ES2307332T3 - Celulas de estroma aisladas para uso en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central. - Google Patents

Abstract

Uso de células estromales aisladas de una muestra de médula ósea de un donante humano para preparar un medicamento para tratar un paciente humano que tiene una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central, por administración directa al sistema nervioso central y además en el que dicha enfermedad, trastorno o afección se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, apoplejía y lesión de médula espinal.

Description

Células de estroma aisladas para uso en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central.

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de células estromales aisladas de una muestra de médula ósea de un donante humano para preparar un medicamento para tratar un mamífero que padece una enfermedad, un trastorno o una afección asociada al sistema nervioso central.

Antecedentes de la invención

La lesión neurológica en un mamífero que tiene como su traumatismo de generación una formación tumoral o un componente genético u otro es muy difícil de tratar y/o invertir en el mamífero. Un tratamiento del daño neurológico del sistema nervioso central es el neurotrasplante. A lo largo de las últimas décadas se ha usado el neurotrasplante para explorar el desarrollo, la plasticidad y la regeneración del sistema nervioso central (McKay, 1997, Science 276: 66-71). Además, el neurotrasplante se ha usado para realizar la reparación y la restauración funcional de tejidos nerviosos enfermos y lesionados (Bjorklund, 1993, Nature 362: 414-415; Olson, 1997, Nature Med. 3: 1329-1335; Spencer et al., 1992, N. Engl. J. Med. 327: 1541-1548: Freed et al., 1992, N. Engl. J. Med 327: 1549-1555; Kordower et al., 1995, N. Engl. J. Med. 332: 1118-1124; Defer et al., 1996, Brain 119: 41-50; Lopez-Lozano et al., 1997, Transp. Proc. 29: 977-980; Rosenstein, 1995, Exp. Neurol. 33: 106; Turner et al., 1993, Neurosurg. 33: 1031-1037; Kang et al., 1993, J. Neurosci. 13: 5203-5211; Andersson et al., 1993, Int. J. Dev. Neurosci. 11: 555-568; Sanberg et al., 1997, Nature Med. 3: 1129-1132). En particular, se ha tratado una serie de pacientes humanos con enfermedad de Parkinson mediante el neurotrasplante de células mesencefálicas obtenidas de abortos de fetos humanos de 6 a 9 semanas de edad (Spencer et al., 1992, N. Engl. J. Med. 327: 1541-1548; Freed et al., 1992, N. Engl. J. Med 327: 1549-1555; Kordower et al., 1995, N. Engl. J. Med. 332: 1118-1124; Defer et al., 1996, Brain 119: 41-50; Lopez-Lozano et al., 1997, Transp. Proc. 29: 977-980). Algunos de los pacientes mostraron mejora significativa tanto en los síntomas clínicos como en la síntesis de dopamina como se evaluó por la captación de fluorodopa usando tomografía de emisión de positrones (Spencer et al., 1992, N. Engl. J. Med. 327: 1541-1548: Freed et al., 1992, N. Engl. J. Med 327: 1549-1555; Kordower et al., 1995, N. Engl. J. Med. 332: 1118-1124; Defer et al., 1996, Brain 119: 41-50). Sin embargo, el proceso para obtener tejido fetal para usos terapéuticos ha presentado barreras logísticas y éticas importantes (Rosenstein, 1995, Exp. Neurol. 33: 106; Turner et al., 1993, Neurosurg. 33: 1031-1037). Además, solamente sobreviven aproximadamente del 5 al 10% de las neuronas dopaminérgicas, al parecer debido a reacción inmune adversa con las mismas (Lopez-Lozano et al., 1997, Transp. Proc. 29: 977-980) y debido a que el tejido fetal depende principalmente del metabolismo lipídico en vez del glicolítico (Rosenstein, 1995, Exp. Neurol. 33: 106). Por estas razones se han realizado intentos de desarrollar células alternativas tales como fibroblastos (Kang et al., 1993, J. Neurosci. 13: 5203-5211), astrocitos fetales (Andersson et al., 1993, Int. J. Dev. Neurosci. 11: 555-568) y células de Sertoli (Sanberg et al., 1997, Nature Med. 3: 1129-1132) que son adecuadas para el neurotrasplante.

Para tratar enfermedades, trastornos o afecciones del sistema nervioso central, tales como, por ejemplo, tumores cerebrales, traumatismo cerebral, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y lesión de médula espinal, por trasplante, las células de donante deben estar fácilmente disponibles, ser capaces de una expansión rápida en cultivo, ser inmunológicamente inertes, tener capacidad de supervivencia a largo plazo e integración en el tejido cerebral del hospedador y ser susceptibles a transfección estable y expresión a largo plazo de genes exógenos (Bjorklund, 1993, Nature 362: 414-415; Olson, 1997, Nature Med. 3: 1329-1335). Las células de donante que cumplen estos criterios actualmente no están disponibles.

Además de las células madre hematopoyéticas, la médula ósea contiene precursores similares a células madre de células no hematopoyéticas, tales como osteoblastos, condrocitos, adipocitos y mioblastos (Owen et al., 1988, en Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symposium 136, Chichester, UK, págs. 42-60; Caplan, 1991, J. Orthop. Res. 9: 641 -650; Prockop, 1997, Science 276: 71-74). Los precursores no hematopoyéticos de la médula ósea se han denominado de forma diversa fibroblastos de unidades formadoras de colonias, células madre mesenquimales y células estromales de médula (MSC).

Las MSC son células precursoras mesenquimales (Friedenstein et al., 1976, Exp. Hemat. 4: 267-274) que se caracterizan por sus propiedades de adherencia cuando se retiran las células de médula ósea de un mamífero y se transfieren a placas de plástico. En el intervalo de aproximadamente cuatro horas, las MSC se adhieren al plástico y, por tanto, se pueden aislar retirando células no adherentes de las placas. Las células de médula ósea, es decir, las MSC, que se adhieren de forma firme al plástico, se han estudiado de forma extensa (Castro-Malaspina et al., 1980, Blood 56: 289-30125; Piersma et al., 1985, Exp. Hematol 13: 237-243; Simmons et al., 1991, Blood 78: 55-62; Beresford et al., 1992, J. Cell. Sci. 102: 341-3 51; Liesveld et al., 1989, Blood 73: 1794-1800; Liesveld et al., Exp. Hematol 19: 63-70; Bennett et al., 1991, J. Cell. Sci. 99: 131-139). Las expresiones "MSC" y "células estromales" se usan de forma intercambiable en la presente memoria.

Se cree que las células estromales participan en la creación del microentorno dentro de la médula ósea in vivo. Cuando se aíslan, las células estromales inicialmente son quiescentes pero finalmente comienzan a dividirse de tal forma que se pueden cultivar in vitro. Se pueden establecer y mantener números expandidos de células estromales. Se han usado las células estromales para generar colonias de células fibroblásticas, adipocíticas y osteogénicas cuando se cultivan en condiciones apropiadas. También se pueden producir para diferenciarse en células de cartílago y mioblastos. Si las células adherentes se cultivan en presencia de hidrocortisona u otras condiciones selectivas, se obtienen poblaciones enriquecidas en precursores o células osteogénicas (Carter et al., 1992, Blood 79: 356-364 y Bienzle et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91: 350-354).

\global\parskip0.900000\baselineskip

Hay varios ejemplos del uso de células estromales para el tratamiento de enfermedad. Por ejemplo, la Patente Europea EP 0.381.490 describe terapia génica usando células estromales. En particular se describe un método para tratar hemofilia. Las células estromales se han usado para producir tejido fibroso, hueso o cartílago cuando se implantan en tejidos selectivos in vivo (Ohgushi et al., 1989, Acte. Orthop. Scand. 60: 334-339; Nakahara et al., 1992, J. Orthop. Res. 9: 465-476; Niedzwiedski et al., 1993, Biomaterials 14: 115-121; y Wakitani et al., 1994, J. Bone & Surg. 76A: 579-592). En algunos informes se han usado células estromales para generar hueso o cartílago in vivo cuando se implantan por vía subcutánea con una cerámica porosa (Ohgushi et al., 1989, Acta. Orthop. Scand. 60: 334-339), por vía intraperitoneal en una cámara de difusión (Nakahara et al., 1991, J. Orthop. Res. 9: 465-476), por vía percutánea en un defecto óseo inducido quirúrgicamente (Niedzwiedski et al., 1993, Biomaterials 14: 115-121) o trasplantados dentro de un gel de colágeno para reparar un defecto quirúrgico en un cartílago articular (Wakitani et al., 1994, J. Bone Surg. 76A: 579-592). Piersma et al. (1983, Brit. J. Hematol. 94: 285-290) describe que después del trasplante de médula ósea intravenoso, las células formadoras de colonias de fibroblastos que establecen el estroma hematopoyético se alojan y permanecen en la médula ósea del hospedador. Stewart et al. (1993, Blood 81: 2566-2571) observaron recientemente que administraciones inusualmente grandes y repetidas de células de médula completa produjeron un injerto a largo plazo de precursores hematopoyéticos en ratones que no se habían sometido a ablación de médula. Además, Bienzle et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 350-354) usaron de forma exitosa cultivos de médula ósea a largo plazo como células de donante para poblar de forma permanente células hematopoyéticas en perros sin ablación de médula. En algunos informes se usaron células estromales como células que establecieron un microentorno para el cultivo de precursores hematopoyéticos (Anklesaria, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7681-7685) o como una fuente de una población enriquecida de células madre hematopoyéticas (Kiefer, 1991, Blood 78 (10): 2577-2582).

Sievers et al. GLIA 1994, 245-258 describe la diferenciación de monocitos sanguíneos y macrófagos esplénicos en células similares a microglía.

El documento US5082670 describe el tratamiento de enfermedades y lesiones del SNC, por ejemplo, enfermedad de Parkinson, que comprende injertar células modificadas genéticamente, por ejemplo, fibroblastos, en el SNC.

Dada la escasez de tratamientos exitosos para enfermedades, trastornos y afecciones del sistema nervioso central, sigue habiendo una necesidad de métodos adicionales para tratar pacientes afectados por una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central. La presente invención satisface esta necesidad y supera las deficiencias de tratamientos de la técnica antecedente.

Compendio de la invención

La invención se refiere al uso de células estromales aisladas a partir de una muestra de médula ósea de un donante humano para preparar un medicamento para tratar un paciente humano que tenga una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central. Las realizaciones de la invención son:

1.

Uso de células estromales aisladas a partir de una muestra de médula ósea de un donante humano para preparar un medicamento para tratar un paciente humano que tiene una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central, por administración directa al sistema nervioso central y además en el que dicha enfermedad, trastorno o afección se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, apoplejía y lesión de médula espinal.

2.

El uso de la realización 1, en el que dicho donante humano no padece una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central y en el que dicho donante humano es singenéico con dicho paciente.

3.

El uso de la realización 1, en el que dicho donante humano es dicho paciente humano.

4.

El uso de la realización 1, en el que dichas células estromales aisladas administradas a dicho sistema nervioso central permanecen presentes o se replican en dicho sistema nervioso central.

5.

El uso de la realización 1, en el que dichas células estromales aisladas se han cultivado in vitro.

6.

El uso de la realización 1, en el que dichas células estromales aisladas son células estromales transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica, donde dicha proteína se expresa en dichas células y dicha proteína sirve para realizar el tratamiento de dicha enfermedad, trastorno o afección.

7.

El uso de la realización 6, en el que dicha proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en una citocina, una quimiocina, una neurotrofina, un anticuerpo y una proteína tóxica para glioma.

8.

El uso de la realización 1, en el que dichas células estromales aisladas son células estromales transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica, en el que dicha proteína se secreta por dichas células y dicha proteína sirve para realizar el tratamiento de dicha enfermedad, trastorno o afección.

\global\parskip1.000000\baselineskip

9.

El uso de la realización 8, en el que dicho ácido nucleico aislado está unido de forma funcional a una secuencia promotora/reguladora.

10.

El uso de la realización 8, en el que dicha proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en una citocina, una quimiocina, una neurotrofina, un anticuerpo y una proteína tóxica para glioma.

11.

El uso de la realización 6, en el que dicho ácido nucleico aislado es una copia de tipo silvestre de un gen mutado, no funcional o sub-expresado, en el que dicho ácido nucleico aislado está unido de forma funcional a una secuencia promotora/reguladora y se expresa en dichas células estromales aisladas.

12.

El uso de la realización 8, en el que dicho ácido nucleico aislado es una copia de tipo silvestre de un gen mutado, no funcional o sub-expresado, en el que dicho ácido nucleico aislado está unido de forma funcional a una secuencia promotora/reguladora y se expresa en dichas células estromales para generar una proteína que se secreta por dichas células estromales aisladas.

13.

El uso de la realización 1, en el que dichas células estromales aisladas son células estromales que se pre-diferencian cultivando dichas células estromales en presencia de una población sustancialmente homogénea de células diferenciadas o en presencia de un inductor de diferenciación celular, por lo que dicha célula estromal aislada se diferencia y adquiere las características fenotípicas de las células diferenciadas o la característica de fenotipo de diferenciación de una célula tratada con el inductor.

14.

El uso de la realización 1, en el que dichas células estromales aisladas se han sometido a al menos una de las etapas de cultivar dichas células in vitro, introducir ácido nucleico aislado en dichas células y pre-diferenciar dichas células.

15.

El uso de la realización 1, en el que dichas células estromales aisladas son células estromales que se aíslan inmunológicamente.

16.

Un método para dirigir la diferenciación de una célula estromal de médula ósea humana aislada en un astrocito adecuado para la preparación de un medicamento para tratar un paciente humano que tiene una enfermedad, un trastorno o una afección del SNC, comprendiendo dicho método cultivar dicha célula estromal aislada en presencia de una población sustancialmente homogénea de astrocitos, por lo que dicha célula estromal aislada se diferencia y adquiere las características fenotípicas de los astrocitos diferenciados.

17.

El uso de la realización 8, en el que la transfección de las células estromales se ha realizado usando un vector retroviral.

18.

El uso de la realización 6 u 8, en el que dichas células estromales aisladas son adecuadas para administrarse por injerto de las células directamente en el cerebro.

19.

El uso de la realización 4, en el que dichas células estromales aisladas administradas a dicho sistema nervioso permanecen presentes o se replican en dicho sistema nervioso central hasta aproximadamente 150 días.

20.

El uso de la realización 1, en el que después de administrar dicho medicamento al sistema nervioso central, aproximadamente 0,1% de dichas células estromales aisladas administradas al sistema nervioso central son capaces de expresar un marcador de diferenciación en células macrogliales, astrocitos o neuronas.

21.

El uso de la realización 20, en el que dicho marcador de diferenciación es proteína ácida fibrilar glial.

22.

El uso de la realización 6 u 8, en el que dicha proteína terapéutica es una enzima requerida en la biosíntesis de un neurotransmisor que es deficiente o no se produce en una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central.

23.

El uso de la realización 22, en el que dicho neurotransmisor es L-DOPA.

24.

El uso de la realización 22, en el que dicho medicamento realiza una disminución en un fenotipo observado para enfermedad de Parkinson.

25.

El uso de la realización 24, en el que dicho fenotipo observado para enfermedad de Parkinson es rotación inducida por apomorfina en un modelo de rata para enfermedad de Parkinson.

26.

El uso de la realización 23, en el que dichas células estromales aisladas continúan sintetizando y secretando L-DOPA durante al menos 3 días.

27.

El uso de la realización 23, en el que dicho L-DOPA se convierte en metabolitos de L-DOPA.

\newpage

Se describe una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central se seleccionan del grupo que consiste en una enfermedad genética, un tumor, traumatismo y apoplejía.

También se describe lesión de los tejidos o las células del sistema nervioso central.

Se describe una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central seleccionado del grupo que consiste en una enfermedad genética, un tumor, traumatismo y apoplejía.

También se describe lesión de los tejidos o las células del sistema nervioso central.

Adicionalmente se describe tumor cerebral.

Aunque no es parte de la invención reivindicada, se describe que cuando se tiene que tratar un tumor cerebral, el tumor cerebral es un glioma, y cuando se usa una proteína terapéutica, la proteína terapéutica es una proteína tóxica para el glioma. Preferiblemente, la proteína tóxica de glioma es un ligando Fas, un anticuerpo de cadena única biespecífico dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y CD3 o un anticuerpo dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema de las construcciones retrovirales pCMV-lac Z, pCOL1-lac Z y pCOL2-lac Z. Los casetes de las construcciones génicas son: LTR-Neo-promotor-Lac Z-30 LTR.

La Figura 2 es una ilustración esquemática de una cámara de difusión.

La Figura 3 es un gráfico que ilustra el efecto de PDGF-AA sobre el crecimiento de MSC humanas. Se representan los siguientes símbolos: \blacklozenge, control; \ding{115}, 2-5 ng/ml de PDGF; \square, 2-5 ng/ml de PDGF; \blacksquare, 2-5 ng/ml de PDGF.

Las Figuras 4A-4F son imágenes de una serie de microfotografías que ilustran las características morfológicas de MSC y astrocitos en cultivo. Las Figuras 4A y 4B ilustran dos tipos de MSC humanas, planas y alargadas. La Figura 4C ilustra MSC de rata. La Figura 4D ilustra núcleos marcados fluorescentemente de MSC humanas antes del implante. Las Figuras 4E y 4F ilustran tinción de inmunofluorescencia indirecta de astrocitos con anticuerpos contra vimentina y proteína ácida fibrilar glial.

Las Figuras 5A-5F son imágenes de una serie de microfotografías que ilustran el sitio del implante de células estromales de médula ósea en el cuerpo estriado de ratas adultas. La Figura 5A ilustra el sitio del implante de MSC humanas después de 14 días. La Figura 5B ilustra una sección adyacente a la mostrada en la Figura 5A, donde las MSC humanas se tiñeron con anticuerpos para HLA-ABC. La Figura 5C ilustra una sección adyacente a la de la Figura 5A, en la que se examinaron las células para fluorescencia nuclear de MSC humanas. La Figura 5D ilustra el sitio del implante de MSC humanas después de 72 días. La Figura 5E ilustra el mismo sitio de implante que la Figura 5D de MSC humanas después de 30 días. La Figura 5F ilustra el sitio del implante de MSC humanas después de 14 días. Estas células se examinaron por fluorescencia nuclear.

La Figura 6, que comprende las Figuras 6A y 6B, es una serie de dibujos de líneas de prosencéfalo de rata que ilustra la migración de MSC a través del cerebro. El dibujo es un compuesto de cerebros examinados 4, 14, 30 y 72 días después de la infusión de células. El patrón de implante y migración de MSC humanas es similar al de astrocitos de rata. Las células periféricas, localizadas en la corteza temporal y áreas del cuerpo calloso más alejadas de los sitios de inyección, fueron las primeras en desaparecer. Se representan los siguientes símbolos: \medbullet, MSC humanas; \medcirc, astrocitos de rata.

Las Figuras 7A-7C son imágenes de una serie de microfotografías que ilustran la tinción con anticuerpo para colágeno I y fibronectina. La Figura 7A ilustra MSC humanas teñidas con anticuerpos para colágeno I antes del implante. La Figura 7B ilustra MSC humanas teñidas con anticuerpos para fibronectina. La Figura 7C ilustra una sección de un cerebro de rata teñido para fibronectina 5 días después del implante de MSC humanas.

Las Figuras 8A-8D son imágenes de una serie de microfotografías que ilustran la inmunotinción de MSC de rata en cultivo. La Figura 8A ilustra la tinción de inmunofluorescencia indirecta para Vimentina con un aumento de 20 x (escala = 0,1 mm) donde el inserto es una imagen de un control positivo de fibroblastos a un aumento de 20 x. La Figura 8B ilustra la tinción de inmunofluorescencia indirecta para Nestina a un aumento de 40 x, donde el inserto es una superposición de fase del mismo campo (escala = 0,1 mm). La Figura 8C ilustra la tinción de inmunofluorescencia indirecta para GFAP a un aumento de 40 x, donde el inserto es una imagen de un control positivo de astrocitos a un aumento de 20 x (escala = 0,1 mm). La Figura 8D ilustra la tinción de inmunofluorescencia indirecta para S 100 con superposición de fase a un aumento de 20 X (escala = 0,1 mm).

Las Figuras 9A-9C son imágenes de una serie de microfotografías que ilustran la cuantificación de cultivos primarios de prosencéfalos de rata después del implante de HMSC. La Figura 9A ilustra una región no confluente del cultivo celular mixto de prosencéfalo de rata. Las HMSC no se pueden diferenciar morfológicamente de células cerebrales endógenas. La Figura 9B ilustra células cultivadas recogidas en un hemocitómetro observadas bajo un microscopio de fase. La Figura 9C ilustra las mismas células que en la Figura 9b visualizadas con un microscopio de fluorescencia que demuestra hMSC marcadas con bis-benzamida, que se implantaron en el cerebro de rata 30 días antes del
cultivo.

Las Figuras 10A-10D son imágenes de una serie de microfotografías que ilustran la recuperación de células humanas de cultivos enriquecidos con astrocitos de cerebro de rata. Los cultivos de cerebro de rata se prepararon dos semanas después del implante de hMSC. Las muestras se tiñeron inmunocitoquímicamente. Las Figuras 10A-D ilustran una célula aislada en cultivo teñida del siguiente modo: La Figura 10A ilustra la tinción con anticuerpos para GFAP (contra GFAP humana generada en conejo, DAKO); la Figura 10B ilustra la tinción con anticuerpos para HLA-ABC humana (generada en ratón, Pharmingen); La Figura 10C ilustra la tinción con anticuerpos marcados doblemente (aumento 40x, escala 25 \mum); y la Figura 10D ilustra la tinción con anticuerpos marcados doblemente en una muestra diferente de células cerebrales de rata cultivadas.

La Figura 11, que comprende las Figuras 11A, 11B y 11C, es un trío de una ilustración esquemática de las estrategias usadas para modificar por ingeniería genética hMSC para secretar proteínas tóxicas para tumor.

La Figura 12 es una imagen de un ensayo de transferencia de Western que demuestra la síntesis y la secreción de FasL soluble por células COS transfectadas con un ADNc para FasL soluble (truncado). El ADNc estaba contenido dentro del plásmido pSecTag^{2}/Hyg. Las células se transfectaron de forma transitoria con lipofectamina y se ensayaron por transferencia de Western como se describe por Rensing-Ehl et al. (1995, Eur. J. Immunol. 25: 2253-2258). El carril 1 ilustra lisado celular (14 \mug de proteína) obtenido a partir de células transfectadas (aproximadamente 5 x 10^{5} en 2 ml de medio) incubadas durante 2 días. Carril 2: Igual que en el Carril 1 después de 4 días de incubación. Carril 3: Lisado celular obtenido a partir de células transfectadas de forma simulada incubadas durante 4 días. Carril 4: Medio (18 \mul) no concentrado de células transfectadas después de incubación durante 1 día. Carril 5: Igual que en el carril 4 después de 2 días de incubación. Carril 6: Igual que en el carril 4 después de 4 días de incubación. Carril 7: Medio obtenido a partir de células transfectadas de forma simulada después de 4 días de incubación. Nota: La bandas blancas difusas en los carriles 4 a 7 son grandes concentraciones de albúmina en las muestras del medio que disminuyen el fondo para la transferencia de Western.

Las Figuras 13A-13D son imágenes de una serie de microfotografías que ilustran la inhibición del crecimiento y la inactivación de células 293 (Fas^{+}) por medio obtenido a partir de células COS que expresan de forma transitoria un ADNc que codifica FasL soluble. Se incubaron aproximadamente 5 x 10^{5} células 293 con un 1 ml de medio fresco más 1 ml de medio obtenido a partir de células COS transfectadas 48 horas después de la transfección. Las células 293 se muestran a los 3 días de la incubación. El tratamiento disminuyó las células viables en más de 90%. La Figura 13A ilustra células 293 de control incubadas con 1 ml de medio obtenido a partir de células COS transfectadas de forma simulada. La Figura 13B ilustra células 293 de ensayo incubadas con 1 ml de medio de células COS que expresan FasL soluble. El aumento de contraste de fase fue x 100. Las Figuras 13C y 13D ilustran los mismos cultivos que en la Figura 13B al mayor aumento de x 200. El aspecto de las células sugiere que son apoptóticas.

La Figura 14 una imagen de una transferencia de Western de MSC de rata transducidas con un retrovirus (pLNCX) que contiene un gen de ensayo (tirosina hidroxilasa). Las condiciones para la transducción de retrovirus fueron como se describe en la presente memoria en el Ejemplo 10. El ensayo de transferencia de Western se realizó con lisados celulares y un anticuerpo para tirosina hidroxilasa. Carril 1: marcadores de PM. Carriles 2-5: Lisados celulares de MSC transducidas (5 ó 10 \mug de proteína). Carril 6: Lisados celulares de MSC no transducidas. Carril 7: Lisado celulares de células de control (293).

La Figura 15 es un gráfico que ilustra la síntesis y la secreción del producto (L-DOPA) por MSC humanas transducidas con un retrovirus que contiene un ADNc de ensayo (tirosina hidroxilasa). Las células se incubaron con el cofactor esencial tetrahidropteridina 50 \muM y L-DOPA producido en el medio se ensayó por HPLC. No se detecto L-DOPA en medio obtenido a partir de MSC de control.

Las Figuras 16A-16F son imágenes de esquemas y una serie de imágenes que ilustran el injerto de MSC de ratón después de la inyección en los cerebros de ratones neonatos. La Figura 16A es un esquema que ilustra la distribución de núcleos marcados fluorescentemente 12 días después de la infusión. La Figura 16B es una imagen que ilustra núcleos marcados fluorescentemente en el sitio de inyección adyacente al ventrículo lateral izquierdo. La Figura 16C es una imagen a un aumento mayor que se usó para contar los núcleos marcados recientemente de células de donante. Se contaron doce secciones en serie. La Figura 16D es un esquema de la distribución de células de donante marcadas fluorescentemente a los 45 días. La Figura 16E es una imagen que muestra el aspecto de células de donante a lo largo del camino de inyección adyacente al ventrículo lateral izquierdo por todo el cuerpo estriado. La Figura 16F es una imagen que ilustra la detección de células de donante que se expanden a la corteza somatosensorial a lo largo de la sustancia aracnoide y que migran al interior de la comisura del hipocampo ventral.

Las Figuras 17A y 17B son imágenes de un par de imágenes que demuestran adicionalmente la migración de las MSC de ratón donante 45 días después de la infusión en cerebro neonatal. Las imágenes están a un aumento mayor que el mostrado previamente y demuestran que las células se alinean por sí mismas en series lineales y parece que migran a lo largo de tractos de sustancia blanca dentro de la cápsula externa, del cuerpo calloso, de la comisura anterior (AC), de la comisura del hipocampo ventral (VHC) y a lo largo de haces de fibra del cuerpo estriado.

La Figura 18 es una imagen de un gel que ilustra ensayos de RT-PCR que demuestran bajos niveles de ARNm que codifican FasL y sin ARNm detectable que codifique Fas en hMSC. Se describieron cebadores por Kitagawa et al. (1998, Luekemia 12: 486-492) se usaron y la PCR se realizó durante 30 ciclos). Carril 1: Marcadores. Carril 2: Control de \beta-actina. Carril 3: Ensayo para FasL. Carril 4: Ensayo para Fas.

Las Figuras 19A y 19B son un par de imágenes que ilustran el implante exitoso de células de glioma C6 en el cerebro de rata. Las secciones de cerebro se tiñeron con H y E. La Figura 19A ilustra con baja potencia el límite entre el tumor implantado y tejido cortical cerebral normal (CTX). La Figura 19B ilustra células de glioma con núcleos raros (mostrados por la flecha) a una mayor potencia (40 x).

Las Figuras 20A-20D son un cuarteto de imágenes que ilustran cultivos de MSC de ratón (mMSC) antes y después de la inmunodepleción. Las Figuras 20A y 20C ilustran cultivos de mMSC de siete días de edad antes de la inmuno-depleción teñidos con Giemsa o con un anticuerpo anti CD11b conjugado con FITC y contrateñido con DAPI, respectivamente. Las Figuras 20B y 20D ilustran cultivos de mMSC de siete días de edad después de la inmuno-depleción teñidos con Giemsa o con un anticuerpo anti CD11b conjugado con FITC y contrateñidos con DAPI, respectivamente.

Las Figuras 21A-21E son esquemas e imágenes que ilustran el desarrollo temporal del injerto de MSC de ratón en cerebros neonatales de ratón. La Figura 21A es un esquema que ilustra la diseminación de MSC marcadas con bis-benzamida a los 3 días (amarillo), 12 días (rojo) y 45 días (negro) después de la inyección. Las regiones en el cerebro donde la distribución de células de donante no fue solapante se indican por los puntos para cada momento. La Figura 21B es una imagen que ilustra MSC adyacentes al ventrículo lateral aproximadamente +0,9 mm del bregma 12 días después de la inyección. El aumento fue x 100. La Figura 21C es una imagen que ilustra lo mismo que en la Figura 21B a un aumento mayor de x 400. La Figura 21d es una imagen que ilustra MSC evidentes a lo largo del cuerpo estriado y la cápsula externa a -0,2 mm del bregma 45 días después del trasplante de las células. El aumento fue de x 100. La Figura 21E es una imagen que ilustra células de donante que revisten la comisura del hipocampo ventral y el plexo coroideo a un aumento de x 100. (LV = ventrículo lateral; EC = cápsula externa; VHC = comisura del hipocampo ventral).

