JP2010209074A - 中枢神経系の疾病の処置における使用のための単離されたストロマ細胞 - Google Patents
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- C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
Abstract
【解決手段】ヒト骨髄サンプルからストロマ細胞を単離すること及び単離されたストロマ細胞をヒト患者の中枢神経系に投与することを含み、その場合、脳における単離されたストロマ細胞の存在は、該疾病、疾患または病気の処置をもたらす。単離されるストロマ細胞をインビトロで培養してもよく、治療的化合物を生産するようにそれらを遺伝子的に設計してもよく、そして/または中枢神経系への投与前にそれらを前以て分化させてもよい。
【選択図】なし
Description
疾病、疾患または病気の処置をもたらす。
成物及び方法を含む。該組成物は、組換えDNA技術を用いて遺伝子的に改変してもしなくてもよい単離された骨髄細胞である。該方法は、ドナーから骨髄サンプルを得、その骨髄サンプルからストロマ細胞を単離し、そして単離されたストロマ細胞を患者の中枢神経系に直接投与するという工程を含んでなる。
冠詞「一つ(a)」及び「一つ(an)」は、その冠詞の文法的対象の一つまたは一つより多く(すなわち、少なくとも一つ)をさすために本明細書において用いられる。例として、「一つの要素」は、一つの要素または一つより多くの要素を意味する。
が、細胞から異常に分泌されるタンパク質をコードする遺伝子欠損を特徴とする疾病、疾患または病気をさすものとする。
トロマ細胞が分化し、そして分化した細胞の表現型特性を獲得するように分化した細胞の実質的に均質な集団または分化した細胞の産物または細胞分化の誘導物質と共培養した単離されたストロマ細胞を意味すると解釈されるべきである。
本発明は、プラスチックへの付着により単離されかつ哺乳動物の脳に注入されるMSCが、植え付け、移動しそして中枢神経系の細胞に分化する一方で、他の細胞は前駆細胞としてとどまるか、もしくは中枢神経系の細胞に分化する娘細胞を産むという発明に基づく。この発見は、個体、すなわち哺乳動物、および好ましくは中枢神経系に関連する疾病、疾患もしくは病気に罹っているヒト患者に正常の適合された(matched)同一遺伝子系のドナーから得られたストロマ細胞を提供すること、もしくは、個体からストロマ細胞を単離すること、当該細胞を培養すること、そして、中枢神経系における欠陥と関連する疾病、疾患もしくは病気の原因である遺伝的欠損はなんでも修正するようにそれらを遺伝子的に改変することのいずれかによる、個体の成功裏の治療を見込む。
法を上回る有意の利点を有する。なぜなら、ストロマ細胞は大量のコラーゲンを産生せず、そして従って線維症を引き起こさないことができるからである。
d)、そして個体に全身的に投与される。単離/増殖されたストロマ細胞のいくつかは正常な脳細胞に発達することができる。正常なストロマ細胞は欠損のあるストロマ細胞よりもより迅速に増殖し、そして増殖された若返らされた集団は、正常細胞のより大きい比率を反映することができる。従って、ストロマ細胞の増殖されかつ若返らされた集団での中枢神経系組織の再集団化(repopulation)は、正常な中枢神経系細胞の集団を提供するようにはたらき、これらは中枢神経系組織中の欠損の修正を助長する。また、ストロマ細胞は、中枢神経系へのストロマ細胞の投与前に、本明細書に提供されるプロトコルに従うことにより例えばアストロサイトに前分化されることができる。
デノウイルスもしくは他の形質転換するウイルスを使用すること、または形質転換する特性を有するタンパク質を使用することによるように不死化してよい。本発明のいくつかの局面においては、疾病、疾患もしくは病気に罹っている個体は、不完全な遺伝子の正常な機能するコピーを包含する遺伝子構築物を含有する免疫学的に単離されたストロマ細胞を提供することにより欠損のあるもしくは不完全な遺伝子を補充する、増加させるそして/もしくは置き換えることにより治療することができる。本発明のこの局面は遺伝子治療に関し、その中で、個体は、それについてそれらが存在および/もしくは機能が不完全である遺伝子を提供される。細胞により提供される遺伝子は個体の欠損のある遺伝子を補償する。なぜなら、当該遺伝子が中枢神経系組織で発現される場合に、個体における疾病、疾患もしくは病気を緩和もしくは別の方法で治療するようはたらくタンパク質が産生されるからである。こうした遺伝子は、好ましくは分泌されるタンパク質をコードする。
導可能な、ならびに/もしくは組織特異的および分化特異的なプロモーターを包含するがしかしこれらに制限されない。構成的プロモーターは、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスプロモーターを包含するがしかしこれらに制限されない。加えて、ハウスキーピング遺伝子の発現を調節するもののようなハウスキーピングプロモーターもまた使用してよい。他のプロモーターは、神経膠線維酸性タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターのような、しかしこれらに制限されない、中枢神経系の細胞で優先的に発現されるものを包含する。加えて、遺伝子発現が誘導可能であるようなプロモーター/調節要素を選択してよい。例えば、テトラサイクリンで誘導可能なプロモーターを使用してよい(Freundlichら、1997、Meth.Enzymol.283:159−173)。
とができる。ストロマ細胞は30分ないし約3日以内でプラスチック表面に付着することができる。最低30分、好ましくは約4時間後に、付着されない細胞を除去しそして廃棄してよい。付着された細胞はストロマ細胞であり、これは当初、非分割性である。しかしながら、約2〜4日後に、この細胞は増殖することを開始し、そして標準的細胞培養技術を使用してそれらの数を増大させるように培養し得る。
;単離された非循環性のストロマ細胞が、最初に、それらを非循環細胞から複製する細胞に転換するのに十分な時間の期間の間培養され、それらがその後トランスフェクトされ、そしてその後投与されるか;もしくは、単離された非循環性のストロマ細胞が、最初に、それらを非循環細胞から複製する細胞に転換するのに十分な時間の期間の間培養され、それらがその後トランスフェクトされ、それらがその後培養され、そしてその後ヒトに投与されるかのいずれかである。いくつかの態様において、ストロマ細胞が単離され、トランスフェクトされそして直ちにヒトに投与される。
マ細胞は、単純注入などにより中枢神経系、すなわち脊髄に投与される。
Res.250:157−165に記述される。遺伝子構築物をストロマ細胞に導入した後、当該細胞を、直ちに、もしくはインビトロ培養の期間の後に免疫学的に単離し得る。ストロマ細胞は、それらが免疫学的に単離された後に埋込まれ得る。ストロマ細胞は、容易に入手可能な出発原料および/もしくは装置を使用するいずれかの数の公知の方法を使用して免疫学的に単離してよい。ストロマ細胞は、例えば、米国特許第4,391,909号、米国特許第4,806,355号、米国特許第4,942,129号および米国特許第5,334,640号に開示されるものを包含する多くのこうした微小被包化プロトコルを使用して微小被包化してよい。
くは、それらをマイクロビーズ中に被包化してよい。別の態様において、ストロマ細胞は、アミコン インク(Amicon,Inc.)(マサチューセッツ州ビバリー)から入手可能なもののような中空ファイバー中に含有される。これらのファイバーは、例えば、透析のためのカートリッジを作成するのに使用される。一端部は、その細胞により作成されるタンパク質の投薬量が減少されるべきである場合には皮膚の下から引き出され得そして大きさが減少され得る。当該ファイバーの表面積は非常に大きい。さらに、ファイバー中の細胞は定期的に洗い流され得そして置き換えられ得る。中空ファイバーは、アミコン
インク(Amicon,Inc.)の刊行物第323号の50〜51ページに記述される。
様においては5〜14日、いくつかの態様においては7〜10日、培養し得る。トランスフェクトされたストロマ細胞は、投与前に、3から30日、いくつかの態様においては5〜14日、いくつかの態様においては7〜10日、培養し得る。単離されたストロマ細胞は、トランスフェクション前に、3から30日、いくつかの態様においては5〜14日、いくつかの態様においては7〜10日、培養し得、そして、トランスフェクションに際して、投与前に3〜30日、いくつかの態様においては5〜14日、いくつかの態様においては7〜10日間、付加的に培養し得る。いくつかの態様においては、単離されたストロマ細胞は、トランスフェクション前に、4週ないし1年、いくつかの態様においては6週ないし10ヶ月、いくつかの態様においては3〜6ヶ月間培養される。トランスフェクトされたストロマ細胞は、埋込み前に、4週ないし1年、いくつかの態様においては6週ないし10ヶ月、いくつかの態様においては3〜6ヶ月間培養し得る。
組織−特異的方法でコラーゲンI用のヒト微小−遺伝子(mini-gene)を発現するトランスジェニックマウス系統からの細胞を使用して、培養で増殖する骨髄からの前駆間充織細胞が照射されたマウス中への静脈注入後に骨および他の結合組織の長期前駆体として機能しうるかどうかを測定した。標識遺伝子は短縮されたプロα1(I)鎖の合成をもたらすプロコラーゲンIのヒトプロα1(I)鎖をコードする内部欠失した微小−遺伝子からなっていた(Khillan et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:23373-23379; Pereira et al., 1983, J. Clin. Invest. 91:709-716; および Sokolov et al., 1993, Biochemistry 32:
9242-9249)。遺伝子を発現する細胞は、内因性マウス遺伝子に関連するヒト微小−遺伝子のコピー数が約100〜1でありそして内因性マウス遺伝子により発現されるmRNAに関連するヒト微小−遺伝子により発現されるmRNAの定常状態水準がマウス組織中で約0.5:1であるトランジェニックマウス系統から得られた。
で175cm2フラスコ中で4時間にわたる正常マウスからの骨髄のインキュベーションにより得られた6×105個の非−付着細胞と混合した。0.2〜0.4mlのα−MEMおよび10%ウシ胎児血清中の約7×105個の細胞の混合物を各々のレシピエント(recipient)マウスの尾静脈の中に注射した。
MSC類が増殖するが幹細胞−様の表現型を保有するようなMSC類の培養条件を試験した。表Iは、骨片を用いるMSC類の共培養が1週間後に得られた細胞数を増加させたことを立証するデータを与える。同時に、骨を用いる共培養は細胞中のアルカリ性ホスファターゼ(APase)水準を減少させ、それは細胞が骨芽細胞へ分化しなかったことを示唆する観察結果である。また、タルタレート(tartarate)−耐性の酸ホスファターゼ(TRAP)の水準における減少もあり、それは細胞が骨芽細胞へ分化しなかったことを示唆する観察結果である。MSC類の二次培養でも同様な効果が観察された。従って、これらの結果は骨片を用いるMSC類の共培養がMSC類の増殖のための改良された条件を与えることを示唆する。また、培養された骨片の培地がサイトカイン類および培養中のMSC類の増殖のための成長因子の重要な原料であるかもしれない。
MSC類の感染用ウイルスを得るために、LNCZレトロウイルスベクター(Miller et al., 1989, Bio Techniques 7:980-990)を改質して、サイトメガロウイルス(pCMV)用のプロモーターがlacZ遺伝子の発現を誘発させた(図1)。ベクターはアンフォトロピック(amphotropic)ネズミパッケージング細胞系統(PA317)のに安定にトランスフェクトされた。構成ウイルスプロデューサークローンがG418選択により単離され、そしてクローンから得られた上澄み液がMSC類の感染用に使用された。MSC類の一次培養物(生後3日)に3日間連続して最高力価を有するプロデューサー系統から得られた新しい上澄み液を感染させた。5日後の細胞の染色は、細胞の約15−20%が典型的にlacZ遺伝子を発現したことを示した。感染細胞の数種の培養物を選択下でG418(0.44μg/mlの活性濃度)を用いて50日間放置した。回収された細胞のほとんどはlacZ遺伝子を発現し続けた。LNCZの改質も、lacZ遺伝子の発現がCOLA1遺伝子のプロモーターおよびCOL2A1遺伝子(pCOL2A1)のプロモーターにより誘発されるように構成された。lacZ遺伝子の発現はMSC類の一次培養物中で2種の構造zzを用いて好結果を伴って得られた。
