DE69633231T2

DE69633231T2 - Tnf-alpha konvertierendes enzym

Info

Publication number: DE69633231T2
Application number: DE69633231T
Authority: DE
Inventors: A. Roy BLACK; Charles Rauch; J. Carl MARCH; P. Douglas CERRETTI
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1995-06-08
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: DE69633231D1; JP2002515020A; EP0830130A4; EP0830130B9; CA2222650C; MX9709744A; ES2227598T3; EP0830130B1; CA2222650A1; AU712759C; NZ510390A; AU6378196A; AU712759B2; NZ312285A; JP4326022B2; PT830130E; WO1996041624A1; IL122305A0; NO975438L; NO323623B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft gereinigtes und isoliertes TNF-α konvertierendes Enzym, die Nukleinsäuren, welche ein solches Enzym kodieren, Verfahren zur Herstellung von rekombinanten TNF-α Konvertasen, pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen solche Enzyme enthalten sind, und deren Verwendung in verschiedenen Analysen und Therapien.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α, auch als Cachectin bekannt) ist ein Säuger-Protein, das eine Reihe von Wirkungen bei zahlreichen Zellarten herbeiführen kann. Der TNF-α war anfänglich durch seine Fähigkeit gekennzeichnet, die Lyse von Tumorzellen zu verursachen, und wird durch aktivierte Zellen wie mononukleare Phagozyten, T-Zellen, B-Zellen, Mastzellen und NK-Zellen erzeugt. Es gibt zwei Formen von TNF-α, ein Typ-II-Membranprotein mit einer relativen Molekularmasse von 26.000 (26 kD) und eine lösliche 17kD-Form, die aus dem zellgebundenen Protein durch proteolytisches Spalten erzeugt wird. TNF-α ist ein Hauptmediator der Wirtsreaktion auf gramnegative Bakterien. Lipopolysaccharid (LPS, auch als Endotoxin bezeichnet), das aus der Zellwand von gramnegativen Bakterien gewonnen wird, ist ein mächtiger Stimulator der TNF-α-Synthese. Da die schädlichen Wirkungen, die aus einer Überproduktion oder einer nicht regulierten Produktion von TNF-α entstehen können, äußerst schwerwiegend sind, wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen, um den Serumpegel von TNF-α zu kontrollieren oder zu regeln. Ein wächtiger Teil im Rahmen der Bemühungen zur effektiven Kontrolle der Serumpegel von TNF-α ist das Verständnis des Mechanismus der TNF-α-Biosynthese.
Der Mechanismus, durch den TNF-α abgesondert wird, wurde zuvor noch nicht aufgeklärt. Kriegler et al. Cell, 53:45 (1988) mutmaßten, dass die „Absonderung" von TNF-α auf das Konvertieren des 26kD membrangebundenen Moleküls durch ein damals unbekanntes proteolytisches Enzym oder eine Protease zurückzuführen sei. Scuderi et. al., J. Immunology, 143:168 (1989) meinten, dass die Freisetzung des TNF-α von humanen Leukozytenzellen von einer oder mehreren Serinproteasen abhängt, zum Beispiel einer Leukozytenelastase oder Trypsin. Es wurde festgestellt, dass ein Serinproteasen-Hemmer, p-Toluolsulfonyl-Largininmethylester, die Freisetzung von TNF-α aus humanen Leukozyten in einer konzentrationsabhängigen Weise hemmt. Scuderi et. al. gaben an, dass ein Argininmethylester um die Arginin-Bindungsstelle im reaktiven Zentrum des Enzyms konkurriert und dadurch die Hydrolyse blockiert. Die Lysin- und Phenylalanin-Analoge des Hemmers haben es erwiesener Maßen nicht geschafft, den Argininmethylester nachzuahmen. Es wurde jedoch nie nachgewiesen, dass diese Verbindung wirkte, indem sie eine Protease hemmte, welche den 26kD-TNF spaltet. Vor kurzem wurde berichtet, dass die Metalloprotease-Hemmer die Freisetzung von TNF aus THP-1-Zellen blockieren. Siehe Mohler et al., Nature 370:218 (1994); Gearing et al., Nature, 370:555 (1994); und McGeehan et al., Nature, 370:568 (1994).
Die meisten, aber nicht alle, Proteasen erkennen eine spezifische Aminosäuresequenz. Einige Proteasen erkennen vorrangig Reste, die N-terminal von der gespaltenen Bindung angeordnet sind, einige erkennen Reste, die C-terminal von der gespaltenen Bindung angeordnet sind, und einige Proteasen erkennen Reste auf beiden Seiten der gespaltenen Bindung. Metalloprotease-Enzyme verwenden ein gebundenes Metallion, im Allgemeinen Zn²⁺, um die Hydrolyse der Peptidbindung zu katalysieren. Metalloproteasen sind an Gelenkszerstörung (die Matrixmetalloprotease), Blutdruckregelung (Angiotensin konvertierendes Enzym) und Regelung der Peptidhormonpegel (neutrale Endopeptidase-24.11) beteiligt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt biologisch aktives TNF-α konvertierendes Enzym („TACE") als isoliertes und gereinigtes Polypeptid bereit. In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes und gereinigtes TACE-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 9 bereit. Das Polypeptid kann ein Fragment von SEQ ID Nr. 2 aus Aminosäure 215–477 oder 18–477 aufweisen. Das Polypeptid kann die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 enthalten. Ferner kann das Polypeptid aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid ausgewählt werden, welches Aminosäuren 18-Xaa von SEQ ID Nr. 2 enthält, wobei Xaa eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure 671 bis einschließlich 824 ausgewählt wird.
Außerdem kann das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens zu 80 % oder mindestens zu 90 % mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids des ersten Aspekts der Erfindung identisch ist.
Vorzugsweise kann das TACE TNF-α von der 26kD-Form in die 17kD-Form konvertieren. Typischerweise weist das TACE ein Molekulargewicht von ungefähr 80 kD auf. Ferner kann das TACE rekombinant sein.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung isolierte und gereinigte Antikörper bereit, die an ein TACE-Polypeptid gemäß des ersten Aspekts der Erfindung binden. Vorzugsweise sind die Antikörper monoklonale Antikörper.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung isolierte Nukleinsäure bereit, welche ein TACE-Polypeptid gemäß des ersten Aspekts der Erfindung kodiert. Die Erfindung stellt weiterhin eine Nukleinsäure bereit, welche unter mäßig stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure des dritten Aspekts der Erfindung hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine isolierte Nukleinsäure bereit, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Folgendem besteht:

a) cDNA, welche Nukleotide 52–2472 der SEQ ID Nr. 1 aufweist;
b) Nukleinsäure, die zu mindestens 80 % mit der Nukleinsäure von a) identisch ist und ein Polypeptid kodiert, das TNF-α von der 26kD-Form in die 17kD-Form konvertiert; und
c) Nukleinsäure, welche aufgrund des genetischen Codes zu einer in a) oder b) definierten Nukleinsäure degeneriert ist und welche biologisch aktives TACE kodiert.

In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung der TACE-behindernden Aktivität eines Moleküls bereit, welches das Mischen des Moleküls mit einem Substrat und einem Polypeptid nach dem ersten Aspekt der Erfindung und das Bestimmen des Ausmaßes der Substratspaltung aufweist. Das Substrat kann die Aminosäuresequenz Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser (SEQ ID Nr. 5) aufweisen. Ferner kann es sich bei dem Substrat um einen membrangebunden TNF-α handeln.
Die Erfindung stellt auch einen Antikörper bereit, der die Aktivität eines TACE-Polypeptids gemäß des ersten Aspekts der Erfindung hemmt.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Polypeptids des ersten Aspekts der Erfindung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Tumoren, Entzündungen oder Fruchtbarkeitsstörungen bereit. Das TACE-Polypeptid kann verwendet werden, um ein Zelloberflächen-Zytokin, einen Zytokinrezeptor oder ein Adhäsionsprotein zu modulieren oder zu entfernen.
Außerdem betrifft die Erfindung Expressionsvektoren, welche die Nukleinsäure des dritten Aspektes der Erfindung aufweisen. Im Schutzumfang der Erfindung sind Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transfiziert oder transformiert wurden, und Verfahren zur Herstellung von TACE durch Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Expression von TACE fördern, enthalten. Durch die Reinigung von TACE sind Antikörper, und insbesondere monoklonale Antikörper gegen TACE, ein Aspekt der Erfindung. Ferner sind im Schutzumfang der Erfindung Analysen, welche TACE verwenden, um eine Überprüfung in Bezug auf potentielle Hemmer davon durchzuführen, und Verfahren, welche TACE als therapeutischen Wirkstoff zur Behandlung von Krankheiten verwenden, die durch zellgebundenen TNF-α oder andere Moleküle vermittelt werden, enthalten.
Hemmung des TACE hindert die Freisetzung von TNF-α in das Serum oder andere extrazelluläre Räume. TACE-Hemmer wären daher verwendbar zur Behandlung von Zuständen, die durch Überproduktion oder hochgeregelter Produktion von TNF-α charakterisiert sind. Ein besonders nützlicher TACE-Hemmer für bestimmte pathologische Zustände würde selektiv TACE hemmen, jedoch die Niveaus von TNF-β (auch bekannt als Lymphotoxin) nicht beeinflussen. Die Überproduktion oder ungeregelte Produktion von TNF-α wurde mit bestimmten Zuständen und Störungen in Zusammenhang gebracht, z.B. systemisches entzündliches Reaktionssyndrom, Reperfusionsverletzung, cardiovaskuläre Erkrankung, Infektionserkrankung, wie HIV-Infektion und HIV-Neuropathie, geburtshilfliche oder gynäkologische Erkrankungen, entzündliche Erkrankungen/Autoimmunität, allergische/atopische Erkrankungen, bösartige Tumorerkrankungen, Transplantationen einschließlich Abstoßung der Transplantat-gegen-Empfängerkrankheit, Kachexie, angeborene, dermatologische, neurologische, renale, toxische und metabolisch/idiopatische Störungen.
TACE-Hemmer würden die Spaltung von zellgebundenem TNF-α verhindern, wodurch der Pegel von TNF-α im Serum und in Geweben reduziert wird. Solche Hemmer wären von großer klinischer Nützlichkeit und könnten potentielle Therapeutika zur Behandlung der oben genannten TNF-α-bezogenen Störungen sein. Die Isolierung und Reinigung von TACE würde einen deutlichen Fortschritt in den Bemühungen zur Entwicklung von Hemmern dieses Enzyms und bei der Behandlung von TNF-bezogenen Krankheiten darstellen und könnten in der Tat dazu führen, dass TACE selbst als therapeutischer Wirkstoff für bestimmte physiologische Störungen verwendet wird. Zum Beispiel können zusätzlich zum TNF-α andere Zytokine sowie Zytokinrezeptoren und mehrere Adhäsionsproteine aus der Zelloberfläche durch TACE oder verwandte Protease freigesetzt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine cDNA, die ein humanes TNF-α konvertierendes Enzym („TACE") kodiert, wurde isoliert und in SEQ ID Nr. 1 offenbart. Die Entdeckung der cDNA, welche humanes TACE kodiert, ermöglicht die Konstruktion von Expressionsvektoren, welche Nukleinsäuresequenzen aufweisen, die TACE kodieren; von Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transfiziert oder transformiert werden; von biologisch aktivem humanem TACE als isolierte und gereinigte Proteine und von Antikörpern, die mit TACE immunoreaktiv sind.
