JP6545335B2 - 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 - Google Patents
多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6545335B2 JP6545335B2 JP2018159129A JP2018159129A JP6545335B2 JP 6545335 B2 JP6545335 B2 JP 6545335B2 JP 2018159129 A JP2018159129 A JP 2018159129A JP 2018159129 A JP2018159129 A JP 2018159129A JP 6545335 B2 JP6545335 B2 JP 6545335B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- stem cells
- cell
- pluripotent
- differentiation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5073—Stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
(a)自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞;および
(b)前記幹細胞の増殖を支持し得る培地、を含む培養物。
を含む培養物に関する。
(a)非胚動物供給源から細胞を入手する工程;
(b)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;および
(c)前記細胞を培養する工程。
(a)生後動物供給源から細胞を入手する工程;
(b)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;および
(c)前記細胞を培養する工程。
(a)成体動物供給源から細胞を入手する工程;
(b)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;および
(c)前記細胞を培養する工程。
(a)非胚動物供給源から細胞を入手する工程;
(b)20μmフィルターを介して前記細胞をろ過する工程;
(c)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;および
(d)前記細胞を培養する工程。
(a)少なくとも1つのマーカー遺伝子または目的の遺伝子を含むDNA構築物で多能性胚様幹細胞をトランスフェクトする工程;
(b)前記多能性胚様幹細胞において前記マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現を選択する工程;
(c)工程(b)において選択された幹細胞を培養する工程。
A.本発明の多能性胚様幹細胞と分化決定因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;および
B.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程、
ここで、前記接触された細胞の系統は、前記サンプルにおける分化決定因子の存在または活性を示す。
A.分化未決定されていない細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;
B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。
A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;
B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。
A.本発明の多能性胚様幹細胞と増幅因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;および
B.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程、
ここで、分化決定を伴わない前記接触された細胞の増殖は、前記サンプルにおける増殖因子の存在または活性を示す。
A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;
B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。
A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;
B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。
A.治療有効量の本発明の多能性胚葉幹細胞;および
B.薬学的に受容可能な媒体またはキャリア。
本発明に従えば、用いられる従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術は当業者の範囲内にある。例えば、Sambrookら、”Molecular Cloning; A Laboratory Manual” (1989);”Current Protocols in Molecular Biology”Volumes
I−III [Ausubel, R. M編(1994)];”Cell Biology; A Laboratory Handbook”Volumes 1−111
[J. E. Celis編(1994))];”Current Protocols in Immunology”Volumes 1−111 [Coligan, J. E編(1994)];”Oligonucleotide Synthesis”
(M. J. Gait ed. 1984);”Nucleic Acid Hybridization” [B. D. Hames & S. J. Higgins編(1985)];”Transcription AndTranslation”
[B. D. PHames & S. J. Higgins編(1984)] ”Animal Cell Culture” [R. I. Freshney編(1986)];”Immobilized Cells And Enzymes” [IRL Press,(1986)]; B. Perbal,”A Practical Guide To Molecular Cloning” (1984)を参照されたい。
シンボル アミノ酸
1文字 3文字
Y Tyr チロシン
G Gly グリシン
F Phe フェニルアラニン
M Met メチオニン
A Ala アラニン
S Ser セリン
I Ile イソロイシン
L Leu ロイシン
T Thr トレオニン
V Val バリン
P Pro プロリン
K Lys リジン
H His ヒスチジン
Q Gln グルタミン
E Glu グルタミン酸
W Trp トリプトファン
R Arg アルギニン
D Asp アスパラギン酸
N Asn アスパラギン
C Cys システイン
すべてのアミノ酸残基配列は、左右の方向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式で本明細書において表されることに注意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、1以上のアミノ酸残基のさらなる配列に結合したペプチドを示すことに注意すべきである。上記の表は、3文字命名と本明細書において代替的に出現し得る1文字命名とを相関させるために示されている。
ロイシン(Leu または L) UUA または UUG または CUU または CUC または CUA または CUG
イソロイシン(Ile または I) AUU または AUC または AUA
メチオニン(Met または M) AUG
バリン(Val または V) GUU または GUC of GUA または GUG
セリン(Ser または S) UCU または UCC または UCA または UCG または AGU または AGC
プロリン(Pro または P) CCU または CCC または CCA または CCG
トレオニン(Thr または T) ACU または ACC または ACA または ACG
アラニン(Ala または A) GCU または GCG または GCA または GCG
チロシン(Tyr または Y) UAU または UAC
ヒスチジン(His または H) CAU または CAC
グルタミン(Gln または Q) CAA または CAG
アスパラギン(Asn または N) AAU または AAC
リジン(Lys または K) AAA または AAG
アスパラギン酸(Asp または D) GAU または GAC
グルタミン酸(Glu または E) GAA または GAG
システイン(Cys または C) UGU または UGC
アルギニン(Arg または R) CGU または CGC または CGA または CGG または AGA または AGG
グリシン(Gly または G) GGU または GGC または GGA または GGG
トリプトファン(Trp または W) UGG
終止コドンUAA (オーカー) または UAG (アンバー) または UGA (オパール)
上に明記されたコドンはRNA配列に関するものであることを理解すべきである。DNAに対する対応コドンはUの代わりにTを有する。
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。
アスパラギン酸、グルタミン酸。
リジン、アルギニン、ヒスチジン(pH 6.0において)。
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。
もう1つの群は、分子量に従い得る(即ち、R基のサイズ)。
グリシン 75
アラニン 89
セリン 105
プロリン 115
バリン 117
トレオニン 119
システイン 121
ロイシン 131
イソロイシン 131
アスパラギン 132
アスパラギン酸 133
グルタミン 146
リジン 146
グルタミン酸 147
メチオニン 149
ヒスチジン(pH 6.0で) 155
フェニルアラニン 165
アルギニン 174
チロシン 181
トリプトファン 204
陽性荷電が維持され得るようなArgの代わりにLysおよびその逆;
陰性荷電が維持され得るようなAspの代わりにGluおよびその逆;
遊離の−OHを維持することができるようなThrの代わりにSer;および
遊離のNH2を維持することができるようなAsnの代わりにGln。
(a)自己再生可能ならびに内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞;および
(b)前記幹細胞の増殖を支持し得る培地。
(a)非胚動物供給源から細胞を入手する工程;
