til en Vydac C18-kolonne og eluering med en gradient bestående av 0 til 30 % acetonitril over en periode på 15 minutter.

Materialet som var eluert fra DEAE-kolonnen med 0,05-0,25 M NaCl hadde ca. 4 ganger høyere spesifik aktivitet enn utgangsmaterialet. Det eluerte materiale ble sonikert og så ristet med hvetekimagglutiningagarose (Vedtor Laboratories) to timer ved 4 °C før anvendelese ble hvetekilagglutininagarosen vasket med 5 kolonnevolumer buffer B (Buffer B omfatter 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1 mM MnCl2, 0,1 mM CaCl2 1 % oktylglukosid og 10 % glycerol); 1 ml av dette resinet ble anvendt for hvert 2 mg protein i prøven, som bestemt av BCA-proteinanalysen (Pierce). Etter to timer ble resinet vasket med 7 volumenheter buffer B og materialet ble så eluert med 5 kolonnevolumer buffer B i tillegg til Q,3 M acetylglukosamin (Sigma) med 30 minutters intervaller mellom anvendelse av . hvert kolonnevolum.

Eluerte fraksjoner inneholdende TACE-aktivitet hadde ca. ti ganger høyere spesifik aktivitet enn utgangsmaterialet. Disse fraksjoner ble konsentrert til ca.. 5 Ml med Centriprep-30-konsentrerere (Amicon) og så fortynnet tre ganger med buffer C (buffer C inneholder 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 % oktylglukosid og 10 % glycerol). Det fortynnede materiale ble sonikert (tre ganger av 10 sekunder) og så tilsatt en MonoQ HR

5/5-kolonne (Pharmacia) ved 0,5 ml per minutt. Kolonnen ble så vasket med 10 ml buffer C med 0,5 ml per minutt og materialet ble eluert med en 0 til '0,25 MNaCl-gradient i buffer C med 0,5 ml per minutt over en periode på 30 minutter. TACE-aktivitet (påvist på dette trinn og senere ved inkubering med det tidligere beskrevene peptidsubstrat i fravær av proteaseinhibi-torer) eluert med ca. 0,15 M NaCl.

NaCl-konsentrasjonen i MonoQ-fraksjonene med aktivitet ble redusert minst 10 ganger ved fortynning av materialet i buffer C og materialet ble tilført en kolonne med hydroksy-apatit (American International Chemical, keramisk hydroksy-apatit HS40) i en grad på 0,5 mM per minutt. Etter vasking med tre kolonnevolumer av buffer C ble proteinet eluert med en 0 til 50 mM-gradient av natriumfosfat med 1 ml per minutt over en periode på 30 minutter. TACE ble eluert med ca. 15 mM natriumfosfat.

TACE eluert fra hydroksyapatitkolonnen ble så konsentrert til ca. 100 ul med Centricon-50-konsentrerere (Amicon) og tilført til en Bio-Rad Sec-400 størrelseskolonne (30 cm). Protein ble eluert med buffer C kjørt gjennom kolonnen med 0,5 ml per minutt; TACE ble eluert i ca. 28 minutter.

TACE eluert fra størrelseskolonnen ble fortynnet tre ganger i buffer D (buffer D omfatter 20 mM MES (pH 6), 1 % oktyglukosid og 10 % glyserol) og tilført en kolonne på 1 ml med rød 120-agarose (Sigma) med 0,25 ml per minutt. Etter at kolonnen var vasket med 10 ml buffer D ble protein eluert med en 0 til 1 M NaCl-gradient i buffer D med 0,25 ml per minutt over en periode på 60 minutter. TACE ble eluert med 0,2 til 0,3 M NaCl. Fem prosent av hver eluerte fraksjon ble kjørt på en SDS-polyakrylamidgel (10 %j, og sølvfarging viste at det dominertende protein i fraksjonen, med aktivitet, hadde gått omtrent midt mellom markørene på 66 og 97. kD (Novex) på genen, tilsvarende ca. 80 kD.

Trifluoroeddiksyre (TFA) ble tilført til 0,2 % (volum i forhold til volum-prosent) til et forråd av fraksjonene inneholdende proteinet på ca. 80 kD og blandingen ble så pumpet inn i en C4-kolonne på 2,1 x 5 cm med ca. 100 ul per minutt ved anvendelse av en Shimadzu LC-10AD. Protein ble eluert med en 0 til 100% gradient acetonitril i 0,1 % TFA med 100 ul pr minutt over en periode på 100 minutter. En minutts fraksjoner ble innsamlet og 5 til 10 % av hver fraksjon ble kjørt på en Novex SDS-polyakrylamidgel (10 %). Fraksjoner som var eluert med ca. 70 % acetonitril og som inneholdt et protein på ca. 80 kD ble samlet og fordampet til tørrhet.

Generering av peptider og sekvensering

Dette forråd av fraksjoner ble så oppløst i 200 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA og en mengde endo-LYS-C

(Promega) tilsvarende ca. 1/50 av mengden protein i prøven ble tilsatt. Materialet ble inkubert ved 37 °C over natt og så ble en fersk aliquot med samme mengde ende-LYS-C tilsatt ytterligere 3 timer ved 37 °C.