Isolierte und gereinigte TACE-Polypeptide gemäß der Erfindung sind beim Erkennen der TACE-behindernden Aktivität eines Moleküls nützlich. In einem solchen Verfahren, das routinemäßige und herkömmliche Techniken einschließt, wird ein Molekül mit unbekannter TACE-behindernder Aktivität mit einem Substrat gemischt und mit einem TACE-Polypeptid inkubiert. Danach kann das Ausmaß der Substratspaltung chromatographisch bestimmt werden.
Zusätzlich sind die TACE-Polypeptide gemäß der Erfindung für das strukturbasierende Design eines TACE-Hemmers nützlich. Ein solches Design würde die Schritte des Bestimmens der dreidimensionalen Struktur des TACE-Polypeptids, des Analysierens der dreidimensionalen Struktur in Bezug auf die wahrscheinlichen Bindungsstellen von Substraten, das Synthetisieren eines Moleküls, das eine vorhersehbare reaktive Stelle enthält, und das Bestimmen der TACE-behindernden Aktivität des Moleküls aufweisen.
Antikörper, die mit TACE immunoreaktiv sind, und insbesondere monoklonale Antikörper gegen TACE, werden nun durch die Erfindung zur Verfügung gestellt. Diese Antikörper können bei der Hemmung der TACE-Aktivität in vivo und bei dem Erkennen der Gegenwart von TACE in einer Probe nützlich sein.
So wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „TACE" auf einen Genus von Polypeptiden, die imstande sind, die 26kD zellmembrangebundene Form von TNF-α (welche eine intrazelluläre Region, eine Membranregion und eine extrazelluläre Region einschließt) in die lösliche 17kD-Form zu konvertieren, welche die C-terminalen 156 Reste des TNF-α-Proteins enthält. TACE umfasst Proteine, welche die Aminosäuresequenz 18 bis 824 von SEQ ID Nr. 2 aufweisen, sowie jene Proteine mit einem hohen Ähnlichkeitsgrad (mindestens 80 % und bevorzugter 90 % Homologie) mit der Aminosäuresequenz 18 bis 824 von SEQ ID Nr. 2 und wobei die Proteine biologisch aktiv sind. Ferner betrifft TACE die biologisch aktiven Genprodukte der Nukleotide 52–2472 von SEQ ID Nr. 1. Ferner umfasst der Begriff „TACE" die membrangebundenen Proteine (welche eine intrazelluläre Region, eine Membranregion und eine extrazelluläre Region einschließen) und lösliche oder trunkierte Proteine, welche vorrangig den extrazellulären Abschnitt des Proteins enthalten, biologische Aktivität beibehalten und abgesondert werden können. Spezifische Beispiele solcher löslichen Proteine sind jene, welche die Sequenz von Aminosäuren 18–671 von SEQ ID Nr. 2 aufweisen. Trunkierte Versionen sind jene, die weniger als den extrazellulären Abschnitt des Proteins aufweisen und zum Beispiel Aminosäuren 18–477 von SEQ ID Nr. 2 enthalten oder welche im Wesentlichen die gesamte katalytische Domäne aufweisen, d. h. Aminosäuren 215 bis 477 von SEQ ID Nr. 2.
Das isolierte und gereinigte TACE gemäß der Erfindung weist ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 66 kD und ungefähr 97 kD auf, so wie durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Insbesondere wurde festgestellt, dass TACE ein Molekulargewicht von ungefähr 80 kD aufweist, so wie durch SDS-PAGE bestimmt.
Der Begriff „isoliert und gereinigt" bedeutet, so wie hierin verwendet, dass das TACE im Wesentlichen frei von Verbindung mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ist, zum Beispiel als ein Reinigungsprodukt einer rekombinanten Wirtszellenkultur oder als ein gereinigtes Produkt aus einer nicht-rekombinanten Quelle. Der Begriff „im Wesentlichen gereinigt", so wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Mischung, welche TACE enthält und im Wesentlichen frei von Verbindung mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ist, mit Ausnahme der Gegenwart von bekannten Proteinen, die unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers entfernt werden können, und wobei das im Wesentlichen gereinigte TACE biologische Aktivität aufrechterhält. Der Begriff „gereinigtes TACE" bezieht sich entweder auf die „isolierte und gereinigte" Form von TACE oder die „im Wesentlichen gereinigte" Form von TACE, da beide hierin beschrieben werden.
Der Begriff „biologisch aktiv" bedeutet unter Bezugnahme auf TACE, dass das TACE in der Lage ist, die 26kD-Zellform von TNF-α in die 17kD-Form zu konvertieren.
Eine „Nukleotidsequenz" betrifft ein Polynukleotidmolekül in der Form eines separaten Fragments oder als Bestandteil eines größeren Nukleinsäurekonstruktes, das aus DNA oder RNA gewonnen wurde, die zumindest einmal in im Wesentlichen reiner Form (d. h. frei von kontaminierenden endogenen Materialien) und in einer Menge oder Konzentration isoliert wurde, welche Identifizierung, Manipulation und Gewinnung ihrer Komponenten-Nukleotidsequenzen durch standardmäßige biochemische Verfahren ermöglicht (so wie jene, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben werden). Solche Sequenzen werden vorzugsweise in der Form eines offenen Leserahmens ohne Unterbrechung durch interne nicht-translatierte Sequenzen oder Introne bereitgestellt, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorhanden sind. Sequenzen von nicht-translatierter DNA können 5' oder 3' von einem offenen Leserahmen vorhanden sein, wo dieselben sich nicht auf die Manipulation oder Expression der codierenden Region auswirken.
Eine „TACE-Variante", so wie hierin bezeichnet, steht für ein Polypeptid, das im Wesentlichen zum nativen TACE homolog ist, welches aber eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von jener des nativen TACE (vom Menschen, der Maus oder anderen Säugetierarten) aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen unterscheidet. Die variante Aminosäuresequenz ist vorzugsweise zu mindestens 80 % mit einer nativen TACE Aminosäuresequenz identisch, am meisten bevorzugt zu mindestens 90 %. Die prozentuelle Gleichheit kann zum Beispiel durch Vergleichen von Sequenzinformationen mit Hilfe des GAP-Computerprogramms, Version 6.0, beschrieben von Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) und bei der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich, bestimmt werden. Das GAP-Programm verwendet das Ausrichtungsverfahren von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), wie von Smith und Waterman überarbeitet (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Die bevorzugten voreingestellten Parameter für das GAP-Programm schließen ein: (a) eine unäre Vergleichsmatrix (welche einen Wert von 1 für Gleichheiten und 0 für Nicht-Gleichheiten enthält) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff beschrieben, Hrsg., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Seiten 353–358, 1979; (2) eine Strafe von 3,0 für jede Lücke und eine zusätzliche Strafe von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keine Strafe für Endlücken.
Varianten können konservativ substituierte Sequenzen enthalten, das bedeutet, dass ein bestimmter Aminosäurerest durch einen Rest ersetzt wird, der ähnliche physiochemische Eigenschaften aufweist. Konservative Substitutionen sind auf dem Fachgebiet hinlänglich bekannt und schließen die Substitution von einem aliphatischen Rest durch einen anderen, wie Ile, Val, Leu oder Ala untereinander, oder Substitutionen eines polaren Restes durch einen anderen, wie zwischen Lys und Arg, Glu und Asp oder Gln und Asn, ein. Herkömmliche Verfahren und Methoden können verwendet werden, um solche Varianten zu erzeugen und zu verwenden. Andere konservative Substitutionen, wie zum Beispiel Substitutionen von gesamten Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitäts-Eigenschaften, sind hinlänglich bekannt und werden routinemäßig durchgeführt. Natürlich vorkommende TACE-Varianten werden ebenfalls durch die Erfindung erfasst. Beispiele für solche Varianten sind Proteine, die aus alternativen mRNA-Spleißereignissen oder aus proteolytischer Spaltung des TACE-Proteins resultieren, wobei die TACE proteolytische Eigenschaft beibehalten wird. Alternatives Spleißen von mRNA kann ein trunkiertes, aber biologisch aktives TACE-Protein ergeben, so wie eine natürlich vorkommende lösliche Form des Proteins, zum Beispiel wie in SEQ ID Nr. 4 dargestellt. Variationen, die auf Proteolyse zurückzuführen sind, schließen zum Beispiel Unterschiede bei den N- oder C-Enden bei Expression in unterschiedlichen Typen von Wirtszellen aufgrund von proteolytischer Entfernung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren von dem TACE-Protein ein (im Allgemeinen von 1–5 terminale Aminosäuren).
Wie oben angeführt, stellt die Erfindung isolierte und gereinigte oder homogene TACE-Polypeptide bereit, sowohl rekombinante als auch nicht-rekombinante. Varianten und Derivate von nativen TACE-Proteinen, welche die gewünschte biologische Aktivität beibehalten, können durch Mutationen von Nukleotidsequenzen erhalten werden, welche für native TACE-Polypeptide kodieren. Abänderungen der nativen Aminosäuresequenz können durch jedes einer Reihe von herkömmlichen Verfahren erzielt werden. Mutationen können an bestimmten Orten durch Synthetisieren von Oligonukleotiden eingeführt werden, die eine mutante Sequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, welche die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analog mit der gewünschten Aminosäure-Insertion, -Substitution oder -Deletion.
Alternativ dazu können Oligonukleotid-gerichtete stellenspezifische Mutagenese-Verfahren angewendet werden, um ein verändertes Gen bereitzustellen, wobei vorbestimmte Kodone durch Substitution, Deletion oder Insertion verändert werden können. Beispielhafte Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Veränderungen werden von Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987) und in den US-Patentschriften Nr. 4,518,584 und 4,737,462 offenbart.