MSC類をマウスから単離しそして引用することにより本発明の内容となる Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4857-4861 に記載された条件下で培養した。MSC類にレトロウイルスベクターを感染させるかまたは裸のDNAを用いてトランスフェクトして、ヒト成長ホルモン(hGH)、ヒト肥満蛋白質(Ob)、またはヒト因子IX用の遺伝子を発現するクローンを得た。lacZ遺伝子はレトロウイルスベクターを用いてマウスのMSC類中に好結果を伴って導入されているため、同一ベクターの変種が
使用される。同時に、MSCは電気穿孔法(Andreason et al., 1988, Bio Techniques 6:650-660; Toneguzzo et al., 1986, Mol. Call. Biol. 6:703-706)、リポフェクタミンおよび核注射(Mercer et al., 1992, In: Antisense Strategies, Ann. IV. Y. Acad. Sci. Biol. 660:209-218)を用いて安定にトランスフェクトされて、より大きい内因性遺伝子を使用することができる。さらに、レトロウイルスベクターの潜在的な欠点の一部は別の導入法を用いて回避される。
レトロウイルスベクターLNCXがこの構成体として使用される。構成体中の使いやすいクローニング部位が改質された構成体であるpRSV−lacZ、pCMV−lacZ、pCOL1/lacZおよびpCOL2−lacZを製造するために使用される(図1)。pCOL1プロモーターは、ヒトCOL1A1遺伝子の476bpのプロモーター、第一エキソンおよび大部分の第一イントロンを含有する1.4kb断片である。このプロモーターはトランスジェニックマウスでは無プロモーター形態のCOL2A1遺伝子を高度に組織特異的および成長特異的方法で発現することが示されている(Sokolov et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:9622-9629)。COL2A1プロモーターは、発現の組織−特異性を与える(Bradham et al., 1994, J. Cell Physiol. 158:61-68)ヒトCOL2A1遺伝子(Ala-Kokko et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14175-14178)からの1kb断片である。lacZ遺伝子はhGH遺伝子(ニコルス・ラボラトリーズ(Nichols Laboratories))、OB遺伝子(Considine et al., 1995, J. Clin. Invest. 95:2986-2988)またはヒト因子IX遺伝子(ジェネティック・セラピー・インコーポレーテッド(Genetic Therapy, Inc.)で置換される。
レトロウイルスベクタープロデューサー細胞系統
プロデューサー細胞系統を制定するために、アンフォトロフィック(amphotrophic)レトロウイルスベクターパッケージングネズミ細胞PA317を使用した。細胞を100mm皿の中でレトロウイルスベクターのpBR322領域中で切るScaIを用いる消化により線状にされた15μgのプラスミドDNAを用いる燐酸カルシウム沈澱工程(プロメガ(Promega))により20%集密度でトランスフェクトした。トランスフェクトから1日後に、G418(GIBCO/BRL))を培地に1mg/mlの活性濃度で加えた。ネオマイシン−耐性コロニーが随時7〜10日で現れそして機械リングを用いるクローニングにより単離された。クローンを膨張させそして個々のクローンを二重ウェルの直接染色によりlacZを発現する能力に関して試験した。陽性細胞により製造されるウイルスの力価は、6−ウェルマイクロリットル平板中で1個のウェル当たり3mlの培地を用いて且
つ4μg/mlのポリブレンの存在下で20%集密度まで成長させたHT−1080ヒト腫瘍細胞に対する50μlの培地の1回の添加により検定された。力価は、lacZ遺伝子の発現に関して陽性に染色したHT−1080細胞の数を測定することにより検定された。典型的には、力価は1×105〜1×106であった。
マウスMSC類の一次培養物を上記の通りにして製造した。3日後に、非−付着骨髄細胞を廃棄しそして新しい培地を加えた。細胞に次にレトロウイルスを4μg/mlのポリブレンの存在下でウイルス製造の最高力価を有する安定にトランスフェクトされたプロデューサー細胞からの1/4量の新しい上澄み液培地の添加により感染させた。感染をさらに2回毎日繰り返した。細胞を次にlacZ発現のために直接染色するかまたはより大きい皿に分けそして選択下で0.4mg/mlのG418(活性濃度)で放置した。一次培養物の約15〜20%はlacZに関して陽性でありそしてG418選択に耐えた細胞のほとんどがlacZに関して陽性であった。
MSC類の一次培養物を10%FBSを含有するα−MEMの中で10日間成長させた。トリプシン処理および軽いこすりとり後に、細胞を6−ウェル平板の中に1個のウェル当たり105個の密度で接種した。細胞を2日間成長させ、次にPBSで2回洗浄しそしてDNA−リポフェクタミン錯体を用いてインキュベートした。DNA−リポフェクタミン錯体は下記の通りにして製造された:6μlのリポフェクタミン(GIBCO/BRL)を200μlのα−MEM中の1μgのLNCZ DNAと混合し、室温で30分間インキュベートし、そして800マイクロリットルのα−MEM中にMSC類を含有する6−ウェル平板の1つのウェルに加えた。37℃における6時間のインキュベーション後に、DNA−リポフェクタミン錯体を10%FBSを含有する2mlのα−MEMで置換する。FBS−含有培地中の18時間のインキュベーション後に、細胞をlacZに関して染色するかまたはG418選択下に置く。陽性クローンが得られるが、明らかに細胞密度がG418選択後に低すぎるためにそれらはゆっくり成長した。この状況を回避するために、三種の方式を使用することができる:細胞をより高い密度で平板培養する;共培養細胞培養挿入物を生存クローン上に選択方法で早めに置きそして新しいMSC類または挿入物中の骨片を毎日の基準で入れて(表1参照)成長を刺激するのに必要な細胞因子を与える;G418を用いるその選択がトランスフェクトされなかった細胞の多くを殺した時に、lacZ遺伝子がチミジンキナーゼに関する選択的遺伝子で置換されているレトロウイルスLNCX(図1)の変種を感染させたMSC類を培養物に再接種する。従って、レトロウイルスで安定にトランスフェクトされたMSC類を使用して必要なサイトカイン類、成長因子、およびG418中の選択中にトランスフェクトされたMSC類の初期成長に必要な細胞相互作用を与える。レトロウイルスで感染した細胞をガングシクロビル(gangcyclovir)を用いる負の選択により次に除去してもよい。
核注射
核注射は一部の細胞をトランスフェクトする手段として非常に有効である。細胞を、微量注射用領域の輪郭を描く円で印がつけられた22×22mmカバースリップを含有する60−mm皿の中で平板培養した。細胞を0.1%CSを含有する培地の中で5日間インキュベートして、微量注射前の成長停止を誘発させた。これらの条件下で、細胞の8〜15%が5および6日の間の24時間にわたる連続的標識つけ中に[3H]チミジンを組み入れた。微量注射はエッペンドルフ(Eppendorf)微量注射器および市販のガラス毛管フェムトチップス(femtotips)を用いる微量操作器が装備されたザイス・アキシオベルト反転顕微鏡を用いて行われた。カバースリップの輪郭が描かれた領域内の全ての細胞(一般的には150−200)をDNAを有する核の中に10mMトリス緩衝液(pH7.6)中0.
01−10μg/μlの範囲の濃度で微量注射した。注射された細胞を次に膨張させそして上記の通りにして検定した。
MSC類を0.25%トリプシンおよび1〜5mM EDTAで5分間にわたり室温で処理しそして次にこすりとりにより回収した。細胞を4,000×gでの10分間にわたる遠心により造粒し、そして次にペレットを氷冷PBS(pH7.4)の中に再懸濁させることにより2回洗浄する。MSC類を0.8ml当たり2×106個の細胞に再懸濁させそして電気穿孔キュベット(0.4cm隙間)の中に試料を分けた。細胞を氷上で10分間インキュベートし、DNAを懸濁液(5−50μg)に加え、そして細胞をさらに10分間冷却する。細胞懸濁液を次に市販の器具(バイオラド・ジーン・パルサー(BioRad Gene
Pulser)、モデル1652076)を用いて外から加えられたDNAを保有する細胞の最高割合を与える経験的に決められたフィールド強度で電気穿孔する。MSC類に関する適切なフィールド強度を決めるために、0.25〜2.5kv/cmの範囲で滴定を行った。lacZ遺伝子(LNCZベクター)を導入しそして次に細胞を電気穿孔から48〜72時間後に染色することにより、電気穿孔効果を監視した。
hGH
市販のキット(GIBCO/BRL)を有する酵素結合された免疫吸収剤検定法を用いて6−ウェルマイクロリットル平板中で成長させた細胞のクローンからの培地を検定することにより、hGH遺伝子の発現を監視する。この検定では、0.1mlの2×希釈剤緩衝液がマイクロリットル平板の1つのウェル当たり加えられる。5分後に、0.1mlの試験サンプルを加えそして平板を37℃で30分間インキュベートする。ウェルを5回洗浄しそして1つのウェル当たり0.2mlの一次抗体を加える。サンプルを37℃で30分間インキュベートし、そして5回洗浄する。次に0−フェニレンジアミン基質を含有する0.2mlの基質緩衝液を加える。サンプルを室温で30分間インキュベートしそして反応を0.1mlの2N硫酸の添加により停止させる。サンプルの吸収は490nmで評価される。
細胞を細胞培地の蛋白質放射免疫検定法を用いてOB遺伝子の発現に関して検定する。ヒトOB蛋白質の一次抗体をウサギで、大腸菌発現システムで合成されそして均質となるまで精製された組み換え蛋白質に対して、成長させた。ヒト蛋白質はマウスに対して非常に同一性があり、従って、抗−ヒト抗体はマウス蛋白質と交差反応するはずである。そうしない場合には、短いマウスcDNA(619nt)が大腸菌内で発現され、蛋白質が精製されそして抗体が製造される。或いは、マウス配列を有する合成ペプチド類を購入しそしてこれらを使用して抗体を製造する。検定用には、組み換えヒトOb蛋白質にボルトンハンター(BoltonHunter)法により125ヨウ素で放射標識をつけ、その後にセファデックス(Sephadex)G−25を用いてゲル濾過精製する。得られた特異的活性は30μCi/μgであった。検定用のサンプル(0.2ml)を一次抗血清(1:2000希釈度)を用いて0.1%トリトン(Triton)X−100を含有するホスフェートで緩衝した食塩水の中で16時間にわたり4℃で0.4mlの合計量で予備インキュベートした。125I−Ob蛋白質(100μl中に担持された30,000cpm)を次に加えそしてインキュベーションをさらに24時間続けた。結合されたOb蛋白質(12±1%、非特異的結合1.4±0.1%)を0.1mlのヒツジ抗−ウサギIgG血清(カリフォルニア州、デービスのアンチボディーズ・インコーポレーテッド(Antibodies, Inc.)、0.1mlの正常なウサギ血清(GIBCO/BRL、メリーランド州、ガイセルスブルグ)、および0.1mlの10%ポリエチレングリコールの添加により免疫沈澱させた。管を15分間遠心し(2200rpm)、結合していない標識を傾斜しそしてペレット中の放射活性をパッカード(P
ackard)5000ガンマカウンター(イリノイ州、ダウネーズ・グロブ(Downers Grove))中で計数した。未知サンプル中のOb濃度をロッドバード(Rodbard)の非重量測定4パラメーター論理モデルを用いて計算した。この検定法の検出限度は0.39ng/mlである。検定中変動は12ng/mlでは11.6%であり、13.1ng/mlでは20.8%の変動であった。
市販のエリザ(ELISA)(アメリカン・バイオプロダクツ・カンパニー(American Bioproducts Company)を用いてhGH検定(上記)で使用されたものと同様な条件下で遺伝子コードつけ因子IXの発現を検定する。標準的曲線は1−50ng/ml-1でありそして感度の限度は1ng/ml-1であった。検定はマウス因子IXと交差反応しなかった。
ここに表示された実験は、培養されたMSC類が全身注入後に骨、軟骨および他の間充織組織の幹細胞−様前駆体として機能しうることを示した。従って、hGH、Ob蛋白質または因子IXを発現するMSC類を照射されたおよび照射されなかったマウスに注入して遺伝子の持続発現をインビボで評価する。