(b)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;および
(c)前記細胞を培養する工程。
(a)生後動物供給源から細胞を入手する工程;
(b)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;および
(c)前記細胞を培養する工程。
(a)成体動物供給源から細胞を入手する工程;
(b)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記細胞を緩徐に凍結する工程;および
(c)前記細胞を培養する工程。
(a)非胚動物供給源から細胞を入手する工程;
(b)前記細胞をコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液中でインキュベートする工程;
(c)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記インキュベートした細胞を緩徐に凍結する工程;および
(d)前記細胞を培養する工程。
(a)非胚動物供給源から細胞を入手する工程;
(b)20μmフィルターを介して前記細胞をろ過する工程;
(c)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で前記ろ過した細胞を緩徐に凍結する工程;および
(d)前記細胞を培養する工程。
(a)少なくとも1つのマーカー遺伝子または目的の遺伝子を含むDNA構築物で多能性胚様幹細胞をトランスフェクトする工程;
(b)前記多能性胚様幹細胞において前記マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現を選択する工程;
(c)工程(b)において選択された幹細胞を培養する工程。
A.治療有効量の本発明の多能性胚葉幹細胞;および
B.薬学的に受容可能な媒体またはキャリア。
静脈内処方I
成分 mg/ml
セホタキシム 250.0
因子 10.0
デキストロースUSP 45.0
重亜硫酸ナトリウムUSP 3.2
エデト酸二ナトリウムUSP 0.1
注射用水 全量1.0 mlまで適宜添加する
静脈内処方II
成分 mg/ml
アンピシリン 250.0
因子 10.0
重亜硫酸ナトリウムUSP 3.2
エデト酸二ナトリウムUSP 0.1
注射用水 全量1.0 mlまで適宜添加する
静脈内処方III
成分 mg/ml
ゲンタマイシン(硫酸塩としてチャージする) 40.0
因子 10.0
重亜硫酸ナトリウムUSP 3.2
エデト酸二ナトリウムUSP 0.1
注射用水 全量1.0 mlまで適宜添加する
静脈内処方IV
成分 mg/ml
因子 10.0
デキストロースUSP 45.0
重亜硫酸ナトリウムUSP 3.2
エデト酸二ナトリウムUSP 0.1
注射用水 全量1.0 mlまで適宜添加する
(1984)を参照されたい。
A.幹細胞*+Ab1=幹細胞*Ab1
B.幹細胞+Ab1 *=幹細胞Ab1 *
C.幹細胞+Ab1+Ab2 *=幹細胞Ab1Ab2 *
A.本発明の多能性胚様幹細胞と分化決定因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;および
B.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程、
ここで、前記接触された細胞の系統は、前記サンプルにおける分化決定因子の存在または活性を示す。
A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;
B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。
A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;
B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の系統を決定する工程。
A.本発明の多能性胚様幹細胞と増幅因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;および
B.形態学、mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程、
ここで、分化決定を伴わない前記接触された細胞の増殖は、前記サンプルにおける増殖因子の存在または活性を示す。
A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;
B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。
A.分化未決定な細胞として幹細胞を維持する増殖培地において本発明の多能性胚様幹細胞を培養する工程;
B.試験下で前記作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された前記細胞の増殖および系統を決定する工程。
(a)多能性胚様肝細胞もしくは該細胞への特異的結合パートナーの検出可能な標識への直接的または間接的付着によって得られる予め決定された量の少なくとも1つの標識された免疫組織学的反応成分;
(b)他の試薬;および
(c)前記キットの使用のための指示書。
(a)一般に固相に結合して免疫吸着剤を形成するか、あるいはその代わりに安定なタグ、または複数のそのような終産物など(もしくはそれらの結合パートナー)にそれぞれに1つ結合する上記のような既知の量の多能性胚様肝細胞;
(b)必要であれば、他の試薬;および
(c)前記試験キットの使用のための指示書。
(a)多能性胚様肝細胞を検出可能な標識を結合することによって得られている標識された成分;
(b)少なくとも1つの試薬がリガンドである1つ以上のさらなる免疫科学的試薬であって、該リガンドは以下のものからなる群より選択される;
(i)標識された成分に結合可能なリガンド;
(ii)標識された成分の結合パートナーに結合可能なリガンド;
(iii)決定しようとする少なくとも1つの成分に結合可能なリガンド;および
(iv)決定しようとする少なくとも1つの成分の少なくとも1つの結合パートナーに結合可能なリガンド;ならびに
(c)多能性胚葉幹細胞と該細胞に対する特異的結合パートナーとの間の免疫組織反応の1つ以上の成分の検出および/または決定のためのプロトコールの実施のための指示書。
提唱された研究は、組織構造および組織機能、例えば、幹細胞、生体活性因子、および生体マトリックスの回復に必要な3部システムならびに組織再生および移植療法のための使用の特定の同定を確かめるように指令された長期間の調査努力の一部である。これらの努力の目的は、ヒト多能性幹細胞を単離し、特定の分化決定に特異的な分子機構を同定することである。この目的は、細胞表面マーカーに対する抗体を使用し、次いで、抗体結合に基づく単離プロトコールを考案することでこれらの細胞を特徴付けることによって達成されるであろう。
現在までに、少なくとも5つの種が試験され、間葉幹細胞の系統発生的分布が決定されている(表7)。試験されたすべての種、例えば、胎児期トリ(Youngら、1991、1992a,b、1993、1995、1998a;Bowermanら、1991)、胎児期マウス(Klausmeyerら、1994;Rogers Val、1995;Youngら、1998b)、胎児期および生後ラット(Lucasら、1994、1995;Davisら、1995;Warejckaら、1996)、生後ウサギ(Pateら、1993)、ならびに胎児期および生後ヒト(Youngら、1999)は、間葉幹細胞の常在性集団を有する。これらの幹細胞は、デキサメタゾンおよび/またはインスリンの存在下でインキュベートする場合、多数の中胚葉表現型を形成する能力を有する。これまで、16種の個別かつ容易に同定可能な細胞/組織表現型が得られている。これらは即ち、骨格筋、平滑筋、心筋、関節軟骨、成長平板軟骨、硝子軟骨、弾性軟骨、繊維軟骨、軟骨内骨化、膜性骨化、瘢痕組織、真皮、脂肪細胞、腱/靭帯、骨膜/軟骨膜、および内皮細胞である。
移植療法の始原および多能性幹細胞を回収する至適年齢を決定するための研究が行われている。これまで、種あたりに存在する(多能性)幹細胞の数、増殖能力、または分化能については、ドナーの年齢および性別(ヒトのみ)と比較すると差異が認められていない(表7)(Youngら、1993,1995,1998(a), 1998(b),1999、観察結果は公開されていない;Pateら、1993;Troumら、1993;Lucasら、1994,1995;Rogersら、1995;Warejckaら、1996;Calcuttら、1998)。試験した5つのすべての種(ニワトリ、マウス、ラット、ウサギおよびヒト)では、種あたりの多能性幹細胞数について年齢に関する差異は認められていない。増殖能または分化能に対する年齢の影響は認められていない。生後では、老年(ヒト)幹細胞において差異は認められていない。
5つの動物種由来のドナー部位の分析は、うっ血もしくは修復を経験し、結合組織画分を有する任意の組織または器官は、間葉幹細胞の常在性集団を有する。これまでにアッセイされた器官、組織およびそれらの関連結合組織画分は、胚全体、胎児全体、骨格筋、真皮、脂肪、腱、靭帯、軟骨膜、骨膜、心臓、大動脈、心内膜、心筋層、心外膜、大動静脈、肉芽組織、末梢神経、末梢神経節、脊髄、硬膜、軟髄膜、気管、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、脾臓、膵臓、壁側腹膜、臓側腹膜、壁側胸膜、肺胸膜、膀胱、胆嚢、腎臓、関連結合組織および骨髄(Youngら、1993,1995;Pateら、1993;Troumら、1993;Lucasら、1994,1995;Davisら、1995;Rogersら、1995;Warejckaら、1996;Calcuttら、1998;観察結果は公開されていない)を含む。
間葉幹細胞の同定された集団内の細胞の組成を決定するために、連続限界希釈によるクローン化可能分析を行った。トリ(Youngら、1993)およびマウス(Rogersら、1995;Youngら、1998b)由来の間葉幹細胞のクローン化可能分析は、一貫して幹細胞の2つのカテゴリー、例えば、分化決定された始原幹細胞および分化未決定の多能性幹細胞を明らかにしている。5つの組織系統が、胎児期および生後多能性幹細胞クローン(例えば、筋原性、軟骨形成、脂肪生成、繊維形成および骨形成)において、全般および系統特異的誘導剤により誘導され、その後、分化された表現型が発現されている(Grigoriadisら、1988;Youngら、1993,1998b、本研究;Rogersら、1995)。
幹細胞、始原細胞および多能性細胞の各カテゴリーは、共通の特徴と自己特有の特徴とを有している。始原および多能性間葉幹細胞の両方は、付着のためのI型コラーゲン下層を選好し、凍結保存法および10%血清および7.5%DMSOを含有する培地(Youngら、1991)での−70〜−80℃での保存を選好する。