TACE kann modifiziert werden, um TACE-Derivate durch Bilden kovalenter oder aggregierender Konjugate mit anderen chemischen Anteilen zu erzeugen, wie zum Beispiel Glycosylgruppen, Polyethylenglykol(PEG)-Gruppen, Lipide, Phosphat, Acetylgruppen und dergleichen. Kovalente Derivate von TACE können durch Koppeln der chemischen Anteile mit funktionalen Gruppen auf TACE-Aminosäureseitenketten oder am N-Terminus oder C-Terminus eines TACE-Polypeptids oder der extrazellulären Domäne davon hergestellt werden. Andere TACE-Derivate innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung schließen kovalente oder aggregierende Konjugate von TACE oder seinen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ein, wie durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das Konjugat eine Signal- oder Leader-Polypeptidsequenz (z. B. den α-Faktorleader von Saccharomyces) an dem N-Terminus eines TACE-Polypeptids aufweisen. Das Signal- oder Leader-Peptid lenkt co-translational oder post-translational den Transfer des Konjugats von seiner Synthesestelle zu einer Stelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand.
TACE-Polypeptidkonjugate können Peptide umfassen, welche hinzugefügt sind, um die Reinigung und Identifikation von TACE zu erleichtern. Solche Peptide schließen, zum Beispiel, poly-His oder die antigenen Identifikationspeptide ein, die in der US-Patentschrift Nr. 5,011,912 und in Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988, beschrieben werden.
Die Erfindung schließt ferner TACE-Polypeptide mit oder ohne verbundene Nativ-Muster-Glycosylierung ein. TACE, das in Hefe oder Säuger-Expressionssystemen (z. B. COS-7-Zellen) exprimiert ist, kann einem nativen TACE-Polypeptid in Bezug auf Molekulargewicht und Glycosylierungsmuster. ähnlich sein oder sich davon deutlich unterscheiden, je nach Wahl des Expressionssystems. Die Expression von TACE-Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen, wie E. coli, stellt nicht-glycosylierte Moleküle bereit. Glycosylgruppen können durch herkömmliche Verfahren entfernt werden, insbesondere durch solche, die Glycopeptidase verwenden. Im Allgemeinen kann glycosyliertes TACE mit einem molaren Überschuss von Glycopeptidase inkubiert werden (Boehringer Mannheim).
Äquivalente DNA-Konstrukte, welche verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten oder -sequenzen oder Deletionen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen, die nicht für biologische Aktivität benötigt werden, kodieren, werden durch die Erfindung erfasst. Zum Beispiel können N-Glycosylierungsstellen in der TACE extrazellulären Domäne modifiziert werden, um Glycosylierung auszuschließen, wobei die Expression eines reduzierten Kohlenhydratanalogs in Säuger- und Hefeexpressionssystemen ermöglicht wird. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind durch ein Aminosäuretriplet Asn-X-Y gekennzeichnet, wobei X eine beliebige Aminosäure ist, mit Ausnahme von Pro, und Y Ser oder Thr ist. Geeignete Substitutionen, Additionen oder Deletionen zu der Nukleotidsequenz, welche diese Triplets kodiert, werden dazu führen, dass ein Anheften von Kohlenhydratresten an der Asn-Seitenkette verhindert wird. Änderung eines einfachen Nukleotids, die so ausgewählt wird, dass Asn zum Beispiel durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, ist ausreichend, um eine N-Glycosylierungsstelle zu deaktivieren. Bekannte Verfahren zum Deaktivieren von N-Glycosylierungsstellen in Proteinen schließen jene ein, die in der US-Patentschrift 5,071,972 und in EP 276,846 beschrieben werden.
In einem anderen Beispiel können Sequenzen, welche Cys-Reste kodieren, die für die biologische Aktivität nicht wesentlich sind, verändert werden, damit die Cys-Reste entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, wobei die Bildung von nicht korrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei Renaturierung verhindert wird. Andere Äquivalente werden durch Modifikation von benachbarten zweibasischen Aminosäureresten hergestellt, um die Expression in Hefesystemen zu fördern, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist. EP 212,914 offenbart die Verwendung von stellenspezifischer Mutagenese, um KEX2-Protease verarbeitende Stellen in einem Protein zu deaktivieren. KEX2-Protease verarbeitende Stellen werden durch Deletieren, Addieren oder Substitutieren von Resten deaktiviert, um Arg-Arg-, Arg-Lys- und Lys-Arg-Paare zu ändern, um das Auftreten dieser benachbarten basischen Reste zu beseitigen. Lys-Lys-Paare sind deutlich weniger für KEX2-Spaltung empfänglich, und die Konversion von Arg-Lys oder Lys-Arg zu Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz für das Deaktivieren von KEX2-Stellen dar.
Nukleinsäuresequenzen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung schließen isolierte DNA- und RNA-Sequenzen ein, welche mit den nativen TACE-Nukleotidsequenzen hybridisieren, die hierin unter mäßig oder hoch stringenten Bedingungen offenbart sind und welche biologisch aktives TACE kodieren. Die mäßig stringenten Bedingungen, so wie sie einem Durchschnittsfachmann bekannt sind und wie von Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band 1, Seiten 1.101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) definiert, schließen die Verwendung einer Vorwaschlösung von 5 X SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH-Wert 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von ungefähr 50 °C – 60 °C, 5 X SSC, über Nacht, vorzugsweise 55 °C, ein. Hoch stringente Bedingungen schließen höhere Hybridisierungs- und Waschtemperaturen ein. Der Fachmann wird erkennen, dass die Temperatur und die Waschlösungssalzkonzentration nach Bedarf gemäß Faktoren, wie der Länge der Sonde, eingestellt werden können.
Aufgrund der bekannten Degeneration des genetischen Codes, wobei mehr als ein Kodon dieselbe Aminosäure kodieren kann, kann eine DNA-Sequenz von jener, die in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird, unterschiedlich sein und noch immer ein TACE-Protein kodieren, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 aufweist. Solche varianten DNA-Sequenzen können aus stummen Mutationen (die z. B. während der PCR-Verstärkung auftreten) resultieren oder können das Produkt beabsichtigter Mutagenese einer nativen Sequenz sein.
DNA, welche Äquivalente zur DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 sind, werden unter mäßig stringenten oder hoch stringenten Bedingungen mit der doppelsträngigen nativen DNA-Sequenz hybridisieren, welche Polypeptide kodiert, die Aminosäuresequenzen von 18-Xaa von SEQ ID Nr. 2 aufweist, wobei Xaa eine Aminosäure von 671 bis 824 ist. Beispiele von TACE-Proteinen, die durch solche DNA kodiert werden, schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – TACE-Fragmente (lösliche oder membrangebunden) und TACE-Proteine ein, welche deaktivierte N-Glycosylierungsstelle(n), deaktivierte KEX2-Protease verarbeitende Stelle(n) oder konservative Aminosäuresubstitution(/en) aufweisen, so wie oben beschrieben. TACE-Proteine, die durch DNA kodiert sind, welche von anderen Säugerarten stammt, wobei die DNA unter moderat oder hoch stringenten Bedingungen mit der Ergänzung der cDNA von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, sind ebenfalls enthalten.
Alternativ dazu können TACE-bindende Proteine, wie die Anti-TACE-Antikörper der Erfindung, an eine feste Phase gebunden sein, wie zum Beispiel eine Säulenchromatographiematrix oder ein ähnliches Substrat, das geeignet ist, Zellen zu identifizieren, zu trennen oder zu reinigen, welche das TACE auf deren Oberfläche exprimieren. Die Adhärenz von TACE-bindenden Proteinen an eine feste Phase, welche mit der Oberfläche in Berührung kommt, kann durch ein beliebiges Mittel erreicht werden, zum Beispiel durch magnetische Mikrokugeln, die mit TACE-bindenden Proteinen überzogen und im Inkubationsgefäß durch ein magnetisches Feld gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen werden mit der festen Phase in Berührung gebracht, auf der sich TACE-bindende Proteine befinden. Zellen, auf deren Oberfläche sich TACE befindet, binden an das fixierte TACE-bindende Protein, und in der Folge werden nicht gebundene Zellen fortgewaschen. Dieses Affinitätsbindungsverfahren ist beim Reinigen, Screening oder Trennen der TACE-exprimierenden Zellen von der Lösung nützlich. Verfahren zum Freisetzen positiv ausgewählter Zellen aus der festen Phase sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel die Verwendung von Enzymen. Diese Enzyme sind vorzugsweise nicht-toxisch und für die Zellen nicht-schädigend und werden vorzugsweise so gelenkt, dass sie den Zelloberflächen-bindenden Partner spalten.
Alternativ dazu können Mischungen von Zellen, von denen angenommen wird, dass sie TACE-exprimierende Zellen enthalten, zuerst mit einem biotinylierten TACE-bindenden Protein inkubiert werden. Die Inkubationszeiten betragen typischerweise mindestens eine Stunde, um ein ausreichendes Binden an TACE zu gewährleisten. Die resultierende Mischung wird dann durch eine Säule geführt, die mit avidinbeschichteten Perlen gepackt ist, wobei die hohe Affinität von Biotin für Avidin die Bindung der TACE-bindenden Zellen an die Perlen bereitstellt. Die Verwendung von avidinbeschichteten Perlen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239(1986). Das Waschen von ungebundenem Material und die Freisetzung der gebundenen Zellen erfolgt unter Anwendung herkömmlicher Verfahren.
In den oben beschriebenen Verfahren sind geeignete TACE-bindende Proteine Anti-TACE-Antikörper und andere Proteine, welche zu Hochaffinitätsbindung von TACE fähig sind. Ein bevorzugtes TACE-Bindungsprotein ist ein Anti-TACE monoklonaler Antikörper, der zum Beispiel so erhalten wird wie in Beispiel 4 beschrieben.
TACE-Polypeptide können als Oligomere existieren, wie zum Beispiel kovalent gekoppelte oder nicht-kovalent gekoppelte Dimere oder Trimere. Oligomere können durch Disulfidbindungen gekoppelt sein, die zwischen Cysteinresten auf verschiedenen TACE-Polypeptiden gebildet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein TACE-Dimer geschaffen, indem TACE an die Fc-Region eines Antikörpers (z. B. IgG1) in einer Weise fusioniert wird, welche sich nicht auf die biologische Aktivität von TACE auswirkt. Das Fc-Polypeptid wird vorzugsweise an den C-Terminus eines löslichen TACE (welches nur die extrazelluläre Domäne aufweist) fusioniert. Die allgemeine Herstellung von Fusionsproteinen, welche heterologe Polypeptide aufweisen, die an verschiedenen Abschnitten von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden fusioniert sind (einschließlich der Fc-Domäne) wurde z. B. durch Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991) und Byrn et al. (Nature 344:677, 1990) beschrieben. Eine Genfusion, welche das TACE:Fc-Fusionsprotein kodiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. TACE:Fc-Fusionsproteinen wird ermöglicht, sich zusammenzufügen, ganz ähnlich wie Antikörpermolekülen, wobei Zwischenketten-Disulfidbindungen sich zwischen Fc-Polypeptiden bilden, was zweiwertiges TACE ergibt. Wenn Fusionsproteine sowohl mit Schwer- als auch Leichtketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein TACE-Oligomer mit bis zu vier TACE extrazellulären Regionen zu bilden. Alternativ dazu können zwei lösliche TACE-Domänen mit einem Peptid-Linker gekoppelt werden.