最初に、MSC類をマウスにここに記載された条件下で(生後3週間のマウス:300または700グレー(Gray)照射;腹腔内注射;1×106個のMSC;および2×108個の全骨髄細胞)。さらに、静脈注入を腹腔内と比較し、そして比較的低水準のX線照射が使用される。また、帝王切開により細胞を胚にも注入する。予備試験では、50μlの5×104ESを7個の13日目の胚の羊膜中に注射し、7個のうちの6個を生存幼体(pups)として移した。従って、MSC類のイントラウテリン注射は実行可能である。
hGHの有効なインビボ発現はマウスの成長速度を高めるはずでありそしてOb蛋白質の発現は飢餓を誘発するはずである。従って、処理されたマウスおよび対照同腹子の体重および寸法が監視される。
MSC類、hGHおよび因子IXの注入から1週間、1カ月、3カ月、5カ月、10カ月、および20カ月後にマウスの後眼窩叢から血液を得る。hGHおよび因子IXはエリザにより検定され、そしてOb蛋白質は放射免疫検定法で検定される。さらに、ヒト因子IXにおける測定可能な増加がエリザで得られる場合には、Smith et al. (1993) Mature Genet. 5:397-402 に記載された工程で生物学的に活性なヒト因子IXを検定する。この工程では、ヒト因子IXを最初に微量滴定ウェルの中でモノクローン抗体であるBGIX1を用いて捕獲しそして次に因子XIaにより活性化する。活性因子IXは、因子VIIIと組み合わされて、因子XをXaに転化させる。因子Xaは色素産生(chromogenic)基質であるS2765を分裂させて黄色生成物を生ずる。BGIX1−コーテイングされたマイクロリットル平板および因子VIIIはエルカテック・インコーポレーテッド(Elcatech, Inc.)(ノースカロライナ州、ウィンストン−サレム)から購入した。因子XIaはエンザイム・リサーチ・ラブス・インコーポレーテッド(Enzyme Research Labs, Inc.)(イリノイ州、サウスベンド)から購入した。
ris)、150mM NaCl、1%BSA、pH7.5;B、150mMトリス、5mM CaCl2、10mg/mlゼラチン、pH7.6;C、50mMトリス、10mM CaCl2、pH7.5;D、50mMトリス、150mM NaCl、pH8.4。等量の下記の原料を混合することにより因子VIII/X反応混合物を新たに製造した:因子VIII、緩衝液A中5U/ml;因子X、緩衝液中1U/ml;1−2581緩衝液A中34μg/ml;CaCl2、水中25mM;および燐脂質。血漿サンプルを緩衝液Aの中で希釈しそして100μlを各々の微量滴定ウェルに加えた。平板を室温で90分間インキュベートしそして次に緩衝液Bで5回洗浄した。100μlの因子XIa(緩衝液C中2μg/ml)を各々のウェルに加えた。37℃における30分後に100μlのS2765(緩衝液D中0.5mM)を各々のウェルに加えそして平板を室温で10分間インキュベートし、その後に酢酸を10%の最終濃度まで加えることにより反応を停止させる。バイオ−ラド微量平板読み取り器を用いて405nmにおける吸収を測定した。ヒトの正常な貯蔵血漿の希釈で作成された標準曲線は3−25ng/mlから線状であった。この検定はマウス因子IXと交差反応しなかった。因子IXに関しては、250ng/mlすなわち正常値の5%の水準が一般的に治療用であると考えられそして100〜150ng/mlが有利であると考えられる。
皮下拡散室の中に移植された細胞はヒト患者の治療で少なくとも2つの顕著な利点を有する:免疫応答が回避され、そしてマウス(Benayahu, 1989, J. Cell Physiol. 140:1-7)、ラット(Mardon et al., 1987, Cell Tissue Res. 250:157-165)またはウサギ(Friedenstein et al., 1987, Cell Tissue Kinet. 20:263-272)でカプセル中に移植された時には、明らかにそれらが血管新生を必要としない骨、繊維状組織または軟骨として残存するため(Benayahu et al., 1989, 上を見よ; Mardon, et al., 1987, 上を見よ; Owen et al., 1988, In: Cell and Molecular Biology of Invertebrate Hard Tissues, Wiley
Chicester, CIBA Foundation Symposium, 136:42-60; Friedenstein et al., 1987, 上を見よ)、それらは少なくとも6週間生存する(Wakitani, 1994, J. Bone and J.T. Surgery 76A:579-592)。
拡散室は市販の構成部品(ミリポア・コーポレーション(Millipore Corp.))から組み立てられそして上記のレポート(Benayahu et al., 1989, 上を見よ; Mardon, et al., 1987, 上を見よ)に記載されている。要するに、孔寸法を有する膜フィルターを2つのプラスチックリングの各々の一面にアクリロイド付着剤を用いて付着する。2つのリングを次に一緒に付着して室を形成し、寸法は9mmの内径および2mmの厚さ、約127mm3の容量である。104〜107個のMSC類を室の中に1つのリング内の孔を通して接種しそして孔を付着剤でコーテイングされた先が細くなったプラスチック栓で密封する。室をマウスに麻酔下で背中に皮下移植するかまたは腹腔内移植する。最初に、1つもしくはそれ以上の室を離乳したてのマウス(3週間)に挿入する。引き続き、室を生後1週間のマウスに挿入する。生後1週間のマウスでの実験用には、比較的小さい室をマイクロピペット用のプラスチックチップから切断された円形(5mm、内径)から製造する。
室の移植から1週間、1カ月、3カ月、5カ月、10カ月および20カ月後に後眼窩叢から血液を得る。血漿を上記の通りにしてhGH、Ob蛋白質および因子IXに関して検定する。
図2を参照すれば、拡散チャンバー(1)は、2つの端、第1の端(5)および第2の
端(7)をもつチャンバーバレル(3)を備えていてもよい。バレルは、非毒性手段によって一緒に確保される1個以上のリングをからなっていてもよい。チャンバーは、各端にフィルター、第1のフィルター(9)および第2のフィルター(11)を固定される。フィルターは、ファクターがチャンバーと哺乳動物体の間を通過できるように、ファクター、例えばタンパク質にとって多孔性である。フィルター孔径は、約0.25μm以下、好ましくは約0.1μmであってもよい。フィルターは、プラスチック、テフロン、ポリエステルもしくは強くて柔軟であり、そして化学的処理を受け付けない、いかなる不活性材料から作成されてもよい。フィルターは、また、より緊密に密閉できるゴムのガスケットにより位置を確保されている。場合によっては、チャンバーのバレル部分は、キャップ(示されていない)によってカバーされている開口部(13)をもっていてもよい。キャップは、それ自体密閉性のゴムの形式にネジが切られていて、そして開口部に固定される。かくして、チャンバー内容物中への細胞の挿入は、キャップを取り除くことによって開口部に近づき、そして普通の針および注射器を用いて細胞を挿入することによって実施できる。チャンバーは、すべての物質、例えば限定されるものではないが、プラスチック、テフロン、ルーサイト、チタン、もしくは哺乳動物にとって無毒であり、良好に許容しうる、いかなる不活性材料から作成されてもよい。さらに、チャンバーは、滅菌に耐えられなければならない。
ドナーMSCおよびアストロサイトの調製
ヒトMSC(Owen et al.,1988,in Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues,Ciba Foundation Symposium 136,Chichester,UK,pp.42−60;Caplan,1991,J.Orthop.Res.9:641−650;Prockop,1997,Science 276:71−74;Pereira et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.92:4857−4861;Pereira et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.95:1142−1147)は、年齢19〜46才の正常な男子および女子ボランティアの腸骨稜から採取された吸引物から増殖された。吸引物を、α−MEM/10%FBSにより1:1希釈し、そして密度勾配(Ficoll−Paque
Plus;1.077g/ml,Pharmacia,LKB Biotechnology Inc.,Piscataway,NJ)を通して1000Xgで30分間遠心した。上澄液および界面物を合わせた後、混合液を、α−MEM/10%FBSにより約40mlに希釈し、そして再び遠心した。核形成細胞、すなわちMSCが、α−MEM/10%FBS中、濃度1x107mlで懸濁され、そして細胞は、25cm2培養皿中に3X106/cm2でプレートされた。MSCを3日間培養し、そして非付着細胞を、培養物中の培地を交換することによって除去した。MSC培養が集密に達した後、MSCを、0.25%トリプシンおよび1mMEDTAによる37℃で3〜4分間のインキュベーションによってプレートからはがした。MSCを、1:2もしくは1:3希釈し、そしてMSC調製操作が3〜5継代繰り返された。第2の継代を開始する際に、血小板由来増殖因子(PDGF−AA;GIBCO/BRL,Grand Island,NY)5ng/mlを培地に添加した。
,IN)。骨の末端を切断し、そして骨髄を、注射器と針を使用してDMEM(GIBCO/BRL,Grand Island,NY)5mlを用いて押し出した。全骨髄細胞100〜200X106個を、DMEM/10%FBSの175cm2組織培養フラスコにプレートした。24時間後、非付着細胞を、培地を交換することによって除去した。細胞が集密に増殖するように、培地は2〜3日毎に交換された。細胞は、0.25%トリプシンおよび1mMEDTA存在下のインキュベーションによって前のようにはがされ、それに続いて細胞は、3〜4回継代され、次いで使用まで凍結保存された。
10ミクロン組織切片を、クリオスタットを用いて調製した。脳内の移植部位は、組織切片中の蛍光標識された細胞を顕微鏡的に同定することによって位置付けられた。凍結切片を、ゼラチン被覆されたスライドに付着させ、そして素早く5分間冷アセトンに浸漬し、そしてさらなる処理のために−20℃で保存した。チャンバースライド中の細胞は、アセトンで5分間固定された。免疫細胞化学試験は、室温で実施された。細胞および組織切片は、2%ヤギ血清および5%胎児ウシ血清を含有するブロッキング抗体により30分間処理された。コラーゲンおよびビメンチン(vimentin)の標識を必要とする実験では、細胞は、さらに、TritonX−100により30分間処理され、次いで、PBS中で洗浄された。1次抗体が、チャンバースライド中の細胞に1〜2時間適用された(表2)。これらの抗体は、組織切片の場合は、24時間適用された。使用された2次抗体は、FITCもしくはローダミンのいずれかにカップルされた種特異的IgGであった。
ヒト骨髄から得られるMSCは、プラスチックへのそれらの付着によって単離され、そして3〜5継代の間増殖された。図3に示されるように、PDGF−AAの添加は、細胞の増殖速度を増強した。したがって、PDGF−AAが、2〜5継代において細胞に添加されて、十分な数のヒトMSCが得られた。しかしながら、ラットMSCは、PDGF−AAの添加なしに十分に増殖した。また、アストロサイトも、プラスチック培養皿へのそれらの強固な付着によって単離された。アストロサイトは、約3週間の1次培養の後に収穫された。
MSCおよびアストロサイトが、ラット脳の線条体に最小の拡散圧を用いて注射された。5〜72日後に、ラットを殺し、そしてそれらの脳切片を得た。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された切片の試験により、ラットアストロサイトもしくはMSCのいずれの移植部位周辺にも有意な神経膠症がないことが示された(図5、パネルa)。蛍光標識された細胞は、容易に、脳切片において検出された。ラットアストロサイトは、先行技術において既に示されたように、容易に移植された(Andersson et al.,
1993,Int.J.Dev.Neurosci.11:555−568;Azizi,1996,Ann.Neurol.(前出)121:T236;Zhou et al.,1992,J.Comp.Neurol.317:145−155)。類似の結果が、ラットMSC(図5,パネルf)およびヒトMSC(図5,パネルb−e)を用いて得られた。表3に示されるように、約20,000〜42,000細胞が、回収された脳において存在していた。注射された細胞数は、100,000〜120,000の範囲であったので、注入されたヒトMSCの約20%が5〜72日後に回収された。さらに、30〜72日目に回収された注入ヒトMSCの数では、減少が見られた。ラットMSCの場合は、33,000細胞もしくは約30%が、注入後14日目に回収された(図5f)。