Las Figuras 22A y 22B son un par de imágenes que ilustran la orientación de MSC a lo largo de tractos de sustancia blanca establecidos 45 días después de la inyección. La Figura 22A ilustra MSC marcadas con bis-benzamida orientadas en disposiciones paralelas, radiales dentro de la cápsula externa (EC). La Figura 22B ilustra MSC marcadas con bis-benzamida orientadas en disposiciones paralelas, radiales dentro de la comisura del hipocampo ventral (VHC). Las Figuras 22A y 22B están a un aumento de x 400. Las Figuras 23A-23D son un cuarteto de imágenes que ilustran la localización inmunohistoquímica de MSC marcadas con BrdU en el prosencéfalo 12 días después de la inyección. La Figura 23A ilustra secciones en serie teñidas con Hematoxilina y Eosina y la Figura 23B, las ilustra teñidas con anti-BrdU, del cuerpo estriado y del ventrículo lateral, ipsolateral al sitio de inyección, aproximadamente a +0,9 mm del bregma. El aumento es x 40. La Figura 23C es una imagen de una microfotografía de las secciones en la Figura 23B al mayor aumento de x 400 que ilustra células de donante marcadas con BrdU que revisten la cápsula externa. La Figura 23D ilustra un astrocito obtenido de MSC (indicado por la flecha) marcado doblemente con anticuerpos contra proteína ácida fibrilar glial (GFAP) a un aumento de x 1000 en la capa molecular del hipocampo aproximadamente a -2,4 del bregma. Las células de donante que no se han diferenciado en astrocitos se indican por las flechas dobles.

Las Figuras 24A-24F son una serie de imágenes que ilustran MSC marcadas con 8-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) en regiones ricas en neuronas del prosencéfalo y del cerebelo. La tinción con Hematoxilina y Eosina (H&E), ilustrada en la Figura 24A, o la tinción con anti-BrdU, ilustrada en la Figura 24B, de secciones en serie indica células obtenidas de donante en las Islas de Calleja (ICj) en la corteza de prosencéfalo ventral. La tinción con H&E, ilustrada en la Figura 24C, o la tinción con anti-BrdU, ilustrada en la Figura 24D, de secciones en serie indica células obtenidas de donante en el subepéndima del bulbo olfatorio (OB). La tinción con H&E, ilustrada en la Figura 24E, o la tinción con anti-BrdU, ilustrada en la Figura 24F, de secciones en serie indica células obtenidas de donante en las capas granular externa e interna (EGL, IGL) del cerebelo. El aumento fue a x 400.

La Figura 25 es un gráfico que ilustra los niveles de L-DOPA producidos en el cerebro de una rata tratada con MSC de rata modificadas por ingeniería genética que secretan L-DOPA. Se realizó microdiálisis en el cuerpo estriado de una rata lesionada con 6-hidroxidopamina Sprague Dawley 3 días después del injerto de MSC de rata modificadas por ingeniería genética (TH+GC+). Se injertaron aproximadamente 100.000 células. Se tomaron dializados cada 30 minutos durante 3 horas. Antes del injerto, las MSC de rata se transdujeron con un retrovirus que contenían el gen para tirosina hidroxilasa (TH) y después un segundo retrovirus con el gen para GTP-ciclohidrasa (GC). El gen para GC proporciona tetrahidropteridina, un cofactor esencial para tirosina hidroxilasa. No se detectó L-DOPA en ratas de control.

La Figura 26 es un gráfico que ilustra los niveles de L-DOPA detectados por HPLC en muestras a partir de los experimentos de microdiálisis ilustrados en la Figura 25. Como se indica en la Figura 27, 3-O-metil DOPA (3-O-MD) y un ácido homovanilíco (HVA) pueden surgir a partir de una ruta alterada del metabolismo del DOPA. El ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPA-C) es un metabolito de la dopamina.

La Figura 27 es una ilustración esquemática que ilustra los metabolitos de L-DOPA.

\newpage

La Figura 28 es un gráfico que ilustra la disminución de rotaciones inducidas por apomorfina en un modelo de rata para parkinsonismo. Las ratas se prepararon por infusión de 6-hidroxidopamina en el cuerpo estriado para producir el modelo de parkinsonismo. La rotación se indujo por inyección de apomorfina (0,05 mg/kg, sc). Los valores ilustrados son de 2 a 5 ratas infundidas con rMSC transducidas para sintetizar L-DOPA (+GCTH) y 3 ratas de control infundidas con rMSC transducidas solamente con el gen para tirosina hidroxilasa (TH), convirtiendo las células en incapaces de producir L-DOPA en cultivo sin tetrahidropteridina añadida. El gráfico indica que el efecto de la rotación desapareció después de aproximadamente 7 días, el mismo momento en el que L-DOPA ya no se detectó por la microdiálisis ilustrada en la Figura 25.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere al uso de células estromales aisladas a partir de una muestra de médula ósea de un donante humano para preparar un medicamento para tratar pacientes afectados por una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central. Esto implica composiciones que se tienen que aislar de células de médula que pueden estar o no genéticamente alteradas usando tecnología de ADN recombinante. El enfoque comprende las etapas de obtener una muestra de médula ósea a partir de un donante, aislar células estromales de la muestra de médula ósea y administrar las células estromales aisladas directamente al sistema nervioso central del paciente.

Definiciones

Los artículos "un" y "una" se usan en la presente memoria para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Como se usa en la presente memoria, se tiene que considerar que "sistema nervioso central" incluye el cerebro y/o la médula espinal de un mamífero. La expresión también puede incluir el ojo y el nervio óptico en algunos casos.

Como se usa en la presente memoria, "células estromales", "fibroblastos formadores de colonias", "células estromales de médula", "células adherentes" y "MSC" se usan de forma intercambiable y significan que se refieren a la fracción pequeña de células en la médula ósea que pueden servir como precursores similares a células madre de osteocitos, condrocitos y adipocitos y que se pueden aislar a partir de médula ósea por su capacidad de adherirse a placas de plástico. Las células estromales se pueden obtener a partir de cualquier animal. En algunas realizaciones, las células estromales se obtienen de primates, preferiblemente seres humanos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "células adherentes" significa que se refiere a células estromales.

La expresión "células no adherentes" como se usa en la presente memoria significa que se refiere a células precursoras hematopoyéticas.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "enfermedad, trastorno o afección del sistema nervioso central" significa que se refiere a una enfermedad, un trastorno o una afección que está causada por una mutación genética en un gen que se expresa por células del sistema nervioso central de tal forma que uno de los efectos de una mutación de este tipo se manifiesta por estructura y/o función anormal del sistema nervioso central, tal como, por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa o formación de tumor primario. Tales defectos genéticos pueden ser el resultado de un gen mutado, no funcional o sub-expresado en una célula del sistema nervioso central. También se tiene que considerar que la expresión incluye otras patologías en el sistema nervioso central que no son el resultado de un defecto genético per se en células del sistema nervioso central, sino que más bien son el resultado de la infiltración del sistema nervioso central por células que no se originan en el sistema nervioso central, por ejemplo, formación de tumor metastásico en el sistema nervioso central. También se tiene que considerar que la expresión incluye traumatismo del sistema nervioso central inducido por lesión directa de los tejidos del sistema nervioso central. Se tiene que entender adicionalmente que la expresión incluye enfermedades conductuales tales como, pero sin limitación, adición a fármacos y alcohol, depresión, esquizofrenia, enfermedades que implican captación de serotonina o receptores opioides, metabolismo de fármacos y similares. También se tiene que considerar que la expresión incluye apoplejía y embolias.

Como se usa en la presente memoria, "una enfermedad, un trastorno o una condición caracterizada por un defecto génico" significa que se refiere a una enfermedad, un trastorno y una afección en la que un gen defectuoso y/o una expresión génica insuficiente está unida de forma causal a la enfermedad, el trastorno o la afección. Los individuos que tienen alguna de varias enfermedades, trastornos y afecciones bien conocidas caracterizadas por un defecto génico se pueden identificar por los especialistas en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, "una enfermedad, un trastorno o una afección caracterizada por un defecto en un gen que codifica una proteína secretada" significa que se refiere a una enfermedad, un trastorno o una afección caracterizada por un defecto génico en el que el gen que es defectuoso o se expresa insuficientemente codifica una proteína que se secreta de forma anormal por la célula.

Con la expresión "secreción anormal" se quiere decir que la proteína se procesa en la célula de un modo que difiere de la proteína normal, es decir, de tipo silvestre, no defectuosa. Por ejemplo, la proteína normal se puede secretar por la célula en una configuración estructural particular; la secreción anormal de esta proteína puede suceder cuando la proteína se secreta en una configuración diferente. Adicionalmente a modo de ejemplo, cuando la proteína normal se secreta normalmente por la célula, puede suceder secreción anormal de la proteína si la proteína no se secreta por la célula o se secreta por la célula a un nivel que difiere marcadamente, es decir, es superior o inferior, al nivel normal de secreción de la proteína normal.

Como se usa en la presente memoria, "una enfermedad, un trastorno o una afección que se puede tratar con una proteína beneficiosa" significa que se refiere a una enfermedad, un trastorno o una afección que se puede tratar o prevenir por la presencia de una proteína que alivie, disminuya, prevenga o provoque que se alivien, disminuyan o prevengan las causas y/o los síntomas que caracterizan la enfermedad, el trastorno o la afección. Las enfermedades, los trastornos y las afecciones que se pueden tratar con una proteína beneficiosa incluyen enfermedades, trastornos y afecciones caracterizadas por un defecto génico así como las que no están caracterizadas por un defecto génico pero que a pesar de esto se pueden tratar o prevenir por la presencia de una proteína que alivie, disminuya, prevenga o que provoque que se alivien, disminuyan o prevengan las causas y/o los síntomas que caracterizan la enfermedad, el trastorno o la afección.

Como se usa en la presente memoria, "proteína beneficiosa" y "proteína heteróloga" son intercambiables y significa que se refieren a una proteína que puede compensar la proteína codificada por un gen defectuoso y/o la expresión génica insuficiente que está unida de forma causal a la enfermedad o los síntomas de la enfermedad, el trastorno o la afección caracterizada por un defecto génico. La presencia de la proteína alivia, disminuye, previene o provoca que se alivien, disminuyan o prevengan las causas y/o los síntomas que caracterizan la enfermedad, el trastorno o la afección.

Como se usa en la presente memoria, "lesión de los tejidos o las células del sistema nervioso central provocada por un tumor" significa que se refiere a una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central, donde sucede un crecimiento nuevo de tejido, habitualmente en el cerebro e incluye multiplicación de células que es incontrolable y progresiva. Las células que se multiplican se pueden originar del, o pueden no originarse a partir del tejido nervioso central.

Como se usa en la presente memoria, "inmunológicamente aislado", "inmunológicamente protegido", "inmunológicamente neutralizado" y "una manera que aísla físicamente células del sistema inmune del receptor" significa que se refiere a la encapsulación, la contención u otra separación física de una célula implantada del cuerpo en el que se implanta de tal forma que la célula no está expuesta a y no puede ser eliminada por el sistema inmune del cuerpo, de tal forma que las células que se aíslan inmunológicamente se administran de un modo que las aísla físicamente del sistema inmune del receptor. Los ejemplos de métodos de aislamiento inmunológicos incluyen, pero sin limitación, tecnologías y dispositivos bien conocidos tales como microencapsulación, matrices biocompatibles, cámaras de difusión, cartuchos implantables, dispositivos de implante con ensamblados de membrana y otros recipientes con membranas. Se prefiere que las células estén inmunológicamente aisladas manteniéndolas en el cuerpo dentro de un dispositivo de implante.

Se tiene que considerar que la expresión "ácido nucleico aislado" se refiere a una secuencia de ácido nucleico, o segmento, o fragmento que se ha purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en un estado de origen natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se haya retirado de las secuencias que son normalmente adyacentes al fragmento, por ejemplo, las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el que sucede de forma natural. La expresión también se aplica a ácidos nucleicos que se han purificado sustancialmente a partir de otros componentes que acompañan de forma natural al ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN o proteínas que lo acompañan de forma natural en la célula.

Como se usa en la presente memoria, "una molécula de ácido nucleico aislado" puede ser una que no esté presente en células estromales o que no se exprese como una proteína en niveles suficientemente elevados en células estromales hasta que se introduce en la célula por medios tales como, pero sin limitación, transfección clásica (transfección mediada por fosfato cálcico o DEAE dextrano), electroporación, microinyección, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por agentes químicos, transferencia mediada por ligando o transferencia por vector viral recombinante.

Como se usa en la presente memoria, "construcción génica" significa que se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que incluye secuencias codificantes que codifican una proteína beneficiosa unida de forma funcional a una secuencia promotora/reguladora que tiene elementos suficientes para la expresión de la secuencia codificante en células estromales.

Como se usa en la presente memoria, "secuencia promotora//reguladora" significa una secuencia de ADN que se requiere para la expresión específica de un gen unido de forma funcional a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y en otros casos, estas secuencias también pueden incluir una secuencia potenciadora y otros elementos regulares que se requieren para la expresión del gen de un modo específico de tejidos o inducible de otro modo o constitutivo.

Al describir dos secuencias de ácido nucleico "unidas de forma funcional" como se usa en la presente memoria se quiere decir que un resto de ácido nucleico monocatenario o bicatenario comprende cada una de las dos secuencias de ácido nucleico y que las dos secuencias se disponen dentro del resto de ácido nucleico de tal forma que al menos una de las dos secuencias de ácido nucleico es capaz de ejercer un efecto fisiológico que se caracteriza después del otro.

Como se usa en la presente memoria, "gen heterólogo" significa que se refiere a la secuencia codificante de la construcción génica.

Una "proteína heteróloga" como se usa en la presente memoria, es una que la codificada por un gen heterólogo.

Como se usa en la presente memoria, las expresiones "material genético recombinante" y "gen recombinante" se usan de forma intercambiable y significan que se refieren a ADN genómico, ADNc, ADN y ARN sintéticos, ARNm y ADN y ARN antisentido que se introduce en la células estromal. El material genético recombinante puede ser material genético heterólogo o puede ser una copia o copias adicionales de material genético encontrado normalmente en el individuo o el animal. Cuando se usan células como un componente de una composición farmacéutica en un método para tratar una enfermedad, un trastorno o una afección humana, el material genético recombinante que se usa para transformar las células puede codificar una proteína seleccionada como un agente terapéutico usado para tratar al individuo y/o para convertir las células en más susceptibles al trasplante.

Como se usa en la presente memoria, "células estromales transfectadas" significa que se refiere a células estromales a las que ha proporcionado una construcción génica usando cualquier tecnología usada para introducir moléculas de ácido nucleico en células tales como, pero sin limitación, transfección clásica (transfección mediada por fosfato cálcico o DEAE dextrano), electroporación, microinjección, transferencia medida por liposomas, transferencia medida por agentes químicos, transferencia mediada por ligando o transferencia por vector viral recombinante.

Como se usa en la presente memoria, se debe considerar que la expresión "pre-diferenciada" se refiere a células estromales aisladas que se co-cultivan con una población sustancialmente homogénea de células diferenciadas o productos de células diferenciadas o inductores de diferenciación celular, de tal forma que las células estromales aisladas se diferencian y adquieren características fenotípicas de las células diferenciadas.

Como se usa en la presente memoria, se debe considerar que la expresión "características fenotípicas" se refiere a al menos una de las siguientes características: aspecto morfológico, la expresión de una proteína específica, un patrón de tinción y la capacidad teñirse con una sustancia.

Se tiene que considerar que la frase "población sustancialmente homogénea de células diferenciadas", como se usa en la presente memoria, se refiere a una población de células en la que al menos 75% de las células muestran el mismo fenotipo diferenciado.

Se debe considerar que la expresión "dirigir la diferenciación" como se usa en la presente memoria, se refiere a la inducción de un fenotipo diferenciado en una célula indiferenciada co-cultivando la célula indiferencia en presencia de una población sustancialmente homogénea de células diferenciadas, en presencia de productos de células diferenciadas o en presencia de un inductor de diferenciador celular.

Como se usa en la presente memoria, se debe considerar que la expresión "proteína tóxica para glioma" significa una proteína que es capaz de bloquear el crecimiento de y/o destruir células de glioma.

Descripción

La presente invención sea basa en el descubrimiento de que las MSC que se aíslan por adhesión a plástico y se infunden en el cerebro de un mamífero, se injertan, migran y se diferencian en células del sistema nervioso central, mientras que otras células permanecen como células precursoras o células hijas descendientes que se diferencia en células del sistema nervioso central. Este descubrimiento permite la preparación de un medicamento para el tratamiento exitoso de un individuo, es decir, un mamífero y, preferiblemente, un paciente humano, que padece una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central, usando células estromales de un donante normal, coincidente de forma singeneica o aislando células estromales del individuo, cultivando las células y modificándolas genéticamente para corregir cualquier defecto genético que sea responsable de la enfermedad, el trastorno o la afección del sistema nervioso central.

En una realización preferida de la invención, las células estromales obtenidas de un donante coincidente o del mismo individuo se tienen que administrar a un individuo que padece una enfermedad, un trastorno o una afección que implica al sistema nervioso central para aumentar o sustituir las células nerviosas enfermas y dañadas. Las células estromales se administran preferiblemente a un ser humano. Las células estromales se administran preferiblemente de forma adicional al cerebro del ser humano. En algunos casos, las células se tienen que administrar a la parte del cuerpo estriado del cerebro humano. El sitio preciso de la administración de las células estromales dependerá de varios factores, incluyendo, pero sin limitación, el sitio de la lesión que se tiene que tratar, el tipo de la enfermedad que se tiene que tratar, la edad del ser humano y la gravedad de la enfermedad y similares. La determinación del sitio de la administración pertenece al conocimiento del especialista experto en la administración de tales células.

El modo de administración de las células estromales al sistema nervioso central del ser humano puede variar dependiendo de varios factores incluyendo el tipo de enfermedad que se tiene que tratar, la edad del ser humano, si las células estromales están diferenciadas o no, si las células estromales tiene introducidas ADN heterólogo en las mismas y similares. Un ejemplo de administración de células estromales directamente al tejido cerebral se proporciona en la presente memoria en la sección de detalles experimentales. En ese ejemplo se introducen células en el cerebro de un mamífero creando en primer lugar un orificio en el cráneo a través del cual se pasan después de las células al interior del tejido cerebral. Las células se pueden introducir por inyección directa, usando una derivación o cualquier otro medio usado en la técnica para la introducción de compuestos en el sistema nervioso central.

Hay varias maneras en las que las células estromales se pueden usar en un mamífero, preferiblemente, un ser humano, para tratar enfermedades del sistema nervioso central. Por ejemplo, las células estromales se pueden usar como células precursoras que se diferencian después de la introducción en el sistema nervioso central o como células que se han diferenciado en células neurales antes de la introducción en el sistema nervioso central o simplemente como células que no se diferencian y sirven como vectores para productos génicos. En cualquier situación, como establecen los datos presentados en la presente memoria, las células se convierten en residentes permanentes del sistema nervioso central. Estas células, por lo tanto, pueden sustituir células en el sistema nervioso central que se hayan perdido como un resultado de una enfermedad genética, un traumatismo, u otra lesión. Adicionalmente, antes de la introducción en el sistema nervioso central, las células estromales pueden modificarse por ingeniería genética para producir moléculas tales como citocinas, neurotrofinas y similares, que influirán beneficiosamente en células que ya están presentes en el sistema nervioso central. Por ejemplo, se pueden usar células estromales modificadas por ingeniería genética que se introducen después en el sistema nervioso central para reparr cualquier lesión del sistema nervioso central y/o para combatir tumores del sistema nervioso central.

Los datos presentados en la presente memoria establecen que las células estromales humanas que se cocultivan con astrocitos de rata se convierten en positivas para proteína ácida fibrilar glial, un marcador para astrocitos tempranos. En otras palabras, es posible dirigir la diferenciación de células estromales cultivando células estromales con un tipo celular deseado. Adicionalmente es posible convertir células estromales humanas en células macrogliales de acuerdo con los datos presentados en la presente memoria. Por tanto, es posible, de acuerdo con los datos presentados en la presente memoria, pre-diferenciar células estromales aisladas para que se desarrollen hacia un fenotipo deseado antes de su introducción en el tejido nervioso central. Adicionalmente es posible que células estromales aisladas que se introducen en el sistema nervioso central se puedan diferenciar en tejido cerebral o en tejido de médula espinal en oligodendrocitos, células de Schwann, neuronas y astrocitos.

Basándose en esas consideraciones, los tipos de enfermedades que se pueden tratar usando células estromales aisladas que se introducen directamente en el sistema nervioso central son muchas. Por ejemplo, en neonatos y niños, las células se pueden usar para el tratamiento de varias enfermedades genéticas del sistema nervioso central, incluyendo, pero sin limitación, enfermedad de Tay-Sachs y la enfermedad relacionada de Sandhoff, síndrome de Hurler y mucopolisacaridosis relacionadas y enfermedad de Krabbe. En alcances variables, estas enfermedades también producen lesiones en la médula espinal y nervios periféricos y también tienen efectos no neurológicos. Mientras que los efectos no neurológicos de estas enfermedades se pueden tratar por trasplante de médula ósea, los efectos en el sistema nervioso central no mejoran a pesar del trasplante de médula ósea. El uso de células estromales de médula ósea aisladas como se ha descrito, por lo tanto, se puede usar para abordar los efectos en el sistema nervioso central de estos tipos de enfermedades. Además, en neonatos y niños, el tratamiento del traumatismo craneal durante el parto o después del parto se puede tratar introduciendo células estromales directamente en el sistema nervioso central de los niños. La formación tumoral en el sistema nervioso central en niños también se puede tratar usando como se describe las células estromales de médula ósea aisladas.

Con respecto a enfermedades en adultos del sistema nervioso central, las células estromales aisladas son útiles para el tratamiento de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, lesión de médula espinal, apoplejía, traumatismo, tumores, enfermedades degenerativas de la médula espinal tales como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington y epilepsia. También puede ser posible el tratamiento de la esclerosis múltiple.

El tratamiento de las lesiones de la médula espinal es posible usando las células estromales de médula ósea de acuerdo con la presente invención. Algunos métodos de la técnica antecedente para tratar lesiones de la médula espinal implican usar células fibroblásticas para suministrar neurotrofinas en el sitio de las lesiones en la médula espinal en animales. Las neurotrofinas suministradas de este modo sirven para disminuir la lesión o tratar de otro modo el daño. Sin embargo, a diferencia de las células estromales, los fibroblastos continúan produciendo grandes cantidades de colágeno que provocan fibrosis en el sitio de la lesión, anulando de este modo los efectos beneficiosos del tratamiento. Por tanto, el suministro de neurotrofinas a lesiones de médula espinal usando células estromales modificadas por ingeniería genética tiene ventajas significativas con respecto a métodos de la técnica antecedente ya que las células estromales no producen grandes cantidades de colágeno y, por lo tanto, no provocarán fibrosis.

Aunque los datos presentados en la presente memoria establecen que la introducción directa de células estromales en el sistema nervioso central es útil para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central, en algunos casos, las células estromales aisladas también pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades o lesión asociada al ojo. Las células estromales, cuando se inyectan directamente en el ojo, se pueden diferenciar en epitelio pigmentado retiniano, es decir, las células que revisten la superficie posterior de la retina y que parecen servir como células nutrientes para los conos y bastones en el ojo. Alternativamente puede ser posible pre-diferenciar células estromales aisladas en epitelio pigmentado retiniano cocultivando células estromales con células del ojo. Se ha observado que las células madre producen células del ojo en peces. Los ojos de los peces continúan creciendo a lo largo de la vida del pez. En ese caso, hay células madre en los bordes anteriores del ojo que se diferencian tanto en epitelio pigmentado retiniano y en células sensibles a la luz de la retina. Las células estromales aisladas se pueden usar para tratar una diversidad de enfermedades degenerativas del ojo, incluyendo enfermedades degenerativas de las células epiteliales pigmentadas retinianas del nervio óptico. Las enfermedades incluyen, pero sin limitación, degeneración macular, un proceso de origen desconocido que conduce a una pérdida de visión central en ancianos. También se incluye ceguera producida por diabetes o esclerosis arterial, es decir, enfermedades del ojo que son el resultado de lesiones en el suministro vascular de la retina. Además también se pueden tratar enfermedades raras tales como, por ejemplo, amaurosis congénita de Laber, usando las composiciones como se describe.

En algunos aspectos de la invención se puede tratar un individuo que padece una enfermedad, un trastorno o una afección que afecta al sistema nervioso central y que se caracteriza por un defecto génico suplementando, aumentando y/o sustituyendo células neurológicas defectuosas o deficientes con células que expresan correctamente un gen de célula neurológica normal. Las células que se tienen que introducir en el individuo se pueden obtener de células estromales obtenidas de un donante coincidente normal o pueden ser células estromales obtenidas del individuo que se tiene que tratar. Las células también se pueden modificar genéticamente para corregir el defecto. Pero este no es el único caso en el que las células se pueden modificar genéticamente.

En otra realización de la invención se puede tratar un individuo que padece una enfermedad, un trastorno o una afección que afecta al sistema nervioso central y que está caracterizada por un defecto génico suplementando, aumentado y/o sustituyendo células defectuosas con células que expresan correctamente un gen normal. Las células se pueden obtener de células estromales obtenidas de un donante coincidente normal o células estromales obtenidas del individuo que se tiene que tratar. Las células también se pueden modificar genéticamente para corregir el defecto.

Un ejemplo de una enfermedad, un trastorno o una afección que afecta al sistema nervioso central y que está caracterizado por un defecto genético es un tumor cerebral. A un individuo que padece un tumor cerebral se pueden administrar células estromales obtenidas de un donante coincidente normal, células estromales que se diferencian en células cerebrales normales que se pueden usar para sustituir o suplementar las células cerebrales en el individuo que tiene las células tumorales. Las células tumorales compensarán las células defectuosas en el cerebro.

En un ejemplo adicional, las células estromales se aíslan de un individuo que padece un tumor cerebral y un gen capaz de inactivar o bloquear de otro modo la replicación de las células tumorales se inserta en las células estromales aisladas. Las células transfectadas se reintroducen después en el individuo. El crecimiento y/o la replicación de las células tumorales se bloquea y/o se induce la apoptosis de las células tumorales.

En un aspecto de la invención, un individuo que padece una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central se puede tratar del siguiente modo. Se obtienen células estromales aisladas, se expande y se administran por vía sistémica al individuo. Algunas de las células estromales aisladas/expandidas se desarrollarán en células cerebrales normales. Las células estromales normales se expandirán más rápidamente que las células estromales defectuosas y la población rejuvenecida expandida reflejará una mayor proporción de células normales. Por tanto, la repoblación del tejido del sistema nervioso central con una población expandida y rejuvenecida de células estromales sirve para proporcionar una población de células del sistema nervioso central normales que facilitan la corrección del defecto en el tejido del sistema nervioso central. Además, las células estromales se pueden pre-diferenciar en, por ejemplo, astrocitos, siguiendo los protocolos proporcionados en la presente memoria, antes de la administración de las células estromales al sistema nervioso central.

Además de sustituir células defectuosas con células reparadas o células normales de donantes coincidentes, el enfoque de la invención también se puede usar para facilitar la expresión de una proteína deseada que cuando se secreta en el sistema nervioso central tiene un efecto beneficioso. Es decir, las células estromales se pueden aislar, proporcionar con un gen que codifique una proteína deseada e introducir en el tejido del sistema nervioso central de un individuo. La expresión de la proteína deseada en el sistema nervioso central del individuo ejerce un efecto terapéutico en el individuo. Este aspecto de la invención se refiere a la terapia génica en la que se administran proteínas terapéuticas a un individuo.

De acuerdo con algunos aspectos de la presente invención se pueden usar células estromales transfectadas aisladas inmunológicamente como agentes terapéuticos celulares para tratar una enfermedad, un trastorno o una afección caracterizada por un defecto génico y/o una enfermedad, un trastorno o una afección que se puede tratar usando una proteína recombinante en un enfoque de terapia génica. En particular, una construcción génica que comprende un gen heterólogo que codifica una proteína beneficiosa se introduce en células estromales. Las células estromales transfectadas después se aíslan inmunológicamente y se implantan en un individuo que se beneficiará cuando la proteína se exprese y se secrete por la célula en el tejido del sistema nervioso central, preferiblemente en el cerebro.

Las células estromales aisladas inmunológicamente son particularmente útiles en composiciones terapéuticas celulares, ya que además de ser hospedadores adecuados para expresar genes heterólogos y producir proteínas heterólogas, las células estromales responden favorablemente cuando se aíslan inmunológicamente. Las células estromales aisladas inmunológicamente tienen una viabilidad muy elevada cuando se implantan en localizaciones que carecen de un suministro sanguíneo vascular directo. Además, las células estromales se pueden obtener fácilmente y rápidamente, se expanden rápidamente en cultivo convirtiéndolas en una buena fuente de un suministro adecuado de células útiles para agentes terapéuticos celulares aislados inmunológicamente.

De acuerdo con la presente invención, las construcciones génicas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas heterólogas se introducen en células estromales. Es decir, las células se alteran genéticamente para introducir un gen cuya expresión tenga un efecto terapéutico en el individuo. De acuerdo con algunos de aspectos de la invención, las células estromales obtenidas del mismo individuo que se tiene que tratar o de otro individuo o a partir de un animal no humano, se pueden alterar genéticamente para sustituir un gen defectuoso y/o para introducir un gen cuya expresión tenga un efecto terapéutico en el individuo.