Rekombinante Expressionvektoren, welche eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die TACE kodiert, können unter Anwendung hinlänglich bekannter Verfahren hergestellt werden. Die Expressionsvektoren schließen eine TACE-DNA-Sequenz, die wirkungsmäßig mit geeigneten transkriptionalen oder translationalen regulatorischen Nukleotidsequenzen gekoppelt ist, wie jene, die von einem Säuger-Gen, einem mikrobiellen, viralen oder Insekten-Gen gewonnen werden, ein. Beispiele für regulatorische Sequenzen schließen transkriptionale Promotoren, Operatoren oder Verstärker, eine mRNA ribosomale Bindungsstelle und geeignete Sequenzen ein, welche die Initiation und Termination von Transkription und Translation regeln. Nukleotidsequenzen sind „wirkungsmäßig gekoppelt", wenn die regulatorische Sequenz funktionell in Beziehung zur TACE-DNA-Sequenz steht. Somit ist eine Promoter-Nukleotidsequenz wirkungsmäßig mit einer TACE-DNA-Sequenz gekoppelt, wenn die Promotor-Nukleotidsequenz die Transkription der TACE-DNA-Sequenz regelt. Die Fähigkeit, in den gewünschten Wirtszellen zu replizieren, die für gewöhnlich durch einen Replikationsursprung und ein Auswahl-Gen übertragen wird, durch welches Transformanten identifiziert werden, kann zusätzlich in den Expressionsvektor aufgenommen werden.
Zusätzlich können Sequenzen, welche geeignete Signalpeptide kodieren, die nicht natürlich mit TACE assoziiert sind, in Expressionsvektoren aufgenommen werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) im Leserahmen an die TACE-Sequenz fusioniert werden, so dass das TACE anfänglich als ein Fusionsprotein translatiert wird, welches das Signalpeptid aufweist. Ein Signalpeptid, das in den beabsichtigten Wirtszellen funktional ist, verstärkt die extrazelluläre Absonderung des TACE-Polypeptids. Das Signalpeptid kann von dem TACE-Polypeptid bei Absonderung des TACE von der Zelle gespalten werden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von TACE-Polypeptiden schließen Prokaryote, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen ein. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit bakteriellen, pilzlichen, hefeartigen und zellularen Wirten von Säugern werden zum Beispiel in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985) beschrieben. Zellfreie Translationssysteme könnten auch eingesetzt werden, um TACE-Polypeptide unter Verwendung von RNAs zu erzeugen, die aus hierin offenbarten DNA-Konstruktionen gewonnen werden.
Prokaryote schließen gramnegative oder grampositive Organismen ein, zum Beispiel E. coli oder Bacilli. Geeignete prokaryotische Wirtszellen für die Transformation schließen zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies innerhalb der Genera Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein. In einer prokaryotischen Wirtszelle, wie E. coli, kann ein TACE-Polypeptid einen N-terminalen Methioninrest enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu erleichtern. Das N-terminale Met kann von dem exprimierten rekombinanten TACE-Polypeptid gespalten werden.
Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen umfassen im Allgemeinen ein oder mehrere phänotypische selektierbare Marker-Gene. Ein phänotpyisches selektierbares Marker-Gen ist zum Beispiel ein Gen, welches ein Protein kodiert, das antibiotische Resistenz verleiht oder welches eine autotrophe Bedingung bereitstellt. Beispiele für nützliche Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen schließen jene ein, die aus im Handel erhältlichen Plasmiden gewonnen werden, wie der Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit einfache Mittel zum Identifizieren von transformierten Zellen bereit. Um einen Expressionsvektor unter Verwendung von pBR322 zu konstruieren, werden ein geeigneter Promotor und eine TACE-DNA-Sequenz in den pBR322-Vektor eingefügt. Andere kommerziell erhältliche Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein.
Promotorsequenzen, die häufig für rekombinante prokaryotische Wirtszellen-Expressionsvektoren verwendet werden, schließen β-Lactamase (Penicillinase), ein Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; und EP-A-36776) und einen tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 412, 1982) ein. Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszellen-Expressionssystem verwendet einen Phage-λ-P_L-Promotor und eine c1857ts thermolabile Repressorsequenz. Plasmidvektoren, die bei der American type Culture Collection erhältlich sind und die Derivate des λ-P_L-Promotors enthalten, schließen Plasmid pHUB2 (resident in E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092)) und pPLc28 (resident in E. coli RR1 (ATCC 53082)) ein.
TACE-Polypeptide können alternativ in Hefe-Wirtszellen, vorzugsweise aus dem Saccharomyces-Genus (z. B. S. cerevisiae) exprimiert werden. Andere Genera von Hefe, wie Pichia, K. lactis oder Kluyveromyces können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden oft eine Replikationsursprungssequenz von einem 2μ Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für Polyadenylierung, Sequenzen für Transkriptionstermination und ein selektierbares Marker-Gen enthalten. Geeignete Promotorensequenzen für Hefevektoren schließen unter anderem Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Andere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in Hefeexpression werden ferner in Hitzeman, EPA-73,657 oder in Fleer et. al., Gene, 107:285–195 (1991) und van den Berg et. al., Bio/Technology, 8:135–139 (1990) beschrieben. Eine andere Alternative ist der glucose-reprimierbare ADH2-Promotor, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300:724, 1982) beschrieben wird. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Hefe als auch E. coli replizierbar sind, können konstruiert werden, indem DNA-Sequenzen von pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Amp^τ-Gen und Replikationsursprung) in die oben beschriebenen Hefevektoren eingefügt werden.
Die Hefe-α-Faktor-Leadersequenz kann angewendet werden, um die Absonderung eines TACE-Polypeptids zu lenken. Die α-Faktor-Leadersequenz wird oft zwischen die Promotorsequenz und die Sequenz des strukturellen Gens eingefügt. Siehe z. B. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; US-Patentschrift 4,546,082 und EP 324,274 . Andere Leadersequenzen, die geeignet sind, die Absonderung von rekombinanten Polypeptiden aus Hefe-Wirtszellen zu erleichtern, sind Fachleuten bekannt. Eine Leadersequenz kann nahe ihrem 3'-Ende modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies wird die Fusion der Leadersequenz an das strukturelle Gen erleichtern.
Hefetransformationsprotokolle sind Fachleuten bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen et al. Protokoll selektiert für Trp⁺-Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67 % Hefestickstoffbase, 0,5 % Casaminosäuren, 2 % Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die durch Vektoren transformiert werden, die eine ADH2-Promotorsequenz enthalten, können gezüchtet werden, um Expression in einem „reichen" Medium herbeizuführen. Ein Beispiel eines reichen Mediums ist ein Medium, das aus 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 1 % Glucose besteht, ergänzt durch 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil. Es kommt zu einer Derepression des ADH2-Promotors, wenn Glucose aus dem Medium erschöpft ist.
Säuger- oder Insekten-Wirtszellkultursysteme könnten auch verwendet werden, um rekombinante TACE-Polypeptide zu exprimieren. Baculovirus-Systeme zur Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen werden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) berichtet. Etablierte Zelllinien mit Säuger-Ursprung können ebenfalls verwendet werden. Beispiele für geeignete Säuger-Wirtszelllinien schließen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Chinesische-Hamster-Ovarzellen (CHO), HeLa-Zellen und BHK (ATCC CRL 10)-Zelllinien und die CV-1/EBNA-1-Zelllinie ein, die von der afrikanischen Grünaffennierenzelllinie CVI (ATCC CCL 70) gewonnen wird, wie von McMahan et al. beschrieben (EMBO J. 10:2821, 1991).
Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen für Säuger-Wirtszellexpressionsvektoren können aus viralen Genomen ausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotorsequenzen und Verstärkersequenzen werden aus Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Simian-Virus 40 (SV40) und humanem Cytomegalovirus gewonnen. DNA-Sequenzen, die aus dem SV40 viralen Genom abgeleitet werden, zum Beispiel SV40-Ursprungsstellen, Stellen des frühen und späten Promotors, Verstärkers, Spleißstellen und Polyadenylisierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression einer Sequenz eines strukturellen Gens in einer Säuger-Wirtszelle bereitzustellen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht aus einem viralen Genom als Fragment erhältlich sind, das auch einen viralen Replikationsursprung enthalten kann (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250-bp-Sequenz, die sich von der Hind-III-Stelle zur Bg1I-Stelle in der SV40 viralen Replikationsursprungsstelle befindet, ist eingeschlossen.
Beispielhafte Expressionsvektoren zur Verwendung in Säuger-Wirtszellen können so konstruiert werden wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) offenbart. Ein nützliches System für stabile Hochpegel-Expression von Säuger-cDNAs in C127 Mäuse-Säuger-Epithelzellen kann im Wesentlichen so wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986) beschrieben konstruiert werden. Ein nützlicher Hochexpressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768, 1984, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säuger-Expressionsvektoren werden in EP-A-0367566 und in der US-Patentanmeldung Seriennummer 07/701,415, eingereicht am 16. Mai 1991, beschrieben. Die Vektoren können aus Retroviren gewonnen werden. Anstatt der nativen Signalsequenz kann eine heterologe Signalsequenz hinzugefügt werden, wie die Signalsequenz für IL-7, beschrieben in der US-Patentschrift 4,965,195; die Signalsequenz für den IL-2-Rezeptor, beschrieben in Cosman et al., Nature 312:768 (1984); das IL-4-Signalpeptid, beschrieben in EP 367,566 ; das Type 1-IL-1-Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben in der US-Patentschrift 4,968,607 und das Typ II-IL-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in EP 460,846 .
Ein isoliertes und gereinigtes TACE-Protein gemäß der Erfindung kann durch rekombinante Expressionssysteme erzeugt werden, so wie oben beschrieben, oder aus natürlich vorkommenden Zellen gereinigt werden. TACE kann im Wesentlichen gereinigt werden, wie durch eine einzelne Proteinbande bei Analyse durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) angezeigt. Ein Verfahren zur Herstellung von TACE weist das Kultivieren einer Wirtszelle auf, die mit einem Expressionsvektor transformiert wird, der eine DNA-Sequenz enthält, welche TACE unter Bedingungen kodiert, die ausreichen, um die Expression von TACE zu fördern. Danach wird TACE aus dem Kulturmedium oder den Zellextrakten gewonnen, je nach Art des verwendeten Expressionssystems. Wie den Fachleuten bekannt ist, variieren Verfahren zum Reinigen eines rekombinanten Proteins gemäß solcher Faktoren wie der Art der verwendeten Wirtszellen und ob das rekombinante Protein in das Kulturmedium abgesondert wird oder nicht. Zum Beispiel kann das Kulturmedium, wenn Expressionssysteme verwendet werden, die das rekombinante Protein absondern, zuerst unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters konzentriert werden, zum Beispiel durch Verwendung einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrierungseinheit. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix, wie ein Gelfiltrierungsmedium, aufgetragen werden. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit hängenden Diethylaminoethyl(DEAE)-Gruppen. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere Arten sein, die häufig bei der Proteinreinigung zum Einsatz kommen. Alternativ dazu kann ein Kationenaustauschschritt durchgeführt werden. Geeignete Kationenaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrizen ein, welche Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen aufweisen. Sulfopropylgruppen sind bevorzugt. Schließlich können ein oder mehrere Schritte einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) unter Verwendung von hydrophoben RP-HPLC-Medien (z. B. Kieselsäuregel mit überhängenden Methylgruppen oder anderen aliphatischen Gruppen) verwendet werden, um TACE weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorhergehenden Reinigungsschritte sind, in verschiedenen Kombinationen, hinlänglich bekannt und können verwendet werden, um ein isoliertes und gereinigtes rekombinantes Protein bereitzustellen.