移植されたラットアストロサイトは、移植された神経幹細胞もしくは神経幹細胞の形質転換細胞系について見られる移動(McKay,1997,Science 276:66−71)と同じように、脳の層を通過して移動する(Andersson et al.,1993,Int.J.Dev.Neurosci.11:555−568;Zhou et al.,1992,J.Comp.Neurol.317:145−155)ことが、既に記述されている。本発明では、MSCが類似の様式で移動することを発見した。ドナー細胞は、反対側の皮質を含む、脳の多くの領域において見い出された(図6)。細胞は、それらが移動した部位に残存していた。もっとも濃い細胞濃度は、線条体中の吻尾側軸周囲および脳梁に沿って見い出された。大脳皮質中にはより少数の細胞しかなかった。標識細胞のクラスターは、検査された全時点における側頭葉域において一貫して観察された。72日目には、外にある皮質領域においてはより少数の細胞しか見いだされず、この観察は、30〜72日目の間の細胞数の明らかな減少と一致した(表3)。
切片の免疫染色は、HLA−ABCに対する抗体が使用された場合、移植されたヒトMSCが、また、脳全般において検出される(図6)ということを例証した。ヒトMSCは、移植前に、コラーゲンIに対する抗体により染色されるけれども(図7,パネルa)、同じ抗体による染色が移植後には見られなかった。かくして、MSCは、脳組織へ組み込まれた後、I型コラーゲンの合成を止めた。フィブロネクチンに特異的な抗体による細胞の染色は、移植前に観察され(図7,パネルb)、そしてまた、移植後5日目には観察されなかった(図7,パネルc)。
れてもよい。
濃度2X105細胞のヒトMSCが、濃度1X105細胞のラットアストロサイトとともに、MEMプラス30%FBS(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)からなる培地10ml中で同時培養された。ヒト細胞は、同時培養前にα−ヒトHLA−ABCにより蛍光標識された。同時培養5日後、ヒト細胞の約2%が、また、グリア繊維酸性タンパク質を陽性に染色した。グリア繊維酸性タンパク質は、初期アストロサイトに対するマーカーであるので、これらの結果は、ヒトMSCのフラクションが、ラットアストロサイトとの同時培養中にアストロサイトに分化したことを例証している。
b 細胞培養インサート(23mm;孔径3μm;Becton Dickinson)における骨片(大腿骨1/2および脛骨1/2)との同時培養。
c Matrigelでコーティングされたインサートによるbと同じ。
d 10日目の1次培養物が、0.25%トリプシンおよび1mMEDTAにより37℃で5分間脱着され、続いて静かに掻き取られた。1つのウェルからの細胞(2X105)が1:4希釈され、そして9.5cm2ウェルにおいて3日および6日目に培地を変えて7日間培養された。
e APアーゼおよびTRAPは、全タンパク質1mg当たりであった。
中枢神経系におけるニューロン細胞およびグリア細胞は、多能性脳室周囲(periventricular)前駆体から誘導される。骨髄ストロマ細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞および筋管に分化できる骨髄由来の多能性細胞のサブセットであり、そして若干のグリア細胞もしくはそれらの前駆体の起源になることもできる。
Neurosc.13:5203−5211;Anderson et al.,1993,Int.J.Dev.Neurosc.11:555−568;Sanberg et al.,1997,Nat.Med.3:1129−1132;Isacson et al.,1997,Nat.Med.3:964−969)。さらに、移植された細胞の多くは、宿主において生存しない。例えば、ブタ胎児からの中脳神経細胞が、パーキンソン病に罹っている患者に神経移植された後、7カ月目には、ドナー細胞の約0.1%が生存しているだけであった(Isacson et al.、1997,Nat.Med.3:964−969)。
本明細書の上に記述したように8から12週令のLewis/SsNHsdメスラット(Harlan−Sprague−Dawly)から脛骨および大腿骨を切り取ることを通して、ラットMSCを単離した。前記骨の末端部を切断した後、針とシリンジを用いて骨髄を5mlのDMEM(GIBCO/BRL、Grnad Island、NY)で抽出した。骨髄細胞全体(100−200X106)をDMEM/10%FBSに入っている175cm2の組織培養フラスコに塗布した。24時間後に前記培地を取り替えることで付着しなかった細胞を除去した。前記細胞が増殖して集密状態になることから前記培地を2から3日毎に取り替えた。前記細胞を0.25%のトリプシンおよび1mMのEDTAと一緒にインキュベーションすることで隆起させ(lifted)、3または4継代後、凍結貯蔵する。
前記細胞を仕切り付きスライド内で継代培養した後、抗体染色を行った。移植を行う24時間前にhMSCを1−10μg/mlのビス−ベンズアミド(Sigma Chemical Co.、St Louis、MO)と一緒にインキュベートすることで核の蛍光標識を実施した。この培養物をラットの脳に注入する1−2時間前に、この培養物を無菌緩衝食塩水で3回洗浄して0.25%のトリプシンと一緒にインキュベーションを1−3分間行うことで隆起させた。血清が20%入っている培地を添加することでトリプシンを中和した後、細胞を遠心分離で単離した。この細胞を血清が入っていないα−MEMに入れて1μl当たり約10,000個の細胞が入っているスラリーとして懸濁させた。
酸素中3%のハロタンを用いて、成長したSprague−Dawly白皮症ラット(200から300g)に麻酔をかけ、キシロジンが6mg/kgでケタミンが60mg/kgの混合物を筋肉内注射することで保持した。次に、ラットを立体定位装置に入れ、そしてブレグマの横3mmの所にバーホール(burr hole)を開けた。脳の表面から4から5mmの深さの所に位置する線条の中に約10μlの前記細胞懸濁液を30分かけてゆっくりと注入することを通して、前記hMSCを投与した。その傷を割り込み外科縫合で閉じた後、この動物を0.2mg/kgのBuprenorphineで処置することで回復させた。前記ラットをキシロジンおよびケタミンで深い麻酔下に置きながら、氷で冷却した燐酸塩緩衝食塩水に続いて3%の緩衝パラホルムアルデヒドそして次に10%のスクロースを用いた心臓内潅流を前記ラットに受けさせることで、このラットをと殺した。脳を取り出し、前脳を削り取った後、このサンプルを直ちに凍結した。
クリオスタット(cryostat)を用いて脳組織断片を10ミクロンの厚みで調製した。この組織断片内の蛍光標識細胞を顕微鏡で同定することを通して移植部位の位置を確かめた。凍結断片をゼラチン塗布スライドに付着させ、迅速に冷アセトンに5分間浸漬した後、さらなる処理および計数測定を行う目的で−20℃で貯蔵した。前記線条の吻側から尾側の範囲から切り取った8から10個の組織断片に存在する蛍光標識核の数を数えた。2人の試験者が断片を交互に用いることで前記手順を各脳に関して繰り返した。明瞭に標識されている核の数のみを数えた。死滅した細胞および破壊した細胞は、それを取り巻く組織内に青色がかった色が発生しそして核の染色が明確には起こらないことで特徴づけられた。植え込まれた生存細胞の数を推定する目的で、観察した数を断片の全数に外挿した。
前脳を機械的に分離させて小さい片にしそしてその結果として得た組織をジスペース(dispase)が2.4単位/mlでコラゲナーゼ(GIBCO/BRL、Grand
Island、NY)が45単位/mlの混合物に入れて37℃で15分間インキュベートすることを通して、ラット脳細胞の培養物を調製した。大きな孔のピペットを用いたフラッシュ洗浄(flushing)を5分間隔で行うことで前記組織を分離させた。この分離させた組織を遠心分離にかけて、その上澄み液を廃棄した。各脳から得た残渣をα−MEMに入れて懸濁させた後、α−MEM/10%FBSに入っている2個の175cm2培養フラスコに塗布した。培地を48時間後に変えそして培養物が集密状態になるまで約2週間に渡って4日毎に培地を変えることで、付着しなかった細胞およびくずを除去した。緩く付着した細胞を除去する目的で、集密状態の培養物に2.4単位/mlのジスペースを用いた処理を37℃で15分間受けさせた後、傾斜回転振とう装置を6−7rpmで用いた振とうを2時間受けさせた。脱離した細胞を廃棄した後、付着している細胞に新鮮な培地を加えて培養物を再びインキュベートした。次に、この細胞をトリプシン(0.5%)で隆起させた後、計数測定および免疫細胞化学染色を行う目的で仕切り付きスライドに入れて継代培養した。細胞の全数および蛍光標識核を有する細胞の分率を血球計数器で数えた。
仕切り付きスライドに入れた細胞をアセトンで5分間固着させた。免疫細胞化学を室温で実施した。細胞にヤギ血清が1%とウシ胎児血清が1%入っている適切な阻止抗体を用いた処理を30分間受けさせた。一次抗体を仕切り付きスライドに1から2時間加えた。用いた二次抗体はFITCまたはローダミンのいずれかに結合する種特異的IgGsであった。結果として蛍光標識された細胞を目で確認しかつ蛍光顕微鏡を用いて写真を撮った。
本明細書の上に記述したように、ラットおよびヒト両方のMSCは組織培養プラスチックにしっかりと付着することから、それらを全骨髄の吸引液から単離するのは容易であった(またCaplan、1991、J.Orthopaedic Res.9:641−650も参照)。図8に、ポリL−リシンを塗布したガラスカバースリップ上で培養したラットMSCを示す。この細胞はVimentinで非常に染まり、Nestinで中程度に染まり(細胞の40−60%)、そしてGFAPで若干染まり(細胞の1%)、神経S100蛋白質で若干染まりそしてp75神経成長因子レセプタ(p75NGFr)で若干染まった。同じ条件下で処理を受けさせたヒトMSCはVimentinに関して陽性であった。しかしながら、ヒトMSCの15サンプルを越えるサンプルを試験(約1x105細胞/サンプル)したが、GFAPに対する抗体で染まった細胞は全く確認されなかった。
であることを示唆していた(Zawada他、1998、Nat.Med.4;569−574)。移植後に脳が免疫反応の組織学的兆候を示すことも宿主動物が示す挙動が悪化することもなく前記細胞を多数安定に移植することができることは、hMSCをヒトの脳への移植で安全に用いることができると言った可能性を拡大するものである。
悪性濃腫瘍は、米国において毎年約15,000人に影響を与えかつ患者の90%を2年以内に死亡させる破壊的な病気である(Levine他、1989、In Cancer:principles and practice of oncology、Davita他(編集)(Lippincoff、Philadelphia)、1557−1611頁;Azizi他、1998、J.Neurovirol.4:204−216;Chung他、1998、Surg.Oncol.Clin.N.Am.、7:589−602;Liang他、1998、Curr.Opin.Oncol.10:201−206)。従って、現在、改良治療法を開発する試みが数多く取られている。本明細書に記述したように、ヒトの骨髄から得られる細胞のサブセット(subset)[間葉腫幹細胞または骨髄間質細胞(hMSC)と呼ぶ]をラットの脳に植え付けることができることを示した。このhMSCをラットの脳に注入すると、これは取り込まれた後、神経幹細胞が移行する公知路に沿って移行する。ヒトMSCは如何なる免疫反応も炎症反応も引き起こさず、3カ月後、その細胞の約15%を脳内で回収した。また、宿主ラットの脳から調製した星状細胞豊富培養物を分析した結果、植え付けた少量のhMSCが分化を起こして初期星状細胞(early astrocytes)になって、これがグリアの原線維
状酸性蛋白質を発現させることも示した。本明細書に記述したように、hMSCを骨髄から単離しそしてそれに遺伝工学処理を受けさせて外因性遺伝子を発現させるのは比較的容易なことから(また、Owen他、1988、In Cell nad Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues、Ciba Foundation Symposium 136、Chichester、UK、42−60頁;Caplan、1991、J.Orthop.Res.、9:641−650も参照)、それらは治療用遺伝子産物を脳に搬送するための魅力的な運搬手段であると見られる。