本発明者らは、これまでに、多能性細胞におけるMMP誘導性筋形成を試験するための研究においてノーザンブロット分析を使用している。MMPは、胎児期マウス多能性幹細胞(Rogersら、1995;Youngら、1998b)においてミオゲニンおよびMyoD1遺伝子発現のmRNAの転写を誘導した。
細胞の回収および培養
ラットの細胞について、CO2吸入を使用して、1日齢Sprague−Dawleyラット児を屠殺した。ラットを2分間、70%エタノールに浸漬し、滅菌フードに入れ、皮を剥ぎ、大殿筋、中殿筋、大腿二頭筋、半膜様筋、半腱様筋、縫工筋、大腿四頭筋、ヒラメ筋、および腓腹筋の新鮮筋腹を取り出した。注意深く腱、大きな血管、および神経を除去した。関連する筋内膜、筋周膜、および筋外膜結合組織画分を含む筋組織を10 mlの完全培地中に置き、注意深く細かく切り刻んだ。完全培地は、10%の予め選択されたウマ血清(lot #’s 17F−0218 or 49F−0082, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、1%抗生物質溶液(10,000単位/mlペニシリンおよび10,000 mg/mlストレプトマイシン、GIBCO)を補充したEarle塩を有する89%(v/v)Eagle最小必須培地(EMEM)、pH 7.4 (22)(GIBCO, Grand Island, NY)から成った。細かく切り刻んだ後、組織懸濁液を50×gで20分間、遠心分離した。. 上清を捨て、細胞ペレットの容積を見積もった。細胞ペレットを7容積のEMEM、pH 7.4および2容積のコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液に再懸濁し、酵素反応により細胞を遊離させた(Lucasら、1995)。コラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液は、100 mlディスパーゼ溶液(Collaborative Research, Bedford, MA)に添加された50 mlのEMEM中37,500単位のコラゲナーゼ(CLS−I, Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ)から成った。最終濃度は250単位/mlコラゲナーゼおよび33.3単位/mlディスパーゼであった(Youngら、1995)。得られた懸濁液を37℃で1時間撹拌し、細胞を分散させて300×gで20分間、遠心分離した。上清を捨て、組織ペレットを20 mlのMSC−1培地に再懸濁した。細胞を90 mmおよび20 mm Nitexフィルター(Tetco Inc.,Elmsford, N. Y)で篩い分けし、単一の細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を150×gで10分間、遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを10 mlの完全培地に再懸濁した。Trypanブルー排除(Youngら、1991)により細胞生存度を決定した。1%ゼラチン化(EM Sciences, Gibbstown, NJ)100 mm培養皿(Falcon, Becton−Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)あたり105細胞で細胞を播種した。細胞培養物を95%空気/5%CO2湿潤環境、37℃で密集状態まで増殖させた。密集時に、細胞をトリプシンで遊離させ、凍結保存した。細胞を、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシド(Sigma)を含有する完全培地中で、−80℃の温度が達成されるまで緩徐に凍結(1分間あたり1℃の温度低下)した(Youngら、1991)。種によって起源材料は異なるものの、ヒト、ウサギ、トリおよびマウスの単離についても同様の手順を使用した。
凍結した細胞のアリコートを融解し、完全培地に再懸濁した。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを完全培地中に再懸濁した。細胞の生存度をTrypanブルー排除によって決定した。次いで、細胞を、ゼラチン化100 mm皿あたり105細胞で播種し、密集状態まで増殖させた。細胞をトリプシンで遊離させ、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO ; Morton Thiokol, Danvers, MA)を含有する完全倍地中で−80℃まで凍結保存した。
胎児期ニワトリ(Youngら、1993)および胎児期マウス(Rogersら、1995;Youngら、1998b)による先のクローン化研究は、個々の細胞が、同じ親株の高度増殖細胞による「前馴化された」培地中で増殖した場合、より高いクローン化効率が達成されることを示した。従って、幹細胞が密集状態(対数増殖期)で回収されるごとに、培養培地をプールし、0.2 mmフィルターで2回ろ過し、アリコートに分けて、4℃で保存した。本研究のクローン化部分の間は、得られた「前馴化培地」を使用した。
胎児期マウス(Rogersら、1995;Young ら、、1998b)における先の研究は、クローン化前に、細胞を50細胞倍加後に増殖させる場合、より高いクローン化効率が達成されることを示した。そのような幹細胞をインスリンと共にインキュベートすると、1%未満の細胞が、様々な間葉系統の分化された細胞の表現型マーカーを示した。これらの観察は、クローン化前に50を超える細胞倍加で細胞を増殖させることによって、大部分の細胞は集団から取り出されることを示唆した。おそらく、50細胞倍加(Hayflickの限界)後の細胞の増殖により、分化決定された細胞をプログラムされた細胞老化および死を経験した(Hayflick,1963,1965; Young,1999a)。
50倍加を超えて増殖させた細胞の凍結アリコートを融解し、密集状態まで増殖させ、トリプシンで遊離させ、遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、細胞の生存度を決定した。細胞を、クローン化培地でクローン密度(5mlあたり1ml)にまで希釈した(Youngら、1993,1998b;Rogersら、1995)。等容量の完全培地と前馴化培地とを混合することによってクローン化培地を調製した。5ミリリットルの細胞懸濁液を、ゼラチン化した96ウェルの平板(Curtain−Matheson Scientific, Atlanta, GA)の各ウェルの中心に置き、37℃でインキュベートした。6時間後、200 mlのクローン化培地を各ウェルに添加した。最初の播種の18時間後、ウェルあたりの細胞数を決定した。単一の細胞を有するウェルのみをさらに増殖させた。培地を他のすべてのウェルから取り出した。これらのウェルを70%(v/v)エタノールと共に5分間インキュベートし、室内の空気中で乾燥させた。0.03%(w/v)アジ化ナトリウムを含有する200 mlの滅菌Dulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS, GIBCO), pH 7.4を添加して、混入菌の増殖を阻止した(Rogersら、1995;Youngら、1998b)。
インスリンおよびデキサメタゾンを使用して、クローンを検査し、それらの同一性、即ち、分化決定された始原細胞かまたは分化未決定の多能性細胞であるかを決定した。インスリンなどの発達因子は始原細胞において表現型発現を加速するが、多能性幹細胞の表現型発現の誘導に対しては効果を示さない。対照的に、デキサメタゾンなどの系統誘導剤は、多能性細胞において分化決定および発現を誘導するが、始原細胞における表現型発現を変更しない。従って、始原細胞のみが培養物中に存在する場合、インスリン中でインキュベートされた培養物について発現された表現型の質または量は、デキサメタゾンと共にインキュベートした培養物と比較して差異は認められない。始原細胞および多能性細胞の療法を含有する培養物を混合する場合、デキサメタゾンで処理した培養物において発現された表現型の質および/または量は、インスリンで処理した培養物と比較してより大きい。培養物が多能性細胞のみを含有する場合、インスリンで処理した培養物において表現型の発現は認められない。デキサメタゾンで処理した同様の培養物は、多数の発現された表現型を示す。このように、デキサメタゾンおよびインスリンによる処理の効果を比較することにより、不明な細胞群内の始原および多能性細胞の特定の型を同定することができる(Youngら、1992,1993,1995,1998a,b,1999a−c;Lucasら、1993,1995;Pateら、1993;Rogersら、1995;Warejckaら、1996)。
骨髄支質は、骨芽細胞および軟骨細胞に分化し得る細胞を含有することが知られている。骨髄支質はまた、他の表現型を形成し得る多能性細胞を含有することが仮定されている。本発明者らは、多くの間葉表現型に分化可能である細胞(本発明者らはこれを間葉幹細胞(MSC)と呼んでいる)がラット骨格筋細胞から単離することができることを明らかにした。本発明者らは、こららの同じ技術を応用して、MSCが生体ラット骨髄の支質組織に存在するかどうかを決定した。7週齢雄性ラット由来の骨髄を回収し、付着細胞を、EMEM+10%プレ選択されたウマ血清中で密集状態まで培養し、次いで、トリプシン処理、ろ過し、7.5%DMSO中で−80℃まで緩徐に凍結した。細胞を融解し、上記の培地中で平板固定し、10−10〜10−6Mの範囲の濃度のデキサメタゾンで5週間まで処理した。観察された表現型は骨格筋管(抗ミオシン)、平滑筋(抗平滑筋αアクチン)、骨(Von Kossa染色)、軟骨(Alcecブルー、pH 1.0)および脂肪(SudanブラックB)を含んだ。骨髄は骨始原細胞以外の幹細胞を含有する。
細胞培養
骨髄全体から細胞を単離するために使用した手順は、Friedensteinが最初に記載した手順(Friedenstein, 1976)と本質的に同一である。6〜8週齢のラットから長い骨を取り出し、末端を切断し、Earle塩を有する10%予め選択されたウマ血清および1%抗生物質(Fungizone, GIBCO)を補充されたEagle最小必須培地(EMEM)(GIBCO, Grand Island, NY)を18ゲージ針を介してフラッシュした。骨髄細胞は、連続的に小さな針(最終的に22ゲージ針)に通して粉砕を反復することによって解離した。解離した細胞を20μMNitexフィルターを介してろ過し、単一細胞の調製物を得た。血球計で細胞数を決定し、造血および支質細胞を含む細胞を、100 mm培養皿あたり107細胞で平板固定した。皿は、予め1%ウシゼラチンで被覆しておいた(EM Sciences, Cherry Hills NJ)。