Además, de acuerdo con la presente invención, las células estromales son útiles para preparar células transfectadas que se pueden aislar inmunológicamente y expresan proteínas beneficiosas heterólogas proporcionando de este modo un medio para corregir defectos génicos y/o para producir proteínas terapéuticas en el individuo. Las células estromales se pueden aislar con relativa sencillez y las células estromales aisladas se pueden cultivar para aumentar el número de células disponibles. Las células estromales se pueden transfectar, aislar inmunológicamente e implantar con un elevado grado de viabilidad en localizaciones que carezcan de suministro sanguíneo directo tales como localizaciones subcutáneas.

En algunas realizaciones, las células estromales se pueden inmortalizar, tal como usando virus SV40, un retrovirus, un adenovirus u otro virus transformante o usando proteínas que tengan propiedades transformantes. En algunos aspectos de la invención, un individuo que padezca una enfermedad, un trastorno o una afección se puede tratar suplementando, aumentado y/o sustituyendo genes defectuosos o deficientes proporcionando células estromales aisladas inmunológicamente que contengan construcciones génicas que incluyen copias normales funcionales del gen deficiente. Este aspecto de la invención se refiere a terapia génica en la que al individuo se proporcionan genes para el que es deficientes en presencia y/o función. El gen proporcionado por la célula compensa al gen defectuoso del individuo, ya que cuando el gen se expresa en el tejido del sistema nervioso central, se produce una proteína que sirve para aliviar o tratar de otro modo la enfermedad, el trastorno o la afección en el individuo. Tales genes codifican preferiblemente proteínas que se secretan.

Las células estromales se transfectan y se tienen que administrar al sistema nervioso central del individuo "como tales" o en una forma aislada inmunológicamente. En algunas realizaciones, las células estromales se transfectan con genes para los que el individuo que se tiene que tratar padece de una ausencia completa de una copia no mutada del gen o padece de una ausencia o expresión insuficiente de una forma no mutada de la proteína. Las células estromales se transfectan con una copia no mutada del gen en una forma expresable. Es decir, la proteína codificada por el gen transfectado se expresará por las células estromales, preferiblemente como una proteína secretada.

Además de sustituir genes defectuosos con genes funcionales, la invención también se puede usar para expresar proteínas secretadas deseadas que ejercen un efecto terapéutico o profiláctico biológicamente activo. Tales proteínas se secretan preferiblemente por las células. Es decir, las células estromales se pueden aislar, proporcionar con un gen que codifique una proteína deseada, después se puede administrar al individuo como tales o en una forma aislada inmunológicamente, y la proteína deseada se expresa en las mismas. De acuerdo con este aspecto de la invención, las células estromales aisladas sirven como vectores para introducir genes terapéuticos en el individuo así como como hospedadores para tales genes cuando las células se administran al individuo.

En tales realizaciones, las células estromales se transfectan con genes que codifican proteínas que tienen un efecto terapéutico cuando se expresan en el individuo que se tiene que tratar. Más que administrar la proteína terapéutica directamente al individuo que puede requerir administraciones repetidas, la presente invención proporciona un medio para administrar una proteína terapéutica a un individuo de un modo continuo administrando al individuo células que producen la proteína. Las células estromales se transfectan con un gen que codifica la proteína en una forma expresable. Es decir, la proteína codificada por el gen transfectado se expresará en las células estromales preferiblemente como una proteína secretada. Por tanto, la invención incluye un enfoque para tratar una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central en el que las células estromales que se transportan con genes que codifican una proteína se administran al individuo. La proteína se expresa y tiene un efecto terapéutico. Los ejemplos de proteínas terapéuticas incluyen, pero sin limitación, citocinas, quimiocinas, neurotrofinas y similares. Además, se contempla que se pueden usar genes implicados en trastornos conductuales, tales como, pero sin limitación, trastornos que implican receptores de opiáceos, captación de serotonina y similares, incluyendo adición a fármacos y alcohol, genes implicados en el metabolismo de fármacos, genes implicados en el tratamiento de esquizofrenia, depresión, en la invención para el suministro de sus productos proteicos para el tratamiento de estas enfermedades y trastornos.

En todos los casos en los que se transfecta una construcción génica en una célula estromal, el gen heterólogo está unido de forma funcional a una secuencia promotora/reguladora apropiada que se requiere para conseguir la expresión del gen en la célula estromal. Tales secuencias promotoras/reguladoras incluyen, pero sin limitación, promotores constitutivos e inducibles y/o específicos de tejidos y específicos de diferenciación. Los promotores constitutivos incluyen, pero sin limitación, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus y el promotor del virus del sarcoma de Rous. Además también se pueden usar promotores constitutivos tales como los que regulan la expresión de genes constitutivos. Otros promotores incluyen los que se expresan de forma preferente en células del sistema nervioso central, tales como, pero sin limitación, el promotor del gen que codifica la proteína ácida fibrilar glial. Además, se pueden seleccionar elementos promotores/reguladores de tal forma que la expresión génica sea inducible. Por ejemplo, se puede usar un promotor inducible por tetraciclina (Freundlich et al., 1997, Meth. Enzymol. 283:159-173).

La construcción génica se proporciona preferiblemente como un vector de expresión que incluye la secuencia codificante de una proteína heteróloga unida de forma funcional a las secuencias promotoras/reguladoras esenciales de tal forma que cuando el vector se transfecta a la célula, la secuencia codificante se expresa por la célula. La secuencia codificante está unida de forma funcional a los elementos promotores/reguladores necesarios para la expresión de la secuencia en las células. La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede ser ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado o un híbrido del mismo o una molécula de ARN tal como ARNm.

La construcción génica que incluye la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína beneficiosa unida de forma funcional a los elementos promotores/reguladores, puede permanecer presente en la célula como una molécula episómica funcional o se puede integrar en el ADN cromosómico de la célula. Se puede introducir material genético en células donde permanece como material genético separado en forma de un plásmido. Alternativamente se puede introducir en la célula ADN lineal que se puede integrar en el cromosoma de una célula hospedadora. Cuando se introduce ADN en la célula se pueden añadir reactivos que promuevan la integración del ADN en los cromosomas. Las secuencias de ADN que son útiles para promover la integración también se pueden incluir en la molécula de ADN. Alternativamente se puede introducir ARN en la célula.

Los elementos en las secuencias promotoras/reguladoras que son necesarios para la expresión génica incluyen: un promotor, un codón de inicio, un codón de terminación y una señal de poliadenilación. Es necesario que estos elementos sean funcionales en las células estromales o en células que surjan a partir de las células estromales después de la infusión de las células en un individuo. Además es necesario que estos elementos se unan de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de tal forma que la secuencia de nucleótidos se pueda expresar en las células estromales y, por tanto, se pueda producir la proteína. Se considera generalmente que los codones de inicio y el codón de terminación parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales en las células estromales o en células que surjan a partir de las células estromales. De forma similar, los promotores y las señales de poliadenilación usadas tienen que ser funcionales dentro de las células estromales o las células que surjan de las células estromales.

Los ejemplos de secuencias promotoras/reguladores útiles para la práctica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras/reguladores que son activas en muchas células tales como el promotor del citomegalovirus, el promotor de SV40 y muchos promotores retrovirales. Otros ejemplos de secuencias promotoras/reguladores útiles para practicar la presente invención incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras/reguladores específicas de tejidos, es decir, secuencias promotoras/reguladores que funcionan en algunos tejidos pero no en otros; además, secuencias promotoras/reguladores de genes expresados normalmente en células estromales con o sin secuencias potenciadoras específicas o generales. En algunas realizaciones se usan secuencias promotoras/reguladoras que expresan constitutivamente genes en células estromales con o sin secuencias potenciadoras. Se proporcionan secuencias potenciadoras en algunas realizaciones cuando es apropiado o deseable.

Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para practicar la presente invención incluyen, pero sin limitación, la señal de poliadenilación de colágeno I humano, la señal de poliadenilación de colágeno II humano y la señal de poliadenilación de SV40.

Para que se exprese material genético en un vector de expresión, los elementos promotores/reguladores se tienen que unir de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína. Para maximizar la producción de proteína, se pueden seleccionar secuencias promotoras/reguladoras que sean adecuadas para la expresión génica en las células deseadas. Además se pueden seleccionar codones que se transcriban de la forma más eficaz en la célula. Un especialista en la técnica puede producir material genético recombinante como vectores de expresión que sea funcional en las células deseadas.

También se contempla que se pueden seleccionar elementos promotores/reguladores para facilitar la expresión específica de tejido de la proteína. Por tanto, por ejemplo, se pueden proporcionar secuencias promotoras/reguladores específicas de tal forma que el gen heterólogo solamente se expresará en el tejido en el que se implantan las células estromales aisladas inmunológicamente. Además se pueden seleccionar elementos promotores/reguladores de tal forma que la expresión génica sea inducible. Por ejemplo, se puede usar un promotor inducible por tetraciclina (Freundlich et al., 1997, Meth. Enzymol. 283: 159-173).

La proteína heteróloga incluye preferiblemente una secuencia señal que dirige el transporte y la secreción de la proteína heteróloga en la célula estromal. La secuencia señal generalmente se procesa y se retira después de la secreción de la proteína madura por la célula.

Además de proporcionar células con material genético recombinante que corrige un defecto genético en las células, que codifica una proteína que de otro modo no está presente en cantidades y/o condición funcional suficientes de tal forma que el material genético corrige un defecto genético en el individuo y/o que codifica una proteína que es útil como agente terapéutico en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, un trastorno o una afección particular asociada al mismo, el material genético también se puede introducir en las células estromales usadas en la presente invención para proporcionar un medio para terminar de forma selectiva tales células si dicha terminación fuese deseable. Tales medios para dirigir las células para la destrucción se pueden introducir en células estromales que se tienen que modifi-
car genéticamente de otro modo así como en las que no se tiene que introducir otro material genético recombinante.

De acuerdo con la invención, las células estromales aisladas se proporcionan con material genético que las convierte en susceptibles específicamente a destrucción. Por ejemplo, se pueden proporcionar células estromales con un gen que codifique un receptor al que se puede dirigir específicamente con un agente citotóxico. Una forma expresable de un gen que se puede usar para inducir muerte celular selectiva se puede introducir en las células. En un sistema de este tipo, las células que expresan la proteína codificada por el gen son susceptibles a inactivación dirigida en condiciones específicas o en presencia o ausencia de agentes específicos. Por ejemplo, una forma expresable de una timidina quinasa de herpes virus (tk de herpes) se puede introducir en las células y usar para inducir muerte celular selectiva. Cuando el material genético introducido que incluye el gen de la tk de herpes se introduce en el individuo, se producirá tk de herpes. Si es deseable o necesario inactivar las células implantadas, se puede administrar al individuo el fármaco ganciclovir, que provocará la inactivación selectiva de cualquier célula que produzca tk de herpes. Por tanto, se puede proporcionar un sistema que permita la destrucción selectiva de células implantadas.

Se pueden células estromales retirando células de médula ósea de un donante y colocando las células en un recipiente estéril con una superficie de plástico u otra superficie apropiada con la que se pongan en contacto las células. Las células estromales se adherirán a la superficie de plástico en el intervalo de 30 minutos a aproximadamente 3 días. Después de al menos 30 minutos, preferiblemente aproximadamente cuatro horas, las células no adheridas se pueden retirar y desechar. Las células adheridas son células estromales que inicialmente no se dividen. Sin embargo, después de aproximadamente 2-4 días, las células comienzan a proliferar y se pueden cultivar para aumentar su número usando técnicas de cultivo celular convencionales.

De acuerdo con realizaciones particulares preferidas, las células estromales se cultivan en medio suplementado con suero fetal bovino al 2-20% o medio sin suero con o sin suplementos adicionales. Las células estromales aisladas se pueden transfectar usando técnicas bien conocidas disponibles fácilmente para los especialistas en la técnica. Se pueden introducir genes extraños en células estromales usando métodos convencionales que se emplean para introducir una construcción génica en células que expresan la proteína codificada por el gen. En algunas realizaciones, las células se transfectan por transfección por precipitación con fosfato cálcico, transfección por DEAE dextrano, electroporación, microinyección, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por agentes químicos, transferencia mediada por ligando o transferencia por vector viral recombinante.

En algunas realizaciones se usan vectores de adenovirus recombinante para introducir ADN que tiene una secuencia deseada en la célula estromal. En algunas realizaciones se usan vectores retrovirales recombinantes para introducir ADN que tiene una secuencia deseada en la célula estromal. En algunas realizaciones se emplean técnicas de transfección con fosfato cálcico, DEAE dextrano o mediadas por vehículo lipídico convencionales para incorporar un ADN deseado en células en división. Se pueden usar técnicas de selección por resistencia a antibióticos convencionales para identificar y seleccionar células transfectadas. En algunas realizaciones se introduce ADN directamente en las células por microinyección. De forma similar se pueden usar técnicas de electroporación o de bombardeo con partículas bien conocidas para introducir ADN extraño en células estromales aisladas. Habitualmente se co-transfecta un segundo gen o se une al gen terapéutico. El segundo gen frecuentemente es un gen seleccionable por resistencia a antibióticos. Las células transfectadas se pueden seleccionar dejando crecer las células en un antibiótico que destruya las células que no capten el gen seleccionable. En la mayoría de los casos en los que los dos genes no están unidos y co-transfectados, las células que sobreviven al tratamiento con antibióticos contienen y expresan ambos genes.

Después de aislar las células estromales, las células se pueden administrar al ser humano después del aislamiento o después de un periodo de cultivo in vitro. Las células estromales se pueden administrar después del aislamiento o se pueden administrar en el intervalo de aproximadamente una hora después del aislamiento. Generalmente, las células estromales se pueden administrar inmediatamente después del aislamiento en situaciones en las que el donante es grande y el receptor es un niño. Se prefiere que las células estromales se cultiven antes de la administración. Se pueden cultivar células estromales aisladas desde 1 hora hasta más de un año. En algunas realizaciones preferidas, las células estromales aisladas se cultivan antes de la administración durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que las mismas se conviertan en células que no ciclan en células en replicación. En algunas realizaciones, las células estromales aisladas se cultivan durante 3-30 días, preferiblemente 5-14 días, más preferiblemente 7-10 días. En otras realizaciones, las células estromales aisladas se cultivan de 4 semanas a un año, preferiblemente de 6 semanas a 10 meses, más preferiblemente 3-6 meses.

En otras realizaciones, las células estromales aisladas se cocultivan de tal forma que se diferencian en astrocitos u otras células neurales antes de la administración al sistema nervioso central.

Si las células se tienen que transfectar, en primer lugar se transfectan células estromales aisladas, que no ciclan y después se administran como células que no ciclan; en primer lugar se transfectan células estromales aisladas, que no ciclan, después se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para convertirlas de células que no ciclan en células en replicación y después se administran; en primer lugar se cultivan células estromales aisladas, que no ciclan, durante un periodo de tiempo suficiente para convertirlas de células que no ciclan en células en replicación, después se transfectan y después se administran; o en primer lugar se cultivan células estromales aisladas, que no ciclan, durante un periodo de tiempo suficiente para convertirlas de células que no ciclan en células en replicación, después se transfectan, después se cultivan y después se administran al ser humano. En algunas realizaciones, las células estromales se aíslan, se transfectan y se administran inmediatamente al ser humano.

Se prefiere que las células estromales se cultiven antes de la transfección y/o administración. Las células estromales aisladas se pueden cultivar durante 3-30 días, en algunas realizaciones, 5-14 días, en otras realizaciones, 7-10 días antes de la transfección. Las células estromales transfectadas se pueden cultivar durante 3-30 días, en algunas realizaciones, 5-14 días, en algunas realizaciones, 7-10 días antes de la administración. Las células estromales aisladas se pueden cultivar durante 3-30 días, en algunas realizaciones, 5-14 días, en algunas realizaciones, 7-10 días antes de la transfección y después de la transfección, cultivar adicionalmente durante 3-30 días, en algunas realizaciones, 5-14 días, en algunas realizaciones, 7-10 días antes de la administración. En algunas realizaciones, las células estromales aisladas se cultivan de 4 semanas a un año, en algunas realizaciones, de 6 semanas a 10 meses, en algunas realizaciones, 3-6 meses antes de la transfección. Las células estromales transfectadas se pueden cultivar durante 4 semanas a un año, en algunas realizaciones, de 6 semanas a 10 meses, en algunas realizaciones, 3-6 meses antes de la administración. En algunas realizaciones, las células estromales aisladas se cultivan de 4 semanas a un año, en algunas realizaciones, de 6 semanas a 10 meses, en algunas realizaciones, de 3-6 meses antes de la transfección y después de la transfección, se cultivan adicionalmente durante 4 semanas a un año, en algunas realizaciones, de 6 semanas a 10 meses, en algunas realizaciones, de 3-6 meses antes de la administración.

Para la administración de células estromales al ser humano, las células estromales aisladas se retiran de las placas de cultivo, se lavan con solución salina, se centrifugan hasta un sedimento y se resuspenden en una solución de glucosa que se infunde al paciente. En algunas realizaciones se realiza ablación de médula ósea antes de la infusión para producir espacio en el hueso para las células introducidas. Las respuestas inmunes suprimidas por agentes tales como ciclosporina también se tienen que considerar. La ablación de médula ósea se puede conseguir irradiando con rayos X el individuo que se tiene que tratar, administrando fármacos tales como ciclofosfamida o por una combinación de radiación con rayos X y administración de fármacos. En algunas realizaciones se produce la ablación de médula ósea por administración de radioisótopos que se conoce que destruyen células de hueso metastásico tales como, por ejemplo, estroncio radioactivo, ^{135}Samario y ^{166}Holmio (véase Applebaum et al., 1992, Blood 80(6): 1608-1613).

Si la ablación de médula ósea precede a la administración de células estromales, la administración de células estromales se tiene que acompañar por la administración de células no adherentes que comprenden precursores de células sanguíneas necesarios para la supervivencia. Tales células no adherentes se pueden obtener de la misma muestra usada como materiales de partida en el aislamiento de células estromales y almacenar o se pueden obtener de una muestra diferente. En algunas realizaciones preferidas, las células no adherentes se proporcionan por el receptor/paciente. Antes de procedimientos que generan ablación de médula ósea se obtiene y se almacena una muestra de la médula ósea del paciente/receptor. Se puede usar toda la muestra o las células no adherentes se pueden aislar y usar para administrar junto con células estromales aisladas. Las células no adherentes administradas junto con administración de células estromales se pueden administrar de forma separada antes o después de la administración de células estromales o se pueden mezclar con células estromales aisladas antes de la administración.

En algunas realizaciones, las células estromales aisladas se tienen que administrar al cerebro por infusión directa como se describe en la presente memoria en la sección de ejemplos experimentales. En otras realizaciones, las células estromales aisladas se tienen que administrar al sistema nervioso central, es decir, la médula espinal, por inyección simple, etc.

Se administran entre aproximadamente 10^{5} y aproximadamente 10^{13} células por 100 kg de persona por infusión. En algunas realizaciones se infunden entre aproximadamente 1,5 X 10^{6} y aproximadamente 1,5 X 10^{12} células por vía intravenosa por 100 kg de persona. En algunas realizaciones se infunden entre aproximadamente 1 X 10^{9} y aproximadamente 5 X 10^{11} células por vía intravenosa por 100 kg de persona. En algunas realizaciones se infunden entre aproximadamente 4 X 10^{9} y aproximadamente 2 X 10^{11} células por 100 kg de persona. En algunas realizaciones se infunden entre aproximadamente 5 X 10^{8} células y aproximadamente 1 X 10^{1} células por 100 kg de persona.

En algunas realizaciones se proporciona una administración única de células. En algunas realizaciones se proporcionan múltiples administraciones. En algunas realizaciones se proporcionan múltiples administraciones a lo largo del curso de 3-7 días consecutivos. En algunas realizaciones se proporcionan 3-7 administraciones a lo largo del curso de 3-7 días consecutivos. En algunas realizaciones se proporcionan 5 administraciones a lo largo del curso de 5 días consecutivos.

En algunas realizaciones se proporciona una administración única entre aproximadamente 10^{5} y aproximadamente 10^{13} células por 100 kg de persona. En algunas realizaciones se proporciona una administración única entre aproximadamente 1,5 X 10^{8} y aproximadamente 1,5 X 10^{12} células por 100 kg de persona. En algunas realizaciones se proporciona una administración única entre aproximadamente 1 X 10^{9} y aproximadamente 5 X 10^{11} células por 100 kg de persona. En algunas realizaciones se proporciona una administración única de aproximadamente 5 X 10^{10} células por 100 kg de persona. En algunas realizaciones se proporciona una administración única de 1 X 10^{10} células por 100 kg de persona.

En algunas realizaciones se proporcionan múltiples administraciones entre aproximadamente 10^{5} y aproximadamente 10^{13} células por 100 kg de persona. En algunas realizaciones se proporcionan múltiples administraciones entre aproximadamente 1,5 X 10^{8} y aproximadamente 1,5 X 10^{12} células por 100 kg de persona. En algunas realizaciones se proporcionan múltiples administraciones entre aproximadamente 1 X 10^{9} y aproximadamente 5 X 10^{11} células por 100 kg de persona a lo largo del curso de 3-7 días consecutivos. En algunas realizaciones se proporcionan múltiples administraciones de aproximadamente 4 X 10^{9} células por 100 kg de persona a lo largo del curso de 3-7 días consecutivos. En algunas realizaciones se proporcionan múltiples administraciones de aproximadamente 2 X 10^{11} células por 100 kg de persona a lo largo del curso de 3-7 días consecutivos. En algunas realizaciones se proporcionan 5 administraciones de aproximadamente 3,5 X 10^{9} células a lo largo del curso de 5 días consecutivos. En algunas realizaciones se proporcionan 5 administraciones de aproximadamente 4 X 10^{9} células a lo largo del curso de 5 días consecutivos. En algunas realizaciones se proporcionan 5 administraciones de aproximadamente 1,3 X 10^{11} células a lo largo del curso de 5 días consecutivos. En algunas realizaciones se proporcionan 5 administraciones de aproximadamente 2 X 10^{11} células a lo largo del curso de 5 días consecutivos.

Se describen células estromales en cámaras de difusión en Benayahu et al., 1989, J. Cell Physiol. 140: 1-7; Mardon et al., 1987, Cell Tissue Res. 250: 157-165. Después de introducir la construcción génica en las células estromales, las células se pueden aislar inmunológicamente inmediatamente o después de un periodo de cultivo in vitro. Las células estromales se pueden implantar después de que se hayan aislado inmunológicamente. Las células estromales se pueden aislar inmunológicamente usando cualquier método bien conocido usando materiales de partida y/o dispositivos disponibles fácilmente. Las células estromales se pueden microencapsular usando muchos de tales protocolos de microencapsulación incluyendo los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.391.909, la Patente de Estados Unidos Nº 4.806.355, la Patente de Estados Unidos Nº 4.942.129 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.334.640.

Las células estromales se pueden administrar a un individuo en cámaras que usan membranas difundibles o se pueden encapsular en microperlas. En otra realización, las células estromales están contenidas en fibras huecas tales como las disponibles de Amicon, Inc. (Beverly MA). Estas fibras se usan, por ejemplo, para producir cartuchos para diálisis. Un extremo se puede extraer desde debajo de la piel y disminuir de tamaño si las dosificaciones de la proteína realizadas por las células se tienen que disminuir. El área superficial de las fibras es muy elevada. Además, las células en la fibra se pueden eliminar por lavado y sustituir periódicamente. Las fibras huecas se describen en las páginas 50-51 de Amicon, Inc. Publicación Nº 323.

De forma similar, la incorporación de células estromales transfectadas en matrices biocompatibles facilita la secreción de una proteína beneficiosa para el individuo mientras que mantiene las células en una condición aislada inmunológicamente. Se describen ejemplos de matrices biocompatibles, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.902.295 y la Patente de Estados Unidos Nº 4.997.443. En algunas realizaciones, las células estromales transfectadas se aíslan inmunológicamente revistiendo las mismas dentro de sistemas de implante tisular que son ensamblajes de membrana. Es decir, las células se mantienen en recipientes que incluyen al menos una membrana porosa. Las células dentro del ensamblaje de membrana se aíslan inmunológicamente mientras que proteínas beneficiosas se ponen a disposición para los individuos pasando a través de la membrana. Los dispositivos de implante que son ensamblajes de membrana incluyen, pero sin limitación, los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.314.471 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.344.454. De acuerdo con una realización de la invención se proporciona un dispositivo de implante que comprende dos ensamblajes de diez anillos. Cada ensamblaje de anillo comprende un anillo circular de plástico y una membrana Millipore de 0,3 micrómetros que cubre el área el círculo. Las células estromales transfectadas se disponen entre los dos ensamblajes de anillo que están conectados entre sí en la circunferencia. El dispositivo de implante construido se implanta preferiblemente por vía subcutánea.

En algunos dispositivos de implante preferidos se proporcionan de aproximadamente 10^{5} a aproximadamente 10^{13} células. Los intervalos de células preferidos que se tiene que administrar cuando se aíslan inmunológicamente son como se describen en la presente memoria cuando las células no están aisladas inmunológicamente. Las células aisladas inmunológicamente se pueden implantar en los ventrículos del espacio subdural o en el espacio subaracnoideo del cerebro y la columna espinal.

Se prefiere que las células estromales se cultiven antes del aislamiento inmunológico. Las células estromales se pueden cultivar de aproximadamente 1 hora a más de un año. En algunas realizaciones preferidas, las células estromales se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que se conviertan de células que ciclan en células en replicación. En algunas realizaciones, las células estromales se cultivan durante 3-30 días, preferiblemente 5-14 días, más preferiblemente 7-10 días. En algunas realizaciones, las células estromales se cultivan de 4 semanas a un año, preferiblemente de 6 semanas a 10 meses, más preferiblemente 3-6 meses. En realizaciones preferidas, las células son células estromales aisladas, que no ciclan que en primer lugar se transfectan y después se aíslan inmunológicamente, después se implantan como células que ciclan; células estromales aisladas que no ciclan que en primer lugar se transfectan, después se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para convertirlas de células que no ciclan en células en replicación, después se aíslan inmunológicamente y después se implantan; células estromales aisladas que no ciclan que en primer lugar se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para convertirlas de células que no ciclan en células en replicación, después se transfectan, después se aíslan inmunológicamente y después se implantan; o células estromales aisladas, que no ciclan que en primer lugar se cultivan durante un periodo de tiempo suficiente para convertirlas de células que no ciclan en células en replicación, después se transfectan, después se cultivan, después se aíslan inmunológicamente y después se implantan. En algunas realizaciones, las células estromales se aíslan, se transfectan, se aíslan inmunológicamente y se implantan. Se prefiere que las células estromales se cultiven antes y después de la transfección, antes del aislamiento inmunológico. Las células estromales aisladas se pueden cultivar durante 3-30 días, en algunas realizaciones, 5-14 días, en algunas realizaciones, 7-10 días antes de la transfección. Las células estromales transfectadas se pueden cultivar durante 3-30 días, en algunas realizaciones, 5-14 días, en algunas realizaciones, 7-10 días antes de la administración. Las células estromales aisladas se pueden cultivar durante 3-30 días, en algunas realizaciones, 5-14 días, en algunas realizaciones, 7-10 días antes de la transfección y después de la transfección, cultivar adicionalmente durante 3-30 días, en algunas realizaciones, 5-14 días, en algunas realizaciones, 7-10 días antes de la administración. En algunas realizaciones, las células estromales aisladas se cultivan de 4 semanas a un año, en algunas realizaciones, de 6 semanas a 10 meses, en algunas realizaciones, 3-6 meses antes de la transfección. Las células estromales transfectadas se pueden cultivar de 4 semanas a un año, en algunas realizaciones, de 6 semanas a 10 meses, en algunas realizaciones, 3-6 meses antes de la implante.

La invención se describirá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan solamente con propósitos de ilustración. Por tanto, la invención no se tiene que considerar de ningún modo limitada a los siguientes ejemplos, sino más bien se tiene que considerar que incluye cualquiera y todas las variaciones que se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos Ejemplo 1 Células Estromales como Células Precursoras de Tejidos Conectivos

Se usaron células de una línea de ratón transgénico que expresa un mini-gen humano para colágeno I de un modo específico de tejido para determinar si células mesenquimales precursoras de médula que se expanden en cultivo pueden servir como precursores a largo plazo de hueso y otros tejidos conectivos después de la infusión intravenosa en ratones irradiados. El gen marcador consistía en un mini-gen delecionado internamente que codifica la cadena pro\alpha1 (I) humana de procolágeno I que provoca la síntesis de cadenas pro\alpha1 (I) acortadas (Khillan et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 23373-23379; Pereira et al., 1983, J. Clin. Invest. 91: 709-716; y Sokolov et al., 1993, Biochemistry 32: 9242-9249). Se obtuvieron células que expresaban el gen a partir de una línea de ratones transgénicos en la que el número de copias del mini-gen humano con respecto al gen endógeno de ratón era de aproximadamente 100 a 1 y los niveles de ARNm expresado en el estado de equilibrio por el mini-gen humano con respecto al ARNm expresado por el gen endógeno de ratón eran de aproximadamente 0,5:1 en la mayoría de los tejidos.