cells)としてhMSCを用いること、従ってそれをグリオームに局所的搬送される腫瘍毒性蛋白質の長期源として働かせる点にある。
2A:636−640)。
悪性グリオームに関して現在行われている治療は、主に、外科切除に続く放射線治療から成る(Levine他、1989、In Cancer:principles and practice of oncology、Davita他(編集)(Lippincott、Philadelphia)、1557−1611頁;Azizi他、1998、J.Neurovirol.4:204−216;Chung他、1998、Surg.Oncol.Clin.N.Am.7:589−602;Liang他、1998、Curr.Opin.Oncol.、10:201−206)。高い段階のグリオームの場合にはしばしば前記治療を化学療法と組み合わせている。そのような治療プロトコルによって患者の寿命を数カ月伸ばすことは可能であるが、悪性グリオームの再発率は90%を越えており、かつ手術後の生活の質も劣っている。最近、放射線治療の技術が向上し、例えばハイパーフラクショネーション(hyper−fractionation)、放射線の品質の改良、正常な組織に危害を加えない立体定位治療、および放射線増感物質の添加などによって、いくらかではあるが結果が改善されてきている。数多くの化学療法剤が試験されてきているが、その結果はあまり良くなかった(Levine他、1989、In Cancer:principles and practice of oncology、Davita他(編集)(Lippincott、Philadelphia)、1557−1611頁;Azizi他、1998、J.Neurovirol.4:204−216;Chung他、1998、Surg.Oncol.Clin.N.Am.7:589−602;Liang他、1998、Curr.Opin.Oncol.、10:201−206)。
最近、悪性疾患を治療するための分子標的および反応体としてFas(CD95/APO−1)およびFasL(CD95L)がかなりの注目を集めてきている(Trauth他、1989、Science 245:301−305;Nagata他、1995、Science 267:1449−1456)。Fasは、進歩してきているシトキンレセプタ系列の一員であり、そのような系列にはTNF−αおよびNGFのレセプタが含まれる。FasLはTNFに同族の細胞毒性シトキンであり、それは感受性標的細胞内でアポトーシス様細胞死滅(apoptotic cell death)を誘発する(Nagata他、1995、Science 267:1449−1456)。このFasL/Fas系はT細胞仲介細胞毒性、T細胞ホメオスタシスの調節および発生中の胸腺細胞選択に関係していると推定されている。膜結合FasLは細胞と細胞の接触によってそれの細胞毒性を及ぼし得るが、FasLのcDNAを移入させて可溶FasLを分泌させたCOS細胞の上澄み液にも有意な細胞毒性が確認されている(Rensing−Ehl他、1995、Eur.J.Immunol.25:2253−2258)。Fasに対する抗体はFasLレセプタを持つ細胞にアポトーシスを誘発する。前記抗体をnu/nuマウスに1回注入するとヒトB細胞腫瘍の迅速な後退が誘発された(Trauth他、1989、Science 245:301−305)。しかしながら、Fasに対する抗体を野生型マウスに投与すると肝臓内の細胞がアポトーシスを起こすことから致命的である(Ogasawara他、1993、Nature 364:806−809)。
ain Pathol.8:285−293;Gratas他、1997、Brain Pathol.7:863−869)。ただ1つの例外は内皮細胞であり、それらはインビトロにおいてFas抗体が誘発するアポトーシスに耐える(Weller他、1994、J.Clin.Invest.94:954−964)。それとは対照的に、FasおよびFasLは両方とも悪性グリオーム内に発現する(Weller他、1998、Brain Pathol.8:285−293)。理由は明らかではないが、FasとFasLの両方が同じグリオーム細胞内に存在しているとアポトーシスがもたらされない。しかしながら、FasのmRNAが全ての一次グリア芽腫内に検出されかつ二次グリア芽腫の約1/5に検出される。段階IからIVの星状細胞腫の系統的分析により、FasのmRNAのレベルと悪性腫瘍進行が相互に関係していることが示された(Weller他、1998、Brain Pathol.8:285−293)。Fas蛋白質の定量により、発現は主に大きな壊死領域を取り巻くグリオーム細胞内に観察されることが示された。
現在、数多くの悪性病の治療、例えば卵巣癌の治療(Bookman、1998、Semin.Oncol.25:381−396)または結腸直腸癌の治療(Kufer他、1997、Cancer Immunol.Immunother.45:193−197)で二特異的単鎖抗体(scFv)が探求されている。例えば、CD3とトランスフェリンレセプタの両方に特異的な二特異的scFvは、活性化マウス細胞毒性Tリンパ球がトランスフェリンレセプタ含有ヒト細胞を特異的に破壊するように再び導いた(redirected)(Jost他、1996、Molec.Immunol.33:211−219)。この二官能性反応体は数ng/mlの濃度で効果を示す(Jost他、1996、Molec.Immunol.33:211−219)。同様に、CD3と上皮細胞抗原の両方に特異的な二特異的scFvを調製して結腸直腸癌を治療することが行われた(Kufer他、1997、Cancer Immunol.Immunother.45:193−197)。また、腫瘍細胞に由来する膜結合IgMのイディオタイプとCD3の両方に特異的な二特異的抗体も調製された。そのような抗体はBCL1B細胞リンパ腫マウスの腫瘍をなくすことが示された(De Jonge他、1997、Cancer
Immunol.Immunother.45:162−165)。加うるに、すい臓癌細胞に見られる抗原とCD3の両方に結合する二特異的scFvも調製された(EGP2;上皮糖蛋白質−2 C017−1A抗原、KSA)。その結果として得られた蛋白質はインビトロにおいて腫瘍破壊の仲介で効果を示した(Helfrich他、1998、
Int.J.Cancer 76:232−239)。
EGFRに対する抗体がグリオームの治療で広範に研究され、段階I(Faillot他、1996、Neurosurg.39:478−483;Stragliotto,G.他、1996、Eur.J.Cancer、32A:636−640)および段階II(Snelling他、1995、Hybridoma 14:111−114)の両方の臨床試行で用いられた。この治療の理論的解釈は、EGFRを静脈内投与した後にEGFRが数多くのグリオーム細胞に豊富に存在しかつEGFRに対する抗体がグリオーム内に集中することが観察されたことを基にしている。このような観察を基にして、EGFRに対する125I標識モノクローナル抗体が調製され、そしてそれがヒトグリオーム細胞内に存在することが示された。また、予備的段階II臨床試行も実施され(Snelling他、1995、Hybridoma 14:111−114)、この試行では、EGFRに対する125I標識モノクローナル抗体がグリア芽腫多形(multiforme)を伴う60人の患者に全身投与された。
37−543;Okamoto他、1996、Br.J.Cancer 73:1366−1372;Wikstrand他、1998、J.Neurovirol.4:148−158;Schmidt他、1998、Int.J.Cancer 75:878−884)。数多くのグリオーム細胞に見られるEGFRをより特異的に標的にするそのような抗体を用いた臨床的試行を開始することにかなりの興味が持たれている。このような実験は悪性グリオームのより有効で安全な治療を与える可能性がある。
可溶形態のFasLをコード化して発現させる遺伝子を有する細胞を生じさせる目的でCOS細胞の移入を実施し、この細胞が可溶なFasLを分泌したことで、この移入は成功であった。図12は、可溶(端が切り取られた)FasLをコード化するcDNAを移入させたCOS細胞が可溶FasLを合成して分泌することを立証するウエスタンブロットアッセイの画像である。前記cDNAはプラスミドpSecTag2/Hygに含まれていた(Invitrogen、Carlsbad、CA;本明細書に示す遺伝子構造物のデザインおよび合成の実施例10を参照)。前記細胞にリポフェクタミンを用いた過渡的移入を受けさせて、Rensing−Ehl他が記述した如きウエスタンブロッティングによる定量を受けさせた(Rensing−Ehl他、1995、Eur.J.Immunol.25:2253−2258の図2を参照)。レーン1は、移入を受けさせて2日間インキュベートした細胞(2mlの培地中約5x105)から得た細胞溶解産物(14μgの蛋白質)を示している。レーン2:レーン1と同じであるが4日間のインキュベーション後である。レーン3:見せ掛け移入を受けさせ(mock transfected)て4日間インキュベートした細胞から得た細胞溶解産物。レーン4:移入を受けさせてインキュベーションを1日行った後の細胞から得た培地(18μl)(濃縮を受けさせていない)。レーン5:レーン4と同じであるが2日間のインキュベーション後である。レーン6:レーン4と同じであるが4日間のインキュベーション後である。レーン7:見せ掛け移入を受けさせて4日間インキュベートした細胞から得た培地。レーン4から7に含まれる拡散した白色の帯は、培地サンプルに含まれる大濃度のアルブミンであり、これがウエスタンブロットの背景を減少させている。
脳組織に含まれるグリオーム細胞を殺す時に用いられるグリオーム毒性蛋白質がhMSC内に生じるようにhMSCに移入を受けさせることの可能性を立証する目的で下記の実験を実施した。この実験の結果を下記の如く図13に示す。図13a−dは、可溶FasLをコード化するcDNAを過渡的に発現させるCOS細胞から得た培地が293細胞(Fas+)の増殖を抑制しかつ殺すことを示す1組の顕微鏡写真の画像である。移入を受けさせて移入後48時間の時のCOS細胞から得た1mlの培地に加えて1mlの新鮮な培地を約5x105個の293細胞と一緒にインキュベートした。3日間のインキュベーションの時の293細胞を示す。この処理によって生存可能細胞が90%を越える度合で減少した。図13aに、見せ掛け移入を受けさせたCOS細胞から得た1mlの培地と一緒にインキュベートした対照の293細胞を示す。図13bに、可溶FasLを発現させるCOS細胞から得た1mlの培地と一緒にインキュベートした試験293細胞を示す。位相差倍率はx100であった。図13cおよび13dに、図13bと同じであるが倍率を高くしてx200にした時の培養物を示す。細胞の外観は、それらはアポトーシス性(apoptotic)であることを示唆している。
マウスおよびヒトMSCが試験外因性遺伝子を発現するようにそれに遺伝工学処理を受けさせることができることを示す目的で、試験的遺伝子であるチロシン水酸化酵素を用いた実験を実施した。図14および15に、このような実験の結果を示し、これは、マウスおよびヒトMSCが試験外因性遺伝子であるチロシン水酸化酵素を発現するようにそれに
レトロウイルスベクターを用いた遺伝工学処理を成功裏に受けさせることができることを立証している。図14は、試験遺伝子(チロシン水酸化酵素)を含有するレトロウイルス(pLNCX)を用いて形質導入を受けさせたラットMSCのウエスタンブロットの画像である。レトロウイルス形質導入の条件は本明細書の実施例10に記述する如き条件であった。細胞溶解産物およびチロシン水酸化酵素の抗体を用いてウエスタンブロットアッセイを実施した。レーン1:MWマーカー。レーン2−5:形質導入を受けさせたMSCの細胞溶解産物(5または10μgの蛋白質)。レーン6:形質導入を受けさせていないMSCの細胞溶解産物。レーン7:対照細胞(293)の細胞溶解産物。図15は、試験cDNA(チロシン水酸化酵素)を含有するレトロウイルスを用いて形質導入を受けさせたヒトMSCが産物(L−DOPA)を合成および分泌することを示すグラフである。前記細胞を必須補助因子である50μMのテトラヒドロプテリジンと一緒にインキュベートした後、前記培地内に生じたL−DOPAをHPLCで定量した。対照MSCから得た培地には全くL−DOPAが検出されなかった。