1.鉱化組織。本質的にHumason(Humason, 1972)に記載の通り、リン酸カルシウムのVon Kossa染色により石灰化組織の存在についてアッセイした。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをDPBSで2回濯いだ。細胞を0.5 mlの10%ホルマリン(Sigma)で3〜5分間固定化し、次いで、蒸留水で4回濯いだ。次いで、0.5 mlの新たに調製した2%硝酸銀(Sigma)溶液を添加し、細胞を暗所で10分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を5回濯いだ。約0.5 mlの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを、明るい光に15分間暴露した(光を反射させるためにプレートのすぐ下に白色背景を置いた)。プレートを再度5回蒸留水で濯ぎ、次いで、100%エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化した(Youngら、1991)。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ca2+、Mg2+を含まない緩衝液中に1%w/v [エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)]−テトラ酢酸(EGTA) (Sigma)(カルシウム特異的キレーター)を有する選択された培養物を1時間前処理することによって実施した。
骨髄全体から単離された細胞のほとんどは、培養皿に付着しない造血細胞であった。培地を交換したときの培養1日目に、これらの細胞を取り出した。6日目までの培養物は、星形を伴うほとんどの付着細胞から成った(図1AおよびB)。小さな丸型で極めて収縮性の細胞が星状細胞胃付着し、この星状細胞がさらに培養皿に付着しているを思われる場合、しばしば細胞の凝集隗が認められる。しかし、培養物の最も際立った特徴は、細胞が直線状に配列することである。このラインの長さの測定値は60 mmを超え、100 mm培養皿にほとんどまたがっている。コラーゲンは、ブラシで円形状に適用されたため、細胞が乾燥コラーゲンのラインの後を追っているとは考えにくい。直線ライン上にある細胞は、それらに付着する他の細胞を有すると思われた。初代骨髄細胞の培養物の培地では、浮遊細胞が連続的に供給されていることが認められた。これは、最初の付着後では浮遊細胞が認められなかった骨格筋および心臓由来の培養物とは対照的である。
本発明者らは、骨格筋および心臓から得られる細胞とほぼ同一の方法で、多くの表現型に分化することによってデキサメタゾン処理に応答する骨髄から細胞集団を単離することができた。しかし、初代培養物は、筋および心臓から得られる初代培養物とは同一ではなかった。これは、驚くべきことではない。何故なら、各組織は分化された細胞およびそれらの即時型前駆体の独特な補体を含有するからである。骨格筋由来の初代培養物は分化された多核筋管を含有すし、心臓由来の初代培養物は心筋細胞を含有する(Lucasら、1995;Warejeckaら、1996)。これらの表現型は両方とも初代骨髄培養物には存在しなかった(図1)。しかし、初代骨髄培養物は、長い直線ラインで細胞が並ぶ独特な特徴を有した。このことは以前に文献で報告されておらず、本発明者らは、これらの培養物の性状についてはあまり説明していない。しかし、それらは、いくらかの独立した調製物において再現性が認められた。プレートには予めコラーゲンが被覆してあるため、乾燥コラーゲンのラインに沿って細胞が配列した可能性もある。しかし、コラーゲンが、円運動で使用されるブラシで適用されたならば、この可能性は低いと思われる。コラーゲンアプリケーションの変化は、細胞の直線ラインの形成に影響を及ぼさない(データ示さず)。もう1つの可能性は、ラインが、培養物において造血環境を形成しようとする分化された支質細胞を示すことである。培養条件および予め選択されたウマ血清の使用は、この状況を引き起こし易い。本発明者らは既に、ほとんどのロットの血清が細胞に繊維芽細胞への分化を引き起こさせ、デキサメタゾン処理には感応しないことを明らかにしている(Lucasら、1995)。おそらく、繊維芽細胞分化を防止することにより、より容易に観察するために分化された支質細胞をより明白にそれらの表現型を発現させることが可能である。培地において繰り返し生じる浮遊細胞の再生もまた骨格筋および心臓由来の初代培養物とは異なるが、分化した造血組織とは一致する。ライン内の細胞および浮遊細胞の性質についてはさらに検討する必要がある。
以前に、本発明者らは、新生ラット骨格筋から、デキサメタゾンなどの非特異的分化作用物質で処理すると多くの間葉表現型に分化可能な細胞を単離した。本発明者らは、これらの細胞を間葉幹細胞と呼び、それらは肉芽組織に存在すると仮定している。この仮説を試験するために、肉芽組織から細胞を単離し、それらが多数の中胚葉表現型を形成する能力についてアッセイした。7週齢雄性ラットの皮下にステンレス製創傷チャンバをインプラントした。インプラント7または14日後に該チャンバを取り出し、付着している組織を掻き取った。コラゲナーゼ/ディスパーゼによる消化で細胞を単離し、予め選択されたウマ血清を有する培地においてゼラチン被覆皿中で密集状態まで培養した。細胞をトリプシンで遊離させ、7.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)中−80℃で凍結し、次いで、融解し、10−6〜10−10Mデキサメタゾンを補充した同培地中で培養した。両時点での細胞は、培養中同様に挙動した。対照培養は星状形態を有する細胞を含有し、骨格筋から単離された細胞と外観は同様であった。しかし、デキサメタゾンによる処理では、以下のような表現型が観察された。培養時に自発的に収縮し、ミオシンに対する抗体で染色された長型多核細胞(骨格筋管)、細胞外マトリックスがAlcianブルー、pH 1.0で染色された丸型細胞の小節(軟骨)、細胞外マトリックスが鉱物に対するVon Kossa染色で染色された丸型細胞(骨)、SudanブラックBで染色された大きな小胞を有する丸型細胞(脂肪細胞)、平滑筋αアクチンに対する抗体で染色された細胞内繊維を有する大細胞(平滑筋)、アセチル化低(ow)密度リポタンパク質を取り入れた丸型細胞(内皮細胞)、および顆粒化されたおよび原繊維の細胞(結合組織)。これらの結果は、、肉芽組織内における、単なる繊維結合組織瘢痕ではなく多数の中胚葉組織を形成し得る間葉幹細胞の存在を示唆する。これらの細胞をin vivoで適切に操作した場合、瘢痕組織の形成とは異なる実際の組織再生を達成することができる。
細胞培養
Schilling (Schillingら、1959,1969)により記載され、Goodson (Goodsonら、1976)によって改変されたように、長さ3.5 cmのシリンダーに形成されたステンレス製メッシュから創傷チャンバを構築した。ベンゼン、次いでエタノールに浸漬することによって創傷チャンバを清浄し、石鹸水中で洗浄し、次いで徹底的に濯いだ。それらをオートクレイブ中で滅菌した。
1. 筋肉。骨格筋筋管を、培養物中で自発的に収縮した多核線状および分岐構造として形態学的に観察した(Youngら、1992a)。Youngら(Young ら、1992b)の手順を改変して使用し、支質ミオシンに対するMF−20抗体(Hybridoma Bank, Ames, IA)で細胞を染色することによって、組織化学的に骨格筋表現型を確認した。断りがない限り、各工程の前にDPBSで2回濯いだ。DPBSで細胞層を濯いだ後、0.5 mlの冷エタノール(−20℃)を5分間適用し、細胞を固定化した。この後、0.5 mlのDPBS中1%v/v TritonX100/0.05%w/vアジ化ナトリウムと共に5分間インキュベーションし、細胞膜を溶解して、それぞれ内因性ペルオキシダーゼを阻害した。20%ヤギ血清の1次ブロッカーを30分間、37℃インキュベーター中で適用する。次いで、MF−20の1: 200希釈の1次IgG(0.4 ml/ウェル)を1時間インキュベートす。0.5 mlの20%ヤギ血清の2次ブロッカーを30分間適用し、続いて、1: 7500 希釈のビオチン化ヤギ抗マウスIgG(Leinco, St. Louis, MO)を0.4 ml加え、また37℃で30分間インキュベートした。20%ヤギ血清から成る3次ブロッカーを30分間適用し、取り出し、次いで、1: 3750 希釈のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(Leinco)を0.4 ml添加し、37℃で30分間インキュベートした。この時点で、細胞を0.5 ml DPBSで2回、次いで、0.5 mlの蒸留水で2濯いだ。染色キットの取扱説明書に従って、以後の写真撮影のために選択されたウェルにChromagen (Sigma)を添加した。一旦発色したら、25μlの0.05%アジ化ナトリウムを各ウェルに添加して、反応を停止した。次いでウェルを濯ぎ、グリセリンゼリーで永久保存化した。
初代培養物により、密集状態に達するまで単核星形細胞が増殖した(図6AおよびB)。トリプシンで細胞を遊離させ、ろ過し、凍結保存した後も平板固定時には細胞は星形を保持した。4週間目に、対照培養部は星形細胞から成った(図7A)。しかし、デキサメタゾンで処理した培養物は、7種の形態を示した。約1週間の培養を始めたところ、自発的に収縮した線状および分岐した両方の多核細胞がすべてのデキサメタゾン濃度で出現したが、10−8および10−7Mデキサメタゾンの方がより多く出現した(図7B)。これらの細胞を骨格支質ミオシンに対する抗体で染色した(図7C)ところ、骨格筋筋管と同定された。
本発明者らの研究室の先の研究では、いくらかの中胚葉表現型に分化可能なニワトリ、ラットおよびウサギの骨格筋において単離された細胞集団の存在が明らかにされている(Lucasら、19995;Youngら、1992a;Pateら、1993)。ニワトリ胚(Youngら、1995)および新生ラット心臓(Warejcka、1996)のいくらかの結合組織において同様の細胞集団が見出されている。Owenの用語(Owen、1987)に従って、本発明者らは、明らかな非制限的増殖能(Lucasら、1995;Youngら、1993)および中胚葉(間葉)発生系統の細胞へ分化する能力について、これらの細胞を間葉幹細胞と命名した。本研究において、本発明者らは、7週齢ラットの皮下に7または14日間インプラントされたHunt Schilling創傷チャンバから得られる肉芽組織に同じ単離および試験手順を適用した。