De resulterende peptider ble separert ved tilføring av materialet til en kapillær-C18-kolonne med 20 ul per minutt og eluert med en stigende gradient av acetonitril (0,5 % per minutt) i 0,1 % TFA over en periode på 200 minutter. Peptider ble sekvensert med en ABI 476 eller en ABI 494 automatisert sekvenseringsmaskin.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av isolert og renset TACE Foreliggende eksempel beskriver en fremgangsmåte for ytterligere rensing av det rensede TACE som ble erholdt ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. Renset TACE erholdt fra THP-l-celler kan inneholde små mengder humant, lysosonalt signalglykoprptein på 85 kD ( Biochem. Biophys. Res. Commun. 284:604-611 (1992) og humant lysosomalt alfa-manno-sidase ( Biochem. Biophys. Res.' Comm. 200:239-245 (1994) som kan fjernes ved anvendelse av vanlige immunoadsorbans-prosedyrer som f.eks. beskrevet i Robert K. Scopes, Protein Purification- Principles and Practice (Springer-Verlag, 2. utgave), ss 167-172. Ved anvendelse av prosedyrene beskrevet i dette eksempel (eksempel 2) kan isolert og renset TACE erholdes .

EKSEMPEL 3

Kloning av humant TACE

Foreliggende eksempel beskriver en fremgangsmåte for isolering av en DNA-sekvens som koder for hument TACE. Et til-feldig primet cDNA-bibliotek ble generert fra den kommersielt tilgjengelige cellelinjen THP-11 (Amersham) ved anvendelse av vanlige fremgangsmåter. Polymerasekjedereaksjon (PCR) (Mullis og Faloona, Meth. Enzymol. 255:335-350, 1987) amplifikasjoner ble utført ved at anvendelse av følgende primere: Primer (1): 5'-AARTAYGTNATGTAYCC-3' SEKV. ID NR. 6

Primer (2): 5 *-CCRCARTCRCAYTCYTC-3' SEKV. ID NR. 7

Primer (1) er basert på de første fem aminosyrene til Peptid (2) med tilsetning av en triplet som koder for lysin i 5' ende. Primer (2) er antisens i forhold til en konservert aminosyresekvens, Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly (EECDCG) SEKV. ID NR. 8, som er funnet i homolog metalloprotease, bovint repro-lysin 1 (genbank aksesjonsnr. Z21961).

Enkeltrådet cDNA ble amplifisert ved anvendelse av de blandede olginukleotidene beskrevet ovenfor under vanlige PCR-betingelser. PCR-reaksjonsproduktene ble fraksjonert ved hjelp av genelektroforese og DNA-bånd på ca. 180 bp ble isolert og subklonet inn i kommersielt tilgjengelig pBLUESCRIPT. Sekvensering viste at en klon som inneholdt en nukleotidsekvens som kodet for aminosyrene Ile-Ala-Val-Ser-Gly-Asp-His-Glu-Asn-Asn-Lys (SEKV. ID NR. 9) og en nukleotidsekvens som kodet for aminosyrene Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly (EECDCG) (SEKV. ID NR. 8). Denne klon ble kalt "30CD-klon". 30CD-klonen ble sekvensert og primere ble generert på bakgrunn av denne sekvens. Primerene ble så anvendt for å påvise TACE-cDNA i et fagbibliotek fremstilt fra humane KB-celler. Dette bibliotek ble screenet under vanlige betingelser under anvendelse av en probe basert på 30CE-sekvensen. Positivt hybridiserende plaque ble isolert og DNA-fragmenter fra disse kloner ble sekvensert. Sevkensering viste et fullengde cDNA fra humant TACE som er vist i SEKV. ID NR. 1. Humant TACE ble funnet å være et type I-transmembran-protein på 824 aminosyrer, deriblant et N-terminal signalpeptid på 17 aminosyrer. Signalpeptidet ble fulgt av et ekstracellulært domene på 654 aminosyrer, et transmembrant domene på 23 aminosyrer og et cytoplasmatisk domene på 130 aminosyrer. En alternativt spleiset variant ble klonet og sekvensert og funnet å inneholde samme aminosyresekvens som TACE, bortsett fra et fragment på 50 bp var fjernet i 5' ende av det cytoplasmatiske domene, noe som endret leserammen til å kode for et cytoplasmatisk domene på seks aminosyrer. Aminosyresekvensen til denne variant er vist i SEKV. ID NR. 4 med cDNA'et vist i SEKV. ID NR. 3.