本明細書の実施例9に報告するように、ヒト骨髄から得たhMSCをラットの脳に植え付けると、これは神経幹細胞の移行で知られる路に沿って移行する(図16)。より最近になって、星状細胞が豊富な培養物を宿主ラットの脳から調製した時に培養物に含まれる少量のヒト細胞を回収することができることを見い出した。更に、より少ない量のヒト細胞が初期星状細胞の形態を取っていてグリアの原線維状酸蛋白質、即ち初期星状細胞のマーカーを含有している(図10)。表4に示すように、骨髄移植を受けさせたラットから得た脳断片を評価した結果、120日後でもヒト細胞の15%が存在することが示された。ラットの脳から得た星状細胞豊富培養物の評価を行った結果、その培養物に含まれる細胞の約5%がヒト細胞であることが示された。この培養物に含まれるヒト細胞の約1%がグリアの原線維状酸性蛋白質の抗体で明確に染まる(表5)。この細胞のいずれもED−1に対する抗体で明確には染まらず、従って前記ヒト細胞は小グリア細胞ではなかった。
他の実験において、マウスの骨髄間質細胞(mMSC)をマウスから調製して、7日令の新生児マウスの脳に注入した。脳室の胚ゾーンに前記mMSCを約50,000個注入した。核に前以てビス−ベンズアミド(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)による標識を付けておくことで供与体細胞の検出を行った。12日および45日後に供与体細胞を注入部位の所で回収したが、hMSCを用いたラット実験の場合と同様に、それらはまた脳の大きな領域に移行することも確認した(図16)。倍率をより高くすることで、前記細胞は線形隊列の状態でそれら自身が配列することを見ることができ、外包、脳梁、前交連、前面海馬交連内の白色物跡に沿って移行しかつ線条の繊維束に沿って移行すると見られる(図16および17)。それらはまた反対側半球の線条内にも見られた。本明細書に記述するように、脳の凍結断片に含まれる蛍光核の数を数えることで、12日後にと殺した1匹のマウスおよび45日後にと殺した別のマウスの脳に存在する細胞の数を推定した。表6に示すように、新生児マウスの脳が成長するにつれて
供与体細胞の数が約40倍増加した。成熟したマウスの脳に含まれるDNA含有量を定量した結果、それに含まれる細胞の数は約108個であることが示された。従って、45日目の供与体細胞は脳の全細胞の約2%に相当していた。
Fas、FasLまたはEGFRをコード化するmRNAをhMSCが含有するか否かを測定する目的で、hMSCから得た32P標識ポリA RNAをドットブロットアッセイで用いた。hMSC中にはFas、FasLまたはEGFRに特異的なmRNAを検出することができなかった(データは示していない)。このような結果を立証する目的で、mRNAに関するRT−PCRアッセイを実施した。図18に示す結果は、低いレベルではあるがFasLに特異的なmRNAが検出されはしたがFasに特異的なmRNAが存在する証拠は全く見られないことを示している。
ラットの脳の片側に存在する大脳半球の白色物と灰色物の連結部の縁にC6ラットグリオーム細胞(約100,000)を注入した。2週間後、凍結断片を調製して、ヘミロトキシンおよびエオシンによる染色を受けさせた。図19に示すように、前記C6グリオーム細胞はラットの脳に成功裏に植え込まれた。図19は、グリオームの縁の輪郭がいかに鮮明であるかを示しておりかつ異様な核を有するグリオーム細胞が時折見られることを示している。
これらの実験の全体の方法は以下のとおり略述することができる。
FasLは本発明で使用するのに好ましい遺伝子である。何故ならば、a)可溶性FasLは悪性グリオーマ細胞においてアポトーシスを誘発するが、CNSの正常細胞においては誘発しないことが示され(Weller et al.,1994,J.Clin.Invest.94:954−964; Weller et al.,1995,Cancer Res.55:2936−2944; Frei et al.,1998,J.Neuroimmunol.87:105−113; Weller et al.
,1998,Brain Pathol.8:285−293)、(b)細胞毒性可溶性FasLがここにおいて遺伝子トランスフェクションされたCOS細胞により分泌され、従って、hMSCsは可溶性FasLを分泌する細胞を発生するための遺伝子工学的を受けやすいようであり、c)hMSCsは低いレベルのFasLmRNAを発現しそしてFasmRNAを発現しない(図18)。従って、hMSCsはより高いレベルのFasLを合成及び分泌するように一旦遺伝子工学的に操作されるとアポトーシスを受けないようであり、d)hMSCsを局所的に注入(infusion)及びエングラフトメント(engraftment)して可溶性FasLを分泌することに基づく治療は全身系毒性(systemic toxicity)を回避するが長期のタンパク質のソースを与えるからである。これらの実験は、hMSCsにおけるFasLの発現及びそれからのFasLの分泌が、単純ヘルペスチミジンキナーゼ(herpes simplex thymidine kinase)(Uckert,1998,Hum.Gene.Ther.9:855−865)のような自殺遺伝子の細胞中の存在又はテトラサイクリン感受性プロモーター(Steinmann et al.,1998,Arch.Vitrol.143:3548)のような条件プロモーター(conditional promotor)により調節されうる、その後の実験のための基礎も与える。
グリオーマ毒性遺伝子としてEGFR及びCD3にたいして特異的な二重特異性scFvは本発明における使用のための1つの好ましい構築物(construct)である。何故ならば、(a)それにより発現されたタンパク質は他の悪性疾患(malignancy)を処理するのに使用されておりそして有望な結果が得られ(Kufer et al., 1997,Cancer Immunol.Immunother.45:193−197;De Jonge et al.,1997,Cancer Immunol.Immunother..45:162−165; Bookman,Semin.Oncol.25:381−396; Helfrich et al.,1998,Int.J.Cancer 76:232−239; Jost et al.,1996,Molec.Immunol.33:211−219)、そして(b)この遺伝子の使用は末梢組織に適用可能であると同様にCNSに適用可能である。その理由はTリンパ球がCNSの病理学的変化中に増加した数でCNSに現れ(Hirschberg et al.,1998,J.Neuroimmunol.89:88−96)、そして更に活性化されたT細胞の注入(infusion)はいくらかの患者において有利であった(Haynes et al., Cancer 76:840−852)からである。この遺伝子は上記した如き自殺遺伝子又は誘導性プロモーターを使用して二重特異性scFvの産生を調節するために更に精製することができる(Uckert,1998,Hum.Gene.Ther.9:855−865; Steinmann et al.,1998,Arch.Virol.143:3548)。
このグリオーマ毒性遺伝子も好ましい。何故ならば、a)この遺伝子の使用の潜在的な危険及び実行可能性についての多数の情報がEGFRに対して特異的な125I標識モノクローナル抗体を使用して最近のII期臨床実験(current phase II clinical trial)において既に得られており(Snelling et al.,1995,Hybridoma 14:111−114; Faillot et
al.,1996,Neurosurg.39:478−483; Stragliotto,Eur.J.Cancer 32A:636−640)、b)エングラフテッドトランスフェクションされた(engrafted transfected)hMSCsを使用してEGFRに対するscFv抗体を分泌させ、続いて125I標識抗体をマウスscFvに投与するこの二段階方法は、最近使用されるEGFRに対するモノクローナル
125I標識抗体より更に特異的な治療を与えるはずてあり、そしてc)このタンパク質の使用は、特異性がEGFRに対するマウスscFvの結合及びマウスscFvに対する125I標識抗体の結合の両方において達成されるので、EGFRvIIIに対する125I標識抗体の使用よりも更に特異的であるらしいからである。
FasL構築物の場合に、プラスミド(pBL−KA15)におけるラットFasLcDNAはSuda et al.,(1933,Cell75:1169−1178)に記載されている。遺伝子の細胞外領域(ATG+nt371〜910;Suda et al.,1933,Cell75:1169−1178))をPCR増幅させ、そして配列をクローニングする。次いでcDNAを、Igκ鎖分泌シグナル、CMVプロモーター、myc tag、及びハイグロマイシン耐性遺伝子を含む分泌ベクター(pSecTag2/Hygro:Invitrogen,Carlsbad,CA)に移す。次いでフランキング遺伝子(flanking gene)を含む配列を標準レトロウイルスベクター(pLNCX:Clon Tech Inc,Palo Alto,CA)に移す。
レトロウイルストランスフェクションのために標準プロトコルを使用する。条件は、マウスMSCsを安定にトランスフェクションするのに使用された条件に匹敵し、そして他の人がhMSCsを安定にトランスフェクションするのに使用沙汰条件に匹敵する(Gordon et al.,1997,Hum.Gene Ther.8:1385−13
94;Chuah et al,1998,Hum.Gene Ther.9:353−365;Bulabois et al.,1998,J.Hematother.7:225−239)。ベクターを両種指向性ネズミパッケージング細胞系(amphotropic murine packaging cell line)に安定にトランスフェクションする(Retro−Pack;PT67;Clon Tech,Inc.Palo Alto,CA)。構成ウイルス産生体クローン(constitutive virus producer clones)をG418又はハイグロマイシンによる選択により単離し、ウイルス力価(virus titers)をNIH−3T3細胞上でアッセイする。高い力価のクローンの上清を使用してhMSCsを感染させる。一次培養物を引き続く三日感染させ、そして細胞を5〜14日間選択下に置いて、安定に発現するクローンを得る。
hMSCsの単離の方法は実施例9に上記したとおりである。この方法を3〜15回(passages)繰り返す。同様な条件を使用して、ヒトドナーからの椎体から得られたhMSCsを単離しそして増殖する(expand)。
下記の条件を使用してhMSCsの骨芽細胞への分化をアッセイした。hMSCsを完全培地において70〜90%集密性となるように培養した。培地を骨形成培地(osteogenic medium)(完全培地、10-8Mデキサメタゾン、0.2mMアスコルビン酸;Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)及び10mMβグリセロールリン酸(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)で3日毎に置き換えた。鉱物の付着は通常2〜3週間後に観察された。培養物をPBSで洗浄しそして氷冷70%エタノールの溶液中に1時間固定してアリザリンレッド(AR−S)で染色し、そしてカルシウム鉱物含有率を定量した。培養物をMilli−Q精製水(Milli−Q purified water)で洗浄しそして回転させながら40mMアリザリンレッド−S、pH4.2(1ml/35mmプレート)で10分間染色した。次いで培養物を水で5回洗浄し、続いてPBSで15分間洗浄して(回転を伴って)、非特異的AR−S染色を減少させた。染色された培養物を撮影し、続いて10mMリン酸ナトリウム中の10%w/vセチルピリジニウムクロリド(CPC)、pH7.0を使用して室温で15分間定量的抽出処理した。これらのAR−S抽出物のアリクォートを10%CPC溶液中で10倍希釈し、AR−S濃度を分光光度計で562nmにおける吸光度測定により決定した。値を結合染料(Hoechst33258、Hoechst Marion Roussel,Kansas City,MO)によりアッセイされた全DNA含有率について正規化した。
他の人々により広く使用されてきた標準プロトコルをこれらの実験で使用するが、培養物に潜在的腫瘍毒性試薬(potentially tumor toxic reagent)を加える代わりに、腫瘍毒性タンパク質を分泌するように工学的に処理されたhMSCsを加える。
β−ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子が挿入されている及び挿入されていないラットC6グリオーマ細胞(Rat C6 glioma cells)及びヒトT98Gグリオーマ細胞(human T98G glioma cells)はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)から得られた。更に、確認された病理学的診断を有する13ヒトグリオブラストーマ多形腫瘍(human glioblastoma mult