創傷の治癒は損傷に対する応答であるが、非機能的瘢痕組織を生じる。より好ましい結果は組織の再生であろう。本発明者らは、肢骨、筋肉、脂肪、表皮などに正常に認められる組織へ分化可能な間葉幹細胞の存在を仮定し、胎児および成体ラット骨格筋においてそのような細胞集団を見出した。成体ヒト組織からこれらの細胞を単離するために、これらの実験を設計した。75歳糖尿病雌および35歳雄の切断された脚から骨格筋を回収した。単核細胞を酵素的に単離し、10%予め選択されたウマ血清を補充したEarle塩を有する最小必須培地(EMEM)中で培養した。この調製物は、筋管へ分化される決定された筋原細胞を含有する。次いで、培養物をトリプシン処理し、ろ過し、7.5%DMSO中、−80℃で凍結し、融解し、平板固定し、ここで、2〜6週間の間、10−10〜10−6Mデキサメタゾン(非特異的分化因子)を補充した上記の同じ培地でそれらを培養した。対照培養は、間葉幹細胞に典型的な正常形態を示した。デキサメタゾンで処理された培養物は、以下の表現型を含有した:ミオシンに対する抗体で染色された長形単核細胞(骨格筋)、SudanブラックBで染色された脂質小滴を有する丸型細胞(脂肪細胞)、Alcianブルー、pH 1.0で染色された細胞外マトリックスを有する丸型細胞(軟骨)、平滑筋a−アクチンに対する抗体で染色された細胞(平滑筋)、アセチル化低密度リポタンパク質を取り入れた細胞(内皮細胞)、および鉱物に対するVon Kossa染色で染色された細胞外マトリックス(骨芽細胞)。実験により、間葉表現型に分化する能力を有するヒト間葉幹細胞の存在が確立される。これにより、細胞を操作して、損傷を受けた患者の間葉組織の適切な再生を達成する可能性が生じる。間葉細胞は、結合組織、筋肉、骨、脂肪、軟骨、および血液細胞を含む多くの異なる組織を生じる。間葉から誘導された身体の組織に対する損傷は珍しいことではない。しばしば、組織に対する損傷は外傷、「磨耗および断裂」と呼ばれる病因学的破損、または先天的欠損によって生じる。骨折、変形性関節症、または骨格筋損傷に関与する病因学的過程ではこれは特に正しい。身体は、損傷を受けたまたは消失した間葉組織の修復の機序を有するが、正常な機能を有する組織の再生は不十分であるかまたは不適切であるようである。その代わり、治癒は、通常、主に非機能的繊維瘢痕組織から成る領域を残す。
表現型のアッセイ:
1. 鉱化組織。本質的にHumason(Humason, 1972)に記載の通り、リン酸カルシウムのVon Kossa染色により石灰化組織の存在についてアッセイした。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをDPBSで2回濯いだ。細胞を0.5 mlの10%ホルマリン(Sigma)で3〜5分間固定化し、次いで、蒸留水で4回濯いだ。次いで、0.5 mlの新たに調製した2%硝酸銀(Sigma)溶液を添加し、細胞を暗所で10分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を5回濯いだ。約0.5 mlの蒸留水を各ウェル上に置いた。プレートを、明るい光に15分間暴露した(光を反射させるためにプレートのすぐ下に白色背景を置いた)。プレートを再度5回蒸留水で濯ぎ、次いで、100%エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化した(Youngら、1991)。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ca2+、Mg2+を含まない緩衝液中に1%w/v [エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)]−テトラ酢酸(EGTA) (Sigma)(カルシウム特異的キレーター)を有する選択された培養物を1時間前処理することによって実施した(Humason, 1972)。
10% HS−3 を培養さらに添加し、サンプルを再インキュベートした。細胞懸濁物を150gで12分間、遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引し、ペレットを1.95 mlのDPBS−Ca2+−Mg2+培地に再懸濁した。次いで、細胞を血球計を使用して計数した。次に、細胞をDPBS−Ca2+−Mg2+で洗浄した。次いで、本発明者らは、5mlの1次IgGをEMEM10%HS−3中4℃でインキュベートした。IgGは40μl/106細胞CD−34 Aアイソトープであった。2本のマイクロ遠心管中、20μl/106細胞CD−34 Bアイソトープであった。次いで、サンプルをマイクロ遠心管中、4分間、150 gで遠心分離した。上清をアスピレーターで吸引し、ペレットを再懸濁し、DPBSで洗浄した。次いで、サンプルを再度遠心分離し、1%BSA、0.5%TW中で20分間ブロックした。次いで、サンプルを再度遠心分離した。次いで、2次IgGを添加し、20分間インキュベートした。次いで、サンプルをスピード3で4分間、遠心分離した。上清をアスピレーター吸引し、ペレットを0.5 ml培地で洗浄した。溶液を再度遠心分離し、上清をアスピレーターで吸引した。100 mlの媒体PBSをペレットに添加し、次いで、スライドあたり10μlを利用してサンプルを平板固定した。サンプルをアセトン、ETOH、加熱およびホルマリンで固定化した。次いで、サンプルを、ブルーフィルターを有する蛍光顕微鏡下で観察した。
77歳雌および37歳雄の外科サンプルから得られた骨格筋から間葉幹細胞を単離した。初代培養物は、単核星形細胞(推定多能性間葉幹細胞)および筋芽細胞を示した(図11A、11B)。トリプシンで細胞を遊離させ、ろ過し、凍結保存した後も平板固定時には2次培養物中の細胞は星形を保持した(図11C)。
結合組織は、繊維芽細胞のみから成ると考えられる。3T3細胞は、繊維芽細胞を出現させると思われるマウス胚組織から誘導される細胞株である。本発明者らは、プロトコールに従って3T3細胞を培養した。本発明者らは、ラット組織から多数の表現型に分化することができる細胞を単離することを開発した。Swiss 3T3細胞(American Type Culture Collection)を、Earle塩を有する最小必須培地(EMEM)+10%予め選択されたウマ血清中で培養した。細胞を、非特異的分化剤、10−l0〜10−6Mの範囲の濃度のデキサメタゾンで、4〜8週間処理した。対照にはデキサメタゾンを添加しなかった。いくらかの間葉表現型は培養物中で発生した:脂肪細胞(SudanブラックB染色);軟骨細胞(Alcianブルー染色、pH 1.0)、骨芽細胞(鉱物質に対するVon Kossa染色)、平滑筋細胞(a−平滑筋アクチンに対する抗体)、内皮細胞(アシル低密度リポタンパク質の取り込み)、および骨格筋筋管(線状多核細胞および支質ミオシンに対する抗体)。いくつかの細胞はまた、イソプロテレノール処理で拍動数が増加し、プロプラノロール(propanolol)処理で減少する2核拍動細胞を示した。本発明者らは、この細胞を仮定的に心筋細胞と同定した。3T3は、幹細胞の特徴を有するが、繊維芽細胞の特徴を有さない多数の間葉から誘導された表現型に分化することが可能である。従って、それらは、幹細胞の細胞生物学を診査し、成長および分化因子によって方向付けられる特定の組織型を研究するための簡単、簡便なアッセイを提供するのに極めて貴重な道具であり得る。特異的に細胞分化を指令する能力は、組織の修復において非常に大きな可能性を付与する。
細胞培養
125継代時のSwiss−3T3細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture’Collection)(Bethesda, MD)より入手した。到着時、細胞を融解し、最初に、Earl塩を有する89%Eagle最小必須培地(EMEM GIBCO,Grand Island, NY)、10%予め選択されたウマ血清、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000μペニシリン/10,000マイクログラムのストレプトマイシン硫酸、GIBCO)を含有する培地(pH 7.4)において皿あたり100, 000細胞で、予めウシゼラチン(EM Sciences, Cherry Hills, NJ)を被覆した100 mm皿に播種した。培養物を、湿潤95%空気/5%C02を含有するインキュベーター、37℃中に、細胞が密集状態になるまで配置した。
骨−Humasonに記載の通り、リン酸カルシウムのVon Kossa染色により石灰化組織の存在についてアッセイした。簡単に説明すると、培養培地を取り出し、プレートをDPBSで2回濯いだ。細胞を0.5 mlの10%ホルマリンで3〜5分間固定化し、次いで、蒸留水で4回濯いだ。次いで、1.5 mlの新たに調製した2%硝酸銀溶液を添加し、細胞を暗所で10分間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液を取り出し、蒸留水で細胞を5回濯いだ。約0.5 mlの蒸留水を各ウェル上に置いた。 プレートを明るい光に、光を反射させるための白色背景に対して15分間暴露した。プレートを再度5回蒸留水で濯ぎ、100%エタノールで迅速に脱水した。プレートをグリセリンゼリーで永久保存化した。リン酸カルシウムの存在の確認は、硝酸銀溶液中でインキュベーションする前に、Ca、Mgを含まない緩衝液中に1%重量/容積[エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)]−テトラ酢酸(カルシウム特異的キレーター)を有する選択された培養物を1時間前処理することによって実施した。
3T3細胞をATCCより入手し、解凍し、培養したところ、ほとんどが正常または3角形形態を有した。約1週間〜10日間の培養で密集状態に達した。細胞を凍結し、融解し、記載のように反復した。デキサメタゾンを伴わない対照培養物は、培養期間中を通して、継続して均一な星状形態を示した(図17A)。
培養物における組織の増殖は、後にin vivoでの使用のための生物学的組織の開発に転換することができる細胞生物学を理解するための非常に重要な有望性を有している。一般にSwiss 3T3細胞は、文献上繊維芽細胞と呼ばれている(Eldarら、1990;Linderら、1991)。しかし、3T3を、間葉幹細胞を単離するために開発されたプロトコールに従って培養した場合、3T3細胞は、デキサメタゾンで処理するといくらかの中胚葉表現型に発生する。
ヒト多能性幹細胞(老齢、回収後150細胞倍加でのPAL#3細胞株)を、10%HSおよび1%抗生物質/抗カビ剤を含有するOpti−MEM中1%ゼラチン化T−25フラスコあたり75×103細胞で播種した。24時間後、培地を、(対照)同培地または(実験)造血サイトカイン:2.5 U/mlエリトロポイエチン、10 ng/ml顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、10 ng/ml顆粒球コロニー刺激因子、10 ng/mlマクロファージコロニー刺激因子、50 ng/mlインターロイキン−3、50 ng/mlインターロイキン−6、50 ng/ml幹細胞因子、および2μg/mlインスリンを含有する同培地で置き換えた。培養物は、それぞれの培地において2週間ごとに給餌した。対照と比較して、3週間の実験処理により、ノーザンRNA/cDNA分析により示されるように、GM−CSFレポーターの発現が誘導された。