Las células de donante obtenidas a partir de médula enriquecida parcialmente para en precursores mesenquimales se prepararon usando protocolos convencionales (Friedenstein et al., 1976, Exp. Hemat. 4: 267-274; Castro-Malaspina et al., 1980, Blood 56: 289-301; Piersma et al., 1985, Exp. Hematol 13: 237-243; Simmons et al., 1991, Blood 78: 55-62; Beresford et al., 1992, J. Cell. Sci.102: 341-351; Liesveld et al., 1989, Blood 73: 1794-1800; Liesveld et al., 1990, Exp. Hematot. 19: 63-70; Bennett et al., 1991, J. Cell. Sci. 99: 131 -139). Brevemente, los extremos de huesos largos de los ratones transgénicos se cortaron y se extrajo la médula con una jeringa presurizada llena de \alpha-MEM (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) que contenía suero fetal bovino al 10% (Atlanta Biologicals). Se sembraron aproximadamente 10^{7} células nucleadas sobre matraces de cultivo de plástico de 175 cm^{2} en 25 ml de \alpha-MEM que contenía suero fetal bovino al 10%. Después de 4 horas se desecharon las células no adherentes sustituyendo el medio. Aparecieron focos que contenían de dos a cuatro células similares a fibroblastos en 2 a 3 días, y los focos crecieron hasta colonias prácticamente confluentes en aproximadamente 1 semana. El rendimiento fue de aproximadamente 10^{7} células por matraz después de la digestión con tripsina. La mayoría de las células eran similares a fibroblastos, pero también se observaron unos pocos macrófagos y adipocitos cuando las células se examinaron bajo el microscopio de contraste de fases.

Aproximadamente 10^{5} de las células adherentes cultivadas se mezclaron con 6 x 10^{5} células no adherentes obtenidas por incubación de médula de ratones normales durante 4 horas en matraces de 175 cm^{2} en las mismas condiciones usadas para el aislamiento inicial de las células adherentes. La mezcla de aproximadamente 7 x 10^{5} células en 0,2 a 0,4 ml de \alpha-MEM y suero fetal bovino al 10% se inyectó en la vena de la cola de cada ratón receptor.

Se prepararon ratones de ocho semanas de edad de la misma línea endogámica FVB/N para recibir las células de donante por irradiación con un irradiador de ^{137}Cu (Atomic Energy of Canada, Ltd.). La unidad tenía una velocidad de dosis de 116 cG/min con una configuración de haz opuesto paralelo. Cada animal recibió 9,0 Gy en dos fracciones con un intervalo de 4 horas (4,5 Gy + 4,5 Gy) (O'Hara et al., 1991, Exp. Hemat. 19: 878-881). De una a 2 horas después de la segunda fracción de radiación, la mezcla de células adherentes marcadas y células no adherentes normales se inyectó por vía intravenosa. Los ratones irradiados control que no recibieron una infusión de células murieron después de 10 a 13 días del fallo de médula.

Para seguir el destino de las células de donante se desarrollaron dos ensayos de PCR para el mini-gen COLIA1 humano y el gen COLIA1 endógeno de ratón. Usando un ensayo de dos cebadores, los valores para la proporción de los genes humanos con respecto a los de ratón fueron lineales a lo largo de un intervalo de aproximadamente 10^{-4} a aproximadamente 10^{+1} y, por lo tanto, dieron como resultado aproximadamente 10^{-6} a 10^{-1} células de donante por célula receptora. Usando el ensayo de tres cebadores, los valores fueron lineales a lo largo de un intervalo de aproximadamente 10^{-3} a 10^{+2} y, por lo tanto, dieron como resultado aproximadamente de 10^{-5} a 1 célula de donante por célula receptora.

Los ensayos de ratones irradiados después de un día indicaban solamente cantidades traza de las células de donante en médula, bazo, hueso, pulmón o cerebro. Se observaron niveles ligeramente superiores a los siete días. A los 30 días y 150 días, la progenie de las células de donante representaba del 2,0 al 12% de las células en médula, bazo, hueso y pulmón. A los 150 días, también representaban del 1,5 al 5,0% de las células en el cartílago xifoide que se liberó por disección de cualquier tejido mineralizado o fibroso bajo un microscopio. Aunque los valores medios parecieron mostrar una disminución entre los 1 y 5 meses, no hubo una disminución estadísticamente significativa en los valores combinados para médula, bazo, hueso y pulmón entre estos dos periodos de tiempo. Los ensayos de ratones no irradiados revelaron solamente niveles muy bajos de las células de donante de los mismos momentos (<0,0001 a 0,05%). El ensayo de PCR in situ de secciones tisulares de pulmón demostró que la progenie de las células de donante se distribuía de forma uniforme en el parénquima tanto de alvéolos como de bronquios.

Para confirmar que la progenie de las células de donante estaba presente en el cartílago, se aislaron condrocitos del cartílago xifoide y articular por digestión a 37ºC durante una noche con 0,5 mg/ml con colagenasa bacteriana (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) en DMEM. Los ensayos de PCR indicaron que la progenie de las células de donante representaba el 2,5% de los condrocitos aislados.

Para determinar si las células de donante se convertían en células mesenquimales funcionales en los tejidos que poblaban, los tejidos obtenidos de los ratones receptores se ensayaron por RT-PCR para la expresión del mini-gen humano para colágeno I contenido en las células de donante. En tres ratones ensayados a los 150 días, el mini-gen se expresó en hueso, un tejido en el que más de la mitad de la proteína sintetizada es colágeno I. La expresión en el hueso se confirmó usando un ensayo similar en células óseas aisladas a partir del fémur y cultivadas durante 1 semana. La expresión del mini-gen para colágeno I era más variable en médula, bazo y pulmón, tejidos en los que la velocidad de la síntesis de colágeno I es menor que en el hueso. Como se esperaba, el mini-gen no se expresó en cartílago, un tejido en el que aproximadamente la mitad de la proteína se sintetiza en colágeno II pero en el que no hay síntesis de colágeno I. El mini-gen para colágeno I tampoco se expresó en cultivos de condrocitos obtenidos a partir del ratón receptor que contenían el gen marcador y que sintetizan colágeno II pero no colágeno I.

Los resultados presentados en la presente memoria demuestran que después de la inyección intravenosa en ratones irradiados, los cultivos expandidos de células adherentes pueblan de forma eficaz varios tejidos conectivos. Los resultados también demuestran que las células sirven como células precursoras verdaderas para estos tejidos, ya que expresan el gen marcador para colágeno I de un modo específico de tejido y que se incorporaron de forma difusa en el parénquima mesenquimal del pulmón.

Ejemplo 2 Condiciones para el Aislamiento y Cultivo de MSC

Se examinaron las condiciones para el cultivo de MSC de tal forma que se expandieran pero conservaran el fenotipo similar a célula madre. La Tabla I proporciona datos que establecen que el co-cultivo de MSC con trozos de hueso aumentó el número de células obtenidas después de 1 semana. Al mismo tiempo, el co-cultivo con hueso disminuyó los niveles de fosfatasa alcalina (APasa) en las células, una observación que sugiere que las células no se diferencian en osteoblastos. Además, hubo una disminución de los niveles de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP), una observación que sugiere que las células no se diferencian en osteoblastos. Se observaron efectos similares con cultivos secundarios de las MSC. Por lo tanto, los resultados sugieren que el co-cultivo de MSC con trozos de hueso puede proporcionar condiciones mejoradas para la expansión de MSC. Además, el medio de trozos de hueso cultivados puede ser una fuente importante de citocinas y factores de crecimiento para la expansión de MSC en cultivo.

En experimentos relacionados, se ha descubierto que los cultivos secundarios de MSC se pueden mantener durante largos periodos de tiempo. Las MSC pueden pasarse en cultivo durante más de 4 meses mediante tratamiento con tripsina y nuevo sembrado. Las células son marcadamente estables en cultivos de fase estacionaria. En un experimento, los cultivos estacionarios permanecieron viables durante más de 4 meses, con nueva alimentación aproximadamente una vez por semana. En otro experimento, las células permanecieron viables cuando, por un descuido, se dejaron en un incubador sin nueva alimentación durante 1 mes.

Transfección Estable de MSC con un Vector Retroviral

Para obtener virus para la infección de MSC, se modificó el vector retroviral LNCZ (Miller et al., 1989, BioTechniques 7: 980-990) de tal forma que el promotor de citomegalovirus (pCMV) dirigió la expresión del gen lacZ (Figura 1). El factor se transfectó de forma estable en una línea celular de empaquetamiento de retrovirus murino anfotrópico (PA317). Se aislaron clones productores de virus constitutivos por selección con G418 y se usó el sobrenadante obtenido de los clones para la infección de las MSC. Se infectaron cultivos primarios de MSC (3 días de edad) durante tres días sucesivos con sobrenadante fresco obtenido a partir de la línea productora con el título más elevado. La tinción de las células 5 días después indicó que aproximadamente el 15-20% de las células expresaba típicamente el gen lacZ. Se colocaron varios cultivos de las células infectadas en selección con G418 (0,44 \mug/ml de concentración activa) durante 5 días. La mayoría de las células que se recuperaron continuaron expresando el gen lacZ. También se construyeron modificaciones de LNCZ de tal forma que la expresión del gen lacZ se dirigió por el promotor del gen COL AI y el promotor del gen COL2 Al (pCOL2A1). La expresión del gen lacZ se obtuvo de forma exitosa en cultivos primarios de MSC usando ambas construcciones.

Ejemplo 3 Expresión a Largo Plazo de Genes Humanos usando hGH, factor IX u Ob en MSC Transfectados de Forma Estable

Se aíslan MSC de ratones y se cultivan en las condiciones que se describen en Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4857-4861, que se incorporan en la presente memoria como referencia. Las MSC se infectan con vectores retrovirales o se transfectan con ADN desnudo para obtener clones que expresan los genes para la hormona del crecimiento humana (hGH), la proteína de obesidad humana (Ob) o el gen del factor IX humano. Ya que se ha introducido de forma exitosa un gen lacZ en MSC de ratón con un vector retroviral, se usaron variantes del mismo vector. Al mismo tiempo, las MSC se transfectan de forma estable con electroporación (Andreason et al., 1988, BioTechniques 6: 650-660; Toneguzzo et al., 1986, Mol. Call. Biol. 6: 703-706), lipofectamina e inyección nuclear (Mercer et al., 1992, en: Antisense Strategies, Ann. IV. Y. Acad. Sci. Biol. 660: 209-218) de tal forma que se pueden usar genes endógenos mayores. Además se evitan algunas de las potenciales desventajas de retrovirus usando una metodología de introducción alternativa.

La condiciones convencionales para el aislamiento y el cultivo son: se obtiene médula completa de las tibias y fémures de ratones FVB/N de 6 a 10 semanas de edad cortando los extremos de los huesos y extruyendo la médula con una jeringa que contiene de 1 a 2 ml de \alpha-MEM helado y suero fetal bovino al 10% (FBS). Las células de médula combinadas se dispersan agitando de forma suave y se recuentan en un contador automático (modelo de contador ZM). De 5 X 10^{6} a 5 X 10^{7} células nucleadas en 25 ml de \alpha-MEM y FBS al 10% se siembran en matraces de cultivo de 75 cm^{2}. Después de 4 horas o 3 días, las células no adherentes se retiran sustituyendo el medio. Las células adherentes se expanden como cultivos primarios durante 10 a 12 días con una nueva alimentación aproximadamente cada 4 días. Las células se recuperan por digestión con tripsina al 0,25% y EDTA de 1 a 5 mM durante 5 minutos a 37ºC seguido por raspado suave. Las células se diluyen con \alpha-MEM con FBS al 10% y se vuelven a sembrar a una densidad de 3 X 10^{4} a 1 X 10^{5} células por 9,5 cm^{2} en placas de 6 pocillos. En estas condiciones, el tiempo de duplicación de las células es de 19 a 22 horas. Los cultivos secundarios se vuelven a alimentar aproximadamente cada 4 días y se pasan por tratamiento con tripsina y nuevo sembrado en las mismas condiciones.

Preparación de Construcciones Génicas

Se usa el vector retroviral LNCX como la construcción parental. Se usan sitios de clonación convenientes en la construcción para preparar las construcciones modificadas pRSV-lacZ, pCMV-lacZ, pCOL1/lacZ y pCOL2-lacZ (Figura 1). El promotor pCOL 1 es un fragmento de 1,4 kb que contiene 476 pb del promotor, el primer exón y la mayora parte del primer intrón del gen COL1A1 humano. Se ha demostrado que en ratones transgénicos el promotor expresa una forma sin promotor del gen COL2A1 de un modo altamente específico de tejido y específico del desarrollo (Sokolov et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 9622-9629). El promotor de COL2A1 es un fragmento de 1 kb del gen COL2A1 humano (Ala-Kokko et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 14175-14178) que confiere especificidad de tejido de la expresión (Bradham et al., 1994, J. Cell Physiol.158: 61-68). El gen lacZ se sustituye por el gen hGH (Nichols Laboratories); el gen OB (Considine et al., 1995, J. Clin. Invest. 95: 2986-2988) o el gen del factor IX humano (Genetic Therapy, Inc.).

Uso del Vector Retroviral Líneas Celulares Productoras de Retrovirus

Para establecer líneas celulares productoras se usaron células murinas de empaquetamiento de retrovirus anfotrópico PA317. Las células se transfectaron al 20% de confluencia en placas de 100 mm por el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico (Promega) usando 15 \mug de ADN plasmídico que se linealizó por digestión con Scal que corta en la región pBR322 del vector retroviral. Un día después de la transfección se añadió G418 (GIBCO/BRL) al medio a una concentración activa de 1 mg/ml. Aparecieron colonias resistentes a neomicina de 7 a 10 días después de la selección y se aislaron clonándolas con anillos mecánicos. Los clones se expandieron y se ensayaron los clones individuales para determinar la capacidad de expresar lacZ por tinción directa de pocillos por duplicado. El título del virus producido por las células positivas se ensayó por una única adición de 50 \mul de medio a células tumorales humanas HT-1080 cultivadas hasta el 20% de confluencia en placas de microtitulación de 6 pocillos con 3 ml de medio por pocillo y en presencia de 4 \mug/ml de polibreno. El título se ensayó por determinación del número de células HT-1080 que se tiñeron positivamente para la expresión del gen lacZ. Típicamente, el título fue de 1 X 10^{5} a 1 X 10^{6}.

Infección por Retrovirus de MSC de Ratón

Se prepararon como se ha descrito anteriormente cultivos primarios de MSC de ratón. Después de 3 días, se desecharon las células de médula no adherentes y se añadió medio fresco. Las células se infectaron después con el retrovirus en presencia de 4 \mug/ml de polibreno por adición de 1/4 de volumen de medio de sobrenadante fresco de células productoras transfectadas de forma estable que tenían el mayor título de producción de virus. La infección se repitió en dos días sucesivos adicionales. Las células después se tiñeron directamente para expresión de lacZ o se dividieron en placas de mayor tamaño y se pusieron en selección con 0,4 mg/ml de G418 (concentración activa). Aproximadamente del 15 al 20% de cultivos primarios fueron positivos para lacZ y la mayoría de las células que sobrevivieron a la selección con G418 fueron positivas para lacZ.

Transfección con Lipofectamina

Se cultivaron cultivos primarios de MSC durante 10 días en \alpha-MEM que contenía FBS al 10%. Después del tratamiento con tripsina y de un raspado ligero, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 10^{5} células por pocillo. Las células se cultivaron durante 2 días, después se lavaron 2 veces con PBS y se incubaron con un complejo de ADN-lipofectamina. El complejo de ADN-lipofectamina se preparó del siguiente modo: 6 \mul de lipofectamina (GIBCO/BRL) se mezclaron con 1 \mug de ADN de LNCZ en 200 \mul de \alpha-MEM, se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y se añadieron a un pocillo de una placa de 6 pocillos que contenía MSC en 800 microlitros de \alpha-MEM. Después de 6 horas de incubación a 37ºC, el complejo de ADN-lipofectamina se sustituyó por 2 ml de \alpha-MEM que contenía FBS al 10%. Las células se tiñeron para lacZ o se pusieron en selección con G418 después de 18 horas de incubación en medio que contenía FBS. Se obtuvieron clones positivos, pero crecieron lentamente, aparentemente porque la densidad celular era demasiado baja después de la selección con G418. Para evitar esta situación, se pueden usar tres estrategias diferentes: las células se siembran a densidades mayores; se colocan insertos de cultivo celular en co-cultivo sobre los clones supervivientes de forma temprana en el proceso de selección y se colocan MSC recién obtenidas o trozos de hueso en los insertos (véase la Tabla 1) diariamente para proporcionar los factores celulares necesarios para estimular el crecimiento; en el momento en el que la selección con G418 ha destruido la mayoría de las células no transfectadas, los cultivos se vuelven a sembrar con MSC que se han infectado con una variante del retrovirus LNCX (Figura 1), donde el gen lacZ se sustituye por un gen seleccionable para timidina quinasa. Por lo tanto, las MSC transfectadas de forma estable con retrovirus se usan para proporcionar las citoquinas necesarias, los factores de crecimiento y las interacciones celulares que se requieren para el cultivo inicial de las MSC transfectadas durante la selección en G418. Después, pueden eliminarse as células infectadas con el retrovirus por selección negativa con ganciclovir.

Sistemas de Suministro Inyecciones Nucleares

Las inyecciones nucleares son altamente eficaces como un medio para transfectar algunas células. Se sembraron células en placas de 60 mm que contenían un cubreobjetos de 22 x 22 mm marcado con un círculo para delinear el área para la microinyección. Las células se incubaron en medio que contenía CS al 0,1% durante 5 días para inducir el bloqueo del crecimiento antes de la microinyección. En estas condiciones entre el 8 y el 15% de las células incorporaron [^{3}H] timidina durante el marcado continuo durante 24 horas entre los días 5 y 6. Se realizó la microinyección usando un microscopio invertido de Zeiss Axiovert equipado con un microinyector de Eppendorf y un micromanipulador usando femto-puntas capilares de vidrio adquiridas en el mercado (Eppendorf). Todas las células dentro de un área delineada del cubreobjetos (habitualmente 150-200) se microinyectaron en el núcleo con ADN a concentraciones que variaban de 0,01-10 \mug/\mul en tampón Tris (pH 7,6). Después, las células inyectadas se expanden y se ensayan como se ha descrito anteriormente.

Electroporación

Las MSC se tratan con tripsina al 0,25% y EDTA de 1 a 5 mM durante 5 minutos a temperatura ambiente y después se recogen por raspado. Las células se sedimentan por centrifugación a 4.000 x g durante 10 minutos y después se lavan dos veces resuspendiendo el sedimento en PBS helado (pH 7,4). Las MSC se resuspenden a 2 X 10^{6} células por 0,8 ml y se dividen en alícuotas en una cubeta de electroporación (hueco de 0,4 cm). Las células se incuban durante 10 minutos sobre hielo, se añade el ADN a la suspensión (5-50 \mug) y las células se enfrían durante 10 minutos adicionales. La suspensión celular se usa después para electroporación usando un instrumento comercial (BioRad Gene Pulser; modelo 1652076) a una intensidad de campo determinada empíricamente que proporciona el mayor porcentaje de células que conservan el ADN añadido de forma exógena. Para determinar la intensidad de campo apropiada para las MSC se han realizado titulaciones que variaban de 0,25-2,5 kv/cm. La eficacia de la electroporación se controló introduciendo un gen lacZ (vector LNCZ) y tiñendo después las células de 48 a 72 horas después de la electroporación.

Ensayos hGH

La expresión del gen hGH se controla ensayando el medio de clones de células cultivadas en placas de microtitulación de 6 pocillos con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas con un kit disponible en el mercado (GIBCOBRL). En este ensayo; se añaden 0:1 ml de tampón diluyente 2 X por pocillo a una placa de microtitulación. Después de 5 minutos se añaden 0,1 ml de la muestra de ensayo y la placa se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Los pocillos se lavan 5 veces y se añaden 0,2 ml de anticuerpo primario por pocillo. Las muestras se incuban a 37ºC durante 30 minutos y se lavan 5 veces. Después se añaden 0,2 de tampón de sustrato que contiene sustrato de O-fenilendiamina. Se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos y la reacción se detiene por adición de 0,1 ml de ácido sulfúrico 2 N. La absorbancia de la muestra se ensaya a 490 nm.

Proteína Ob

Las células se ensayan para la expresión del gen OB usando un radioinmunoensayo de proteína de medio celular. El anticuerpo primario para la proteína OB humana se generó en conejos contra proteína recombinante sintetizada en un sistema de expresión de E. coli y se purificó hasta la homogeneidad. La proteína humana es muy homóloga a la de ratón y, por lo tanto, los anticuerpos anti-humana debería presentar una reacción cruzada con la proteína de ratón. Si no, el ADNc corto de ratón (619 nt) se expresa en E. coli, la proteína se purifica y se preparan anticuerpos. Como alternativa, se adquieren péptidos sintéticos que tienen la secuencia de ratón y los mismos se usan para preparar anticuerpos. Para el ensayo, la proteína Ob humana recombinante se radiomarcó con ^{125}Yodo por el método de BoltonHunter seguido de purificación por filtración en gel usando Sephadex G-25. La actividad específica obtenida fue de 30 \muCi/\mug. Las muestras para el ensayo (0,2 ml) se preincubaron con antisuero primario (dilución 1:2000) en solución salina tamponada con fosfato que contenía Triton X-100 al 0,1% durante 16 horas a 4ºC en un volumen total de 0,4 ml. Después se añadió proteína Ob-^{125}l (30.000 cpm contenidos en 100 \mul) y la incubación se continuó durante 24 horas adicionales. La proteína Ob unida (12 \pm 1%; unión inespecífica 1,4 \pm 0,1%) se inmunoprecipitó por la adición de 0,1 ml de suero de oveja anti-IgG de conejo (Antibodies, Inc., Davis, CA), 0,1 ml de suero de conejo normal (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) y 0,1 ml de polietilenglicol al 10%. Los tubos se centrifugaron durante 15 minutos (2200 rpm), se decantó el marcador no unido y se recontó la radiactividad en el sedimento en un contador gamma Packard 5000 (Downers Grove, IL). La concentración de proteína Ob en muestras desconocidas se calculó usando el modelo logístico no ponderado de cuatro parámetros de Rodbard. El límite de detección de este ensayo es de 0,39 ng/ml. La varianza intraensayo es del 11,6% a 12 ng/ml con una varianza interensayo del 20,8% a 13,1 ng/ml.

Factor IX Humano

La expresión del gen que codifica el factor IX se ensaya usando un ELISA disponible en el mercado (American Bio-products Company) en condiciones similares a las usadas en el ensayo de hGH (anterior). La curva patrón variaba de 1-50 ng/ml^{-1} y el límite de sensibilidad era de 1 ng/ml^{-1}. El ensayo no tenía reacciones cruzadas con el factor IX de ratón.

Ejemplo 4 Expresión sostenida de los tres genes a niveles fisiológicamente importantes por infusión sistémica de MSC transfectadas de forma estable en ratones

Los experimentos que se presentan en la presente memoria han demostrado que las MSC cultivadas pueden servir como precursores similares a células madre de hueso, cartílago y otros tejidos mesenquimales después de la infusión sistémica. Por lo tanto, las MSC que expresan hGH, la proteína Ob o el factor IX se infunden en ratones irradiados y no irradiados para evaluar la expresión sostenida de los genes in vivo.

Infusión de MSC

Inicialmente se infunden MSC en ratones en la condiciones descritas en la presente memoria (ratones de 3 semanas de edad: irradiación de 300 ó 700 Gray; inyección intraperitoneal; 1 x 10^{6} MSC; y 2 x 10^{8} células de médula completa). Además, se compara la infusión intravenosa con la intraperitoneal; y se emplean niveles menores de irradiación con rayos X. Además, las células se infunden en embriones por cesárea. En ensayos preliminares se inyectaron 50 \mul de 5 X 10^{4} ES en el amnios de siete embriones de 13 días; 6 de 7 se suministraron como crías viables. Por lo tanto, la inyección intrauterina de MSC es factible.

Curvas de Crecimiento

La expresión in vivo eficaz de hGH debería aumentar la velocidad de crecimiento de ratones y la expresión de la proteína Ob debería inducir inanición. Por lo tanto, se controla el peso y el tamaño de los ratones tratados y de los hermanos de camada control.

Ensayos para Expresión Génica

Se obtiene sangre del plexo retroorbital de ratones 1 semana, 1 mes, 3 meses, 5 meses, 10 meses y 20 meses después de la infusión de las MSC. Se ensayan el hGH y el factor IX por ELISA, y la proteína Ob se ensaya con un ensayo radioinmune. Además, si se obtienen con ELISA aumentos medibles del factor IX humano, el procedimiento descrito en Smith et al. (1993) Mature Genet. 5: 397-402, se usa para ensayar el Factor IX humano biológicamente activo. En este procedimiento, el Factor IX humano se capturó en primer lugar en un pocillo de microtitulación con el anticuerpo monoclonal, BGIX1, y después se activó por el Factor Xla. El Factor IX activo, en combinación con el Factor VIII, convirtió al Factor X en Xa. El Factor Xa escindió el sustrato cromogénico, S2765, proporcionando un producto amarillo. Las placas de microtitulación revestidas con BG1X1 y el Factor VIII se obtuvieron de Elcatech, Inc. (Winston-Salem, NC). El Factor XIa se adquirió de Enzyme Research Labs, Inc. (South Bend, IN).

El Factor X, solución de fosfolípido, S-2765 y el inhibidor de trombina, 1-2581, se adquirieron de Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH). Se prepararon cuatro tampones: A, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, BSA al 1%, pH 7,5; B, Tris 150 mM, CaCI_{2} 5 mM, gelatina 10 mg/ml, pH 7,6; C, Tris 50 mM, CaCI_{2} 10 mM, pH 7,5; D, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8,4. La mezcla de reacción del Factor VIII/X se preparó en fresco mezclando cantidades iguales de las siguientes soluciones madre: Factor VIII, 5 U/ml en tampón A; Factor X, 1 U/ml en tampones; 1-2581, 34 \mug/ml en tampón A; CaCI_{2}, 25 mM en agua; y fosfolípido. Se diluyeron muestras de plasma en tampón A y se añadieron 100 \mul a cada placa de microtitulación. La placa se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente y después se lavó 5 veces con tampón B. Se añadieron 100 \mul de Factor XIa (2 \mug/ml en tampón C) a cada pocillo. Después de 30 minutos a 37ºC, se añadieron 100 \mul de S2765 (0,5 mM en tampón D) a cada pocillo y la placa se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de que se detuviera la reacción añadiendo ácido acético a una concentración final del 10%. Se determinaron las absorbancias a 405 nm usando un lector de microplacas Bio-Rad. La curva patrón, preparada con diluciones de plasma normal humano combinadas, fue lineal de 3-25 ng/ml. El ensayo no tuvo reacciones cruzadas con el Factor IX de ratón. Niveles de Factor IX de 250 ng/ml o del 5% de lo normal se consideran generalmente terapéuticos y de 100 a 150 ng/ml se consideran beneficiosos.

Ejemplo 5 Expresión sostenida de los genes a niveles fisiológicamente importantes colocando las MSC en cámaras de difusión subcutáneas

Las células implantadas en cámaras de difusión subcutáneas tienen al menos dos ventajas distintas para el uso en la terapia de pacientes humanos: se evitan las respuestas inmunes; y cuando se implantan en cápsulas en ratones (Benayahu, 1989, J. Cell Physiol. 140: 1-7), ratas (Mardon et al., 1987, Cell Tissue Res. 250: 157-165) o conejos (Friedenstein et al., 1987, Cell Tissue Kinet. 20: 263-272), sobreviven durante al menos 6 semanas (Wakitani, 1994, J. Bone and J.T. Surgery 76A: 579-592), al parecer debido a que persisten como hueso, tejido fibroso o cartílago que no requiere vascularización (Benayahu et al., 1989, anteriormente; Mardon, et al., 1987, anteriormente; Owen et al., 1988, en: Cell and Molecular Biology of Invertebrate Hard Tissues, Wiley Chicester, CIBA Foundation Symposium, 136: 42-60; Friedenstein et al.,1987, anteriormente).

Preparación de Cámaras

Las cámaras de difusión se ensamblan a partir de componentes disponibles en el mercado (Millipore Corp.) y se usan como se ha descrito en informes previos (Benayahu et al., 1989, anteriormente; Mardon et al., 1987, anteriormente). Brevemente, filtros de membrana con un tamaño de poro se pegan por un lado a cada uno de dos anillos de plástico con pegamento acrílico. Después, los dos anillos se pegan entre sí para formar una cámara, las dimensiones son de 9 mm de diámetro interno y 2 mm de grosor con un volumen de aproximadamente 127 mm^{3}. Se inoculan de 10^{4} a 10^{7} MSC en las cámaras a través de un orificio en un anillo y el orificio se sella con un tapón de plástico ahusado recubierto con pegamento. Las cámaras se implantan en ratones por vía subcutánea en el lomo o por vía intraperitoneal con anestesia. Inicialmente se insertan una o más cámaras en ratones recién destetados (3 semanas). Posteriormente, se insertan cámaras en ratones de 1 semana de edad. Para los experimentos con los ratones de 1 semana de edad se preparan cámaras más pequeñas a partir de discos (5 mm, diámetro interno) recortados a partir de puntas de plástico para micropipetas.