Zusätzlich zur rekombinanten Erzeugung von TACE kann TACE aus einer aktivierten monozytischen Zelllinie, THP-1, isoliert und gereinigt werden. THP-1-Zellen produzieren typischerweise mehr TNF-α als HL-60-Zellen und sind eine bevorzugte Quelle für TACE. Andere Quellen für TACE können verwendet werden, und TACE kann auch in anderen Arten von Zellen gefunden werden, welche TNF-α produzieren. Sobald eine Quelle für TACE identifiziert ist, kann TACE isoliert und gereinigt werden, indem zuerst optional die Quellzellen stimuliert werden, um TNF-α zu erzeugen. Stimulation ist unter Umständen nicht notwendig, kann jedoch unter Anwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet hinlänglich bekannt sind, durchgeführt werden. Die Zellen werden dann geerntet, gewaschen und Plasmamembrane gemäß herkömmlichen Verfahren isoliert. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zum Isolieren der Plasmamembrane ist das Verfahren Nummer drei, so wie in Maecda et al., Biochim. et. Biophys. Acta, 731:115 (1983) beschreiben; außer, dass Dithiothreitol in diesem Verfahren nicht verwendet werden sollte, da festgestellt wurde, dass Dithiothreitol TACE-Aktivität blockiert. Proteine aus der Zellmembran können dann durch Suspendieren der Membranzubereitung in einer Verdünnungslösung von nicht-ionischem Detergenten. löslich gemacht werden, gefolgt von einer kurzen Homogenisierung. Phospholipide können dann unter Anwendung herkömmlicher Verfahren extrahiert werden.
Es ist möglich, eine Affinitätssäule zu verwenden, welche ein TACE-bindendes Protein aufweist, um Affinitätsreinigung bei exprimierten TACE-Polypeptiden durchzuführen. TACE-Polypeptide können von einer Affinitätssäule unter Anwendung herkömmlicher Techniken entfernt werden, z. B. in einem hochsalzigen Elutionspuffer, mit anschließender Dialyse in einen niedersalzigen Puffer zur Verwendung oder durch Änderung des pH-Wertes oder anderer Bestandteile in Abhängigkeit von der verwendeten Affinitätsmatrix. Beispiel 4 beschreibt ein Verfahren zum Verwenden von TACE der vorliegenden Erfindung, um monoklonale Antikörper zu erzeugen, die gegen TACE gerichtet sind.
Rekombinantes Protein, das in bakterieller Kultur erzeugt wird, wird für gewöhnlich durch anfängliche Zerstörung der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion aus Zellpelletts, bei einem unlöslichen Polypeptid, oder aus der überstehenden Flüssigkeit, bei einem löslichen Polypeptid, gefolgt von einer oder mehreren Konzentrationen, Aussalzen, Ionenaustausch, Affinitätsreinigung oder Größenausschlusschromatographie-Schritten isoliert. Schließlich kann die RP-HPLC für endgültige Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen können durch ein beliebiges herkömmliches Verfahren zerstört werden, einschließlich Gefrier-Tau-Zyklus, Beschallung, mechanischer Zerstörung oder Verwendung von zelllysierenden Wirkstoffen.
Transformierte Hefewirtszellen werden vorzugsweise verwendet, um TACE als abgesondertes Polypeptid zu exprimieren, um die Reinigung zu vereinfachen. Abgesondertes rekombinantes Polypeptid aus einer Hefewirtszellenfermentierung kann durch Verfahren gereinigt werden, die zu jenen analog sind, die von Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984) offenbart wurden. Urdal et al. beschreiben zwei sequentielle Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie-Schritte zur Reinigung von rekombinantem humanem IL-2 auf einer präparativen HPLC-Säule.
Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide, welche eine einsträngige Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die imstande ist, an eine Ziel-TACE-mRNA-Sequenz (unter Bildung eines Duplex) oder an die TACE-Sequenz in der doppelsträngigen DNA-Helix (unter Bildung einer dreifachen Helix) zu binden, können gemäß der Erfindung hergestellt werden. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ein Fragment der codierenden Region von TACE cDNA. Ein solches Fragment weist im Allgemeinen mindestens ungefähr 14 Nukleotide auf, vorzugsweise aus ungefähr 14 bis ungefähr 30 Nukleotiden. Die Fähigkeit, ein Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotid zu erstellen, basierend auf einer cDNA-Sequenz für ein bestimmtes Protein, wird zum Beispiel von Stein und Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1988 und van der Krol et al., Bio/Techniques 6:958, 1988 beschrieben.
Das Binden von Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Komplexen, welche die Translation (RNA) oder Transkription (DNA) durch eines von mehreren Mitteln blockieren, einschließlich verstärktem Abbau der Duplexe, vorzeitiger Termination von Transkription oder Translation oder durch andere Mittel. Die Gegensinn-Oligonukleotide können somit verwendet werden, um die Expression von TACE-Proteinen zu blockieren. Gegensinn- oder Sinn- Oligonukleotide weisen ferner Oligonukleotide auf, welche modifizierte Zuckerphosphodiestergrundgerüste aufweisen (oder andere Zuckerkopplungen, wie jene, die in WO91/06629 beschrieben werden) und wobei die Zuckerkopplungen endogenen Nukleasen gegenüber resistent sind. Die Oligonukleotide mit resistenten Zuckerkopplungen sind in vivo stabil (d. h., sie sind imstande, enzymatischem Abbau zu widerstehen), behalten aber Sequenzspezifizität, um in der Lage zu sein, an Ziel-Nukleotidsequenzen zu binden. Andere Beispiele für Sinn- oder Gegensinnoligonukleotide schließen jene Oligonukleotide ein, welche kovalent mit organischen Anteilen gekoppelt sind, so wie jene, die in WO 90/10448 beschrieben sind, und anderen Anteilen, welche die Affinität des Oligonukleotids für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, wie poly-(L-lysin) erhöhen. Ferner können interkalierende Wirkstoffe, wie Ellipticin, und alkylierende Wirkstoffe oder Metallkomplexe an Sinn- oder Gegensinnoligonukleotide angeheftet werden, um Bindungsspezifizitäten des Gegensinn- oder Sinnoligonukleotids für die Ziel-Nukleotidsequenz zu modifizieren.
Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch ein beliebiges Gentransferverfahren eingeführt werden, einschließlich zum Beispiel CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder durch Verwendung von Gentransfervektoren wie das Epstein-Barr-Virus. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide werden in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, vorzugsweise durch Einfügen des Gegensinn- oder Sinnoligonukleotids in einen geeigneten retroviralen Vektor eingefügt, bei anschließendem Kontaktieren der Zelle mit dem Retrovirusvektor, welcher die eingefügte Sequenz enthält, entweder in vivo oder ex vivo. Geeignete retrovirale Vektoren schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – das Mäuseretrovirus M-MuLV, N2 (ein aus M-MuLV gewonnenes Retrovirus) oder die Doppelkopievektoren mit der Bezeichnung DCT5A, DCT5B und DCT5C ein (siehe PCT-Anmeldung US 90/02656).
Sinn- oder Gegensinnoligonukleotide können auch in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleotidsequenz enthält, durch Bildung eines Konjugats mit einem ligandenbindendem Molekül eingeführt werden, wie in WO 91/04753 beschrieben. Geeignete ligandenbindende Moleküle schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Zytokine oder andere Liganden ein, welche an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise führt die Konjugation des ligandenbindenden Moleküls zu keiner wesentlichen Beeinträchtigung der Fähigkeit des ligandenbindenden Moleküls, an sein entsprechendes Molekül oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder den Eintritt des Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren.
Alternativ dazu kann ein Sinn- oder ein Gegensinn-Nukleotid in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Oligonukleotidlipid-Komplexes eingeführt werden, so wie in WO 90/10448 beschrieben. Der Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotidlipid-Komplex ist vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Isoliertes und gereinigtes TACE oder ein Fragment davon und insbesondere die extrazelluläre Domäne von TACE kann auch selbst als therapeutischer Wirkstoff bei der Regulierung der Pegel von bestimmten Zelloberflächenproteinen nützlich sein. zusätzlich zu TNF-α können andere Zytokine sowie Zytokinrezeptoren und verschiedene Adhäsionsproteine aus der Zelloberfläche durch TACE oder verwandte Proteasen freigesetzt werden. TACE oder ein Fragment davon, insbesondere die extrazelluläre Domäne von TACE kann verabreicht werden, um die Zelloberflächenzytokine, Zytokinrezeptoren und Adhäsionsproteine, die an Tumorzellenwachstum, Entzündungen oder Befruchtung beteiligt sind, zu modulieren oder zu entfernen. Wenn TACE als therapeutischer Wirkstoff verwendet wird, kann es gemäß bekannten Verfahren in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden. TACE kann in Beimischung, entweder als das einzige aktive Material oder mit anderen bekannten aktiven Materialien, mit pharmazeutisch geeigneten Verdünnungsmitteln (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), Konservierungsstoffen (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabens), Emulgatoren, Lösungsvermittlern, Hilfsstoffen und/oder Trägern kombiniert werden. Geeignete Träger und deren Formulierungen werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe 1980, Mack Publishing Co., beschrieben. Zusätzlich können solche Zusammensetzungen TACE enthalten, mit Polyethylenglycol (PEG), Metallionen komplexiert oder in polymere Verbindungen wie Polyessigsäure, Polyglycolsäure, Hydrogel usw. oder aufgenommen in Liposome, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Erythrozyten-Ghosts oder Spheroblasten aufgenommen sind. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, Stabilität, Rate der in-vivo-Freisetzung und die Rate der in-vivo-Clearance von TACE beeinflussen.