56およびMHCクラスIを提示する
毎年数百万人の人が組織の消失または終段階の器官不全を患う。同種療法は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。これらの療法は、深刻なドナーの不足、長期罹患率、および死亡率によって制限される。広範な移植、先天異常、選択術、および遺伝子異常は、HLAが一致したドナー組織の供給源として、自己由来の幹細胞による治療の能力を有する。本発明者らの現在の調査は、ヒト始原および多能性間葉幹細胞における細胞表面クラスター分化(CD)マーカーを特徴付けて、これらの細胞の比較的精製された集団の単離に役立てることをることを目的としている。本研究では、15 CDマーカーが存在するか能性について、胎児、成熟、および老齢個体から単離されたヒト多能性および始原細胞を試験した。インスリンおよびデキサメタゾンに対する応答は、細胞単離物が分化決定された始原細胞および分化未決定の多能性細胞から成ることを示した。フローサイトメトリーは、CD10、CD13、CD56、およびMHCクラスIマーカーに対して陽性ならびにCD3、CD5、CD7、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、およびCD65マーカーに対して陰性である細胞集団を示した。ノーザン分析は、細胞回収時のCD13およびCD56が有効に転写されたことを示す。本発明者らは、まず、これらのヒト間葉幹細胞上のCD10、CD13、CD56、およびMHCクラスI表面抗原の同定について報告する。
(材料および方法は、以下に記載のものは例外として、上記の実施例1に記載のとおりである。)
成体(雌性)、胎児(雄性および雌性)、および老齢(雄性および雌性)の5種のヒト細胞集団を、本研究に使用した。成体雌性細胞を、25歳ヒト皮膚繊維芽細胞[NHDF, catalog # CC−0252, lot # 6F0600, Clonetics, San Diego, CA]のサブ密集培養物として購入した。胎児雄性細胞を、大腿筋から誘導した22歳胎児骨格筋細胞[CM−SkM, catalog # CC−0231, lot #6F0604, Clonetics]のサブ密集培養物として購入した。胎児雌性細胞を、三頭筋から誘導した25週齢胎児骨格筋細胞[CF−SkM, catalog # CC−2561, lot # 14722, Clonetics]のサブ密集培養物として購入した。到着時に、細胞を平板培地−A(PM−A)に移した。PM−Aは、Earle塩、10%(v/v)予め選択されたウマ血清[ロット番号 17F−0218 (HS7) or 49F−0082 (HS4), Sigma Chemical Co., St. Louis, MO]、および1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン[10,000単位/mlペニシリンおよび10,000 mg/mlストレプトマイシン、GIBCO]を有する89%(v/v)Eagle最小必須培地[EMEM, GIBCO BRL, Grand Island, NY]、pH 7.4から成った。細胞を37℃で95%空気/5%CO2湿潤環境でインキュベートした。増殖後、0.0744%(w/v)エチレンジアミンテトラ酢酸[EDTA、Sigma]を含有するCa+2、Mg+2を含まないDulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水[GIBCO]中0.05%(w/v)トリプシン[DIFCO, Detroit, MI]で細胞を遊離させ、100×gで20分間、遠心分離し、上清をアスピレーターで吸引した。細胞ペレットをPM−Aに再懸濁し、細胞懸濁物を、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシド[DMSO, Morton Thiokol, Danvers, MA]を含有するPM−A中で−70〜80℃で緩徐に凍結保存した(Youngら、1991)。
CM−SkM、CF−SkM、NHDF、PAL#3、およびPAL#2細胞のアリコートを融解し、PM−Bを利用する1%ゼラチン被覆24ウェルの平板[Corning, Corning, NY]中ウェルあたり10,000細胞で個別に平板固定した。24時間後、PM−Bを取り出し、対照培地、インシュリン試験培地、またはデキサメタゾン試験培地のいずれかと置き換えた。対照培地は、0.01 mMβメルカプトエタノール、1%(v/v) HS3、および1%(v/v)抗生物質−抗カビ剤溶液を含有する98%(v/v) Opti−MEMから成った。インスリン試験培地は、2μg/mlインスリン[Sigma]を含有する対照培地から成った。デキサメタゾン試験培地は、98%Opti−MEM、0.01 mMβメルカプトエタノール、1%血清[HS3, HS9 (ウマ血清、ロット番号 90H−0701, Sigma)またはFBS (ウシ胎児血清、ロット番号 3000L, Atlanta Biologicals, Norcross, GA)]、および1%(v/v)抗生物質−抗カビ剤溶液から成った。この溶液では、デキサメタゾン[Sigma]を10−10、10−9、10−8、10−7Mとした(Youngら、1995;Young、1999;Youngら、1998)。6週間の間に、培地を1週間あたり3回交換した。表現型の変化について1週間あたり2回培地を観察し、写真撮影した。
CM−SkM、CF−SkM、NHDF、PAL#3、およびPAL#2細胞のアリコートを融解し、105細胞/1%ゼラチン被覆T−75フラスコでPM−Bに播種し、37℃で95%空気/5%CO2湿潤環境で増殖させた。増殖後、トリプシンで細胞を遊離させ、PM−Bに再懸濁した。次いで、細胞を遠心分離し、1×106細胞/mlの濃度で洗浄緩衝液に再懸諾した。洗浄緩衝液は、1%(w/v)FBSおよび1%(w/v)アジ化ナトリウム、NaN3 [Sigma]を補充したリン酸緩衝液から成った。トリパンブルー[GIBCO]染料除外技術(Yongら、1993;Yongら、1991)により細胞生存度は>95%であった。100マイクロリットルの細胞調製物(1×105細胞)を、飽和濃度のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE)、またはペルジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)結合CD3、CD5、CD7、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、CD56、CD65、MHCクラスIまたはイソタイプ一致対照[Becton−Dickinson, Inc., San Jose, CA]で染色した。簡単に説明すると、細胞を暗所で30分間、4℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄緩衝液で3回洗浄し、フローサイトメトリー上での分析のために0.5 mlの洗浄緩衝液に再懸濁した。FACScan(商標)(Becton−Dickinson)上でフローサイトメトリーを実施した。光散乱によって細胞を同定した。10,000ゲート制御事象における蛍光の対数を評価した(4十進計、1024チャンネルスケール)。LYSYS II(商標)ソフトウェア(Becton−Dickinson)を使用して分析を実施し、適切なイソタイプ対照と比較してそれぞれの抗原の有無を決定した。蛍光がイソタイプ対照よりも25%を超えて大きい場合は抗原事象をゲート制御した。5種の間葉幹細胞株から得られたプールされたフローサイトメトリーデータについて、統計解析を実施した。従って、それぞれのCDマーカーに対して5種のサンプルサイズを使用した。10,000ゲート制御事象あたりの細胞の絶対数を表10に示す。平均値が1000細胞を超えたら任意のCDマーカーについて陽性とみなした。
CM−SkM、NHDF、およびPAL#3細胞のアリコートを融解し、105細胞/1%ゼラチン被覆T−75フラスコでPM−Bに播種し、37℃で95%空気/5%CO2湿潤環境で増殖させた。培養後、細胞をトリプシンで遊離させ、凍結保存した。得られた上清をアスピレーターで吸引し、細胞ペレットを凍結し、−80℃で保存した。細胞ペレットを氷上で融解し、製造者の取扱説明書に従い、Qiagen QIAシュレッダー [catalog #79654, Qiagen, Chatsworth, CA]およびRNeasy総RNAキット[catalog #74104, Qiagen]を使用して、総RNAをCF−SkM、NHDF、およびPAL#3細胞から抽出した。. CD10、CD13、CD56およびβアクチン(それぞれI. M. A. G. E. Consortium Clone ID : 701606、713961、468885、および586736、Research Genetics, Huntsville, Al)のI. M. A. G. E. Consortium (LLNL) cDNAクローン(Lennonら、1996)を得た。制限消化によって、プラスミドからcDNA挿入物を切り出し、標準的な手順(Sambrookら、1989)に従ってアガロースゲル電気泳動により分離した。製造者の取扱説明書に従い、Qiaex IIゲル抽出キット[catalog #20021, Qiagen]を使用して、cDNAのバンドを使用した。Prime−Itランダムプライマー標識キットKit[catalog #300385, Stratagene, La Jolla, CA]を使用して、3,000 Ci/mMα[32P]−dCTP[catalog number AA0005, Amersham, Arlington Heights, IL]の取り込みによりcDNAを標識した。
細胞の同定
分析にインスリンおよびデキサメタゾンを使用して、ヒト胎児、成熟、および老齢細胞集団内に存在する細胞の正体を試験した。5種すべてのヒト細胞集団において、骨格筋筋管、脂肪細胞、軟骨小節、および骨小節に一致する形態学がインスリンまたはデキサメタゾンによる処理で生成された。しかし、インスリンよりもデキサメタゾンの方が、誘導される形態の百分率が高かった(表9、図22A〜D)。データは、始原細胞(インスリンにより加速された形態)および多能性細胞(デキサメタゾンにより加速された形態)の両方が25歳雌性表皮、22週齢胎児雄性および25週齢胎児雌性(生前)骨格筋結合組織、ならびに67歳雄性および77歳雌性骨格筋結合組織に存在することを示唆する。