Ensayos

Se obtiene sangre a partir del plexo retroorbital 1 semana, 1 mes, 3 meses, 5 meses, 10 meses y 20 meses después del implante de las cámaras. El plasma se ensaya para hGH, proteína Ob y factor IX como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 6 La Cámara de Difusión

Con respecto a la Figura 2, la cámara de difusión (1) puede tener un barril de cámara (3) que tiene dos extremos, un primer extremo (5) y un segundo extremo (7). El barril puede comprender uno o más anillos fijados entre sí por medios no tóxicos. La cámara se fija a cada extremo con un filtro, un primer filtro (9) y un segundo filtro (11). Los filtros son porosos para factores, por ejemplo, proteínas, de tal forma que los factores pueden pasar entre la cámara y el mamífero. El tamaño de los poros del filtro puede ser de aproximadamente 0,25 \mum o menor, preferiblemente de aproximadamente 0,1 \mum. Los filtros se pueden hacer de plástico, teflón, poliéster o cualquier material inerte que sea fuerte, flexible y capaz de resistir tratamientos químicos. Los filtros pueden fijarse en posición con juntas de goma que también pueden proporcionar un precinto más ajustado. Opcionalmente, la parte de barril de la cámara puede tener una abertura (13) que puede ser cubierta por un capuchón (no mostrado). El capuchón puede ser una goma autosellante de tipo rosca y adaptado a la abertura. Por lo tanto, la inserción de células en el contenido de la cámara puede realizarse accediendo a la abertura por retirada del capuchón e insertando las células usando una aguja y jeringa normales. La cámara puede estar hecha de cualquier sustancia tal como, pero sin limitación, plástico, teflón, lucite, titanio o cualquier material inerte que no sea tóxico y que se tolere bien por los mamíferos. Además, las cámaras deben ser capaces de sobrevivir a la esterilización.

La cámara se puede implantar de los siguientes modos no limitantes: por vía subcutánea o por vía intraperitoneal, por ejemplo. La cámara puede retirarse de aproximadamente 24 a aproximadamente 30 horas después del implante. Como alternativa, se puede emplear una cámara rellenable de tal forma que la cámara pueda reutilizarse para los tratamientos y vaciarse después de los tratamientos.

Ejemplo 7 Administración de MSC Aisladas Directamente en Cerebros de Rata Preparación de MSC y Astrocitos de Donante

Se cultivaron MSC humanas (Owen et al., 1988, in Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symposium 136, Chichester, UK, págs. 42-60; Caplan, 1991, J. Orthop. Res. 9: 641-650; Prockop, 1997, Science 276: 71 -74; Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 4857-4861; Pereira et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1142-1147) a partir de aspirados tomados de la cresta ilíaca de voluntarios normales machos y hembras de 19 a 46 años de edad. Los aspirados se diluyeron 1:1 con \alpha-MEM/FBS al 10% y se centrifugaron por un gradiente de densidad (Ficoll-Paque Plus; 1,077 g/ml, Pharmacia, LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) durante 30 minutos a 1000 X g. Después de que se combinaran el sobrenadante y la interfaz, la mezcla se diluyó hasta aproximadamente 40 ml con \alpha-MEM/FBS al 10% y se volvió a centrifugar. Las células nucleadas, es decir, las MSC, se suspendieron a una concentración de 1 X 10^{7}/ml en \alpha-MEM/FBS al 10% y las células se sembraron a 3 X 10^{6}/cm^{2} en placas de cultivo de 25 cm^{2}. Las MSC se incubaron durante 3 días y las células no adherentes se retiraron sustituyendo el medio en el cultivo. Después de que los cultivos de MSC alcanzaran la confluencia, las MSC se retiraron de las placas por incubación con tripsina al 0,25% y EDTA 1 mM a 37ºC de 3 a 4 minutos. Las MSC se diluyeron 1:2 o 1:3 y el procedimiento para preparar las MSC se repitió durante 3 a 5 pases. Comenzando con el segundo pase, se añadieron 5 ng/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA; GIBCO/BRL, Grand Island, NY) al medio.

Para el aislamiento de MSC de rata se disecaron tibias y fémures obtenidos de ratas hembra Lewis/SsNHsd de 8-12 semanas de edad (Harlan Sprauge Dawley, IN). Los extremos de los huesos se cortaron y se extruyó la médula usando 5 ml de DMEM (GIBCOBRL, Grand Island, NY) usando una aguja y una jeringa. Se sembraron entre 100-200 X 10^{6} de células de médula completa en un matraz de cultivo de tejido de 175 cm^{2} en DM EM/FBS al 10%. Después de 24 horas, las células no adherentes se retiraron por sustitución del medio. El medio se sustituyó cada 2 a 3 días a medida que las células se cultivaban hasta la confluencia. Las células se retiraron como anteriormente por incubación en presencia de tripsina al 0,25% y EDTA 1 mM, después de lo cual las células se pasaron de tres o cuatro veces y después se almacenaron congeladas hasta el uso.

Se obtuvieron cultivos primarios de astrocitos (Azizi, 1996, Ann. Neurol. (supl.) 121: T236) a partir de los cerebros de ratas adultas Sprague-Dawley albinas (Harlan Sprague Dawley). Después se decapitaron las cabezas de los ratones, se extrajeron los cerebros en condiciones asépticas y se dejaron flotar en PBS frío sobre hielo. Las meninges y el tronco cerebral se retiraron y se desecharon. El prosencéfalo se disoció mecánicamente en pequeños trozos de tejido y los tejidos se incubaron a 37º durante 30 minutos en 2,4 unidades/ml de dispasa (GIBCO/BRL, Grand Island, NY). A intervalos de 10 minutos, los tejidos se disociaron haciéndolos fluir a través de una pipeta de orificio grande. Los tejidos disociados se centrifugaron y el sobrenadante se desechó. Los residuos de cada cerebro se suspendieron en \alpha-MEM y se sembraron en dos matraces de cultivo de 175 cm^{2}, cada uno en un medio de \alpha-MEM/FBS al 10%. Las células no adherentes y los restos se retiraron cambiando el medio después de 48 horas y después cambiando el medio cada 4 días durante aproximadamente 2 semanas hasta que los cultivos eran confluentes. Para retirar las células poco adheridas, los cultivos confluentes se trataron con 2,4 unidades/ml de dispasa durante 15 minutos a 37ºC y los cultivos se agitaron en un agitador giratorio a 120 rpm durante 2 horas. Las células desprendidas se desecharon. Se añadió medio fresco a las células adherentes y los cultivos se volvieron a incubar durante de 24 a 48 horas. El tratamiento con dispasa para eliminar las células poco adherentes se repitió tres veces a lo largo de un periodo de aproximadamente 1 semana.

Para la tinción con anticuerpo, las células se retiraron de las placas por incubación con tripsina al 0,25% de 1 a 3 minutos. Después, las células se subcultivaron en portaobjetos con cámaras. Para marcar de forma fluorescente los núcleos, las MSC y los astrocitos se incubaron en presencia de 1 \mug/ml de bis-benzamida (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) durante 24 horas antes del implante. De una a dos horas antes del implante, los cultivos se lavaron tres veces con solución salina tamponada estéril y se retiraron de las placas por incubación con tripsina al 0,25% durante de 1 a 3 minutos. La tripsina se neutralizó por adición de medio que contenía suero al 20% y las células se aislaron por centrifugación. Las células se suspendieron como una suspensión de aproximadamente 10.000 células/litro en \alpha-MEM sin suero.

\vskip1.000000\baselineskip

Neurotrasplante de Células

Se anestesiaron ratas albinas Sprague-Dawley adultas (cada una con un peso de 200 a 300 gramos) en una cámara sellada usando halotano al 3% en oxígeno. Se mantuvo la anestesia por inyección intramuscular de una mezcla de 6 mg/kg de xilazina y 60 mg/kg de ketamina. Los animales se transfirieron a un aparato estereotáxico en un campo limpio. Se realizó una incisión de 2 a 5 mm en el cuero cabelludo, 2 mm lateral al bregma. Se realizó un orificio de taladro en el hueso en una posición 3 mm lateral al bregma usando una fresa dental. Aproximadamente 10 \mul de la suspensión celular se inyectaron lentamente a lo largo de 30 minutos en el cuerpo estriado a una profundidad de 4 a 5 mm de profundidad de la superficie del cerebro. La herida se cerró con suturas quirúrgicas interrumpidas y los animales se trataron con 0,6 mg/kg de xilazina y 6 mg/kg de ketamina. A intervalos de 5, 14, 30 y 72 días, las ratas se sacrificaron por perfusión intracardiaca bajo anestesia profunda usando xilazina y ketamina. Se realizó una perfusión usando solución salina tamponada con fosfato helada, seguida de paraformaldehído tamponado al 3% y después seguido de sacarosa al 10%. Se extrajeron los cerebros, se cortaron los prosencéfalos y se congelaron inmediatamente muestras que comprendían secciones del cerebro.

\vskip1.000000\baselineskip

Inmunohistología de Células Implantadas

Se prepararon secciones tisulares de diez micrómetros usando un criostato. El sitio de trasplante en el cerebro se localizó identificando microscópicamente las células marcadas fluorescentemente en las secciones tisulares. Se unieron secciones congeladas a los portaobjetos recubiertos con gelatina y se sumergieron rápidamente en acetona fría durante 5 minutos y se almacenaron a -20ºC para el procesamiento posterior. Las células en los portaobjetos con cámaras se fijaron con acetona durante 5 minutos. Se realizó la inmunocitoquímica a temperatura ambiente. Las células y las secciones tisulares se trataron con anticuerpos bloqueantes que comprendían suero de cabra al 2% y suero fetal bovino al 5% durante 30 minutos. En experimentos que requerían el marcado de colágeno y de vimentina, las células se trataron adicionalmente con Triton X-100 durante 30 minutos y después se aclararon en PBS. Se aplicaron anticuerpos primarios (Tabla 2) durante 1 a 2 horas a células en los portaobjetos con cámaras. Estos anticuerpos se aplicaron durante 24 horas en el caso de secciones tisulares. Los anticuerpos secundarios usados eran IgG específicas de especie acopladas a FITC o rodamina.

Las células marcadas fluorescentemente se visualizaron y fotografiaron usando un microscopio de fluorescencia. El número de núcleos marcados fluorescentemente se recontó en de ocho a diez secciones tisulares, cortadas desde los límites rostral a caudal del cuerpo estriado. Este procedimiento se repitió en cada cerebro por dos individuos, que usaban secciones alternas. Solamente se contaron los núcleos claramente marcados. Las células muertas y lisadas dejaban un matiz azulado en el tejido circundante y ninguna tinción nuclear clara. Los números observados se extrapolaron al número total de escisiones para estimar el número de células injertadas supervivientes.

\vskip1.000000\baselineskip

MSC de Donante y Precursores de Astrocitos

MSC obtenidas a partir de médula ósea humana se aislaron por su adherencia a plástico y se cultivaron durante 3 a 5 pases. Como se indica en la Figura 3, la adición de PDGF-AA aumentó la velocidad de crecimiento de las células. Por lo tanto, se añadió PDGF-AA a las células en los pases 2 a 5 para obtener números adecuados de MSC humanas. Sin embargo, las MSC de rata crecían adecuadamente sin la adición de PDGF-AA. También se aislaron astrocitos debido a su fuerte adherencia a placas de cultivo de plástico. Se recogieron astrocitos después del cultivo primario durante aproximadamente 3 semanas.

Como se indica en la Tabla 2, las MSC se tiñeron fuertemente para fibronectina, colágeno I y HLA-ABC humano. Las MSC humanas se tiñeron débilmente para vimentina y fueron negativas para proteína ácida fibrilar glial, mientras que los astrocitos de rata fueron positivos para ambas. Los astrocitos de rata apenas se tiñeron para fibronectina y fueron negativos para colágeno I y HLA-ABC humano. Los astrocitos de rata también fueron negativos para factor von Willebrand y galactocerebrosidasa C.

Se ha descrito previamente que las MSC humanas se vuelven relativamente homogéneas en aspecto a medida que estas células se pasan en cultivo (Bruder et al., 1997, J. Cell Biochem. 64: 278-294). Sin embargo, en el presente estudio se observaron dos poblaciones distintas. Las mismas incluían una población de células aplanadas grandes y una población de células relativamente alargadas o con forma de huso (Figura 4, Paneles A y B). En MSC de rata también se observaron dos poblaciones distintas de células que tenían morfologías similares (Figura 4, Panel C). Los astrocitos de cerebro de rata eran más dendríticos en aspecto (Figura 4, Paneles E y F).

\vskip1.000000\baselineskip

Supervivencia de Células después de la Inyección en el Cuerpo Estriado

Las MSC y los astrocitos se inyectaron en el cuerpo estriado de cerebros de ratas usando una presión de perfusión mínima. De cinco a 72 días después, las ratas se sacrificaron y se obtuvieron secciones de sus cerebros. El examen de secciones teñidas con hematoxilina y eosina indicó que no había una gliosis significativa alrededor del sitio del implante de los astrocitos de rata o de las MSC (Figura 5, Panel a). Las células marcadas fluorescentemente se detectaron rápidamente en las secciones del cerebro. Los astrocitos de rata, como se ha demostrado previamente en la técnica antecedente, se injertaron rápidamente (Andersson et al., 1993, Int. J. Dev. Neurosci. 11: 555-568; Azizi, 1996, Ann. Neurol. (supl.)121: T236; Zhou et al., 1992, J. Comp. Neurol. 317: 145-155). Se obtuvieron resultados similares usando MSC de rata (Figura 5, Panel f) y MSC humanas (Figuras 5, Paneles b-e). Como se indica en la Tabla 3, de aproximadamente 20.000 a 42.000 células estaban presentes en los cerebros recuperados. Ya que el número de las células inyectadas variaba de 100.000 a 120.000, aproximadamente 20% de las MSC humanas infundidas se recuperaron después de 5 a 72 días. Además, parecía que había una disminución en el número de las MSC humanas infundidas recuperadas entre los días 30 y 72. En el caso de MSC de rata, se recuperaron 33.000 células o aproximadamente el 30% 14 días después de la infusión (Figura 5f).

\vskip1.000000\baselineskip

Migración de las Células Implantadas

Se ha descrito previamente que los astrocitos de ratas implantados migran a través de capas del cerebro (Andersson et al., 1993, Int. J. Dev. Neurosci. 11: 555-568; Zhou et al., 1992, J. Comp. Neurol. 317: 145-155) de un modo similar a la migración observada con células madre neurales implantadas o con una línea transformada de células madre neurales (McKay, 1997, Science 276: 66-71). En la presente invención se ha descubierto que las MSC migraron de una forma similar. Las células de donante se encontraron en múltiples áreas del cerebro, incluyendo corteza contralateral (Figura 6). Las células persistieron en los sitios a los que habían migrado. La concentración más grande de células se encontró alrededor del eje rostrocaudal en el cuerpo estriado y lo largo del cuerpo calloso. Había menos células en la corteza cerebral. Se observaron grupos de células marcadas de forma sistemática en las regiones del lóbulo temporal en todos los momentos examinados. El día 72, se encontraron menos células en la regiones corticales periféricas, una observación coherente con la aparente disminución del número de células entre el día 30 y el 72 (Tabla 3).

\vskip1.000000\baselineskip

Inmunohistología de Células Implantadas

La inmunotinción de secciones demostró que las MSC humanas injertadas también se detectaron a lo largo del cerebro (Figura 6) cuando se usaron anticuerpos para HLA-ABC (Figura 5, Panel b). Aunque las MSC humanas se tiñeron con anticuerpos para colágeno I antes del implante (Figura 7, Panel a), no se observó ninguna tinción con los mismos anticuerpos después del implante. Por tanto, las MSC dejaron de sintetizar colágeno de tipo I después de la integración en el tejido cerebral. La tinción de las células con anticuerpos específicos para fibronectina se observó antes del implante (Figura 7, Panel b) y también se observó 5 días después del implante (Figura 7, Panel c).

Los resultados de los experimentos de neurotrasplante establecen que las MSC humanas infundidas en el cerebro de rata pueden injertarse, migrar y sobrevivir de un modo similar al injerto, la migración y la supervivencia de astrocitos de rata. Las MSC de rata se comportaron de un modo similar a los astrocitos de rata. Por tanto, las células de rata y humanas se comportaron de un modo similar. Los datos presentados en la presente memoria han establecido que al menos un subconjunto de células que se aíslan a partir de la médula ósea por sus características de adherencia a placas de cultivo de plástico pueden participar también en la misma vía que los astrocitos. Los resultados establecen que, por lo tanto, las MSC son vehículos útiles tanto para terapia celular como génica para el tratamiento de una diversidad de enfermedades en seres humanos. Además, ya que las MSC trasplantadas dejaron de sintetizar colágeno de tipo I, estas células son mucho más adecuadas para el neurotrasplante que lo son los fibroblastos, que se conoce que continúan produciendo grandes cantidades de colágeno después del trasplante y que, por lo tanto, inducen fibrosis en el sitio del trasplante.

Las MSC tienes varias ventajas como células para el neurotrasplante. En particular, se pueden obtener fácilmente a partir de médula ósea y se pueden expandir en cultivo. Además, las propias MSC de un paciente pueden emplearse para la terapia evitando, por lo tanto, cualquier problema acompañante de la inmunidad del hospedador y enfermedad de injerto contra hospedador. Además, las células se pueden modificar por ingeniería genética para el tratamiento de enfermedades en seres humanos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Cocultivo de MSC con Astrocitos: Diferenciación de MSC en Astrocitos

Las MSC humanas a una concentración de 2 X 10^{5} células se cocultivaron con astrocitos de rata a una concentración de 1 X 10^{5} células en 10 ml de medio que consistía en MEM más FBS al 30% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Las células humanas se marcaron fluorescentemente con HLA-ABC humano-\alpha antes del cocultivo. Después de 5 días de cocultivo, aproximadamente el 2% de las células humanas también se tiñeron positivamente para proteína ácida fibrilar glial. Ya que la proteína ácida fibrilar glial es un marcador para astrocitos tempranos, estos resultados demuestran que una fracción de las MSC humanas se ha diferenciado en astrocitos durante el cocultivo con astrocitos de rata.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Condiciones para el Crecimiento de Cultivos Primarios y Secundarios de MSC

1

TABLA 2 Inmunotinción de MSC Humanas y Astrocitos de Rata

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Recuperación de MSC Humanas Marcadas Fluorescentemente de Cerebro de Rata

4

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Implante de MSC humanas en cerebro de rata; diferenciación de MSC en células macrogliales

Las células neuronales y gliales en el sistema nervioso central se obtienen de precursores periventriculares multipotenciales. Las células estromales de médula son un subconjunto de células multipotenciales de médula ósea que se pueden diferenciar en osteoblastos, condrocitos y miotubos y pueden ser la fuente de algunas de las células gliales o sus precursores.

Los datos presentados en este Ejemplo demuestran que una fracción de células estromales de médula ósea implantadas en cerebros de ratas pueden expresar el marcador de astrocitos proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Como se describe en la presente memoria, las células estromales de médula humanas (hMSC) se ha observado que se integran y migran en el cerebro de rata de un modo similar a las células madre neurales.

Ha sido axiomático que en la etapas tempranas del desarrollo, las células neuronales y gliales en el sistema nervioso central se obtienen a partir de células precursoras multipotenciales en la zona germinal periventricular (McKay, 1997, Science 276: 66-71; Lundberg et al., 1997, Exp. Neurol. 145:342-360). La glía y la neuronas (Gould et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 3168-3171; Kempermann et al., 1998, Nat Med 4:555-557) continúan proliferando y renovándose. La médula ósea puede ser una fuente de generación de glía (Eglitis et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94: 4080-4085).

Los efectos del implante directo en cerebro de rata de células estromales de médula humanas (hMSC) se describen en otro punto en la presente memoria. Las hMSC son un subconjunto de células multipotenciales en médula ósea que se pueden aislar por su adherencia a plástico y pueden diferenciarse en osteoblastos, adipocitos condrocitos y miotubos. (Owen, 1988, J. Cell Science (Sup.)10: 63-76; Caplan, 1991, J. Orthopaedic Res. 9: 641-650).

El objetivo de los experimentos que se presentan en este Ejemplo fue evaluar si las hMSC se podrían usar como células de donante para injertarse en el cerebro y, por tanto, si estas células se podrían usar como vehículos para la transferencia génica en el SNC. Un objetivo adicional fue determinar si una población de estas células, dadas las señales del entorno y de diferenciación apropiadas, se podría desarrollar en células del cerebro. Estos experimentos tienen implicaciones para fomentar los objetivos de regeneración y reparación en el sistema nervioso.

El neurotrasplante se ha usado previamente para conseguir este objetivo y para estudiar la ontogenia y el linaje de células cerebrales (McKay, 1997, Science 276: 66-71; Bjorklund, 1993, Research Publications - Association for Research in Nervous & Mental Disease 71: 361-374; Olson, 1997, Nat Med 3: 1329-1335; Bjorklund, 1993, Nature 362: 414-415). Se han usado células tanto neurales como no neurales para el injerto. Por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson se han usando células mesencefálicas de fetos humanos como una fuente de tejido dopaminérgico para el tratamiento de seres humanos (Bjorklund, 1993, Research Publications- Association for Research in Nervous & Mental Disease 71: 361-374; Spencer et al., 1992, N. Engl. J. Med. 327: 1541-1548; Freed et al., 1992, N. Engl. J. Med. 327: 1549-1555; Kordower et al., 1997, J. Comp. Neurol. 387: 96-113). Varios de los pacientes mostraron mejoras significativas tanto en síntomas clínicos como en mediciones objetivas tales como una síntesis aumentada de dopamina cuando se ensayaron por captación de fluorodopa por tomografía de emisión de positrones (Spencer et al., 1992, N. Engl. J. Med. 327: 1541-1548; Freed et al., 1992, N. Engl. J. Med. 327:1549-1555; Kordower et al., 1997, J. Comp. Neurol., 387: 96-113; Defer et al., 1996, Brain 119: 41-50). Sin embargo, obtener el tejido fetal ha presentado problemas logísticos y éticos importantes (Rosenstein, 1995, Exp. Neurol. 133: 1-6; Turner et al., 1993, Neurosurg. 33: 1031 -1037) y, por lo tanto, se han realizado una serie de esfuerzos para desarrollar células alternativas para la terapia de la enfermedad de Parkinson y otras enfermedades neurológicas.

Sin embargo, la mayoría de las células ensayadas tienen dificultades asociadas a las mismas. Por ejemplo, han sido tan difíciles de obtener como las células fetales humanas o no se han integrado y migrado después de la infusión en el cerebro (Kang et al., 1993, J. Neurosc. 13: 5203-5211; Andersson et al., 1993, Int. J. Dev. Neurosc. 11: 555-568; Sanberg et al., 1997, Nat. Med. 3: 1129-1132; Isacson et al., 1997, Nat. Med. 3: 964-969). Además, muchas de las células implantadas no sobreviven en el hospedador. Por ejemplo, solamente aproximadamente el 0,1 % de las células de donante sobrevivieron 7 meses después de que las células neurales mesencefálicas de fetos de cerdo se neurotrasplantaran en un paciente con parkinsonismo (Isacson et al., 1997, Nat. Med. 3: 964-969). Los experimentos descritos en otro punto en la presente memoria han mostrado que después de la infusión en cerebros de rata, se observó que las hMSC migran desde el sitio de inyección durante varios milímetros. Los experimentos presentados en el presente Ejemplo se amplían tras esa observación y demuestran que una fracción de hMSC puede recuperarse como células que expresan un marcador para astrocitos (GFAP) después de la infusión en los cerebros de rata.

Aislamiento de MSC de rata y humanas

Se aislaron MSC de rata como se ha descrito previamente en la presente memoria disecando tibias y fémures de ratas hembra Lewis/SsNHsd de 8 a 12 semanas de edad (Harlan-Sprague-Dawly). Se cortaron los extremos de los huesos y se extruyó la médula con 5 ml de DMEM (GIBCOBRL, Grand Island, NY) usando una aguja y una jeringa. Se sembraron células de médula completa (entre 100-200 X 10^{6}) sobre un matraz de cultivo tisular de 175cm^{2} en DMEM/FBS al 10%. Se retiraron las células no adherentes después de 24 horas sustituyendo el medio. Se sustituyó el medio cada 2 ó 3 días a medida que las células se cultivaban hasta la confluencia. Las células se retiraron por incubación con tripsina al 0,25% y EDTA 1 mM, se pasaron tres o cuatro veces y se almacenaron congeladas.

Se cultivaron MSC humanas a partir de aspirados tomados de la cresta ilíaca de voluntarios machos y hembras normales de 19 a 46 años de edad, como se ha descrito previamente en la presente memoria. Se aislaron células nucleadas por centrifugación por un gradiente de densidad (Ficoll-Plaque Plus; 1,077 g/ml; Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ), se suspendieron a una concentración de 1 x 10^{7}/ml en \alpha-MEM/FBS al 10%, y se sembraron a 3 x 10^{6}/cm^{2} en placas de cultivo de 25 cm^{2}. Se retiraron las células no adherentes después de 3 días. Las células se retiraron por incubación con tripsina al 0,25% y EDTA 1 mM a 37ºC durante 3 a 4 minutos después de que los cultivos hubieran alcanzado la confluencia. La suspensión de células se diluyó 1:2 ó 1:3 y se volvió a sembrar. Este procedimiento se repitió durante 3 a 5 pases. Comenzando con el segundo pase, se añadieron 5 ng/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas \alpha\alpha (PDGF-AA; GIBCOBRL, Grand Island, NY) al medio.

Tinción de anticuerpos y marcado fluorescente

Las células se subcultivaron en portaobjetos con cámaras para la tinción con anticuerpos posterior. El marcado fluorescente de núcleos se realizó incubando las hMSC con 1-10 de bis-benzamida (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 24 horas antes del implante. Los cultivos se lavaron tres veces con solución salina tamponada estéril y se retiraron por incubación con tripsina al 0,25% durante 1-3 minutos, 1-2 horas antes de la infusión en cerebros de rata. Se neutralizó la tripsina añadiendo medio que contenía suero al 20% y las células se aislaron por centrifugación. Las células se suspendieron como una suspensión de aproximadamente 10.000 células por \mul en \alpha-MEM sin suero.

Infusión de hMSC en cerebro de rata

Se anestesiaron ratas albinas adultas Sprague-Dawly (200 a 300 g) usando halotano al 3% en oxígeno y se mantuvieron por inyección intramuscular de una mezcla de 6 mg/kg de xilozina y 60 mg/kg de ketamina. Después se colocaron las ratas en un aparato de estereotáxico y se realizó un orificio de taladro 3 mm lateral al bregma. Las hMSC se administraron inyectando aproximadamente 10 \mul de la suspensión celular lentamente durante un periodo de 30 minutos en el cuerpo estriado a una profundidad de 4 a 5 mm desde la superficie del cerebro. La herida se cerró con suturas quirúrgicas interrumpidas y los animales se trataron con 0,2 mg/kg de buprenorfina y se dejó que se recuperaran. Las ratas se sacrificaron por perfusión intracardiaca usando solución salina tamponada con fosfato helada, seguida por paraformaldehído tamponado al 3% y después sacarosa al 10% bajo anestesia profunda con xilazina y ketamina. Los cerebros se retiraron, los prosencéfalos se cortaron y las muestras se congelaron inmediatamente.

Evaluación de supervivencia de células humanas (hMSC) en el cerebro de rata

Se prepararon secciones tisulares de cerebro con un grosor de diez micrómetros usando un criostato. El sitio de trasplante se localizó identificando microscópicamente las células marcadas fluorescentemente en las secciones tisulares. Las secciones congeladas se unieron a portaobjetos recubiertos con gelatina y se sumergieron rápidamente en acetona fría durante 5 minutos y después se almacenaron a -20ºC para el procesamiento y recuento posterior. El número de núcleos marcados fluorescentemente se contó en de 8 a 10 secciones tisulares cortadas desde los límites rostral a caudal del cuerpo estriado. Este procedimiento se repitió en cada cerebro por dos investigadores que usaron secciones alternas. Solamente se contaron los núcleos claramente marcados. Las células muestras y lisadas se caracterizaron por un matiz azulado en el tejido circundante y ninguna tinción nuclear clara. Los números observados se extrapolaron al número total de secciones para estimar el número de células injertadas supervivientes.

Preparación de cultivos celulares

Se prepararon cultivos celulares de cerebro de rata disociando mecánicamente el prosencéfalo en trozos pequeños e incubando el tejido resultante a 37ºC durante 15 minutos en una mezcla de 2,4 unidades/ml de dispasa y 45 unidades/ml de colagenasa (GIBCO/BRL, Grand Island, NY). El tejido se disoció a intervalos de 5 minutos haciéndolo fluir a través de una pipeta de orificio grande. El tejido disociado se centrifugó y se desechó el sobrenadante. El residuo de cada cerebro se suspendió en \alpha-MEM y se sembró en dos matraces de cultivo de 175 cm^{2} en \alpha-MEM/FBS al 10%. Se retiraron las células no adherentes y los restos cambiando el medio después de 48 horas, y después cada 4 días durante aproximadamente 2 semanas hasta que los cultivos fueron confluentes. Para retirar las células poco adheridas, los cultivos confluentes se trataron con 2,4 unidades/ml de dispasa durante 15 min a 37ºC, y se agitaron en un agitador giratorio inclinado a 6-7 rpm durante 2 horas. Las células desprendidas se desecharon y se añadió medio fresco a las células adherentes y los cultivos se volvieron a incubar. Después, las células se retiraron usando tripsina (al 0,5%) y se subcultivaron en portaobjetos con cámaras para el recuento y la tinción inmunocitoquímica. El número total de células y la fracción de células que tenían núcleos marcados fluorescentemente se contaron usando un hemocitómetro.