TACE kann unter Verwendung einer Reihe von Metalloprotease-Analysen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, analysiert werden. Im Allgemeinen kann TACE durch die Verwendung eines Peptidsubstrats, das die natürliche Spaltstelle von TNF-α darstellt, analysiert werden. Zum Beispiel kann das Substrat, um die Spaltung eines Substrats durch TACE zu erkennen, mit einer fluoreszierenden Gruppe auf einer Seite der Spaltstelle markiert werden und mit einer fluoreszenzlöschenden auf der gegenüberliegenden Seite der Spaltstelle. Beim Spalten durch TACE wird das Löschen beseitigt, wodurch ein erkennbares Signal bereitgestellt wird. Alternativ dazu kann das Substrat mit einer colorimetrischen Abgangsgruppe markiert werden, welche bei Spaltung stärker absorbiert. Alternativ dazu kann das Substrat eine Thioestergruppe aufweisen, die in die Spaltstelle des Substrats synthetisiert ist, so dass die Thiolgruppe beim Spalten durch TACE bleibt und leicht unter Anwendung herkömmlicher Verfahren entdeckt werden kann. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zum Erkennen von TACE-Aktivität in einer Probe wird in Beispiel 1, infra, beschrieben. Andere Verfahren zum Erkennen der TACE-Aktivität können verwendet werden, ohne auf unzumutbares Experimentieren zurückzugreifen.
Wie weiterhin in Beispiel 1, infra, beschrieben, kann auch eine quantitative Analyse für TACE verwendet werden, wobei diese Analyse das Inkubieren des Peptidsubstrats bei ungefähr 1mM mit TACE bei 37 °C über einen festen Zeitraum hinweg, das Stoppen der Reaktion durch Hinzufügen eines Säure- oder eines Metall-Chelatbildners und Bestimmen des Ausmaßes der Spaltung durch HPLC-Analyse umfasst.
Innerhalb eines Aspekts der Erfindung können TACE und Peptide, die auf der Aminosäuresequenz von TACE basieren, verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die spezifisch an TACE binden. Ein spezifisches Beispiel einer solchen Antikörperzubereitung wird hierin in Beispiel 4 beschrieben. Der Begriff „Antikörper" schließt polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Fragmente davon, wie F(ab')2 und Fab-Fragmente, sowie beliebige rekombinant erzeugte Bindungspartner ein. Antikörper werden als spezifisch bindend definiert, wenn sie TACE mit K_a von mehr als oder gleich ungefähr 10⁷M^–1 binden. Affinitäten von Bindungspartnern oder Antikörpern können leicht unter Anwendung herkömmlicher Techniken bestimmt werden, zum Beispiel mit Hilfe der von Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949) beschriebenen.
Polyklonale Antikörper können leicht aus einer Reihe von Quellen erzeugt werden, zum Beispiel aus Pferden, Kühen, Ziegen, Schafen, Hunden, Hühnern, Kaninchen, Mäusen oder Ratten, unter Anwendung von auf dem Fachgebiet hinlänglich bekannten Verfahren. Im Allgemeinen wird TACE oder ein Peptid, das auf der Aminosäuresequenz von TACE basiert, welche in geeigneter Weise konjugiert ist, an das Wirtstier typischerweise durch parenterale Injektion verabreicht. Die Immunogenizität von TACE kann durch die Verwendung eines Adjuvans, zum Beispiel durch das Freund'sche vollständige oder unvollständige Adjuvans verstärkt werden. Nach Auffrischungs-Immunisierungen, werden kleine Serumproben gesammelt und auf Reaktivität mit TACE oder den TACE-Peptiden getestet. Beispiele verschiedener Analysen, die für solche Bestimmung nützlich sind, schließen jene ein, die in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, beschrieben werden; sowie Verfahren wie Gegenstrom-Immunoelektrophorese (CIEP), Radioimmunoassay, Radio-Immunopräzipitation, Enzym Gebundene Immuno Sorptions Analyse (ELISA), Dot-Blot-Analysen und Sandwich-Analysen, siehe US-Patentschriften 4,376,1110 und 4,486,530.
Monoklonale Antikörper können einfach unter Anwendung hinlänglich bekannter Verfahren hergestellt werden, siehe zum Beispiel die Verfahren, die in den US-Patentschriften Nr. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439 und 4,411,993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn und Bechtol (Hrsg.), 1980, beschrieben werden. Kurz gesagt, den Wirtstieren, beispielsweise Mäusen, werden intraperitoneal mindestens einmal und vorzugsweise mindestens zweimal in Intervallen von ungefähr 3 Wochen isoliertes und gereinigtes TACE oder konjugiertes TACE-Peptid injiziert, gegebenenfalls in Gegenwart eines Adjuvans. Mäusesera werden dann durch herkömmliche Dot-Blot-Technik oder Antikörper-Fang (ABC) analysiert, um zu bestimmen, welches Tier für die Fusion am besten geeignet ist. Ungefähr zwei bis drei Wochen später erhalten die Mäuse eine intravenöse Auffrischungsinjektion von TACE oder konjugiertem TACE-Peptid. Die Mäuse werden später getötet und Milzzellen mit im Handel erhältlichen Myelomazellen, wie Ag8.653 (ATCC), gemäß etablierten Protokollen fusioniert. Kurz zusammengefaßt, Myelomazellen werden mehrmals in Medien gewaschen und mit Mausmilzzellen in einem Verhältnis von ungefähr drei Milzzellen zu einer Myelomazelle fusioniert. Das Fusionsmittel kann ein beliebiges geeignetes Mittel sein, das auf dem Fachgebiet verwendet wird, zum Beispiel Polyethylenglycol (PEG). Die Fusion wird in Platten ausgestrichen, welche Medien enthalten, die selektives Wachstum der fusionierten Zellen ermöglichen. Die fusionierten Zellen können dann für ungefähr acht Tage wachsen gelassen werden. Überstehende Flüssigkeiten aus resultierenden Hybridomas werden gesammelt und zu einer Platte hinzugefügt, die zuerst mit Ziegen-Antimaus-Ig überzogen wird. Nach Waschungen wird ein Marker, wie ¹²⁵I-TACE, zu jeder Vertiefung hinzugefügt, gefolgt von Inkubation. Positive Vertiefungen können in der Folge durch Autoradiographie erkannt werden. Positive Klone können in Sammel-Kultur gezüchtet werden und überstehende Flüssigkeiten werden über einer Protein-A-Säule (Pharmacia) gereinigt.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können unter Verwendung alternativer Techniken, wie jener, die von Alting-Mees et al., „Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology, 3:1–9 (1990), beschrieben wird, hergestellt werden. Ähnlich können Bindungspartner unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruiert werden, um die variablen Regionen eines Gens aufzunehmen, das einen spezifischen Bindungsantikörper kodiert. Eine solche Technik wird in Larrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989), beschrieben.
Andere Arten von „Antikörpern" können unter Verwendung der hierin bereitgestellten Informationen in Verbindung mit dem Stand der Technik hergestellt werden. Zum Beispiel sind humanisierte Antikörper, die imstande sind, TACE spezifisch zu binden, ebenfalls durch die Erfindung erfasst.
Sobald sie isoliert und gereinigt wurden, können die Antikörper gegen TACE verwendet werden, um die Gegenwart von TACE in einer Probe unter Verwendung etablierter Assay-Protokolle zu erfassen. Ferner können die Antikörper der Erfindung therapeutisch verwendet werden, um an TACE zu binden und seine Aktivität in vivo zu hemmen.
Das gereinigte TACE gemäß der Erfindung kann die Entdeckung der Hemmer von TACE erleichtern und somit von Hemmern einer exzessiven TNF-α-Freisetzung. Die Verwendung eines gereinigten TACE-Polypeptids in dem Screening von dessen potentiellen Hemmern ist wichtig und kann praktisch die Möglichkeit von beeinträchtigenden Reaktionen mit Kontaminanten ausschalten. Ein solcher Screening-Assay zum Erfassen der TACE-behindernden Aktivität eines Moleküls würde typischerweise das Mischen des potentiellen Hemmermoleküls mit einem geeigneten Substrat, das Inkubieren von TACE, das zumindest im Wesentlichen gereinigt ist, mit der Mischung und das Bestimmen des Ausmaßes der Substratspaltung umfassen, wie zum Beispiel oben beschrieben. Während verschiedene geeignete Substrate zur Verwendung im Assay entwickelt werden können, wird vorzugsweise ein Peptidylsubstrat verwendet, und dieses Substrat weist die Aminosäuresequenz Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser (SEQ ID Nr. 5) auf.
Zusätzlich können TACE-Polypeptide auch für strukturbasiertes Design von TACE-Hemmern verwendet werden. Ein solches strukturbasiertes Design ist auch als „rationales Medikamentendesign" bekannt.
Die TACE-Polypeptide können dreidimensional analysiert werden, zum Beispiel durch Röntgenstrahlenkristallographie, Kernmagnetresonanz oder Homologiemodellierung, wobei all diese Verfahren hinlänglich bekannt sind.
Solch computergestütztes Modellieren und Medikamentendesign kann Informationen wie chemische konformationale Analyse, elektrostatisches Potential der Moleküle, Proteinfalten usw. verwenden. Zum Beispiel hat sich der Großteil des Designs von klassespezifischen Hemmern der Metalloproteasen auf Bemühungen konzentriert, das katalytische Zinkatom zu chelatieren oder zu binden. Synthetische Hemmer werden für gewöhnlich entwickelt, um einen negativ geladenen Anteil zu enthalten, an den eine Reihe von anderen Gruppen geheftet werden, um in die Spezifizitätstaschen der speziellen Protease zu passen.
Die folgenden Beispiele stellen Ausführungsformen der Erfindung dar und sind nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung zu verstehen, welche in den beiliegenden Ansprüchen angeführt wird. In den folgenden Beispielen sind alle beschriebenen Verfahren, sofern nicht anders angeführt, herkömmlicher Natur.
BEISPIEL 1
Reinigung des TNF-α konvertierenden Enzyms
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Reinigen von TACE. Das TACE wurde isoliert und von den Membranen der humanen monozytischen Zelllinie THP-1, (ATCC Nr. TIB 202) gereinigt, welche stimuliert worden war, um TNF-α zu erzeugen. THP-1-Zellen wurden ausgewählt, weil sie mehr TNF-α produzieren als HL-60-Zellen, eine häufiger verwendete monozytische Zelllinie. Ungefähr 120 Billionen Zellen wurden unter Verwendung des zuvor von Kronheim et al., Arch. Biochem. Biphys. 269:698 (1992), beschriebenen Verfahrens stimuliert. Zwei Stunden nach der Stimulation wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Die geernteten Zellen wurden mindestens zweimal mit Hanks ausgeglichener Salzlösung gewaschen, und Plasmamembrane wurden gemäß dem Verfahren Nummer drei so wie von Maeda et. al., Ciochim. et. Biophys. Acta, 731:115 (1983) beschrieben, isoliert, außer, dass kein Dithiothreitol verwendet wurde, sondern 1,25 ml Homogenisierungspuffer pro ml Zellpellet. Es wurde festgestellt, dass das Standardverfahren von Maeda et al., Id., unter Verwendung von Dithiothreitol nicht in der Lage war, Verbindungen mit TACE-Aktivität zu ergeben (ein Assay bezüglich der TACE-Aktivität wird unten beschrieben). Proteine wurden dann durch Resuspendieren der Membranzubereitung in der Lösung aus 1 % Octylglucosid, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM MgCl₂ und 30 mM NaCl und kurzes Homogenisieren mit einem Brinkman-Homogenisator (zweimal jeweils fünf Sekunden) löslich gemacht. Phospholipide wurden dann extrahiert, indem vier Volumen eiskaltes (0 °C) Aceton hinzugefügt wurden; nach einer dreißig Minuten langen Inkubation bei 4 °C wurde das acetonextrahierte Material bei 1500 Umdrehungen/Minute 10 Minuten lang in einem H1000B-Rotor zentrifugiert.