iform tumors)の一次培養物を使用のために製造した。使用することができる追加のグリオーマ細胞系LN−18、LN−215、LN−229、LN−308、LN−319及びLN−405はWeller et al.,(1995,Cancer
Res.55:2936−2944)に記載されている。
Frei et al.(1998,J.Neuroimmunol.87:105−113)に記載の条件の如き標準アッセイ条件を使用する。1:10,000〜1:1の範囲のhMSCs対ヒトグリオーマ細胞の割合を使用する。hMSCsを殺すことはグリオーマを殺すことから区別される。これは前記したようにビス−ベンズアミド(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)によるいずれかの細胞タイプの先の核標識(prior nuclear−labeling)による。scFv抗EGFRを分泌するhMSCsの効果を評価するために(図11の方法III)、より複雑なアッセイを使用することができる。scFv抗EGFRを分泌する細胞の効果を、マウスscFvに対する125I標識ウサギIgGを添加して及び添加しないで検査する。125I標識IgGは、細胞混合物のインキュベーションの開始の12又は48時間後に0.039〜20μCi/mlの濃度で加える(Reist et al.,1995,Cancer Res.55:4375−4382)。抗マウスscFvの細胞結合を、Reist et al.(Reist et al.,1995,Cancer Res..55:4375−4382)により述べられたようにFITCtag及び免疫蛍光顕微鏡検査法及び放射能標識を使用して評価する。scFv抗EGFRを分泌するhMSCsはアポトーシスについてはアッセイされない。何故ならば125Iは単独で染色体損傷を引き起こすからである。
%死滅=100%−%生存
を使用して計算される。
濁させる。次いで培養プレートを冷蔵庫(4℃)に15分間移し、次いで室温に10分間移し、次いで37℃の培養物インキュベータ(culture incubator)に移した。試験された各腫瘍及びサンプルについて再現培養物(duplicate cultures)を調製した。4〜7週間のインキュベーションの後、コロニーをニュートラルレッドで染色しそして倒立顕微鏡を使用して計数する。30より多くの細胞を含むクローンをコロニーとして数え、そして30未満の細胞を含むクローンはクラスターとして数える。ニュートラルレッド取り込みも測定する。コロニーを染色する前に、アガロース培養物を0.1NHClで注意深く洗浄する。ニュートラルレッド溶液(3.3mg/ml:Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を0.2NHCl中の0.1%で使用し、そしてコロニーを室温で15分間インキュベーションする。次いでコロニーを0.1NHClで注意深く2回洗浄し、そしてニュートラルレッド陽性コロニーを上記の如くして計数する。平板培養効率は、下記式
%平板培養効率=[成長コロニーの数/平板培養細胞の数]×100
を使用して計算する。
Manheim,)を始める前に、細胞を2回洗浄する。TUNEL反応混合物(50μl)は、0.3ナノモル(nmol)FITC−12dTP、3ナノモルdATP、25単位のTdT及び塩化コバルトを含有する。陰性対照反応は塩化コバルトを省くことにより行われる。反応を37℃で1時間行い、そして2μlの0.5MEDTAの添加により中止する。細胞をPBS中で1回洗浄しそしてエピックス・プロフィル・アナライザー(Epics profile analyzer)を使用して分析する。
この節においては、他の人々により広く使用されている標準プロトコル(Barba et al.,1993,J.Neurosurg.79:729−735)を使用するが、様々の量の遺伝子工学的に処理されたhMSCsを、グリオーマ細胞がラットの脳に注入された後0〜14日の種々の時点で注入する点が変えられている。
本明細書で前記したのと本質的に同じプロトコルを使用して脳腫瘍を発生させる。成熟スプレーグ・ドーリー・アルビノラット(Adult Sprague Dawley albino rats)(200〜300g)を酸素中の3%ハロタンを使用して麻酔し、6mg/kgキシロジン及び60mg/kgケタミンの混合物の筋肉内注入により維
持する。ラットを定位(stereotaxic)装置に入れ、そして2つのバーホール(burr holes)を、ブレグマ(bregma)に対して3mm側方に(lateral)及び2mm前方に(anterior)作る。グリオーマ細胞懸濁液約10μl(50,000〜75,000)を、大脳半球の白灰質及び白質接合部(grey and white matter junction)の縁(margin)に、30分間にわたり各部位にゆっくりと注入する(infused)。切開部(wound)を中断外科縫合糸(interrupted surgical sutures)で閉じ、そして動物を0.6mg/kgのキシロジン及び6mg/kgのケタミンで処理する。0〜14日後の範囲の時点で、遺伝子工学的に処理されたhMSCs10μl(10,000〜100,000細胞)を1つの部位に注入し、そして第2腫瘍部位への野生型hMSCsの同じ注入を行って対照として使用する。ラットを傾眠(lethalgy)及び不全麻痺(paresis)の神経学的症状について毎日検査する。ラットを14〜21日後に殺し、そのとき対照C6グリオーマは直径6〜10mmである。ラットをキシロジン及びケタミンで麻酔し、次いで氷冷リン酸緩衝液、続いて3%緩衝パラホルムアルデヒド及び10%スクロースを心臓内に(intracardially)灌流する(perfused)。脳を取り出し、前脳を刈り込み(trimmed)、そしてサンプルを直ちに冷凍する。
グリオーマの減少又は処理において遺伝子工学的に処理されたhMSCsの有効性は、(a)腫瘍容積の立体学的分析、(b)ラットの長時間の生存、(c)脳の順次の切片(serial sections)における蛍光的に予備標識されたグリオーマ細胞又はhMSCsの計数及び(d)脳からの核の単離及び蛍光的に予備標識されたグリオーマ核の計数、により測定される。本発明で製造される組換えタンパク質は免疫組織学により検出することができる。
この評価は、前述のプロトコル(Barba et al.,1993,J.Neurosurg.79:729−735)を使用して行われる。ラットを殺しそして4%パラホルムアルデヒドで灌流する。個々の脳を採取し、4%パラホルムアルデヒド中に24時間置き、次いで4℃で30%スクロース中に飽和するまで保存する。脳を40μm切片(sections)を使用して順次に切断し(serially sectioned)、すべての第5の切片を取り付けそしてNissl染色で処理して腫瘍鑑定を助ける。腫瘍組織を有する染色された脳切片(every fifth serial 40μm section)を検査しそして腫瘍容積を立体学的に定量する。すべての第5の順次の40μm切片を検査することにより、脳の各100μm切片が腫瘍の存在について走査される。脳内の腫瘍の全容積は、校正されたドットマトリックスグリッドオーバーレイ(dot−matrix grid overlay)から腫瘍の上のグリッドドットを計数することにより顕微鏡により定量される。各ドットにより表される容積は、各ドットにより覆われた面積に各スライスにより表される脳の厚さを乗じた積として計算され、そして全腫瘍容積は個々の脳切片において測定された腫瘍容積の和として計算される。腫瘍容積はグラフの形態でプロットされ、そしてマン−ホイットニー(Mann−Whitney)のU検定ノンパラメトリック統計分析(U−test nonparametric statistican analysis)により比較される。
これらの実験(Barba et al.,1993,J.Neurosurg.79:729−735)は、グリオーマ細胞が1つの部位のみに注入され、続いて遺伝子工学的に処理された又は野生型のhMSCsが同じ部位に注入されるラットを使用して行われる。ラットを90日にわたり評価する。動物を毎日観察し、死亡の日を記録し、そして腫
瘍の存在を組織学的に証明する。結果を生存率曲線としてプロットする。
グリオーマ細胞もしくはhMSCのいずれかを、本明細書に既に記述されたとおり脳への注入前に1μg/mlのビスベンズアミドで24時間前標識する。ラットを殺し、そして上述されたとおり灌流する。脳をイソペンタン−ドライアイス中で凍結させ、そして10μmの切片を調製する。凍結された切片をゼラチン被覆されたスライドガラスに付着させ、そしてすばやく冷アセトン中に5分間浸積し、そしてさらなる処理のため−20℃で保存する。蛍光で標識された細胞を、蛍光顕微鏡を使用して可視化しそして写真撮影する。蛍光で標識された核の数を、線条体の頭側から尾側の限界までで切断された8〜10個の組織切片中で計数する。この処置を、交互の切片を使用する2名の研究者により各脳で反復する。明瞭に標識された核のみ計数する。死んだ細胞および溶解された細胞は周囲組織中に帯青色を残し、そして明瞭な核染色を残さない。観察された数を切片の総数に外挿して、生存する植え付けられた細胞の数を推定する。
hMSCにより分泌されたグリオーマの毒性タンパク質を検出するため、脳を、それらをイソペンタン−ドライアイス(−22℃)中に置くことにより急激に凍結させ、薄片に切断し、そして切片を冷アセトン中で固定する。当該切片をその後、ヤギ抗ラットFasL(サンタ クルズ(Santa Cruz))もしくはヤギ抗マウスIgG(ジャクソン(Jackson))のような一次抗体で染色する。これらの抗体はジャクソン ラブス(Jackson Labs)(フィラデルフィア州チェスター)から得ることができる。二次抗体は適切なFITC標識された抗体(シグマ ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Co.)、ミズーリ州セントルイス)である。
として挙動する
幹細胞は自己再生し、そして多数の、しかし異なる細胞系譜に分化することができる子孫をつくる能力が特徴である。初期胚から派生した幹細胞はすべての体細胞型に分化することができるが(Evans and Kaufman,1981,Nature 292:154;Martin,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:7634;Pederson,1994,Repord,Fertil.Dev.6:543)、成体の組織に由来するものはそれらが存在する組織に特徴的な細胞系譜のみを生産すると考えられている。例えば骨髄に存在する造血幹細胞は、血液要素のみを生じる(Morrison,1994,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.11:35)。また幹細胞はそれらの分布が成体組織に限られ、そして骨髄、消化管、生殖巣、皮膚および脳に見いだされるだけである(Hall and Watt,1989,Development 106:619;Morrison et al.,1977,Cell 88:287)。後者の場合は、近づけないことがこのような幹細胞を中枢神経系疾患の処置に利用することを制限している。
マウスMSCカルチャーをメスのFVB/N マウスの骨髄から樹立し(ジャクソン ラボズ(Jackson Labs)、バー ハーバー、メリーランド州)、そして7〜10日間培養した(Phinney et
al.,1999,J.Cell.Biochem.72:570)。免疫細胞化学のためには、1-ウェル チャンバースライド(ファルコン:Falcon)で培養した細胞を、PBSで洗浄し、風乾し、氷冷アセトン中で2分間固定し、再度風乾し、そして次にギムザで染色するか、またはラット抗-マウスCD 16/CD32(ファミゲン:Pharmigem Fc ブロック)と、1:50希釈で30分間、次にビオチン化CD11b抗体(ファミゲン)と1:200希釈で、そして最後にFITC-結合抗-ビオチン抗体(ダコ:Dako)と1:100希釈でインキューベーションした。スライドはエチジウムブロマイドでカウンター染色した。
に結合したアビジンを被覆した常磁性ビーズ(PGC)のスラリーとインキューベーションした。ビーズの終濃度は0.05mg/mlであり、そして抗体対ビーズの比率は、10μg/mgであった。ビーズに結合しない細胞を回収し、α−最小必須培地(MEM)で洗浄し、そして次に1−ウェルチャンバースライド上にまいた。48時間後、細胞を上記のように染色した。すべての写真はNikon Otpihot-2 顕微鏡で撮影した。