Tinción inmunohistoquímica

Las células en portaobjetos con cámaras se fijaron con acetona durante 5 minutos. Se realizó la inmunocitoquímica a temperatura ambiente. Las células se trataron con anticuerpos bloqueantes apropiados de suero de cabra al 1% y suero fetal bovino al 1% durante 30 minutos. Se aplicaron los anticuerpos primarios durante 1 a 2 horas en portaobjetos con cámaras. Los anticuerpos secundarios usados eran IgG específicas de especie acopladas a FITC o rodamina. Las células marcadas fluorescentemente resultantes se visualizan y se fotografiaron usando un microscopio
fluorescente.

Resultados

Tanto las MSC de rata como humanas se aislaron rápidamente de aspirados de médula ósea completa por su fuerte adherencia a plástico de cultivo tisular, como se ha descrito previamente en la presente memoria (véase también Caplan, 1991, J. Orthopaedic Res. 9: 641 -650). La Figura 8 ilustra MSC de rata cultivados sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina. Las células se tiñeron fuertemente para vimentina, moderadamente para nestina (40-60% de las células) y ligeramente para GFAP (1% de las células), proteína S100 neural y receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (p75 NGFr). Las MSC humanas que se trataron en las mismas condiciones fueron positivas para vimentina. Sin embargo, el examen de más de quince muestras de MSC humanas (aprox. 1 x 10^{5} células/muestra) no mostró ninguna célula que se tiñera con anticuerpos para GFAP.

El número de hMSC marcadas fluorescentemente en cerebros de rata en días seleccionados después del implante se muestran en la Tabla 4. Las hMSC cultivadas se marcaron fluorescentemente con bis-benzamida, y aproximadamente 100.000 células en 10 \mul de tampón se infundieron lentamente en el cuerpo estriado de ratas albinas Sprague-Dawly adultas. Después de los periodos de tiempo seleccionados, que variaban de 5 a 120 días, las ratas se sacrificaron y los cerebros se extrajeron. De forma coherente con los resultados descritos en otro punto en la presente memoria, el examen de secciones de cerebro no mostró ninguna prueba de gliosis o infiltración de leucocitos alrededor del sitio de la infusión celular. La Tabla 4 contiene los resultados después del recuento de células marcadas fluorescentemente en secciones del cerebro. Los datos indican que aproximadamente el 30% de las células humanas estaban presentes después de 5 a 30 días y aproximadamente el 15% estaban presentes después de 120 días. Como se describe en la presente memoria, las células marcadas se observaron a lo largo del trayecto de la aguja, pero las células también migraron hacia múltiples áreas del cerebro, incluyendo la corteza contralateral y las regiones del lóbulo temporal.

En otra serie de experimentos se extrajeron cerebros de rata de 7 a 90 días después de la infusión de aproximadamente 100.000 hMSC (Tabla 5), y los prosencéfalos que contenían los sitios de inyección se cultivaron en MEM y FBS al 20%. Después del establecimiento de cultivos primarios confluentes (Figura 9a), las células se retiraron con tripsina y se recontaron usando una hemocitómetro y un microscopio de fase (Figura 9b). Los núcleos marcados fluorescentemente se contaron usando un hemocitómetro y un microscopio fluorescente (Figura 9c), y se determinó la proporción de células marcadas fluorescentemente con respecto a células no marcadas. Los subcultivos se sembraron en portaobjetos con cámara (FBS al 20% en DMEM) y las células se fijaron en acetona fría o paraformaldehído al 3% para inmunocitoquímica de fluorescencia indirecta. Se examinaron sesenta muestras de 12 cerebros. Las células humanas en los cultivos se identificaron tanto por tinción con HLA-ABC como por marcado fluorescente de los núcleos.

Los resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla 5. Estos resultados indican que del 3 al 7% de las células en los cultivos eran células humanas. Aproximadamente el 1% de las células humanas en los cultivos (aproximadamente el 0,1% de las células totales) se tiñeron con el anticuerpo para GFAP. Esta proporción permaneció relativamente constante con el tiempo. Las células positivas a GFAP presentaban la morfología de astrocitos planos epiteloides (Figura 10). Las MSC humanas tratadas en estas condiciones de cultivo no se tiñeron con anticuerpo para ED-1, un marcador de la superficie de la microglía y, por lo tanto, no eran microglía (Wu et al., 1997, Neurosc. Res. 28: 67-75).

Los datos presentados en este Ejemplo confirman y se amplían con los datos descritos en la presente memoria que demuestran que las hMSC se pueden implantar de forma estable en el cerebro de rata. Los datos en este Ejemplo establecen que las hMSC sobreviven en el entorno cerebral y se pueden detectar en grandes números hasta al menos 150 días después del implante. Estudios previos han sugerido que los resultados del trasplante de tejidos en el cerebro de rata son buenos indicadores del comportamiento y de la supervivencia de estos tejidos en el cerebro humano (Zawada et al., 1998, Nat. Med. 4: 569-574). El hecho de que un gran número de estas células se implantaran de forma estable sin signos histológicos de reacción inmune en el cerebro o de deterioro conductual del animal receptor después del implante presenta la posibilidad de que las hMSC se pueden usar de forma segura para el trasplante en el cerebro humano.

Los resultados también sugieren que las condiciones de cultivo que se describen en la presente memoria seleccionaron las células infundidas o provocaron que proliferaran de forma desproporcionada. Esto puede concluirse porque el número de células humanas recuperadas en los cultivos enriquecidos con astrocitos (Tabla 5) era mucho mayor de lo que se pudo predecir a partir del número relativamente pequeño de hMSC infundidas en los cerebros de rata (el cerebro de rata contiene más de 2 x 10^{7} células y solamente se infundieron 10^{5} hMSC). Los resultados de los experimentos en este Ejemplo, por lo tanto, proporcionan pruebas de que los astrocitos pueden surgir a partir de una pequeña fracción de hMSC que se implantan directamente en los cerebros de ratas. Por tanto, el microentorno del cerebro selecciona linajes de astrocitos en MSC o induce la diferenciación de MSC en astrocitos.

Los datos presentados en este Ejemplo demuestran que una atracción de células estromales de médula humanas implantadas en cerebros de rata pueden expresar GFAP. Como se describe en la presente memoria, las hMSC se integran y migran en el cerebro de rata de un modo similar a las células madre neurales. Estos datos, por lo tanto, también establecen que células estromales obtenidas de médula ósea tienen la capacidad de diferenciarse en células macrogliales en el cerebro.

Estas características apoyan otros datos proporcionándose en la presente memoria de que las MSC son útiles para la terapia celular directa o como vectores para la terapia génica ex vivo de varias enfermedades del sistema nervioso central.

Los informes previos indicaban que los macrófagos de sangre periférica pueden dar lugar a microglía del sistema nervioso central, particularmente de forma temprana en el desarrollo o después de lesiones (Ling et al., 1993, GLIA 7: 9-18; Bauer et al., 1996, Histoch. J. 28: 83-97; Rinner et al., 1995, GLIA 14: 257-266). Es probable que los métodos de cultivo usados por estos investigadores excluyeran estas células y seleccionaran astrocitos. Aunque puede producirse una renovación clara, aunque lenta, en la población glial del cerebro de mamífero adulto (Rakic, 1985, Science 227: 1054-1056), se ha asumido generalmente que los astrocitos son endógenos al cerebro del adulto.

Ejemplo 10 Uso de Células Estromales de Médula para Tratar Gliomas

Los tumores cerebrales malignos son enfermedades devastadoras que afectan aproximadamente a 15.000 individuos cada año en los Estados Unidos y que matan al 90% de los pacientes en menos de dos años (Levine et al., 1989, en Cancer: principles and practice of oncology. Davita et al. (eds.) (Lippincoff, Filadelfia) págs. 1557-1611; Azizi, et al., 1998, J. Neurovirol. 4: 204-216; Chung et al., 1998, Surg. Oncol. Clin. N. Am., 7: 589-602; Liang et al., 1998, Curr. Opin. Oncol. 10: 201 -206). Por lo tanto, actualmente se están desarrollando varios intentos de desarrollar terapias mejoradas. Como se describe en la presente memoria se ha demostrado que los cerebros de rata se pueden injertar con un conjunto de células de médula ósea humana que se denominan células madre mesenquimales o células estromales de médula (hMSC). Después de la infusión en cerebros de rata, las hMSC se integran y migran a lo largo de vías conocidas para la migración de células madre neurales. Las MSC humanas no producen ninguna reacción inmune o inflamatoria y aproximadamente el 15% de las células se recuperaron en el cerebro después de tres meses. Además, el análisis de cultivos enriquecidos con astrocitos preparados a partir de los cerebros de las ratas receptoras indicó que una pequeña fracción de las hMSC injertadas se había diferenciado en astrocitos tempranos que expresaban proteína ácida fibrilar glial. Ya que las hMSC son relativamente sencillas de aislar de médula y de modificar genéticamente para expresar genes exógenos, como se describe en la presente memoria (véase también Owen et al., 1988, en Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symposium 136, Chichester, UK, págs. 42-60; Caplan, 1991, J. Orthop. Res., 9: 641-650), parece que son vehículos atractivos con los que suministrar productos génicos terapéuticos al cerebro.

Este Ejemplo contiene una descripción de experimentos realizados en cultivo celular y en ratas para ensayar la posibilidad de que se puedan usar hMSC para expresar proteínas tóxicas para tumores y después inyectarse en gliomas de forma que proporcionen una terapia potencial para estas enfermedades. Esencialmente se han usado en la presente memoria las mismas estrategias experimentales que otros investigadores han usado de forma exitosa para modificar células por ingeniería genética para que secreten proteínas tóxicas para tumores. Tales protocolos se conocen bien por el especialista. La principal novedad de estos experimentos es que emplean hMSC como células productoras que podrían injertarse en el cerebro y, por lo tanto, servir como una fuente a largo plazo de proteínas tóxicas para tumores que se suministran localmente en un glioma.

En este Ejemplo, las hMSC se modifican por ingeniería genética para expresar y secretar una de tres proteínas tóxicas para tumores (Figura 11): (a) El ligando Fas (FasL) que se ha demostrado recientemente que destruye selectivamente algunas células de glioblastoma (Weller et al., 1994, J. Clin. Invest, 94: 954-964; Weller et al., 1995, Cancer Res., 55: 236-2944; Frei et al., 1998, J. Neuro Immunol., 87: 105-113; Weller et al., 1998, Brain Pathol. 8: 285-293; Nagata, 1998, Intern. Med, 37: 179-181; Suda et al., 1993, Cell, 75: 1169-1178; Li et al., 1998, Transpl. Proc, 30: 943; Tanaka et al., 1997, J. Immunol., 158: 2303-2309); (b) Un anticuerpo de cadena única biespecífico tanto para el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como para CD3. El diseño está basado en el principio de que el anticuerpo anti-EGFR dirigirá a la proteína secretada a células de glioma y el anticuerpo anti-CD3, en el otro extremo de la misma molécula, atraerá linfocitos T activados para destruir las células de glioma. Actualmente se están ensayando anticuerpos de cadena única biespecíficos similares para un gran número de cánceres (Kufer et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45: 193-197; De Jonge et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45: 162-165; Bookman, 1998, Semin. Oncol. 25: 381-396; Helfrich et al. 1998, Int. J. Cancer, 76: 232-239; Jost et al., 1996, Molec. Immunol. 33: 211-219; Wickham et al., 1997, J. Virol. 71: 7663-7669); y (c) un anticuerpo de cadena única de ratón contra los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que son abundantes en las células de glioma maligno obtenidas a partir de aproximadamente 60% de los pacientes y que se pueden usar potencialmente junto con anticuerpos marcados con ^{125}l contra el anticuerpo de cadena única de ratón para destruir células de glioma (Snelling et al., 1995, Hybridoma 14: 111-114; Faillot et al., 1996, Neurosurg. 39: 478-483; Stragliotto et al., 1996, Eur. J. Cancer, 32A: 636-640). El protocolo de estos experimentos está basado en un protocolo similar actualmente usado en ensayos clínicos que usan anticuerpos monoclonales marcados con ^{125}l contra un EGFR (Snelling et al., 1995, Hybridoma 14: 111-114; Faillot t al., 1996, Neurosurg. 39: 478-483; Stragliotto et al., 1996, Eur. J. Cancer, 32A: 636-640).

Terapia Convencional para Gliomas Malignos

La terapia actual para gliomas malignos consiste principalmente en la resección quirúrgica seguida por terapia con radiación (Levine et al., 1989, en Cancer: principles and practice of oncology. Davita et al. (eds.) (Lippincott, Filadelfia) págs. 1557-1611; Azizi et al., 1998, J. Neurovirol. 4: 204-216; Chung et al., 1998, Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7: 589-602; Liang et al., 1998, Curr. Opin. Oncol., 10: 201 -206). Actualmente, estas terapias se combinan con quimioterapia para gliomas de alto grado. Los protocolos de tratamiento pueden prolongar la supervivencia de pacientes unos pocos meses, pero la tasa de recurrencia de los gliomas malignos es mayor del 90% y la calidad post-quirúrgica de vida es peor. Los resultados han mejorado ligeramente con mejoras técnicas recientes en radioterapia tales como hiperfraccionamiento, alterando la calidad de la radiación, tratamiento estereotáxico para preservar tejidos normales y adición de sustancias radiosensibilizantes. Se han ensayado un gran número de agentes quimioterapéuticos pero los resultados no han sido impresionantes (Levine et al., 1989, en Cancer: principles and practice of oncology. Davita et al. (eds.) (Lippincott, Filadelfia) págs. 1557-1611; Azizi, et al. 1998, J. Neurovirol. 4: 204-216; Chung et al., 1998, Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7: 589-602; Liang et al., 1998, Curr. Opin. Oncol. 10: 201-206).

Fas y FasL para Terapia de Gliomas

Fas (CD95/APO-1) y FasL (CD95L) han atraído recientemente una atención considerable como dianas moleculares y reactivos para la terapia de tumores malignos (Trauth et al., 1989, Science 245: 301-305; Nagata et al., 1995, Science 267: 1449-1456). Fas es un miembro de una familia creciente de receptores de citocinas que incluyen receptores para TNF-\alpha y NGF. FasL es una citocina citotóxica homóloga a TNF e induce la muerte celular apoptótica en células diana susceptibles (Nagata et al., 1995, Science 267: 1449-1456). El sistema FasL/Fas ha estado implicado en la citotoxicidad mediada por células T, la regulación de la homeostasis de células T y la selección de timocitos durante el desarrollo. El FasL unido a membrana puede ejercer su toxicidad por contactos célula-célula, pero también se observa una citotoxicidad significativa en el sobrenadante de células COS transfectadas con ADNc de FasL y que secretan FasL soluble (Rensing-Ehl et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25: 2253-2258). Los anticuerpos contra Fas inducen apoptosis en células que llevan el receptor de FasL. Una inyección única de los anticuerpos en ratones nu/nu produjo regresión rápida del tumor de células B humanas (Trauth et al., 1989, Science 245: 301 -305). Sin embargo, la administración de anticuerpos contra Fas en ratones de tipo silvestre fue letal debido apoptosis de las células en el hígado (Ogasawara et al., 1993, Nature 364: 806-809).

Varios informes recientes han sugerido la explotación del sistema Fas/FasL para la terapia de gliomas malignos (Weller et al., 1994, J. Clin. Invest. 94: 954-964; Weller et al., Cancer Res. 55: 2936-2944; Frei 1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-113; Weller et al., 1998, Brain Pathol. 8: 285-293). Las observaciones críticas fueron que Fas no se expresa en el tejido cerebral normal (Weller et al., 1998, Brain Pathol., 8: 285-293; Gratas et al., 1997, Brain Pathol. 7: 863-869). La única excepción son las células endoteliales, pero las mismas resisten la apoptosis inducida por anticuerpos de Fas in vitro (Weller et al., 1994, J. Clin. Invest. 94: 954-964). Por el contrario, tanto Fas como FasL se expresan en gliomas malignos (Weller, M., et al., 1998, Brain Pathol., 8: 285-293). Por razones que no son evidentes, la presencia tanto de Fas como FasL en las mismas células de glioma no produce apoptosis. Sin embargo, se detecta ARNm de Fas en todos los glioblastomas primarios y aproximadamente un quinto de los glioblastomas secundarios. Los análisis sistemáticos de astrocitomas de grado I a IV indicaron que los niveles de ARNm de Fas se correlacionan con la progresión maligna de los tumores (Weller et al., 1998, Brain Pathol. 8: 285-293). Los ensayos para la proteína Fas indicaron que la expresión se observa principalmente en células de glioma que rodean grandes áreas de necrosis.

Basándose en estas observaciones, se han ensayado anticuerpos de Fas y FasL soluble con gliomas en cultivo (Weller et al., 1994, J. Clin. Invest. 94: 954-964; Weller et al., 1995, Cancer Res. 55: 2936-2944; Frei et al., 1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-113; Weller et al., 1998, Brain Pathol. 8: 285-293). Ambos produjeron apoptosis, pero FasL fue más eficaz que los anticuerpos de Fas. FasL indujo apoptosis en todas las 19 líneas celulares tumorales analizadas (Frei et al., 1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-113). Además, el efecto a largo plazo de FasL en la formación de colonias tumorales era más sorprendente porque había más del 90% de inhibición del crecimiento tumoral de colonias con todos los 8 gliomas de alto grado analizados (Frei et al., 1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-113). Basándose en sus resultados, los autores sugirieron que la aplicación intratecal o intratumoral de FasL era un enfoque prometedor para el tratamiento de células tumorales malignas que expresan Fas (Frei et al., 1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-113).

scFv-anti-EGFR y scFv-anti-CD3 biespecíficos para Terapia de Gliomas

Ahora se están explorando anticuerpos de cadena única biespecíficos (scFv) para la terapia de varios tumores malignos tales como cáncer ovárico (Bookman, 1998, Semin. Oncol. 25: 381-396) o cáncer colorrectal (Kufer et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45: 193-197). Por ejemplo, un scFv biespecífico tanto para CD3 como para el receptor de transferrina redirigieron los linfocitos T citotóxicos de ratón activados para lisar específicamente células humanas que contenían el receptor de transferrina (Jost et al., 1996, Molec. Immunol. 33: 211 -219). El reactivo bifuncional fue eficaz a concentraciones de unos pocos ng/ml (Jost et al., 1996, Molec. Immunol. 33: 211 -219). De forma similar, se ha preparado un scFv biespecífico tanto para CD3 como para el antígeno celular epitelial para tratar cánceres colorrectales (Kufer et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45: 193-197). Además, se ha preparado un anticuerpo biespecífico tanto para CD3 como para el idiotipo de IgM unida a membrana de células tumorales. Se demostró que el anticuerpo eliminó tumores en ratones BCL1 con linfoma de células B (De Jonge et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45: 162-165). Además, se ha preparado un scFv biespecífico que se une tanto a CD3 como a un antígeno que se encuentra en células de carcinoma pancreático (EGP2; antígenos CO17-1A de glicoproteína epitelial-2, KSA). La proteína resultante fue eficaz al mediar en la lisis tumoral in vitro (Helfrich et al., 1998, Int. J. Cancer 76: 232-239).

Estos informes proporcionan la base para la estrategia de usar scFv específicos tanto para CD3 como para EGFR. El anticuerpo biespecífico para EGFR se dirige a células de glioma, ya que los EGFR no se observan en tejidos cerebrales normales pero se observan en aproximadamente la mitad de gliomas alto grado (Snelling et al., 1995, Hybridoma 14: 111 -114; Faillot et al., 1996, Neurosurg. 39: 478-483; Stragliotto et al., 1996, Eur. J. Cancer 32A: 636-640). El otro extremo del scFv biespecífico se unirá a linfocitos T CD8+ activados para destruir las células de glioma (véase, por ejemplo, la Estrategia II en la Figura 11). Al desarrollar esta estrategia, se debe señalar que publicaciones previas han demostrado que las células T entran en el sistema nervioso central después de un traumatismo (Hirschberg et al., 1998, J. Neuroimmunol. 89: 88-96) y se han observado en pacientes que tienen esclerosis múltiple y meningitis, así como en controles normales (Vrethem et al., 1998, Acta Neurol. Scand. 97: 215-220). Por lo tanto, el anticuerpo biespecífico usado debe reclutar células T citotóxicas para gliomas. Además, la administración de interleucina-2 junto con células T activadas parece ser beneficiosa para algunos pacientes (Haynes et al., 1995, Cancer 75: 840-852). Por lo tanto, es improbable que la estrategia produzca efectos adversos.

Anticuerpos para EGFR para Terapia de Gliomas

Se han estudiado extensamente los anticuerpos para EGFR para la terapia de gliomas y se han usado tanto en ensayos clínicos de Fase I (Faillot et al., 1996, Neurosurg. 39: 478-483; Stragliotto, G., et al., 1996, Eur. J. Cancer, 32A: 636-640) como de Fase II (Snelling et al., 1995, Hybridoma 14: 111-114). El fundamento de la terapia se basa en las observaciones de que muchas células de gliomas son ricas en EGFR y de que los anticuerpos para EGFR se concentran en gliomas después de la administración intravenosa. Basándose en estas observaciones, se prepararon anticuerpos monoclonales marcados con ^{125}I para EGFR y se demostró que se internalizaron por células de gliomas humanos. Además, se ha realizado un ensayo clínico de Fase II preliminar (Snelling et al., 1995, Hybridoma 14: 111-114) en el que se administró anticuerpo monoclonal para EGFR marcado con ^{125}l por vía sistémica a 60 pacientes con glioblastoma multiforme.

Los resultados indicaron que la terapia era relativamente segura y muchos tuvieron algún beneficio en el manejo de glioblastoma multiforme primario. Sin embargo, en estos estudios, fue evidente que solamente aproximadamente el 1% del anticuerpo administrado por vía sistémica entró en el cerebro (Snelling et al., 1995, Hybridoma 14: 111-114).

Desde que se inició este ensayo clínico se ha identificado una variante específica de tumor de EGFR (Hills et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 537-543; Wikstrand et al., 1995, Cancer Res. 55: 3140-3148; Wikstrand et al., 1997, Cancer Res. 57: 4130-4140; Okamoto et al., 1996, Br. J. Cancer 73: 1366-1372; Wikstrand et al., 1998, J. Neurovirol. 4: 148-158; Schmidt et al., 1998, Int. J. Cancer 75: 878-884; Reist et al., 1997, Nucl. Med. Biol. 24: 639-647). El EGFR específico de tumor (denominado EGFRvIII) tiene una deleción interna y está presente en aproximadamente el 50% de los gliomas. Cuatro grupos de investigadores han preparado anticuerpos monoclonales para EGFRvIII (Hills et al., 1995, J. Cancer 63: 537-543; Okamoto et al., 1996, Br. J. Cancer 73: 1366-1372; Wikstrand et al., 1998, J. Neurovirol. 4: 148-158; Schmidt et al., 1998, Int. J. Cancer 75: 878-884). Hay un interés considerable por iniciar ensayos clínicos con tales anticuerpos que se dirigen más específicamente al EGFR que se encuentra en muchas células de glioma. Estos experimentos podrían proporcionar terapias más eficaces y seguras para gliomas malignos.

Los siguientes experimentos proporcionaron el fundamento para los estudios descritos en este Ejemplo:

Demostración de la transfección exitosa de células de ensayo dando como resultado la secreción de ligando Fas soluble

La transfección exitosa de células COS se realizó para generar células que tenían un gen que codifica y expresa una forma soluble de FasL donde el FasL soluble se secreta por las células. La Figura 12 es una imagen de un ensayo de transferencia de Western que muestra la síntesis y la secreción de FasL soluble por células COS transfectadas con un ADNc que codifica FasL soluble (truncado). El ADNc estaba contenido en el plásmido pSecTag^{2}/Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA; véase el Ejemplo 10 en Diseño y síntesis de construcciones génicas, en la presente memoria). Las células se transfectaron de forma transitoria con lipofectamina y se ensayaron por transferencia de Western como se describe por Rensing-Ehl et al. (véase la Figura 2 en Rensing-Ehl et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25: 2253-2258). El carril 1 ilustra un lisado celular (14 \mug de proteína) obtenido a partir de células transfectadas (aproximadamente 5 x 10^{5} en 2 ml de medio) incubadas durante 2 días. Carril 2: Igual que en el carril 1 después de 4 días de incubación. Carril 3: lisado celular obtenido a partir de células transfectadas de forma simulada incubadas durante 4 días. Carril 4: Medio (18 \mul) no concentrado de células transfectadas después de la incubación durante 1 día. Carril 5: Igual que en el carril 4, después de 2 días de incubación. Carril 6: Igual que en el carril 4, después de 4 días de incubación. Carril 7: Medio obtenido de células transfectadas de forma simulada después de una incubación durante 4 días. Las bandas blancas difusas en los carriles 4 a 7 son grandes concentraciones de de albúmina en las muestras de medio que reducen el fondo para la transferencia de Western.

Es evidente a partir de los datos obtenidos en este experimento que una línea celular de ensayo (COS) se puede transfectar con un gen para dar como resultado la expresión y la secreción por esa línea celular de una versión soluble de ligando de Fas.

Ligando Fas secretado por las células de ensayo destruye células que contienen Fas

Para demostrar la viabilidad de transfectar hMSC con el propósito de generar una proteína tóxica para glioma en hMSC para usar en la destrucción de células de glioma en el tejido cerebral se realizó el siguiente experimento. Los resultados de este experimento se muestran en la siguiente Figura 13. Las Figuras 13 a-d son imágenes de una serie de microfotografías que ilustran la inhibición del crecimiento y la destrucción de células 293 (Fas+) por medio obtenido a partir de células COS que expresan de forma transitoria un ADNc que codifica FasL soluble. Aproximadamente 5 x 10^{5} células 293 se incubaron con 1 ml de medio fresco más 1 ml de medio obtenido a partir de células COS transfectadas a las 48 horas después de la transfección. Las células 293 se muestran a los 3 días de la incubación. El tratamiento redujo las células viables en más del 90%. La Figura 13a ilustra células 293 de control incubadas con 1 ml de medio obtenido a partir de células COS transfectadas de forma simulada. La Figura 13b ilustra células 293 de ensayo incubadas con 1 ml de medio de células COS que expresan FasL soluble. El aumento de contraste de fase fue de x 100. Las Figuras 13c y 13d ilustran los mismos cultivos que la Figura 13b al mayor aumento de x 200. El aspecto de las células sugiere que son apoptóticas.

Demostración de la transducción exitosa de MSC de ratón y humanas para expresar un gen exógeno

Se realizó un experimento usando un gen de ensayo, tirosina hidroxilasa, para demostrar que las MSC de ratón y humanas se podían modificar genéticamente para expresar un gen exógeno de ensayo. Las Figuras 14 y 15 ilustran los resultados de estos experimentos y demuestran que las MSC de ratón y humanas se podían modificar genéticamente de forma exitosa usando un vector retroviral para expresar un gen de ensayo exógeno, tirosina hidroxilasa. La Figura 14 es una imagen de una transferencia de Western de MSC de rata transducidas con un retrovirus (pLNCX) que contiene un gen de ensayo (tirosina hidroxilasa). Las condiciones para la transducción de retrovirus fueron como se describe en la presente memoria en el Ejemplo 10. El ensayo de transferencia de Western se realizó usando lisados celulares y un anticuerpo para tirosina hidroxilasa. Carril 1: Marcadores de PM. Carriles 2-5: Lisados celulares de MSC transducidas (5 ó 10 \mug de proteína). Carril 6: Lisados celulares de MSC no transducidas. Carril 7: Lisado celular de células de control (293). La Figura 15 es un gráfico que ilustra la síntesis y la secreción del producto (L-DOPA) por MSC humanas transducidas con un retrovirus que contiene un ADNc de ensayo (tirosina hidroxilasa). Las células se incubaron con el cofactor esencial tetrahidropteridina 50 \muM y la L-DOPA producida en el medio se ensayó por HPLC. No se detectó L-DOPA en el medio obtenido a partir de MSC de control.

Transfiriendo el promotor y el ADNc para el ligando FAS soluble usado en los experimentos descritos en las Figuras 12 y 13 al retrovirus usado en el experimento descrito en las Figuras 14 y 15, se pueden preparar MSC que secretan una proteína tóxica tal como FasL u otra proteína tóxica para glioma como se describe en la Figura 11. La eficacia de tales MSC modificadas por ingeniería genética para secretar una proteína tóxica para glioma tanto en la inhibición del crecimiento como en la destrucción de células de glioma en cultivo se puede evaluar como se describe en la presente memoria en el Ejemplo 10. Además, la eficacia de tales MSC modificadas por ingeniería genética para secretar una proteína tóxica para glioma tanto para inhibir el crecimiento como para destruir células de glioma en ratas se puede evaluar como se describe en el Ejemplo 10 de la presente memoria.