Chromatographie
Das pelletierte Material wurde in 450 ml Puffer A (Puffer A enthält 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 1 % Octylglucosid (Gewicht zu Volumen Prozentanteil)) aufgelöst und auf eine 120 ml Säule von DEAE-Sepharose Schnellfluss (Pharmacia) mit 4 ml pro Minute aufgegeben. Die Säule wurde danach mit 360 ml Puffer A bei 6 ml pro Minute gewaschen, und Protein wurde im Anschluss mit einem steigenden Gradienten von NaCl (0–0,3 M) in Puffer A eluiert, bei 6 ml pro Minute über einen Zeitraum von 40 Minuten. TACE wurde mit einer NaCl-Konzentration von ungefähr 50 bis ungefähr 150 mM eluiert.
TACE wurde ursprünglich an diesem Punkt an seiner Fähigkeit, rekombinanten 26 kD TNF-α zu spalten, der an die „Flag"-Sequenz von 8 Aminosäuren am Aminoterminus (T. P. Hopp, et al., Bio Technologoy, 6:1204 (1988)) fusioniert ist, erkannt. Das Gen, das humanen TNF-α kodiert, wurde zu DNA gespleißt, welche die Flag-Sequenz kodiert; und dieses Konstrukt wurde in den pPL3-Vektor platziert (C. Maliszewski et al., Molec. Immunol., 25:429 (1987). Das Protein wurde danach in einem proteasedefizienten Stamm von E. coli (R.T. Libby et al., DNA, 6:221 (1987)) exprimiert, welcher für erforderlich befunden wurde, um die Degradierung des Vorläufers durch die Bakterien zu verhindern. Nach dem Entfernen des Wachstumsmediums wurden die Bakterien in 30 mM Tris-HCl (pH-Wert 8), 5 mM EDTA resuspendiert, und die Suspension wurde ungefähr 30 Sekunden lang beschallt. Danach wurde das Material bei 20.000 Umdrehungen pro Minute in einem SS34-Rotor 30 Minuten lang zentrifugiert, die überstehende Fraktion wurde verworfen und das Pellet mit 8 M Urea in 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8) resuspendiert. Das Material wurde mit 25 Strokes in einem Dounce-Homogenisator homogenisiert und danach bei 20.000 Umdrehungen/Minute in einem SS34-Rotor über einen Zeitraum von 30 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Fraktion, welche den Vorläufer TNF-α enthielt, wurde danach vier Mal gegen 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8) dialysiert.
Das Material wurde bei 37 °C mindestens 4 Stunden lang mit dem TACE inkubiert, das aus der DEAE-Sepharose eluiert wurde, welche mit 1 mM N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Val-chloromethylketon, 10 μg/ml Leupeptin und 1 mg/ml α1-Proteasehemmer behandelt worden war, wovon alle im Handel erhältlich sind. Der N-Terminus des resultierenden 17kD-Produktes erwies sich als jener von authentischem TNF-α. Nach der anfänglichen Identifikation von TACE auf diese Weise, wurde festgestellt, dass das Enzym auch ein 8-Restepeptid spaltet, welches das Segment Leu⁷³-Ala⁷⁴-Gln⁷⁵-Ala⁷⁶- ↓ - Val⁷⁷-Arg⁷⁸-Ser⁷⁹-Ser⁸⁰ (SEQ ID Nr. 5) von TNF-α darstellt. Wobei das (↓) die Spaltstelle darstellt. Auf der Grundlage dieser Beobachtung wurde eine quantitative Analyse durchgeführt: Das Peptid wurde bei 1 mM mit dem Enzym bei 37 °C über einen festgelegten Zeitraum hinweg in der Gegenwart von 0,1 mM Dichloroisocoumarin, 1 mM Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethylketon, 10 μg/ml Leupeptin, 10 μM Bestatin und 1 mg/ml al-Proteasehemmer (Sigma) inkubiert, die alle im Handel erhältlich sind. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von Säure oder Metallchelatbildner gestoppt. Das Ausmaß der Spaltung dieses Peptids, welches die Menge des anwesenden TACE reflektiert, wurde bestimmt, indem die Mischung auf eine Vydac-C18-Säule aufgegeben und mit einem Gradienten von 0 bis 30 % Acetonitril über einen Zeitraum von 15 Minuten eluiert wurde.
Material, das aus der DEAE-Säule mit 0,05 bis 0,25 M NaCl eluierte, wies ungefähr eine vierfach höhere spezifische Aktivität als das Ausgangsmaterial auf. Das eluierte Material wurde beschallt und dann mit Weizenkeimagglutininagarose (Vector Laboratories) zwei Stunden lang bei 4 °C geschüttelt. Vor der Verwendung wurde die Weizenkeimagglutininagarose mit 5 Säulenvolumina von Puffer B (Puffer B umfasst 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1 mM MnCl₂, 0,1 mM CaCl₂, 1 % Octylglucosid und 10 % Glycerol) gewaschen; 1 ml dieses Harzes wurde für alle 2 mg Protein in der Probe verwendet, so wie durch den BCA-Proteinassay (Pierce) ermittelt. Nach zwei Stunden wurde das Harz mit 7 Volumina von Puffer B gewaschen, und Material wurde danach mit 5 Säulen Volumina von Puffer B plus 0,3 M Acetylglucosamin (Sigma) mit 30 Minuten Intervallen zwischen der Anwendung jedes Säulenvolumens eluiert.
Eluierte Fraktionen, welche TACE-Aktivität enthielten, wiesen eine ungefähr zehnfach höhere spezifische Aktivität als das Ausgangsmaterial auf. Diese Fraktionen wurden auf ungefähr 5 ml mit Centriprep-30-Konzentratoren (Amicon) konzentriert und danach dreifach mit Puffer C (Puffer C enthält 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8), 1 % Octylglucosid und 10 % Glycerol) verdünnt. Das verdünnte Material wurde beschallt (drei 10-Sekunden-Bursts) und dann auf eine MonoQ HR 5/5-Säule (Pharmacia) bei 0,5 ml pro Minute geladen. Die Säule wurde danach mit 10 ml Puffer C bei 0,5 ml pro Minute gewaschen, und Material wurde mit einem 0 bis 0,25 M NaCl-Gradienten im Puffer C bei 0,5 ml pro Minute über einen Zeitraum von 30 Minuten eluiert. Die TACE-Aktivität (in dieser Phase erkannt und danach durch Inkubation mit dem zuvor beschriebenen Peptidsubstrat in Abwesenheit von Proteasehemmern) eluierte mit ungefähr 0,15 M NaCl.
Die NaCl-Konzentration in den MonoQ-Fraktionen, welche Aktivität enthielten, wurde um mindestens das Zehnfache reduziert, indem das Material in den Puffer C verdünnt wurde, und das Material wurde danach auf eine Säule aus Hydroxyapatit (American International Chemical, keramisches Hydroxyapatit HS40) mit einer Rate von 0,5 ml pro Minute angewendet. Nach dem Waschen mit drei Säulen-Volumina von Puffer C wurde Protein mit einem 0 bis 50 mM Gradienten von Natriumphosphat bei 1 ml pro Minute über einen Zeitraum von 30 Minuten eluiert. TACE eluierte mit ungefähr 15 mM Natriumphosphat.
Das TACE, das aus der Hydroxyapatitsäule eluierte, wurde danach auf ungefähr 100 μl mit Centricon-50-Konzentratoren (Amicon) konzentriert und auf eine Bio-Rad SEC-400 Klassierungssäule (30 cm) aufgegeben. Protein wurde mit Puffer C, das durch die Säule mit 0,5 ml pro Minute lief, eluiert; TACE eluierte bei ungefähr 28 Minuten.
Das TACE, das aus der Klassierungssäule eluierte, wurde dreifach in den Puffer D verdünnt (Puffer D enthält 20 mM MES (pH-Wert 6), 1 % Octyglucosid und 10 % Glycerol) und auf eine 1 ml Säule Rot-120-Agrose (Sigma) bei 0,25 ml pro Minute angewendet. Danach wurde die Säule mit 10 ml Puffer D gewaschen, das Protein wurde mit einem 0 bis 1 M NaCl-Gradienten in Puffer D bei 0,25 ml pro Minute über einen Zeitraum von 60 Minuten gewaschen. TACE eluierte mit 0,2 bis 0,3 M NaCl. Fünf Prozent jeder eluierten Fraktion wurden auf einem SDS-Polyacrylamidgel (10 %) durchgeführt und Silberfärbung zeigte, dass das prädominante Protein in den Fraktionen mit Aktivität ungefähr in der Mitte zwischen dem 66 und dem 97kD-Marker (Novex) auf dem Gel bei ungefähr 80 kD verlief.
Trifluoressigsäure (TFA) wurde zu 0,2 % (Volumen-zu-Volumen-Prozentsatz) eines Pools jener Fraktionen hinzugefügt, welche das ungefähr 80-kD-Protein enthielten, und die Mischung wurde dann auf eine 2,1 × 5 cm C4-Säule mit ungefähr 100 μl pro Minute unter Verwendung von Shimadzu LC-10AD gepumpt. Protein wurde mit einem 0 bis 100 % Gradienten Acetonitril in 0,1 % TFA bei 100 μl pro Minute über einen Zeitraum von 100 Minuten eluiert. Ein-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt, und 5 bis 10 % jeder Fraktion wurden auf einem Novex-SDS-Polyacrylamidgel (10 %) durchgeführt. Fraktionen, die mit ungefähr 70 % Acetonitril eluierten und die ein Protein von ungefähr 80 kD enthielten, wurden gepoolt und zu Trockenheit verdampft.
Erzeugung von Peptiden und Sequenzieren
Dieser Pool an Fraktionen wurde danach in 200 μl von 50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA aufgelöst, und eine Menge von Endo-LYS-C (Promega), die ungefähr 1/50 der Menge von Protein in der Probe entsprach, wurde hinzugefügt. Das Material wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert, und danach wurde ein frischer Anteil derselben Menge von Endo-LYS-C über weitere 3 Stunden bei 37 °C hinzugefügt.