7日間のマウスMSCカルチャーを10μg/mlのビス-ベンズイミド(シグマ:Sigma)と一緒に一晩インキューベーションし、そして次に免疫-抑制により単離したMSCを血球計算器で計数し、そして10,000細胞/μl濃度で無血清α-MEM中に再懸濁した。目印としてブレグマを使用して、全部5μlの約50,000個の細胞を5分間にわたりゆっくりと冷凍麻酔した4日齢のマウスのSVZにステロタクチック(sterotactic)デバイスで注射した。示した時点でマウスを屠殺し、4%パラホルムアルデヒドを潅流し、そして30%シュクロースでPBS中にて凍結保護した。脳を摘出し、そして4つの等しいサイズの皮質切片に大きく分割した。各切片をOCT化合物中に置き、凍結し、そして10μm厚に冷凍切開した。全部で3匹の動物を各時点で組織学的分析のために取った。MSC注射を受けた18匹以上の動物で、1匹だけが脳中にドナー細胞の移植を示さないことが分かった。
冠状の連続切片中で標識した核により覆われた領域を、最初に100×倍率で顕微鏡の網線を使用して算出した。この領域を次に400×倍の視野の領域により分割した。得られた数に、次に5つ毎の10μmの切片について400×倍で視野(n+5)あたりの同じ位相内の蛍光性の核の数を掛け算する。この方法に基づき、前脳中で予測されるドナー細胞の数は、各時点について1匹の動物の調査に従い、注射から3日後で100,000、12日後で600,000、そして45日後で2×106と等しかった。
5日間成長させたMSCカルチャーに、5μM 8-ブロモ-2-デオキシウリジン(10%FBSを補充したα-MEM中)を用いて48時間パルスをかけ、PBSで数回洗浄し、そして上記のように免疫−抑制した。各時点で3匹の動物を組織額的分析に使用した。
最小反応性グリオーシスは、mMSC注射を受けた動物で明らかであったが、注射管の縁に限られた。このグリオーシスは塩水のみを注射された動物の模擬実験でも明らかであった。MSCを注射された動物は、注射から90日後まで明白な行動異常を示さず、これはこれまで確立された中で最も長い。さらに実験動物の兄妹交配では、MSC注射を受けたメスが成功裏に子孫を育てることができたことを確認した。
マウスに4%パラホルムアルデヒドを潅流し、そしてパラフィン包埋のために処理した。BrdUのための免疫組織化学は、抗-BrdU抗体(ダコ社)を前述のように1:500希釈するが(Gage et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.92:897)、ギ酸前処理は除いて行った。BrdU染色切片を、次にGFAPについて二重染色した。切片は10分間、0.25%トリプシンで処理し、続いて20%の正常ヤギ血清を用いて15分間のブロッキング工程で処理した。1:250希釈のウサギ抗-GFAP(ダコ社)を、次に室温で30分間適用した。1次抗体は、1:10希釈の金標識したヤギ抗-ウサギ免疫グロブリン、続いて30分間の銀増感により検出した(ポリサイエンス社:Polyscience Inc.)。
基準を満たす。典型的には、MSCはそれらのプラスチックへの付着により骨髄から単離される(Prockop,1977,Science 276:71)。我々はすでに、様々な同系交配マウス種からこの方法により得たマウスのMSCカルチャーが、細胞表面レセプターCD11bを発現する骨髄造血細胞により支配される異質な群を表すことを示した(Phinney et al.,1999,J.Cell.Biochem.72:570)。このような考察により、我々は(図20)に表すようなフィブロブラストイド−形MSCの均一な群を単離するために、免疫抑制に基づく信頼性のある方法の開発が可能となる。精製後、このような細胞はCD45との免疫反応性を示さず、この群に造血細胞が全く無いことを示している(データは示さず)。
998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:3908) を、マウスMSCが確立された経路に沿って移動し、そして新生児の前脳で行われている発育と一致する様式で神経細胞系譜に分化することを証明することにより広げた。
まとめるとこれらのデータは、増殖、確立された経路に沿った移動、線条の、皮質性の、および小脳の領域内での非分裂的(non-disruptive)散在、ならびに神経細胞系譜への分化を含む正常な脳の発育の観点に参加することにより、マウスMSCがマウス脳内で神経幹細胞の挙動を模倣することを証明している。後者はmMSCが異なる皮膚起源の分化した子孫を生産できること;発育している新生児の脳のミクロ環境に暴露されることにより明らかになる能力も証明している。
マウスおよびヒトのMSCのために、ラットMSC(rMSC)を本明細書にすでに記載したように(実施例10)遺伝的に操作してL-DOPAを分泌させた。簡単に説明すると、rMSCはチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の遺伝子を含む1つのレトロウイルスで形質導入し、そして次にGTP-シクロヒドラーゼ(GC)の遺伝子を含む第2のレトロウイルスで形質導入した。GC遺伝子はチロシンヒドロキシラーゼの必須コファクターであるテトラヒドロプテリジンを提供する。約100,000個の形質導入した細胞を、本明細書ですでに記載したようにラットの脳に移植した。次に実験は移植したrMSCが6-ヒドロキシドパミンにより誘起されたパーキンソン病をもつラットの線条体に移植した後、L-DOPAを合成し、そして分泌し続けるかどうかを決定するために行った。
態様1. 中枢神経系の疾病、疾患または病気にかかっているヒト患者の処置方法であって、ヒトドナー由来の骨髄サンプルを得ること、該骨髄サンプルからストロマ細胞を単離すること及び該単離されたストロマ細胞を該ヒト患者の中枢神経系に投与することを含んでなり、その場合、該中枢神経系における該単離されたストロマ細胞の存在が該疾病、疾
患または病気の処置をもたらす方法。
態様2. 該ヒトドナーが中枢神経系の疾病、疾患または病気を患っておらず、そして該ヒトドナーが該患者と同一遺伝子型(synergeneic)である、態様1の方法。
態様3. 該ヒトドナーが該ヒト患者である、態様1の方法。
態様4. 中枢神経系の該疾病、疾患または病気が遺伝病、腫瘍、外傷及び脳卒中よりなる群から選択される、態様1の方法。
態様5. 該疾病、疾患または病気が該中枢神経系の組織または細胞に対する損傷である、態様1の方法。
態様6. 該疾病、疾患または病気が脳腫瘍である、態様4の方法。
態様7. 該中枢神経系に投与された該単離されたストロマ細胞が該中枢神経系において存在または複製したままである、態様1の方法。
態様8. 該単離されたストロマ細胞を投与する前に、該細胞をインビトロで培養する、態様1の方法。
態様9. 該単離されたストロマ細胞を投与する前に、治療的タンパク質をコードする単離された核酸で該単離されたストロマ細胞をトランスフェクトし、該タンパク質が該細胞において発現される場合に該タンパク質が該疾病、疾患または病気の処置をもたらすように働く、態様1方法。
態様10. 該治療的タンパク質がサイトカイン、ケモカイン、ニューロトロフィン及び抗体並びにグリオーマ有毒タンパク質よりなる群から選択される、態様9の方法。
態様11. 該単離されたストロマ細胞を投与する前に、治療的タンパク質をコードする単離された核酸で該単離されたストロマ細胞をトランスフェクトし、そのようなタンパク質が該細胞により分泌される場合に該タンパク質が該疾病、疾患または病気の処置をもたらすように働く、態様1の方法。
態様12. 該単離された核酸がプロモーター/調節配列に操作可能に連結される、態様11の方法。
態様13. 該治療的タンパク質がサイトカイン、ケモカイン、ニューロトロフィン、抗体及びグリオーマ有毒タンパク質よりなる群から選択される、態様11.の方法。
態様14. 該単離された核酸が突然変異した、機能しないまたは不十分に発現される遺伝子の野生型コピーであり、該単離された核酸がプロモーター/調節配列に操作可能に連結され、そして該単離されたストロマ細胞において発現される、態様9の方法。
態様15. 該単離された核酸が突然変異した、機能しないまたは不十分に発現される遺伝子の野生型コピーであり、該単離された核酸がプロモーター/調節配列に操作可能に連結され、そして該単離されたストロマ細胞から分泌されるタンパク質を作るために該ストロマ細胞において発現される、態様11の方法。
態様16. 該ストロマ細胞を投与する前に、分化した細胞の実質的に均質な集団の存在下でまたは細胞分化の誘導物質の存在下で該ストロマ細胞を共培養することにより該細胞を前以て分化させ、それにより該単離されたストロマ細胞が分化し、そして分化した細胞または誘導物質で処理した細胞に特有の分化表現型の表現型特性を獲得する態様1の方法。
態様17. 該単離されたストロマ細胞の投与前に、該細胞をインビトロで培養し、該細胞中に単離された核酸を導入し、そして該細胞を前以て分化させるという工程の少なくとも一つを実施する、態様1の方法。
態様18. 該単離されたストロマ細胞が免疫学的に分離される、態様1の方法。
態様19. 単離されたストロマ細胞の分化を導く方法であって、分化した細胞の実質的に均質な集団の存在下でまたは細胞分化の誘導物質の存在下で該単離されたストロマ細胞を培養することを含んでなり、それにより該単離されたストロマ細胞が分化し、そして分化した細胞または誘導物質で処理した細胞に特有の分化表現型の表現型特性を獲得する方法。
態様20. 該分化した細胞がアストロサイト、マクログリア細胞及びニューロンよりなる群から選択される、態様19の方法。
態様21. 該脳腫瘍がグリオーマである、態様6の方法。
態様22. 該治療的タンパク質がグリオーマ有毒タンパク質である、態様11の方法。
態様23. 該グリオーマ有毒タンパク質がFasリガンドである、態様22の方法。
態様24. 該グリオーマ有毒タンパク質が上皮増殖因子受容体(EGFR)及びCD3に対して導かれる二重特異性単鎖抗体である、態様22の方法。
態様25. 該グリオーマ有毒タンパク質が上皮増殖因子受容体(EGFR)に対して導かれる抗体である、態様22の方法。
態様26. 該トランスフェクションをレトロウイルスベクターを用いて実施する、態様11の方法。
態様27. 該単離されたストロマ細胞の該投与方法が脳中に直接それらの細胞を移植することによる、態様9の方法。
態様28. 該単離されたストロマ細胞の該投与方法が脳中に直接それらの細胞を移植することによる、態様11の方法。
態様29. 該中枢神経系に投与された該単離されたストロマ細胞が該中枢神経系において約150日までの間存在または複製したままである、態様7の方法。
態様30. 該単離されたストロマ細胞を中枢神経系に投与した後、中枢神経系に投与された該単離されたストロマ細胞の約0.1%がマクログリア細胞、アストロサイトまたはニューロンへの分化のマーカーを発現することができる態様1の方法。
態様31. 分化の該マーカーがグリア繊維酸性タンパク質である、態様30の方法。
態様32. 中枢神経系の該疾病がパーキンソン病である、態様1の方法。
態様33. 該治療的タンパク質が中枢神経系の疾病、疾患または病気において欠失しているかまたは生産されない神経伝達物質の生合成において必要とされる酵素である、態様9の方法。
態様34. 該治療的タンパク質が中枢神経系の疾病、疾患または病気において欠失しているかまたは生産されない神経伝達物質の生合成において必要とされる酵素である、態様11の方法。
態様35. 該神経伝達物質がL-DOPAである、態様33の方法。
態様36. 該神経伝達物質がL-DOPAである、態様34の方法。
態様37. 該処置がパーキンソン病に見られる表現型の減少をもたらす、態様35の方法。
態様38. パーキンソン病に見られる該表現型がパーキンソン病のラットモデルにおいてアポモルヒネにより誘導される回転である、態様37の方法。
態様39. 該単離されたストロマ細胞がL-DOPAを少なくとも約3日間合成し、分泌し続ける、態様36の方法。
態様40. 該L-DOPAがL-DOPAの代謝産物に転化される、態様36の方法。
Claims (1)
- 中枢神経系の疾病、疾患または病気にかかっているヒト患者の処置方法であって、ヒトドナー由来の骨髄サンプルを得ること、該骨髄サンプルからストロマ細胞を単離すること及び該単離されたストロマ細胞を該ヒト患者の中枢神経系に投与することを含んでなり、その場合、該中枢神経系における該単離されたストロマ細胞の存在が該疾病、疾患または病気の処置をもたらす方法。
Applications Claiming Priority (1)
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