Injerto y migración de hMSC en cerebro de rata

Como se describe en la presente memoria en el Ejemplo 9, las hMSC obtenidas de médula ósea humana se injertan en el cerebro de rata y migran a lo largo de vías conocidas para la migración de células madre neurales (Figura 16). Más recientemente, se ha descubierto que si se preparan cultivos enriquecidos con astrocitos a partir de los cerebros de ratas receptoras, se podría recuperar una pequeña fracción de las células humanas en los cultivos. Además, una fracción menor de las células humanas tiene la morfología de astrocitos tempranos y contienen proteína ácida fibrilar glial, un marcador para astrocitos tempranos (Figura 10). Como se indica en la Tabla 4, la evaluación de secciones de cerebro obtenidas a partir de las ratas que recibieron el injerto de médula ósea indicó que el 15% de las células humanas todavía estaban presentes después de 120 días. La evaluación de cultivos enriquecidos con astrocitos obtenidos a partir de los cerebros de rata indicaron que aproximadamente el 5% de las células en los cultivos eran células humanas. De las células humanas en los cultivos, aproximadamente el 1% se tiñeron positivamente con un anticuerpo para proteína ácida fibrilar glial (Tabla 5). Ninguna de las células se tiñó positivamente con un anticuerpo para ED-1 y, por lo tanto, las células humanas no eran microglía.

Las MSC infundidas se propagan durante el crecimiento del cerebro en ratones neonatos

En otros experimentos se prepararon células estromales de médula de ratón (mMSC) a partir de ratones y se infundieron en los cerebros de ratones neonatos de 7 días de edad. Aproximadamente 50.000 de las mMSC se infundieron en la zona germinal subventricular. Las células de donante se detectaron premarcando los núcleos con bis-benzamida (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Después de 12 y 45 días, se recuperaron las células de donante en el sitio de inyección pero, como en los experimentos de ratas con hMSC, también se observó que migraban hacia extensas regiones del cerebro (Figura 16). Con mayores aumentos, se podían observar las células alineándose por sí mismas en series lineales y parecían migrar a lo largo de tractos de la sustancia blanca dentro de la cápsula externa, el cuerpo calloso, la comisura anterior, la comisura del hipocampo ventral y a lo largo de haces de fibras del cuerpo estriado (Figuras 16 y 17). También eran evidentes en el cuerpo estriado del hemisferio contralateral. El número de células presentes en el cerebro de un ratón sacrificado 12 días después y otro sacrificado después de 45 días se estimó por recuento de núcleos fluorescentes en secciones congeladas del cerebro como se describe en la presente memoria. Como se indica en la Tabla 6, el número de células de donante aumentó aproximadamente 40 veces a medida que crecía el cerebro de los ratones neonatos. Los ensayos del contenido de ADN en cerebros de ratones maduros indicaron que contenían aproximadamente 10^{8} células. Por lo tanto, a los 45 días, las células de donante representaban aproximadamente el 2% de las células totales del cerebro.

El análisis de los cerebros de ratón estableció que no había evidencia de formación de tumor y los ratones no desarrollaron ningún signo neurológico o síntomas de tumores. Por lo tanto, la propagación de las células de donante parece ser un proceso que es paralelo a la propagación de las células madre neurales endógenas en el desarrollo del cerebro de ratón.

Ensayos de hMSC para ARNm de Fas, FasL y EGFR

Para determinar si las hMSC contienen o no ARNm que codifica Fas, FasL o EGFR, se usó ARN poli A marcado con ^{32}P obtenido a partir de las hMSC en un ensayo de transferencia puntual. No había ARNm detectable específico para Fas, FasL o EGFR en hMSC (datos no mostrados). Para confirmar estos resultados se realizaron ensayos de RT-PCR con el ARNm. Los resultados presentados en la Figura 18 demuestran que se detectaron niveles bajos de ARNm específicos para FasL, pero no había pruebas de ARNm específico para Fas.

Experimentos realizados en el modelo de glioma C6 en ratas

Se inyectaron células de glioma de rata C6 (aproximadamente 100.000) en el margen de la unión de la sustancia blanca y gris del hemisferio cerebral en un lado de un cerebro de rata. Después de 2 semanas, se prepararon secciones congeladas y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las células de glioma C6 se implantaron de forma exitosa en el cerebro de rata, como se ilustra en la Figura 19. La Figura 19 ilustra cómo los márgenes del glioma se delinearon de forma precisa y que se observaban células de glioma ocasionales con núcleos raros.

Modificación por ingeniería genética de hMSC para expresar y secretar proteínas tóxicas para células de glioma

La estrategia global de estos experimentos se puede esbozar del siguiente modo: (a) se preparan vectores retrovirales que están diseñados para expresar formas secretadas de tres proteínas tóxicas para tumores diferentes (Figura 11); (b) los vectores retrovirales se usan para infectar hMSC; (c) hMSC infectadas de forma estable se exploran para identificar clones que secreten niveles elevados de la proteína tóxica para tumores recombinante; y (d) se ensayan clones de alta producción por su capacidad para diferenciarse in vitro en osteoblastos, condrocitos y adipocitos para asegurar que las células conservan su pluripotencialidad. Después se usan los clones en ensayos de toxicidad para gliomas in vitro e in vivo, como se describen en la presente memoria.

Se usan tres proteínas tóxicas para glioma diferentes a modo de ejemplo. La razón para elegir cada una se describe a continuación.

Ligando Fas (FasL) como una Proteína Tóxica para Glioma

FasL es un gen preferido para usar en la presente invención ya que: a) se ha demostrado que el FasL soluble induce la apoptosis en células de glioma maligno pero no en células normales del SNC (Weller et al., 1994, J. Clin. Invest. 94: 954-964; Weller et al., 1995, Cancer Res. 55: 2936-2944; Frei et al., 1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-113; Weller et al., 1998, Brain Pathol. 8: 285-293); (b) el FasL soluble citotóxico se secretó por células COS transfectadas con genes en la presente memoria y, por lo tanto, las hMSC son probablemente propensas a modificación por ingeniería genética para generar células que secreten FasL soluble; c) las hMSC expresan bajos niveles de ARNm de FasL y no expresan ARNm de Fas (Figura 18). Por lo tanto, es improbable que las hMSC experimente una apoptosis una vez que se modifiquen por ingeniería genética para sintetizar y secretar niveles mayores de FasL; (d) una terapia basada en infusión local e injerto de hMSC para secretar FasL soluble evita la toxicidad sistémica pero proporciona una fuente a largo plazo de la proteína. Estos experimentos también proporcionan la base para experimentos posteriores en los que la expresión de FasL en hMSC y la secreción de FasL a partir de las mismas se puede regular por la presencia en la célula de un gen suicida tal como la timidina quinasa de herpes simple (Uckert, 1998, Hum. GeneTher. 9:855-865) o un promotor condicional tal como un promotor sensible a tetraciclina (Steinmann et al., 1998, Arch. Virol.
143: 3548).

Un scFv biespecífico específico tanto para EGFR como para CD3 como un Gen o Proteína tóxica para Glioma

Una construcción preferida para usar en la presente invención es un scFv biespecífico específico tanto para EGFR como para CD3 como un gen tóxico para glioma ya que (a) la proteína expresada de este modo se ha usado para tratar otros tumores malignos y se han obtenido resultados prometedores (Kufer et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45: 193-197; De Jonge et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45: 162-165; Bookman, Semin. Oncol. 25: 381-396; Helfrich et al., 1998, Int. J. Cancer 76: 232-239; Jost et al., 1996, Molec. Immunol. 33: 211-219) y (b) el uso del gen se puede aplicar tanto al SNC como a tejidos periféricos ya que los linfocitos T aparecen en el SNC en números aumentos durante los cambios patológicos en el SNC (Hirschberg et al., 1998, J. Neuroimmunol. 89: 88-96) y, además, la infusión de células T activadas fue beneficiosa en algunos pacientes (Haynes et al., Cancer 76: 840-852). Este gen puede perfeccionarse adicionalmente para regular la producción del scFv biespecífico usando un gen suicida o un promotor inducible, como se ha descrito anteriormente (Uckert et al., 1998, Hum. Gene Ther. 9: 855-865; Steinmann et al., 1998, Arch. Virol. 143: 3548).

Anticuerpos scFv para EGFRvIII como un Gen o Proteína Tóxica para Glioma

Este gen tóxico para glioma también se prefiere porque a) ya se ha obtenido una gran cantidad de información con respecto a los riesgos potenciales y la viabilidad del uso de este gen en ensayo clínico de Fase II actual usando un anticuerpo monoclonal marcado con ^{125}l específico para EGFR (Snelling et al., 1995, Hybridoma 14: 111-114; Faillot et al., 1996, Neurosurg. 39: 478-483; Stragliotto, Eur. J. Cancer 32A: 636-640); b) esta estrategia de dos etapas en la que se usan hMSC transfectadas injertadas para secretar anticuerpo scFv para EGFR seguido por la administración de anticuerpos marcados con ^{125}l para scFv de ratón debe proporcionar una terapia más específica que el anticuerpo monoclonal marcado ^{125}l usando actualmente para EGFR; c) el uso de la proteína probablemente es más específico que el uso de anticuerpos marcados con ^{125}l para EGFRvIII, ya que se consigue especificidad tanto en la unión del scFv de ratón al EGFR como en la unión del anticuerpo marcado con ^{125}l al scFv de ratón.

Además de lo anterior, se puede usar un vector retroviral ya que tales vectores producen de manera reproducible niveles elevados de expresión génica estable en células en las que se introducen. Además, está disponible en el mercado una amplia diversidad de construcciones retrovirales y se pueden usar en hMSC. Se pueden usar aspirados de médula de las crestas iliacas de voluntarios normales y médula de cuerpos vertebrales obtenidas en la autopsia de donantes de órganos para aislar hMSC. También se puede usar médula de cuerpos vertebrales ya que proporcionan un número mayor de hMSC (aproximadamente 2 x 10^{9} por cuerpo en vez de 10^{8} por aspirado de médula). Además, si las hMSC obtenidas a partir de cuerpos vertebrales de donante se injertan en el cerebro como hMSC de aspirados ilíacos, pueden ser la fuente preferida para ensayos clínicos potenciales.

\newpage

Diseño y Síntesis de Construcciones Génicas

En el caso de la construcción de FasL, se describe ADNc de FasL de rata en un plásmido (pBL-KA15) en Suda et al. (1993, Cell 75: 1169-1178). La región extracelular del gen (ATG más nt 371 a 910; Suda et al., 1993, Cell 75: 1169-1178) se amplifica por PCR y se clona la secuencia. Después se transfiere el ADNc a un vector de secreción (pSecTag2/Hygro; Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene una señal de secreción de cadena de Ig\kappa, promotor de CMV, marcador myc y un gen de resistencia a higromicina. Las secuencias que incluyen los genes flanqueantes se transfieren después a un vector de retrovirus convencional (pLNCX; ClonTech Inc., Palo Alto, CA).

En el caso del scFv dirigido contra EGFR, el vector retroviral pBabeNeo/scFv-225S se describe en (Jannot et al., 1996, Oncogene 13: 275-282). Para mejorar la secreción de la proteína de las células se introduce un sitio de glicosilación como se describe por Jost et al. (Jost et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 26267-26273). El gen de anticuerpo scFv dirigido contra EGFRI se sustituye con el gen para scFv contra EGFRvlII, ya que es una variante específica de tumor de glioma de EGFR, como se describe en la bibliografía que se cita en la presente memoria.

El scFv biespecífico que se dirige tanto contra EGFR como contra CD3 se describe en la bibliografía citada en la presente memoria. Este scFv biespecífico dirigido tanto contra CD3 como contra el epítopo FLAG (Wickham et al., 1997, J. Virol. 71: 7663-7669) se modifica sustituyendo las secuencias de scFv anti-FLAG por secuencias para scFv anti-EGFR o scFv anti-EGFRvIII en el vector retroviral pLNCX para el uso en la presente memoria.

Transfección con Retrovirus

Se usan protocolos convencionales para la transfección con retrovirus. Las condiciones son comparables a las condiciones usadas para transfectar de forma estable MSC de ratón y se han usado condiciones diferentes para transfectar de forma estable hMSC (Gordon et al., 1997, Hum. Gene Ther. 8: 1385-1394; Chuah et al., 1998, Hum. Gene Ther. 9: 353-365; Bulabois et al., 1998, J. Hematother. 7: 225-239). Los vectores se transfectan de forma estable en la línea celular de empaquetamiento de retrovirus murino anfotrópico (Retro-Pack; PT67; ClonTech, Inc. Palo Alto, CA). Se aíslan clones productores de virus constitutivo por selección con G418 o higromicina y se ensayan los títulos de virus en células NIH-3T3. El sobrenadante de clones de título elevado se usa para infectar hMSC. Los cultivos primarios se infectan en tres días sucesivos y las células se colocan en selección durante 5 a 14 días para obtener clones que expresen de forma estable.

Se ensaya la expresión génica recombinante en primer lugar en ensayos de RT-PCR usando las secuencias génicas conocidas para cebadores. El sobrenadante sin células obtenido de clones celulares resistentes se combina y se concentra 45 veces usando un aparato de agitación Amicon y después se ensaya para citotoxicidad por LN-229 y células de glioblastoma C6 (Frei et al., 1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-113; Barth 1998, J. Neurooncol. 36: 91-102) para evaluar la secreción de FasL activo. Para evaluar las células que expresan anticuerpos scfv, se detecta la presencia de anticuerpos específicos dirigidos contra myc (Invitrogen) en medio concentrado para detectar el epítopo myc que se expresa a partir del vector retroviral. Se preparan antisueros contra scFv de ratón usando la proteína sintetizada por hMSC transfectadas y se usan en los ensayos. Se puede evitar cualquier problema de proteína inadecuada obtenida a partir de hMSC para preparar antisueros en conejos preparando la proteína recombinante en E. coli.

Aislamiento y Expansión de hMSC

El método para el aislamiento de hMSC es como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 9. El procedimiento se repite durante 3-15 pases. Se usan condiciones similares para aislar y expandir hMSC obtenidas a partir de cuerpos vertebrales de donantes humanos.

Hay variaciones de la vida en cultivo de muestras de hMSC obtenidas a partir de aspirados de cretas ilíacas aparentemente debido a problemas de muestreo. La duración de la vida está fuertemente correlacionada con la eficacia de las muestras iniciales para generar unidades formadoras de colonias (UFC) y se pueden usar ensayos de UFC para identificar muestras de hMSC que se someterán a 15 duplicaciones en cultivo. Para caracterizar las UFC, las hMSC expandidas en cultivo hasta una confluencia del 70-90% se recogieron usando tripsina-EDTA (GIBCO, Grand Island, NY) durante 5 minutos a 37ºC y se recontaron usando un hemocitómetro. Se flameó una pipeta Pasteur de vidrio en la punta para reducir su diámetro. Las células se hicieron pasar a través de la pipeta estrechada varias veces para asegurar la separación celular. Después, las células se diluyeron 1:100 en medio completo (\alpha-MEM; GIBCO; lote de FCS seleccionado al 20%), Penicilina-Estreptomicina 1X (GIBCO) y L-glutamina 2 mM (GIBCO). Aproximadamente 100-200 células se sembraron en placas de cultivo tisular de 100 mm (Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) y se incubaron durante 10-14 días a 37ºC en CO_{2} humidificado al 5%. Se aspiró el medio y se lavaron las células con PBS 1x y se tiñeron con Violeta Cristal al 5% en metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente. La tinción se aspiró de las células que después se lavaron dos veces con agua destilada. Se recontaron las colonias visibles y se calcularon las UFC como el porcentaje de células totales sembradas.

Ensayos para Diferenciación/Pluripotencialidad

Se usaron las siguientes condiciones para ensayar la diferenciación de hMSC en osteoblastos: se cultivaron hMSC hasta una confluencia del 70-90% en medio completo. El medio se sustituyó cada 3 días con medio osteogénico (medio completo, dexametasona 10^{-8} M, ácido ascórbico 0,2 mM; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y betaglicerol fosfato 10 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Habitualmente se observó depósito de mineral después de 2-3 semanas. Los cultivos se lavaron con PBS y se fijaron en una solución de etanol helado al 70% durante 1 hora para la tinción con rojo Alizarina (AR-S) y para cuantificar el contenido de calcio mineral. Los cultivos se enjuagaron con agua purificada Milli-Q y se tiñeron durante 10 minutos con rojo Alizarina-S 40 mM, pH 4,2 (1 ml/placa de 35 mm) con rotación. Los cultivos se enjuagaron después 5 veces con agua, seguido por un lavado de 15 minutos con PBS (con rotación) para disminuir la tinción inespecífica con AR-S. Los cultivos teñidos se fotografiaron seguido por un procedimiento de extracción cuantitativa usando cloruro de cetilpiridinio al 10% p/v (CPC) en fosfato sódico 10 mM a pH 7,0 durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se diluyeron alícuotas de esos extractos de AR-S 10 veces en la solución de CPC al 10% y la concentración de AR-S se determinó por medición de la absorbancia a 562 nm en un espectrofotómetro. Los valores se normalizaron para contenido de ADN total ensayado con un colorante de unión (Hoechst 33258, Hoechst Marion Roussel, Kansas City, MO).

La diferenciación de hMSC en adipocitos se ensayó usando el siguiente método: las hMSC se cultivaron hasta el 95% de confluencia en medio completo. El medio se sustituyó cada 3 días por una combinación de MHI que contenía hidrocortisona 0,5 \muM, IBMX 125 mM e indometacina 35 mM. Se observaron células que contenían vacuolas lipídicas después de 2-3 semanas. La presencia de grasa se detectó por tinción con Aceite rojo-O (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). Las células se lavaron con PBS y se fijaron en formalina al 10% durante 10 minutos y se tiñeron con solución de Aceite rojo-O fresco (3 partes de solución madre de Aceite rojo-O [Aceite rojo-O al 0,5% en alcohol isopropílico al 99%], 2 partes de agua destilada, se mezcló durante 5 minutos y se esterilizó por filtración durante 10-15 minutos. Las placas se lavaron 3 veces con agua. Se contó el número de colonias que contenía uno o más adipocitos y el número de adipocitos por colonia (media \pm D.T.).

Se evaluaron los resultados en base a si se observaron niveles adecuados de secreción de la proteína recombinante deseada suficientes para destruir células de glioma o para limitar su vida en las células transfectadas.

Ensayo de la eficacia de hMSC modificadas por ingeniería genética en cultivo

Se han usado protocolos convencionales que se han usado ampliamente por otros en estos experimentos, pero en vez de añadir un reactivo potencialmente tóxico para tumor a los cultivos se añaden hMSC modificadas para secretar la proteína tóxica para tumor.

Fuentes de Célula de Glioma

Se obtuvieron células de glioma C6 de rata, con y sin el gen de \beta-galactosidasa (lac Z) insertado en las mismas y células de glioma T98G humano de la American Type Culture Collection (ATCC). Además se prepararon para el uso cultivos primarios de 13 tumores multiformes de glioblastoma humano con un diagnóstico anatomopatológico confirmado. Se describen líneas celulares de glioma adicionales LN-18, LN-215, LN-229, LN-308, LN-319 y LN-405 que se pueden usar en Weller et al. (1995, Cancer Res. 55:2936-2944).

Ensayos de Toxicidad Tumoral

Se usan condiciones de ensayo convencionales tales como las descritas en Frei et al. (1998, J. Neuroimmunol. 87:105-113). Se usan proporciones de hMSC a células de glioma humano que varían de 1:10.000 a 1:1. La destrucción de hMSC se distingue de la destrucción de los gliomas marcando anteriormente de forma nuclear cada tipo celular con bis-benzamida (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como se ha descrito previamente en la presente memoria. Para evaluar los efectos de hMSC que secretan scFv anti-EGFR (Estrategia III en la Figura 11), se puede usar un ensayo más complejo. Los efectos de las células que secretan scFv anti-EGFR se examinan con y sin la adición de IgG de conejo marcada con ^{125}l contra scFv de ratón. La IgG marcada con ^{125}l se añade a una concentración de 0,039 a 20 \muCi/ml (Reist et al., 1995, Cancer Res. 55: 4375-4382) 12 ó 48 horas después del comienzo de la incubación de las mezclas celulares. La unión celular del scFv anti-ratón se evalúa usando un marcador FITC y microscopía de inmunofluorescencia y radiomarcado como se describe por Reist et al. (Reist et al., 1995, Cancer Res. 55: 4375-4382). Las hMSC que secretan el scFv anti-EGFR no se ensayan para apoptosis ya que ^{125}l solo causa daño cromosómico.

Para evaluar la citotoxicidad (Frei et al., 1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-11-3), las mezclas celulares se siembran en placas de 24 pocillos (Falcon) con una densidad de 2 x 10^{5} células por pocillo en 0,5 ml de DMEM que contiene FSC al 10% inactivado por calor. Después de la incubación durante 2 días a 1 semana, se desecha el medio y las células viables adherentes restantes se tiñen con 0,3 ml de violeta cristal (al 0,5% en metanol al 20%) durante 15 minutos, se lavan en agua corriente y se secan al aire. Se determina la viabilidad celular eluyendo el colorante con 0,3 ml de citrato sódico 0,05 M/etanol al 50% y 0,1 ml de solución, la solución de colorante eluida se transfiere al pocillo de una placa de 96 pocillos (Falcon) y midiendo la absorbancia a 540 nm del colorante usando un lector de placa Titertek Multiskan (Flow, Rockville, MD). La supervivencia se expresa como el porcentaje de células que sobreviven con respecto a los cultivos de control y la tasa de destrucción se calcula usando la siguiente fórmula: % de destrucción = 100% - % de supervivencia.

Para evaluar los efectos (tamaño de la colonia y muerte celular) en la formación de colonias de tumor en agarosa blanda (Frei et al., 1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-113), cada placa de una placa de cultivo de 24 pocillos (Falcon) se recubre con una capa base de 0,4 ml que contiene agarosa seaplaque de baja gelificación al 0,7%. Las mezclas celulares (6 x 10^{5}) se resuspenden en 1,5 ml de DMEM que contiene FCS al 20%, N-acetil-L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, 20 \mug/ml de gentamicina, agarosa seaplaque de baja gelificación al 0,3% antes del sembrado de 0,5 ml sobre capas de cultivo base de replicación. Después, las placas de cultivo se transfieren a un refrigerador (4ºC) durante 15 minutos, después a temperatura ambiente durante 10 minutos y después a un incubador de cultivo a 37ºC. Se prepararon cultivos por duplicado para cada tumor y muestra ensayada. Después de 4 a 7 semanas de incubación, las colonias se tiñen con rojo neutro y se recuentan usando un microcopio invertido. Los clones que contienen más de 30 células se cuentan como colonias y los que tienen menos de 30 células se cuentan como grupos. También se mide la captación de rojo neutro. Antes de teñir las colonias, los cultivos en agarosa se enjuagan cuidadosamente con HCI 0,1 N. Se usa solución rojo neutro. (3,3 mg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al 0,1% en HCl 0,2 N y las colonias se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después las colonias se enjuagan cuidadosamente dos veces con HCl 0,1 N y las colonias positivas a rojo neutro se recuentan como se ha descrito anteriormente. Se calcula la eficacia del sembrado usando la siguiente fórmula: % de eficacia de sembrado = [número de colonias crecidas/número de células sembradas] x 100.

También se evalúa la apoptosis en las células usando las condiciones de Frei et al. (1998, J. Neuroimmunol. 87: 105-113) del siguiente modo: se realiza la detección de rupturas de ADN mono- y bicatenario en las células tumorales ex vivo usando el kit de detección de muerte celular in situ (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se cultivan 3 x 10^{6} células en matraces de 25 cm^{2} (Falcon). Después de esto, las células flotantes así como las células adherentes se transfieren a un tubo cónico de 50 ml (Falcon) y se lavan en PBS (pH 7,4) por centrifugación durante 5 minutos a 300 X g. Las células sedimentadas se fijan en 0,2 ml de solución de formaldehído al 2% tamponado con PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador horizontal. Las células se lavan en PBS y después se permeabilizan incubándolas en 0,1 ml de Triton-X100 (al 0,1 %, p/v)/citrato sódico (al 0,1 %, p/v) durante 2 minutos a 4ºC. Antes de comenzar la reacción TUNEL (Boehringer-Mannheim), las células se lavan dos veces. La mezcla de reacción TUNEL (50 \mul) contiene 0,3 nmoles de FITC-12 dTP, 3 nmoles de dATP, 25 unidades de TdT y cloruro de cobalto. Se realizan reacciones de control negativas omitiendo el cloruro de cobalto. La reacción se realiza a 37ºC durante 1 hora y se detiene con la adición de 2 \mul de EDTA 0,5 M. Las células se lavan una vez en PBS y se analizan usando un analizador de perfil Epics.

Los efectos de tratamiento de la muestra se comparan por el ensayo t de Student. Los tratamientos compuestos se comparan por ANOVA. El parámetro crítico es la proporción de hMSC a células de glioma requerido para obtener efectos significativos.

Ensayo de la eficacia hMSC modificadas por ingeniería genética en un modelo de rata para la enfermedad

En esta sección se usan protocolos convencionales que se han usado de forma amplia por otros (Barba et al., 1993, J. Neurosurg. 79: 729-735), pero con la modificación de que se inyectan cantidades variables de hMSC modificadas por ingeniería genética en diversos momentos de 0 a 14 días después de que las células de glioma se hayan inyectado en los cerebros de ratas.

Modelo de rata y administración de hMSC

Se crean tumores tumorales usando esencialmente los mismos protocolos que se han descrito previamente en la presente memoria. Se anestesian ratas albinas Sprague Dawley adultas (de 200 a 300 g) usando halotano al 3% en oxígeno y se mantienen por inyección intramuscular de una mezcla de 6 mg/kg de xilazina y 60 mg/kg de ketamina. Las ratas se colocan en un aparato esterotáxico y se realizan dos orificios de trépano 3 mm lateral y 2 mm anterior al bregma. Aproximadamente 10 \mul de la suspensión celular de glioma (50.000 a 75.000) se infunden lentamente en cada sitio a lo largo de un periodo de 30 minutos en el margen de la unión de la sustancia gris y blanca del hemisferio cerebral. La herida se cierra con suturas quirúrgicas interrumpidas y los animales se trataron con 0,6 mg/kg de xilazina y 6 mg/kg de ketamina. En momentos que varían de 0 a 14 días después se inyectan 10 \mul de hMSC modificadas por ingeniería genética (de 10.000 a 100.000 células) en un sitio y una inyección igual de hMSC de tipo silvestre se realiza en el segundo sitio del tumor para servir como un control. Las ratas se examinan diariamente para síntomas neurológicos de letargia y parálisis. Las ratas se sacrifican después de 14 a 21 días, momento en el que los gliomas C6 de control tienen 6-10 mm de diámetro. Las ratas se anestesian con xilazina y ketamina y después se perfunden por vía intracardiaca con solución salina tamponada con fosfato helada seguido de paraformaldehído tamponado al 3% y sacarosa al 10%. Se retiran los cerebros, se cortan los prosencéfalos y las muestras se congelan inmediatamente.

Ensayos

La eficacia de las MSC modificadas por ingeniería genética para reducir o tratar gliomas se mide por (a) análisis estereológico del volumen del tumor; (b) supervivencia a largo plazo de las ratas; (c) contando células de glioma premarcadas fluorescentemente o hMSC en secciones en serie del cerebro; (d) aislamiento de los núcleos de los cerebros y contando núcleos de glioma premarcados fluorescentemente. Las proteínas recombinantes producidas en las mismas se pueden detectar por inmunohistología.

Evaluación del volumen del tumor

Esta evaluación se realiza usando protocolos que se han descrito previamente (Barba et al., 1993, J. Neurosurg. 79: 729-735). Las ratas se sacrifican y se perfunden con paraformaldehído al 4%. Se recogen cerebros individuales, se ponen en paraformaldehído al 4% durante 24 horas y después se almacenan en sacarosa al 30% a 4ºC hasta la saturación. Los cerebros se seccionan en serie usando secciones de 40 \mum; cada quinta sección se monta y se trata con tinción de Nissl para ayudar a la identificación del tumor. Las secciones de cerebro teñidas que tienen tejido tumoral se examinan y se cuantifican los volúmenes del tumor estereológicamente. Examinando cada quinta sección en serie de 40 \mum, cada sección de 100 \mum de cerebro se explora para la presencia del tumor. Todo el volumen del tumor dentro del cerebro se cuantifica microscópicamente contando puntos de rejilla a lo largo del tumor a partir de una superposición de rejilla de matriz de puntos calibrados. El volumen representado por cada punto se calcula como el producto del área cubierta por cada punto multiplicado por el grosor del cerebro representado por cada corte y se calcula el volumen total del tumor como la suma de los volúmenes de tumor medidos en las secciones de cerebro individuales. Los volúmenes de tumor se representan en forma de gráfico y se comparan por análisis estadístico no paramétrico de ensayo de U de Mann-Whitney.

Ensayo para supervivencia a largo plazo

Estos experimentos (Barba et al., 1993, J. Neurosurg. 79: 729-735) se realizan usando ratas en las que se infunden células de glioma en un sitio solamente seguido por infusión de hMSC modificadas por ingeniería genética o de tipo silvestre en el mismo sitio. Las ratas se evalúan a lo largo de 90 días. Los animales se observan diariamente, se registra el día de la muerte y se verifica histológicamente la presencia del tumor. Los resultados se representan como una curva de supervivencia.