Die resultierenden Peptide wurden getrennt, indem das Material auf eine kapillare C18-Säule bei 20 μl pro Minute aufgegeben und mit einem aufsteigenden Gradienten von Acetonitril (0,5 % pro Minute) in 0,1 % TFA über einen Zeitraum von 200 Minuten eluiert wurde. Peptide wurden mit einem ABI 476 oder einem ABI 494 automatisierten Sequenzer sequenziert.
BEISPIEL 2
Zubereitung von isoliertem und gereinigtem TACE
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum weiteren Reinigen des gereinigten TACE, wie es unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Gereinigtes TACE, das aus den THP-1-Zellen erhalten wurde, kann kleine Mengen an humanem lysosomalem 85 kD Sialoglycoprotein (Biochem. Biophys. Res. Commun. 184:604–611 (1992)) und humaner lysosomaler Alpha-Mannosidase (Biochem. Biophys. Res. Comm. 200:239–245 (1994) enthalten, die unter Anwendung von standardmäßigen Immunoadsorbantverfahren entfernt werden können, wie sie zum Beispiel in Robert K. Scopes, Protein Purification -- Principles and Practice (Springer-Verlag, 2. Ausgabe), Seiten 167–172, beschrieben werden. Unter Anwendung der in diesem Beispiel 2 beschriebenen Verfahren kann isoliertes und gereinigtes TACE erhalten werden.
BEISPIEL 3
Klonen von humanem TACE
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Isolieren einer DNA-Sequenz, welche humanes TACE kodiert. Eine random-primed cDNA-Bibliothek wurde aus der im Handel erhältlichen Zelllinie THP-1 (Amersham) unter Anwendung herkömmlicher Verfahren erzeugt. Polymerasekettenreaktion (PCR) (Multis und Faloona, Meth. Enzymol. 155:335–350, 1987)-Amplifikationen wurden unter Verwendung folgender Primer durchgeführt:
Primer (1): 5'-AARTAYGTNATGTAYCC-3' SEQ ID Nr. 6
Primer (2): 5'-CCRCARTCRCAYTCYTC-3' SEQ ID Nr. 7
Der Primer (1) basiert auf den ersten fünf Aminosäuren von Peptid (2) mit Zugabe eines Triplets, welches für Lysin am 5'-Ende kodiert. Primer (2) ist gegensinnig zu einer konservierten Aminosäuresequenz Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly (EECDCG) SEQ ID Nr. 8, welche in einer homologen Metalloprotease, Rinderreprolysin 1 (GenBank Zugriffsnummer #Z21961) gefunden wird:
Einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung der gemischten Oligonukleotide, die oben beschrieben sind, unter standardmäßigen PCR-Bedingungen amplifiziert. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden durch Gel-Elektrophorese fraktioniert, und DNA-Bande von ungefähr 180 by wurden isoliert und in im Handel erhältliches pBLUESCRIPT subkloniert. Das Sequenzieren ergab einen Klon, welcher eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuren Ile-Ala-Val-Ser-Gly-Asp-His-Glu-Asn-Asn-Lys (SEQ ID Nr. 9) kodiert und eine Nukleotidsequenz enthielt, die für Aminosäuren Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly (EECDCG) (SEQ ID Nr. 8) kodiert. Dieser Klon wurde als „ 30CD-Klon" bezeichnet. Der 30CD-Klon wurde sequenziert, und Primer wurden auf der Basis dieser Sequenz erzeugt. Die Primer wurden danach verwendet, um TACE cDNA in einer Phage-Bibliothek zu erfassen, die aus humanen KB-Zellen hergestellt wurde. Diese Bibliothek wurde unter herkömmlichen Bedingungen unter Verwendung einer Sonde basierend auf der 30CD-Sequenz gescreent. Positive Hybridisierungsplaqus wurden isoliert und DNA-Fragmente dieser Klone sequenziert. Das Sequenzieren ergab eine Volllängen-cDNA von humanem TACE, welche in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist. Das humane TACE erwies sich als ein Typ-I-Transmembranprotein von 824 Aminosäuren, einschließlich eines N-terminalen 17 Aminosäuresignalpeptids. Auf das Signalpeptid folgt eine extrazelluläre Domäne von 654 Aminosäuren, eine transmembrane Domäne mit 23 Aminosäuren und eine cytoplasmische Domäne mit 130 Aminosäuren. Eine alternative gespleißte Variante wurde kloniert und sequenziert, wobei sich herausstellte, dass diese dieselbe Aminosäuresequenz wie TACE enthielt, außer dass ein 50 by Fragment am 5'-Ende der cytoplasmischen Domäne gestrichen ist, wodurch der Leserahmen verschoben wird, um eine cytoplasmische Domäne mit sechs Aminosäuren zu kodieren. Die Aminosäuresequenz dieser Variante wird in SEQ ID Nr. 4 dargestellt, wobei die cDNA in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist.
BEISPIEL 4
Herstellung von Antikörpern gegen TACE
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Erzeugen von monoklonalen Antikörpern gegen TACE. Balb/c-Mäusen wurden zweimal in Intervallen von drei Wochen Injektionen mit 10 μg isoliertem und gereinigtem TACE von Beispiel 1 oder Peptiden auf der Basis der Aminosäuresequenz von TACE in der Gegenwart von RIBI-Adjuvans (RIBI Corp. Hamilton, Montana) verabreicht. Danach werden Mäusesera durch herkömmliche Dot-Blot-Technik oder Antikörperfang (ABC) analysiert, um zu bestimmen, welches Tier sich am besten zum Fusionieren eignet. Drei Wochen später erhalten die Mäuse eine intravenöse Auffrischungsinjektion mit 3 μg humanem TACE oder TACE-Peptid, suspendiert in sterilem PBS. Drei Tage später werden die Mäuse getötet und Milzzellen mit Ag8.653 Myelomazellen (ATCC) gemäß etablierten Protokollen fusioniert. Kurz, es werden Ag8.653-Zellen mehrmals in serumfreiem Medien gewaschen und mit Mäusemilzzellen in einem Verhältnis von drei Milzzellen zu einer Myelomazelle fusioniert. Das Fusioniermittel ist 50 % PEG: 10 % DMSO (Sigma). Die Fusion wird in zwanzig 96-Vertiefungen-Flachbodenplatten (Corning) ausgestrichen, welche HAT-supplementierte DMEM-Medien enthalten und acht Tage wachsen gelassen. Überstehende Flüssigkeiten aus resultierenden Hybridoma werden gesammelt und einer 96-Vertiefungen-Platte sechzig Minuten lang hinzugefügt, die zuerst mit Ziegen-Antimaus-Ig überzogen wird. Nach den Waschvorgängen wird ¹²⁵I-TACE zu jeder Vertiefung hinzugefügt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und viermal gewaschen. Positive Vertiefungen können danach durch Autoradiographie bei –70 °C unter Verwendung von Kodak-X-Omat-S-Film erkannt werden. Positive Klone können in Sammel-Kultur gezüchtet werden, und überstehende Flüssigkeiten werden danach über einer Protein-A-Säule (Pharmacia) gereinigt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes und gereinigtes TNF-Alpha konvertierendes Enzympolypeptid, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 9 aufweist.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 1, welches ein Fragment von SEQ ID Nr. 2 aus Aminosäure 215–477 aufweist.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, welches ein Fragment von SEQ ID Nr. 2 aus Aminosäure 18–477 aufweist.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid mit den Aminosäuren 18-Xaa der SEQ ID Nr. 2 ausgewählt ist, wobei Xaa eine Aminosäure ist, welche aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure 671 bis einschließlich 824 ausgewählt ist.
Isoliertes und gereinigtes TACE-Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 80 % mit der Aminosäuresequenz eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 identisch ist.
Isoliertes und gereinigtes TACE-Polypeptid nach Anspruch 6, wobei die Aminosäuresequenz zu mindestens 90 % mit der Aminosäuresequenz eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 identisch ist.
Isoliertes und gereinigtes TACE-Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid in der Lage ist, TNF-α von der 26kD-Form in die 17kD-Form zu konvertieren.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches ein Molekulargewicht von etwa 80 kD aufweist.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches ein rekombinantes ist.
Isolierte und gereinigte Antikörper, die an ein TACE-Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche binden.
Isolierte und gereinigte Antikörper nach Anspruch 11, wobei die Antikörper monoklonale Antikörper sind.
Isolierte Nukleinsäure welche ein TACE-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 aufweist.
Isolierte Nukleinsäure, welche unter moderat stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure nach Anspruch 13 hybridisiert und welche ein Polypeptid kodiert, das TNF-α von der 26kD-Form in die 17kD-Form konvertiert.
Isolierte Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) cDNA die Nukleotide 52–2472 der SEQ ID Nr. 1 aufweist; b) Nukleinsäure, die zu mindestens 80 % mit der Nukleinsäure aus a) identisch ist und welche ein Polypeptid kodiert, das TNF-α von der 26kD-Form in die 17kD-Form konvertiert; und c) Nukleinsäure, welche aufgrund des genetischen Codes zu einer in a) oder b) definierten Nukleinsäure degeneriert ist und welche biologisch aktives TACE kodiert.
Expressionsvektor, welcher die Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 15 lenkt.
Wirtszelle, welche die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 13 bis 15 oder den Expressionsvektor nach Anspruch 16 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines TACE-Polypeptides, welches das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 17 unter Expressions-fördernden Bedingungen aufweist.
Isoliertes und gereinigtes TACE-Polypeptid, welches aus der Kultur nach Anspruch 18 gewonnen ist.
Verfahren zur Erkennung der TACE-behindernden Aktivität eines Moleküls, welches das Mischen des Moleküls mit einem Substrat und einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 19 und das Bestimmen des Ausmaßes der Substratspaltung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Substrat die Aminosäuresequenz Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser (SEQ ID Nr. 5) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Substrat membrangebundenes TNF-α ist.
Verfahren zur Erkennung der TNF-Spaltfähigkeit eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 19, welches das Inkubieren des Polypeptides mit einem Substrat, welches die Aminosäuresequenz Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser (SEQ ID Nr. 5) enthält und das Bestimmen des Ausmaßes der Substratspaltung aufweist.
Antikörper, welcher die Aktivität eines TACE-Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 19 behindert.
Verwendung eines TACE-Polypeptides nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 19 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren, Entzündungen oder Fruchtbarkeitsstörungen.
Verwendung eines TACE-Polypeptides nach Anspruch 25, wobei das TACE-Polypeptid ein Zelloberflächen-Zytokin, einen Zytokinrezeptor oder ein Adhäsionsprotein moduliert oder entfernt.