ヒト始原細胞および多能性細胞によって発現される細胞表面抗原については不明であるため、本発明者らは、フローサイトメトリーと組み合わせた免疫化学によりCD3、CD5、CD7、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、CD56、CD65、およびMHCクラスIの存在について5種の細胞集団を分析した。この強力な技術により、本発明者らは多量の細胞を比較的迅速かつ容易に試験することができた。試験したすべてのヒト細胞集団は、CD10、CD13、CD56、およびMHCクラスIの細胞表面発現について陽性であり、CD3、CD5、CD7、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD45、およびCD65については陰性であった(表10、図23および24)。データは、CD10(中性脂肪)、CD13(アミノペプチダーゼ)、CD56(神経細胞接着分子、140kDaイソ型)、ならびに胎児(雄および雌)、成体(雌)、および老齢(雄および雌)年齢におけるこれらのヒト細胞の細胞表面に位置する腫瘍組織適合性クラスI抗原を示した。
CD10(中性脂肪)、CD13(アミノペプチダーゼ)、およびCD56(神経細胞接着分子、140kDaイソ型)が回収時の細胞によって転写されるかどうかを決定するために、CF−SkM、NHDF、およびPAL#3サンプル由来の総RNAを、ヒトCD10、CD13、およびCD5632P標識cDNAをプローブとして使用するノーザンブロット技術によって分析した。細胞回収時のCDマーカーの転写において様々なパターンが観察された(表10、図28)。3種のすべての細胞株においてCD56−mRNAへの強力なcDNA結合が観察され、3種のすべての細胞株において神経細胞接着分子イソ型の有効な転写が示唆された。CD13−mRNAへのcDNAは弱い(CF−SkM)、強い(NHDF)、または存在しない(PAL#3)かのいずれかであり、異なる細胞株内のアミノペプチダーゼの転写にばらつきがあることが示唆された。CD 10 mRNAへのcDNA結合は、試験した3種のいずれの細胞株においても認められなかった。この所見は、2つの可能性を示唆している:CD10のmRNAは、細胞回収時に転写されなかったか、またはCD10のmRNAの量がアッセイの検出限界未満であったかのいずれかである。
毎年数百万人の人々が組織の消失または終段階の器官不全を患う(LangerおよびVacanti、1993)。これらの患者のための米国の国民医療費の合計は、1年あたり4千億ドルを超えている。現在、米国では、これらの障害を治療するために年間8百万を超える外科手順が実施されており、4千万〜9千万の病院日数が必要である。これらの外科手順は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。組織移植および外科的介入などの選択肢は深刻なドナー不足および長期の病的状態、および死亡のために厳しく制限されている。ドナー不足は毎年悪化し、必要な臓器の待機リストに掲載されながら死亡する患者の数が増加している。広範な移植、先天異常、選択術、疾患、および遺伝子異常は、ドナー組織の供給源として、自己由来の幹細胞単独または他の薬剤との組み合わせでの治療の能力を有する。好ましい治療は、組織消失の治療であり、ここで、目的は移植に利用可能な細胞数を増加し、それによって失われた組織を置換するかまたはex vivo遺伝子療法のための十分な細胞数を提供することである。自己由来の細胞を使用すれば、同一のHLA一致が得られ、同種異系移植および免疫抑制治療に伴う病態および死亡が妨げられるはずである。
本研究において利用されるヒト胎児、成体、および老齢細胞によって発現される特定の細胞表面部分CD10、CD13、CD56、およびMHCクラスIの機能的重要性については、現在のところまだ不明である。しかし、CD10、CD13、およびCD56は、造血系内の分化された細胞および早期幹細胞の両方において発現されることは既知である(Kishimotoら、1997)。細胞表面中性エンドペプチダーゼ(CD10)は、汎急性リンパ性白血病(CALLA)細胞、早期リンパ球始原細胞、成熟顆粒球、および好中球を同定する方法としてクラスター分化(CD)マーカーに対する抗体およびフローサイトメトリーと共に利用されている(Kishimotoら、1997)。この膜関連亜鉛金属ペプチダーゼは、エンケファリン、化学走性ペプチド、サブスタンスP、ニューロテンシン、オキシトシン、ブラジキニン、ならびにアンジオテンシンIおよびIIを含む広範な調節ペプチドホルモンを不活化することが明らかにされている(Shippら、1989;Shippら、1991a;Llorens−Cortesら、1992;Casaleら、1994)。
上記の4種の陽性染色細胞表面抗原とは対照的に、以下の11種の抗原は、胎児、成体、および老齢ヒト間葉幹細胞の細胞表面上には存在しないことが認められた。これらのマーカーは、CD3、CD5、CD7、CD11b、CD14、CD15、CD 16、CD 19、CD25、CD45、およびCD65であった。.この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。しかし、これらの特定の細胞表面抗原は、造血系(Kishimotoら、1997)、即ち、T細胞(CD3、CD5、CD7、CD11b、CD25、CD45)、B細胞(CD5、CD11b、CD19、CD25、CD45)、胸腺細胞(CD7)、顆粒球(CD11b、CD14、CD15、CD16、CD45、CD65)、単球(CD11b、CD14、CD16、CD25、CD45)、濾胞樹状細胞(CD 19)、および成熟赤血球(CD45)にのみ存在するとされている。
ここでは、ヒト間葉幹細胞上の13種の細胞表面クラスター分化マーカーのプロフィールについて詳細に報告する。間葉幹細胞の単離、冷凍保存、および発達のための以下の標準的なプロトコールに従い、胎児、および老齢個体から細胞を単離した。それぞれの個体由来の間葉幹細胞集団は、始原および多能性幹細胞の両方から成った。30細胞倍加での間葉幹細胞の結果は、CD34およびCD90については陽性染色、ならびにCD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD36、CD38、CD45、CD117、グリコホリンA、およびHLA−II(DR)については陰性染色を示した。各細胞株からRNAを抽出し、電気泳動し、ノーザン分析を使用して、CD34およびCD90に対する32P−標識cDNAをプローブとして検出した。結果は、細胞回収時にCD90が有効に転写されたことを示す。本発明者らは、ヒト間葉幹細胞上でのCD34およびCD90細胞表面抗原の最初の同定について報告する。
ヒト間葉幹細胞
本研究では、6種の幹細胞集団を使用した。2種は胎児ドナー(1つの雌および1つの雄)、2種は成熟ドナー(両方とも雌)、および2種は老齢ドナー(1つの雌および1つの雄)から採取した。細胞は、2つの異なる結合組織画分(真皮および骨格筋関連の結合組織)から誘導した。ヒト組織を回収するためのプロトコールは、Institutional Review Board at the Medical Center of Central Georgia, Macon, GAにより承認されたものである。
始原および/または多能性幹細胞の存在を決定するために、インスリンおよびデキサメタゾンを使用して、発達した細胞を試験した(Youngら、1998b)。本バイオアッセイでは、インスリンは始原幹細胞において表現型発現を加速するが、多能性幹細胞の表現型発現の誘導に対しては効果を示さない。対照的に、デキサメタゾンは、多能性幹細胞において分化決定および発現を誘導するが、始原幹細胞における表現型発現を変更しない。従って、始原細胞のみが培養物中に存在する場合、インスリン中でインキュベートされた培養物について発現された表現型は、デキサメタゾンと共にインキュベートした培養物と比較して差異は認められない。始原細胞および多能性細胞の療法を含有する培養物を混合する場合、デキサメタゾンで処理した培養物において発現された表現型の量は、インスリンで処理した培養物と比較してより大きい。さらに、発現された表現型の数の増加が観察され得る。培養物が多能性細胞のみを含有する場合、インスリンで処理した培養物において表現型の発現は認められない。デキサメタゾンで処理した同様の培養物は、多数の発現された表現型を示す。このように、インスリンおよびデキサメタゾンによる処理の効果を比較することにより、不明な細胞群内の始原および多能性幹細胞の特定の型を同定することができる(Youngら、1992, 1993,1995,1998a, b, 1999;Lucasら、1993,1995;Pateら、1993;Rogersら、1995;Warejckaら、1996)。
回収後、30細胞倍加時のCM−SkM、CF−SkM、NHDF1、NHDF2、PAL#3および細胞PAL#2 のアリコートを融解し、105細胞/1%ゼラチン被覆T−75フラスコでプレー化培地−B、(PM−B)に播種し、37℃で95%空気/5%CO2湿潤環境で増殖させた。培養後、細胞をトリプシンで遊離させ、PM−Bに再懸濁した。次いで、細胞を遠心分離し、洗浄緩衝液(1%FBS [HyClone] および1%(w/v)アジ化ナトリウム、NaN3 [Sigma]を補充したCa+2, Mg+2 [Cellgro, MediaTech] を含有しないDulbeccoリン酸緩衝化生理食塩水)に、1×106細胞/mlで再懸濁した。Trypanブルー染料[GIBCO]排除技術(Youngら、1993、Youngら、1991)により細胞生存度は> 95%であった。100マイクロリットルの細胞調製物(1×105細胞)を、飽和濃度のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE)、またはペルジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)結合CD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD34、CD36、CD38、CD45、CD90、CD117、グリコホリン−AおよびHLA−II(DR)、またはイソタイプ一致対照[Becton−Dickinson, Inc., San Jose, CA]で染色した。簡単に説明すると、細胞を暗所で30分間、4℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄緩衝液で3回洗浄し、0.5 mlの洗浄緩衝液に再懸濁した。FACScan(商標)(Becton−Dickinson)フローサイトメーター上でフローサイトメトリーを実施した。光散乱によって細胞を同定した(図29)。10,000ゲート制御事象における蛍光の対数を評価した(4十進計、1024チャンネルスケール)。LYSYS II(商標)ソフトウェア(Becton Dickinson)を使用して分析を実施した。適切なイソタイプ対照と比較して染色の有無を決定した。25%を超える染色がイソタイプ対照を超えている場合、ゲート制御事象はCDマーカーに対する染色の存在があると評価した。5種の間葉幹細胞株から得られたプールされたフローサイトメトリーデータについて、統計解析を実施した。10,000ゲート制御事象あたりの細胞の絶対数を表11に示す。平均値が1,000ゲート制御細胞を超えたら任意の所定のCDマーカーについて陽性とみなした。