Detección y caracterización de células de glioma y hMSC en secciones de cerebro

Las células de glioma o las hMSC se premarcan con 1 \mug/ml de bis-benzamida durante 24 horas antes de la infusión en el cerebro como se ha descrito previamente en la presente memoria. Las ratas se sacrifican y se perfunden como se ha descrito anteriormente. Los cerebros se congelan en hielo seco de isopentano y se preparan secciones de 10 \mum. Se unen las secciones congeladas a portaobjetos recubiertos de gelatina y se sumergen rápidamente en acetona fría durante 5 minutos y se almacenan a -20ºC para el procesamiento posterior. Se visualizan las células marcadas fluorescentemente y se fotografían usando un microscopio de fluorescencia. Se cuenta el número de núcleos marcados fluorescentemente en 8-10 secciones de tejido cortadas desde los límites rostral a caudal del cuerpo estriado. El procedimiento se repite en cada cerebro por dos investigadores que usan secciones alternas. Solamente se cuentan los núcleos marcados claramente. Las células muertas y lisadas dejan un matiz azulado en el tejido circundante y ninguna tinción nuclear clara. Los números observados se extrapolan al número total de secciones para estimar el número de células injertadas supervivientes.

Para confirmar los ensayos de células de glioma o hMSC se aíslan núcleos de los cerebros (Ausubel, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, 1,4.10,6, John Wiley and Sons, Inc.). Después de la infusión de células de glioma marcadas o hMSC marcadas, los cerebros se cortan en piezas pequeñas a 4ºC y se transfieren a un Homogeneizador Dounce helado. Los tejidos y las células se rompen con 5-10 impactos de una mano de mortero B hasta que los núcleos parecen estar libres de marcadores citoplásmicos como se mide por microscopía de contraste de fases. Los núcleos se transfieren a un tubo de centrifuga de polipropileno cónico de 50 ml y se añaden 4 ml de tampón de sacarosa II (sacarosa 2 M, acetato de magnesio 5 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM en tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,0). La muestra se mezcla por pipeteado suave e inversión. Se añade tampón de sacarosa II (4,4 ml) a un tubo de centrifuga de cubeta oscilante (tubo de polialómero SW 40.1), se añade la capa nuclear sobre el colchón de sacarosa y se complementa el tubo con tampón de sacarosa 1 (sacarosa 0,32 M, CaCI_{2} 3 mM, acetato de magnesio 2 mM, EDTA 0,1 mM y DTT 1 mM y NP-40 al 0,5% y tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,0). La muestra se centrifuga durante 45 minutos a 30.000 x g en un rotor SW 40.1 a 4ºC. El sedimento que contiene núcleos se suspende en 0,2 ml tampón de almacenamiento de glicerol helado con aproximadamente 5 X 10^{7} núcleos por ml. La muestra se almacena congelada a -70ºC en nitrógeno líquido. Para el ensayo se coloca la suspensión descongelada de núcleos en un hemocitómetro. Se cuentan los núcleos marcados usando un microscopio de ultravioleta y se cuentan los núcleos totales usando microscopía de contraste de fases.

Ensayo para secreción de proteína recombinante

Para detectar la proteína tóxica para glioma secretada por las hMSC, los cerebros se congelan rápidamente colocándolos en isopentano-hielo seco (-22 ºC), se seccionan y las secciones se fijan en acetona fría. Después las secciones se tiñen con anticuerpos primarios tales como FasL de cabra anti-rata (Santa Cruz) o IgG de cabra anti-ratón (Jackson). Estos anticuerpos se pueden obtener en Jackson Labs, Chester, PA) Los anticuerpos secundarios son los anticuerpos marcados con FITC apropiados (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Los experimentos se pueden repetir en las mismas condiciones después de periodos de tiempo más prolongados. Por ejemplo, las ratas se pueden evaluar y sacrificar después de 1 a 6 meses para hMSC modificadas por ingeniería genética que se ha demostrado que son eficaces en estos experimentos.

Los gliomas tratados y los gliomas de control tratados de forma simulada se comparan de forma simultánea para las mismas ratas. Los datos de todos los ensayos se evalúan usando el ensayo t de Student.

TABLA 4 El número de hMSC Marcada Fluorescentemente en Cerebros de Rata

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Recuperación de Células Humanas de Cultivos enriquecidos con Astrocitos de Cerebros de Ratas Receptoras

6

TABLA 6 Propagación de mMSC después de la Infusión en los Cerebros de Ratones Neonatos

7

Ejemplo 11 Las células estromales de médula se comportan como células madre neurales después de la inyección en cerebros de ratones neonatos

Las células madre se caracterizan por una capacidad de auto-renovarse y generar progenie capaz de diferenciarse en múltiples linajes celulares, aunque distintos. Mientras que las células madre obtenidas de embriones tempranos se pueden diferenciar en todos los tipos de células somáticas (Evans y Kaufman, 1981, Nature 292: 154; Martin, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7634; Pederson, 1994, Reprod. Fertil. Dev. 6: 543), se considera que las obtenidas de tejidos adultos producen solamente los linajes celulares característicos de los tejidos en los que residen. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas residentes en la médula ósea producen solamente elementos sanguíneos (Morrison, 1994, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11: 35). Las células madre también están restringidas en su distribución dentro del tejido adulto y solamente se encuentran en médula ósea, intestino, gónadas, piel y cerebro (Hall y Watt, 1989, Development 106: 619; Morrison et al., 1997, Cell 88: 287). En el último caso, la ausencia de accesibilidad limita la utilidad de estas células madre para tratar enfermedades del sistema nervioso central.

Recientemente, varios informes han puesto en duda el punto de vista de que el potencial de diferenciación de células madre en tejidos adultos está restringido por linaje (Tajbakhsh et al., 1994, Neuron 13: 813; Bjornson et al., 1999, Science 283: 534). Si, de hecho, tales células madre son totipotentes y su potencial de diferenciación manifestado por una respuesta es proporcional a claves específicas en el microentorno local, entonces puede ser posible reconstituir un tejido usando células madre de un origen dérmico separado.

Los experimentos de este Ejemplo se diseñaron para determinar si las células madre de médula ósea pueden adaptar destinos celulares neurales en el cerebro inyectando células estromales de médula (MSC) en la zona germinal subventricular (SVZ) de ratones neonatos.

Método de inmunodepleción para aislar una población uniforme de MSC

Se establecieron cultivos de MSC murinos de la médula ósea de ratones FVB/N hembra (Jackson Labs, BarHarbor, ME) y se cultivaron de 7 a 10 días (Phinney et al., 1999, J. Cell. Biochem. 72: 570). Para la inmunocitoquímica, las células cultivadas en portaobjetos de cámara de pocillo único (Falcon) se lavaron con PBS, se secaron al aire, se fijaron durante 2 minutos en acetona helada, se volvieron a secar al aire y después se tiñeron con Giemsa o se incubaron con un CD 16/CD32 anti-ratón de rata (bloque Fc de Pharmigen) con una dilución de 1:50 durante 30 minutos, después con un anticuerpo CD11b biotinilado (Pharmigen) con una dilución de 1:200 y finalmente con un anticuerpo anti-biotina conjugado con FITC (Dako) con una dilución 1:100. Los portaobjetos se contratiñeron con bromuro de etidio.

Alternativamente, las células se trataron con tripsina al 0,25% durante 5 minutos a temperatura ambiente y después se recogieron por raspado suave. Aproximadamente 2-2,5 x 10^{6} células se incubaron durante 60 minutos a 4ºC con una suspensión de perlas paramagnéticas recubiertas de avidina (PGC) conjugadas con un anticuerpo anti-CD11b biotinilado (Pharmigen). La concentración final de las perlas fue 0,05 mg/ml y la proporción de anticuerpo a perlas fue de 10 \mug/mg. Las células no unidas a las perlas se recogieron, se lavaron con medio esencial mínimo \alpha (MEM), y después se sembraron en portaobjetos con cámara de pocillo único. Después de 48 horas, las células se tiñeron como se ha descrito anteriormente. Todas las fotografías se produjeron usando un microscopio Nikon Otpiphot-2.

Marcado fluorescente de mMSC con bis-benzimida

Se incubaron cultivos de MSC de ratón de siete días de edad durante una noche con 10 \mug/ml de bis-benzimida (Sigma), y después las MSC aisladas por inmunodepleción se contaron en un hemocitómetro y se resuspendieron en \alpha-MEM sin suero con una concentración de 10.000 células/\mul. Usando el bregma como un punto de referencia, aproximadamente 50.000 células en un total de 5 \mul se inyectaron lentamente durante un periodo de 5 minutos en la SVZ de ratones de 4 días de edad crio-anestesiados usando un dispositivo esterotáxico. En los momentos indicados se sacrificaron los ratones, se prefundieron con paraformaldehído al 4% y se crioconservaron con sacararosa al 30% en PBS. Los cerebros se extrajeron y se disecaron de forma general en cuatro secciones coronales de tamaño igual. Cada sección se puso en un compuesto OCT, se congeló y se crioseccionó con un grosor de 10 \mum. Se tomó un total de tres animales en cada momento para el análisis histológico. En más de 18 animales que recibieron inyecciones de MSC, solamente se observó que uno no mostró injerto de célula de donante en el cerebro.

Cálculo de cantidad de células de donante en el prosencéfalo de ratón

El área cubierta por los núcleos marcados en secciones en serie coronales se calculó en primer lugar usando una retícula de microscopio con un aumento de 100x. Esta área después se dividió después por el área de un campo ocular con un aumento de 400x. El número resultante después se multiplicó por el número de núcleos fluorescentes en fase contados por campo ocular (n+5) con un aumento de 400x para cada quinta sección de 10 \mum. Basándose en este método, el número estimado de células de donante en el prosencéfalo se observó que era igual a 100.000 a los 3 días, 600.000 a los 12 días y 2 x 10^{6} a los 45 días post-inyección después del examen de un único animal para cada momento.

Marcado Celular con 8-bromo-2-desoxiuridina (BrdU)

Los cultivos de MSC desarrollados durante 5 días se pulsaron con 8-bromo-2-desoxiuridina 5 \muM en \alpha-MEM suplementado con FBS al 10% durante 48 horas, se lavaron varias veces con PBS y se sometieron a inmunodepleción como se ha descrito anteriormente. Se usaron tres animales para cada momento en el análisis histológico.

Evaluación de los efectos secundarios de la inyección de mMSC

Fue evidente una mínima gliosis reactiva en animales que recibían inyecciones de mMSC pero estaba confinada a los márgenes del trayecto de inyección. Esta gliosis también fue evidente en experimentos simulados en los que los animales recibieron inyecciones de solamente solución salina. Ninguno de los animales a los que se habían inyectado mMSC mostraron ninguna anormalidad conductual manifiesta hasta los 90 días post-inyección, que es el momento más largo establecido hasta ahora. Además, camadas de hermanos de animales experimentales confirmaron que las hembras que reciben inyecciones de mMSC podrían producir descendencia de forma exitosa.

Tinción para GFAP y BrdU

Los ratones se prefundieron con paraformaldehído al 4% y se procesaron para la inclusión en parafina. Se realizó inmunohistoquímica para BrdU usando una dilución 1:500 de anticuerpo anti-BrdU (Dako, Inc.) como se ha descrito previamente (Gage et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:897) excepto porque se omitió el pre-tratamiento con ácido fórmico. Después, las secciones teñidas con BrdU se marcaron doblemente para GFAP. Las secciones se trataron durante 10 minutos con tripsina al 0,25%, seguido por una etapa de bloqueo de 15 minutos con suero normal de cabra al 20%. Después se aplicó anti-GFAP de conejo con una dilución 1:250 (Dako, Inc.) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detectó anticuerpo primario por inmunoglobulina anti-conejo de cabra marcada con oro con una dilución de 1:10 seguido por una potenciación con plata durante 30 minutos (Polysciences, Inc.).

Las MSC son capaces de expansión, renovación y diferenciación en múltiples linajes celulares mesenquimales (Owen, 1988, J. Cell Sci. Suppl. 10: 63; Aubin, 1998 J. Cell. Biochem. Suppl. 30: 73), y por lo tanto, cumplen los criterios básicos de células madre. Típicamente, las MSC se aíslan de médula ósea por su adherencia a plástico (Prockop, 1997, Science 276: 71). Se ha demostrado previamente que los cultivos de MSC murinos establecidos a partir de diversas cepas de ratón endogámicas mediante este método representan una población heterogénea dominada por células mielopoyéticas que expresan el receptor de superficie celular CD11b (Phinney et al., 1999, J. Cell. Biochem. 72: 570). Estas observaciones han permitido desarrollar un método fiable basado en inmunodepleción para aislar una población uniforme de MSC con forma de fibroblastos como representa en la (Figura 20). Después de la purificación, estas células no mostraron inmunorreactividad con CD45, indicando que la población está desprovista de células hematopoyéticas (datos no mostrados).

Tres días después de la inyección en cerebro de ratón de aproximadamente 50.000 mMSC marcadas con el colorante de unión a ADN fluorescente bis-benzimida, el examen directo de secciones de criostato por microscopía de fluorescencia mostró células de donante marcadas con colorante en la SVZ y revistiendo la última y el tercer ventrículo a lo largo del neuroeje, extendiéndose rostralmente al bulbo olfatorio. También fue evidente un número pequeño de células revistiendo el cuerpo calloso y el plexo coroideo. Estos resultados se representan en la (Figura 21A). También se observaron células de donante ocasionales en el hemisferio contralateral. De las secciones congeladas de animales que recibieron inyecciones de 50.000 bis-benzimida, células marcadas que se lisaron antes de la inyección no contenían núcleos fluorescentes detectables, lo que indica que la bis-benzimida no se transfiera de forma pasiva de células de donante a células del hospedador.

A los 12 días después de la inyección, las células de donante estaban lo más ampliamente distribuidas proximal al trayecto de inyección a +0,9 de bregma, y se habían expandido al cuerpo estriado ipsolateral, extendiéndose desde la comisura anterior hasta la cápsula externa y la corteza cingulada como se representa en las (Figuras 21 a-c). Además, todavía era evidente que muchas células de donante revestían el ventrículo lateral y el plexo coroideo. 45 días después del trasplante, las células de donante se habían diseminado a través del cuerpo estriado como se ilustra en la (Figura 21d). Moviéndose rostralmente desde el sitio de inyección, las células de donante se habían extendido más allá de la cápsula externa, a través de la corteza somatosensorial y a lo largo de la sustancia aracnoide como se representa en la (Figura 21a).

También se observaron células de donante en el cuerpo calloso y las comisuras del hipocampo interior y ventral como ilustra en la (Figura 21e). Dentro de estos tractos de sustancia blanca establecidos, las células de donante se alinearon en disposiciones paralelas, radiales, como se ilustra en la (Figura 22), indicando que su distribución espaciotemporal a lo largo del cerebro estaba mediada por un proceso ordenado de migración más que por difusión simple. El aumento del número de las células marcadas con colorante fue evidente del mismo modo en el hemisferio contralateral. Las estimaciones basadas en el recuento directo de núcleos fluorescentes indicaron que el número de células de donante se expandió más allá de 40 veces.

La marcada proliferación de MSC, junto con su migración desde la SVZ a regiones del cuerpo estriado y corticales, imita los sucesos de gliogénesis; la colonización post-natal del prosencéfalo por NSC desde la SVZ y su diferenciación posterior en macroglía (Levison et al., 1993, Development 119: 611; Levison y Goldman, 1993, Neuron 10: 201; Zerlin et al., 1995, J. Neurosci. 15: 7238). Por lo tanto, las MSC imitan aspectos del comportamiento de células madre neurales.

Para probar adicionalmente este aspecto, estos experimentos se repitieron usando células marcadas con 8-bromo-2-desoxiuridina (BrdU). A los 12 días después de la inyección, las células de donante marcadas con BrdU fueron evidentes a lo largo de la zona subventricular, el cuerpo estriado y la cápsula externa del hemisferio ipsolateral como se ilustra en la (Figura 23a-c), una distribución similar a la observada con células marcadas con bis-benzimida.

El doble marcado mostró que la expresión de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) estaba prácticamente ausente en las células de donante dentro de la SVZ, pero se expresaban fuertemente en un subconjunto de células de donante dentro del cuerpo estriado y la capa molecular del hipocampo, como se ilustra en la (Figura 23d). Basándose en la morfología y su asociación con neuronas, las células marcadas con BrdU también parecía que se diferenciaban en oligodendrocitos. Estos resultados amplían observaciones previas que sugieren que las células obtenidas de médula ósea se injertan en el cerebro y producen macroglía (Eglitis y Mezey, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4080; Azizi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3908) demostrando que las MSC de ratón migran a lo largo de rutas establecidas y se diferencian en linajes celulares neurales de una manera coherente con sucesos del desarrollo en el prosencéfalo neonatal.

Además de astrocitos y oligodendrocitos obtenidos de donante, se observó que las células marcadas con BrdU formaban grupos dentro de las Islas de Calleja, una región rica en neuronas en la corteza del prosencéfalo ventral, como se ilustra en las (Figuras 24a y b), sugiriendo que las MSC también se diferencian en neuronas. Para confirmar esto, la distribución de MSC en regiones conocidas de neurogénesis post-natal (Luskin, 1993, Neuron 11: 173; Lois y Alvarez-Buylla, 1994, Science 264: 1145; Jankovski y Sotelo, 1996, J. Comp. Neurol. 371: 376; Altman, 1972, J. Comp. Neurol. 145: 353; Hatten y Heintz, 1995, Ann. Rev. Neurosci. 18: 385) se analizó y una proporción significativa de células marcadas con BrdU se observó tanto en el bulbo olfatorio como en el cerebelo como se ilustra en la (Figura 24c-f). En el último caso, se observaron células de donante específicamente dentro del subepéndima del cuarto ventrículo, la capa granular externa (EGL) y la capa granular interna (IGL) como se ilustra en las (Figuras 24e y f). La mayoría de estas células no expresan GFAP y, por lo tanto, no eran astrocitos. Su localización específica y la abundancia indica que no son microglía, que está débilmente poblada en estas regiones. Más bien, el patrón de distribución distinto de células marcadas con BrdU en esta región es análogo al esperado para neuroprogenitores, que, durante el desarrollo del cerebro post-natal se someten a expansión clonal dentro y migración posterior de la EGL a la IGL donde se convierten en neuronas (Jacobson, 1991, Developmental Neurobiology, Plenum Press, New York; Zhang y Goldman, 1996, Neuron 16: 47). Esto también es coherente con la observación de que las células de Purkinje adyacentes a la IGL, que maduran durante la embriogénesis y no son mitóticas en el cerebro post-natal (Altman y Bayer, 1978, J. Comp. Neurol. 179: 23; Altman y Bayer, 1985, J. Comp. Neurol. 231: 42), eran exclusivamente de origen en el hospedador.

Compendio

Colectivamente, estos datos demuestran que las MSC de ratón imitan el comportamiento de células madre neurales en el cerebro del ratón participando en aspectos del desarrollo normal del cerebro, incluyendo proliferación, migración a lo largo de rutas establecidas, intercalación no alterada dentro de regiones del cuerpo estriado, corticales y del cerebelo y diferenciación en linajes celulares neurales. Esto último también demuestra que las MSC son capaces de producir progenie diferenciada con un origen dérmico diferente; un potencial aparentemente no enmascarado por la exposición al microentorno del cerebro neonatal en desarrollo.

Un factor en el cerebro que puede mitigar este comportamiento de MSC es FGF2. Este factor de crecimiento de polipéptidos se expresa en zonas germinales dentro del cerebro en desarrollo donde induce la proliferación de precursores neuronales/astrogliales bipotenciales así como NSC multipotenciales (Caday et al., 1990, Brain Res. Develop. Brain Res. 52: 241; Grothe y Meisinger, 1995, Neurosci. Lett. 197: 175; Hattori et al., 1997, Brain Res. Mol. Brain Res. 47: 262). El hecho de que FGF2 es mitógeno para MSC y también evita su diferenciación in vitro (Phinney et al., 1999, J. Cell. Biochem. 72: 570; Oliver et al., 1990, Growth Factors 3: 231; Locklin et al., 1995, Clin. Orthop. Rel. Res. 313: 27), puede ser en parte responsable de la expansión espectacular de estas células en el cerebro. Otros factores neurotróficos para los que las MSC expresan receptores tales como NFG (Caneva et al., 1995, Blood Cells, Molecules & Disease 21: 73), también pueden jugar un papel.

La intercalación no alterada, de amplia dispersión de MSC en el cerebro tiene importantes aplicaciones para la terapia celular de enfermedad del SNC. Las MSC se pueden aislar fácilmente de pequeños volúmenes de aspirado de la cresta iliaca, proporcionando una fuente rellenable de células autólogas para el trasplante. Además, la capacidad de estas células para la diferenciación en linajes celulares neurales sugiere que puede suceder el injerto de una manera funcional.

Ejemplo 12 Uso de MSC de rata modificadas por ingeniería genética para el tratamiento en un modelo de rata de Parkinsonismo

Las MSC de rata (rMSC) se modificaron por ingeniería genética para secretar L-DOPA as como se ha descrito previamente en la presente memoria (véase Ejemplo 10) para MSC de ratón y humanas. En resumen, las rMSC se transdujeron con un retrovirus que contenía el gen para tirosina hidroxilasa (TH) y después un segundo retrovirus con el gen para GTP-ciclohidrasa (GC). El gen de GC proporciona tetrahidropteridina, un cofactor esencial para la tirosina hidroxilasa. Después, aproximadamente 100.000 células transducidas se injertaron en el cerebro de rata como se ha descrito previamente en la presente memoria. Después se realizaron experimentos para determinar si las rMSC injertadas continuarían sintetizando y secretando L-DOPA después del injerto en el cuerpo estriado de ratas con parkinsonismo inducido por 6-hidroxidopamina.

Los niveles de producción de L-DOPA después del injerto en el cerebro de rata se evaluaron por microdiálisis en el cuerpo estriado de una rata lesionada con 6-hidroxidopamina Sprague Dawley seguido por un análisis para HPLC 3 días después del injerto de las rMSC modificadas por ingeniería genética que se han descrito anteriormente (TH+GC+). Los dializados se tomaron cada 30 minutos durante 3 horas. Los resultados de estos experimentos se describen en las Figuras 25 y 26. Los datos presentados en la Figura 27 indican los metabolitos del L-DOPA que son indicativos de la producción de L-DOPA. Los resultados de estos experimentos indican que se produjo L-DOPA en el cerebro de la rata tratada después del injerto de las rMSC transducidas a niveles comparables o superiores a los obtenidos por otros en experimentos comparables en los que se emplearon fibroblastos cutáneos o astrocitos (Lundberg et al., 1996, Exp. Neurol. 139: 39-53; Bencrs et al., 1996, J. Neurosci. 16: 4449-4456; Leff et al., 1998, Exp. Neurol. 151: 249-264). No se detectó L-DOPA en los cerebros de ratas de control.

Los datos presentados en las Figuras 25, 26 y 27 indican adicionalmente que el L-DOPA sintetizado por las rMSC transducidas en el cerebro de rata se convirtió en los metabolitos esperados tanto de L-DOPA como dopamina.

También se observó una disminución de rotaciones inducidas por apomorfina, uno de los fenotipos aceptados del modelo de rata para parkinsonismo en las ratas lesionadas con 6-hidroxidopamina después del injerto de las rMSC transducidas. La Figura 28 contiene los datos obtenidos en estos experimentos. Las ratas se prepararon por infusión de 6-hidroxidopamina en el cuerpo estriado para producir el modelo de parkinsonismo. La rotación se indujo por inyección de apomorfina (0,05 mg/kg, sc). Los valores mostrados se obtuvieron de 2 a 5 ratas a las que se infundieron rMSC transducidas para sintetizar L-DOPA (+GC+TH) y 3 ratas de control infundidas con rMSC transducidas solamente con el gen para tirosina hidroxilasa (TH), convirtiendo las células en incapaces de producir L-DOPA en cultivo sin tetrahidropteridina añadida. El gráfico indica que el efecto sobre la rotación desapareció después de aproximadamente 7 días, el mismo momento en el que L-DOPA ya no se detectó en los experimentos de microdiálisis mostrados en la Figura 25.

Se pueden realizar experimentos similares usando rMSC que están modificadas por ingeniería genética mediante métodos tales como electroporación de ADN desnudo o el uso de retrovirus auto-inactivados para dar como resultado rMSC que no conducen a la suspensión del gen expresado en el sistema nervioso central. Esto proporciona un método para prolongar el tratamiento de parkinsonismo.

Claims (27)

1. Uso de células estromales aisladas de una muestra de médula ósea de un donante humano para preparar un medicamento para tratar un paciente humano que tiene una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central, por administración directa al sistema nervioso central y además en el que dicha enfermedad, trastorno o afección se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, apoplejía y lesión de médula espinal.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho donante humano no padece una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central y en el que dicho donante humano es singenéico con dicho paciente.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho donante humano es dicho paciente humano.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que dichas células estromales aisladas administradas a dicho sistema nervioso central permanecen presentes o se replican en dicho sistema nervioso central.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que dichas células estromales aisladas se han cultivado in vitro.

6. El uso de la reivindicación 1, en el que dichas células estromales aisladas son células estromales transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica, donde dicha proteína se expresa en dichas células y dicha proteína sirve para realizar el tratamiento de dicha enfermedad, trastorno o afección.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que dicha proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en una citocina, una quimiocina, una neurotrofina, un anticuerpo y una proteína tóxica para glioma.

8. El uso de la reivindicación 1, en el que dichas células estromales aisladas son células estromales transfectadas con un ácido nucleico aislado que codifica una proteína terapéutica, en el que dicha proteína se secreta por dichas células y dicha proteína sirve para realizar el tratamiento de dicha enfermedad, trastorno o afección.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que dicho ácido nucleico aislado está unido de forma funcional a una secuencia promotora/reguladora.

10. El uso de la reivindicación 8, en el que dicha proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en una citocina, una quimiocina, una neurotrofina, un anticuerpo y una proteína tóxica para glioma.

11. El uso de la reivindicación 6, en el que dicho ácido nucleico aislado es una copia de tipo silvestre de un gen mutado, no funcional o sub-expresado, en el que dicho ácido nucleico aislado está unido de forma funcional a una secuencia promotora/reguladora y se expresa en dichas células estromales aisladas.

12. El uso de la reivindicación 8, en el que dicho ácido nucleico aislado es una copia de tipo silvestre de un gen mutado, no funcional o sub-expresado, en el que dicho ácido nucleico aislado está unido de forma funcional a una secuencia promotora/reguladora y se expresa en dichas células estromales para generar una proteína que se secreta por dichas células estromales aisladas.

13. El uso de la reivindicación 1, en el que dichas células estromales aisladas son células estromales que se pre-diferencian cocultivando dichas células estromales en presencia de una población sustancialmente homogénea de células diferenciadas o en presencia de un inductor de la diferenciación celular, por lo que dicha célula estromal aislada se diferencia y adquiere las características fenotípicas de las células diferenciadas o la característica de fenotipo de diferenciación de una célula tratada con el inductor.

14. El uso de la reivindicación 1, en el que dichas células estromales aisladas se han sometido a al menos una de las etapas de cultivar dichas células in vitro, introduciendo ácido nucleico aislado en dichas células y pre-diferenciando dichas células.

15. El uso de la reivindicación 1, en el que dichas células estromales aisladas son células estromales que están inmunológicamente aisladas.

16. Un método para dirigir la diferenciación de una célula estromal de médula ósea humana aislada en un astrocito adecuado para la preparación de un medicamento para tratar un paciente humano que tiene una enfermedad, un trastorno o una afección del SNC, comprendiendo dicho método cultivar dicha célula estromal aislada en presencia de una población sustancialmente homogénea de astrocitos, por lo que dicha célula estromal aislada se diferencia y adquiere las características fenotípicas de los astrocitos diferenciados.

17. El uso de la reivindicación 8, en el que la transfección de las células estromales se ha realizado usando un vector retroviral.

18. El uso de las reivindicaciones 6 u 8, en el que dichas células estromales aisladas son adecuadas para administrarse por injerto de las células directamente en el cerebro.

19. El uso de la reivindicación 4, en el que dichas células estromales aisladas administradas a dicho sistema nervioso permanecen presentes o se replican en dicho sistema nervioso central hasta aproximadamente 150 días.

20. El uso de la reivindicación 1, en el que después de administrar dicho medicamento al sistema nervioso central, aproximadamente 0,1% de dichas células estromales aisladas administradas al sistema nervioso central son capaces de expresar un marcador de diferenciación en células macrogliales, astrocitos o neuronas.

21. El uso de la reivindicación 20, en el que dicho marcador para diferenciación es proteína ácida fibrilar glial.

22. El uso de las reivindicaciones 6 u 8, en el que dicha proteína terapéutica es una enzima requerida en la biosíntesis de un neurotransmisor que es deficiente o no se produce en una enfermedad, un trastorno o una afección del sistema nervioso central.

23. El uso de la reivindicación 22, en el que dicho neurotransmisor es L-DOPA.

24. El uso de la reivindicación 22, en el que dicho medicamento realiza una disminución en un fenotipo observado para enfermedad de Parkinson.

25. El uso de la reivindicación 24, en el que dicho fenotipo observado para enfermedad de Parkinson es rotación inducida por apomorfina en un modelo de rata para enfermedad de Parkinson.

26. El uso de la reivindicación 23, en el que dichas células estromales aisladas continúan sintetizando y secretando L-DOPA durante al menos 3 días.

27. El uso de la reivindicación 23, en el que dicho L-DOPA se convierte en metabolitos de L-DOPA.