EKSEMPEL 4

Fremstilling av antistoffer mot TACE Foreliggende eksempel beskriver en fremgangsmåte for generering av monoklonale antistoffer mot TACE. Balb/c-mus ble injisert intraperitonalt ved to anledninger med 3 ukers intervaller med 10 ug isolert og renset TACE fra eksempel 1 eller peptider basert på aminosyresekvensen til TACE med tilstedeværelse av RIBI-adjuvans (RIBI Corp., Hamilton, Montana). Musesera ble så analysert ved. hjelp av vanlig dot blot teknikk eller antistoffinnfanging (ABC) for å bestemme hvilket dyr som det var best å fusjonere. Tre uker senere ble mus gitt en intravenøs innsprøyting av 3 ug humant TACE eller TACE-peptid, suspendert i steril PBS. Tre dager senere ble mus avlivet og miltceller fusjonert med Ag8.653-myelomaceller (ATCC) etter-fult av etablerte fremgangsmåter. I korte trekk ble Ag8.653-celler vasket flere ganger i serumfritt medium og fusjonert til musemiltceller i en grad på 3 miltceller per myelomcelle. Fusjonsmiddelet var 50 % PEG: 10 % DMSO (Sigma). Fusjoner ble platet ut på tyve 96-brønners flatbunnede plater (korning) inneholdende HAT-suplementert DMEM-medium og dyrket i åtte dager. Supernatanter fra dé resulterende hybridomaer ble samlet og tilført til en 96-brønners plate i 60 minutter som først ble dekket med geiteantimus-Ig for så å vaskes og til-ført <125>I-TACE i hver brønn, inkubert i 60 minutter ved rom-temperatur og vakset fire ganger. Positive brønner kunne etter dette påvises ved hjelp av autoradiografi ved -70 °C ved anvendelse av Kodak X-Omat S-film. Positive kloner ble dyrket i satsvise kulturer og supernatanter deretter renset over en protein A-kolonne (Pharmacia).

Claims (17)

1. Isolert og renset TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid med evnen til å omdanne TNF-a fra formen på 26 kD til formen på 17 kD,. karakterisert ved at det omfatter en amino-syresekvens som er- minst 80 % identisk med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID NR.. 9.

2. isolert og. renset polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det har en molekylvekt på ca. 80 kD.

3. Isolert og renset polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er i ikke-glykosyl-ert form.

4. Isolert og renset polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er utvalgt fra gruppen bestående av et polypeptid omfattende aminosyrene 18-Xaa i SEKV. ID NR. 2, hvori Xaa er en aminosyre utvalgt fra gruppen bestående av aminosyrene 671 til 824.

5. Isolerte og rensede antistoffer, karakterisert ved at de binder til polypeptidet ifølge krav 1.

6. Isolerte og rensede antistoffer ifølge krav 5, karakterisert ved at antistoffene er monoklonale antistoffer'.

7. Fremgangsmåte for påvisning av den TACE-inhiberende aktivitet til et molekyl, karakterisert ved at den omfatter blanding av molekylet med et substrat, inkubering av et polypeptid ifølge krav 1 med blandingen og kromatografisk fastsettelse av substratkløyvingsgraden.

8. Fremgangsmåte for påvisning av den TACE-inhiberende aktivitet til et molekyl ifølge krav 7, karakterisert ved at substratet omfatter aminosyresekvensen Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser.

9. Fremgangsmåte for påvisning av den TNF-kløyvende evne til polypeptidetet ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at den omfatter inkubering av polypeptidet med et substrat som omfatter aminosyresekvensen Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser og påvisning av substrat-kløyvingsgraden.

10. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den er utvalgt fra gruppen bestående av: (a) nukleinsyre som koder for polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1-4; (b) et cDNA omfattende nukleotidene 52-247.2 i SEKV. ID NR. 1; • (c) en nukleinsyre som i det minste er 80 % identisk med nukleinsyren i (a) eller (b) og som koder for et polypeptid som forandrer TNF-a fra formen på 26 kD til formen på 17 kD; og (d) en nukleinsyre som er degenerert som følge av den genetiske kode til en nukleinsyre som angitt i (a), (b) eller (c) og som koder for et biologisk aktivt TNF-a-omdannende enzym (TACE).

11. Isolert nukleinsyre ifølge krav 10, karakterisert ved at TNF-a-omdannende enzym (TACE) er humant TACE.

12. Isolert nukleinsyre ifølge krav 10, karakterisert ved at den koder for et polypeptid omfattende aminosyrene 18-671 i SEKV. ID NR. 2.

13. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den dirigerer ekspresjonen av en nukleinsyresekvens ifølge krav 10.

14. Vertscelle, karakterisert ved at den er transfektert eller transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 10.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av et TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid, karakterisert ved at den omfatter dyrking av en vertscelle ifølge krav 14 under betingelser som fremmer ekspresjon, og utvinning av polypeptidet fra kulturmediet.

16. Anvendelse av TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid ifølge ethvert av kravene 1-4 for fremstilling av et medikament for behandling av tumorer, inflammasjon eller fertilitetsforstyrrelser.

17. Anvendelse ifølge krav 16, kjennetegnet ved at det TNF-a-omdannende enzym (TACE)-polypeptid modulerer eller fjerner celleoverflatecytokin, cytokinreseptor eller et adhesjonsprotein.