唯一生物学的に有意な結果はマーカーCD34およびCD90であった。これらを、胎児期ヒト組織から誘導される標本および生後ヒト組織から誘導される標本の2つに分けた。ABSTATコンピュータプログラム(Anderson−Bell Corp., Arvada, CO)を使用して、一方向分散分析により2つのグループを解析した。
回収後30細胞倍加のCM−SkM、NHDF、およびPAL#3細胞のアリコートを融解し、105細胞/1%ゼラチン化T−75フラスコで平板培地−Bに播種し、37℃で95%空気/5%CO2湿潤環境で増殖させた。増殖後、トリプシンで細胞を遊離し、遠心分離し、上清をアスピレーターで吸引し、細胞ペレットを凍結し、−80℃で保存した。細胞ペレットを氷上で融解し、製造者の取扱説明書に従い、Qiagen QIAシュレッダー [catalog #79654, Qiagen, Chatsworth, CA]およびRNeasy総RNAキット[catalog #74104, Qiagen]を使用して、総RNAをCF−SkM、NHDF、およびPAL#3細胞から抽出した。. CD34、CD90およびβアクチン(それぞれI. M. A. G. E. Consortium Clone ID : 770858、714060、および586736、Research Genetics, Huntsville, Al)のI. M. A. G. E. Consortium (LLNL) cDNAクローン(Lennonら、1996)を得た。制限消化によって、それぞれのプラスミドからcDNA挿入物を切り出し、標準的な手順(Sambrookら、1989)に従ってアガロースゲル電気泳動により分離した。製造者の取扱説明書に従い、Qiaex IIゲル抽出キット[catalog #20021, Qiagen]を使用して、それぞれのcDNAのバンドを使用した。Prime−Itランダムプライマー標識キットKit [catalog #300385, Stratagene, La Jolla, CA]を使用して、3, 000 Ci/mMα[32P]−dCTP[catalog number AA0005, Amersham, Arlington Heights, IL]の取り込みによりcDNAを標識した。
幹細胞の同定
インスリン及びデキサメタゾンを使用しする比較/対比分析によって、雄性及び雌性ヒト胎児、成熟、、及び老齢細胞集団内に存在する推定細胞の正体を試験した。骨格筋筋管、脂肪細胞、軟骨小節、及び骨小節に一致する形態学的外観における少数の表現型の変化は、インスリンによって生じた。多量の類似の表現型変化は、デキサメタゾンによる処理によって生じた。デキサメタゾンは、筋肉、脂肪、軟骨、骨、結合組織、及び内皮細胞に関する表現型発現を誘導した。骨格筋、平滑筋、及び心筋表現型は、抗体染色に基づいて認識された。これらの細胞も、骨格筋、筋幹、脂肪細胞、軟骨小節、及び骨小節に類似した。これらの形態学的変化は、30細胞倍加の6つのすべてのヒト幹細胞集団において生じた。80細胞倍加では、インスリンは細胞に影響を及ぼさないが、デキサメタゾンは細胞の表現型発現を変化した(図26A〜D)。データは、始原細胞(インスリンにより加速された形態)及び多能性細胞(デキサメタゾンにより加速された形態)の両方が22週齢胎児(生前)雄性及び25週齢胎児雌性(生前)骨格筋結合組織、25歳雌性表皮、67歳雄性及び77歳雌性骨格筋結合組織から単離される推定ヒト幹細胞の30細胞倍加後の集団に存在したという仮説を支持する。
ヒト間葉幹細胞集団によって発現されるクラスター分化細胞表面については不明であるため、本発明者らは、CD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD34、CD36、CD38、CD45、CD90、CD 117、グリコホリンA、及びHLA−II(DR)の存在について、フローサイトメトリーと組み合わせた免疫化学によって、5種の細胞集団を分析した。この強力な技術により、本発明者らは多量の細胞を比較的迅速かつ容易に試験することができた。すべてのヒト幹細胞は、CD90について陽性染色を示した。CD34に対する陽性染色は、NHDF(成体ヒト雌性NHDF1及びNHDF2)、PAL#3(老齢ヒト雄性)、及びPAL#2(老齢ヒト雌性)由来の生後幹細胞によって示された。CD34に対する陰性染色は、CM−SkM(胎児ヒト雄)及びCF−SkM(胎児ヒト雌)由来の胎児期幹細胞によって示された。生後成体NHDF1及びNHDF2及び老齢(PAL#3及びPAL#2)細胞集団は、二重CD34/CD90染色を発現したが、胎児(CM−SkM及びCF−SkM)集団はCD90のみを発現した。CD34及びCD90の両方に対する抗体について分析すると、NHDFl 集団はCD34及びCD90の両方に陽性な2520細胞ならびにCD90のみに陽性な6979細胞を発現した。NHDF2はCD34及びCD90の両方に陽性な7320細胞ならびにCD90のみに陽性な1539細胞を発現した。同じ技術を使用したところ、PAL#3はCD34及びCD90の両方に陽性な3430細胞ならびにCD90のみに陽性な6069細胞を含有した。PAL#2はCD34及びCD90の両方に陽性な1880細胞ならびにCD90のみに陽性な6360細胞を含有した。CM−SkMはCD34及びCD90の両方に陽性な1細胞ならびにCD90のみに陽性な9549細胞を含有した。CF−SkMはCD34及びCD90の両方に陽性な180細胞を発現したが、CD90のみに陽性な8680細胞を発現した。CD34には陽性であるがCD9には陰性であるような細胞は試験した集団では認められなかった。CD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD36、CD38、CD45、CD117、グリコホリンA、及びHLA−II(DR)(表11、図27〜29)については試験したすべての集団が陰性であった。
CD34及びCD90が回収時に細胞によって有効に転写されたかどうかを決定するために、プローブとしてヒトCD34及びCD90 cDNAを使用するノーザンブロット技術によって、CF−SkM、NHDF、及びPAL#3サンプル由来の総RNAを分析した。細胞回収時のCDマーカーの転写において様々なパターンが観察された(表11、図30)。試験した3種の細胞株のいずれにおいてもCD34−mRNAに結合するcDNAは認められず、回収時に有効な転写が生じないか、又はCD34のmRNAの量がアッセイの検出限界未満であることが示唆された。CD90−mRNAに結合するcDNAは、強力(CF−SkM及びNHDF)か又は弱い(PAL#3)のいずれかであったことから、それぞれの細胞株内ではCD90に対する転写パターンが同様であることが示唆された。
ヒト間葉幹細胞におけるCDマーカーの陽性染色
ヒト胎児、成体、及び老齢間葉幹細胞によって発現される細胞表面クラスターマーカーCD34及びCD90の機能的重要性については、現在のところまだ不明である。
CD34及びCD90に関する所見とは対照的に、11種の抗原が、胎児、成体、及び老齢ヒト間葉幹細胞の細胞表面上には存在しないことが認められた。これらのマーカーはCD3、CD4、CD8、CD11c、CD33、CD36、CD38、CD45、CD117、グリコホリンA、及びHLA−II(DR)であった。この所見の重要性についてはこの時点では知られていない。しかし、これらの特定の細胞表面CD抗原は、CD3、CD4、CD8、CD45、及びCD117の存在が原因であるとされている(Kishimotoら、1997)。単球/マクロファージはCD11c、CD36、CD38、CD45、CD117、及びHLA DR−IIを示している(Kishimotoら、1997)。ナチュラルキラー細胞はCD11c、CD38、CD45、及びCD117を示している(Kishimotoら、1997)。顆粒球はCD11c、CD36、CD38、CD45、及びCD117を示している(Kishimotoら、1997)。骨髄性始原細胞はCD33、CD38、CD45、及びCD117を示している(Kishimotoら、1997)。赤血球はグリコホリンAを示している(Kishimotoら、1997)。いくつかのニューロン細胞はCD38及びHLA DR−IIを示している(Mizguchiら、1995;Rohnら、1996)。
毎年数百万人の人々が組織の消失又は終段階の器官不全を患う(Langer及びVacanti、1993)。これらの患者のための米国の国民医療費の合計は、1年あたり4千億ドルを超えている。現在、米国では、これらの障害を治療するために年間8百万を超える外科手順が実施されている。これらの治療には4千万〜9千万の病院日数が必要である。これらの療法は数えきれないほどの生命を救い、改善するが、それらは完全に解決しているわけではない。組織移植及び外科的介入などの選択肢は深刻なドナー不足及び可能な長期の病的状態のために厳しく制限されている。ドナー不足は毎年悪化し、必要な臓器の待機リストに掲載されながら死亡する患者の数が増加している。広範な外傷、先天異常、疾患、及び遺伝子異常は、ドナー組織の供給源として、自己由来の間葉幹細胞によって治療される可能性がある。組織消失を治療する場合、消失した組織を置き換えるための移植に利用できる細胞数を増やすことが所望される。ex vivo遺伝子療法のための細胞数を増加させるための手順も所望される。自己由来の幹細胞を使用する1つの有益性は、それらが同一のHLA一致を提供することができ、病態及び死亡に関連する免疫抑制療法の必要性が防止されることである。第2の有益性は、多能性細胞に関連する広範な細胞増殖の可能性である。多能性幹細胞は、分化決定誘導前の細胞数を顕著に増加することができる。分化決定誘導後、得られる始原幹細胞は、次いで、プログラムされた細胞老化が生じる前にさらに50〜70細胞倍加増殖することができる。移植及び/又は遺伝子治療に利用できる組織数に限りがある場合、これらの2つの幹細胞集団の増殖特性は極めて重要である。
分離した多能性幹細胞の中胚葉への分化能のキャラクタリゼーションを行う過程で、全く異なる非中胚葉性表現型の存在さえ示唆する異種形態を観察し、それに注目した。Youngら、1991,1992a; Lucasら、1995 の記載に従って、凍結保存で単離したヒト細胞を10−7Mもしくは10−8Mのデキサメタゾン中で増殖させ、培養18日間後に、破骨細胞様細胞(造血系列)(図31A)及び神経細胞(図31B及びC)を観察した。同様に10−6Mのデキサメタゾン中で増殖させたマウス3T3細胞の場合は、マクロファージに似た大型細胞を培養9日後に観察した。ラット細胞は10−7Mのデキサメタゾン中で増殖させ、大型細胞を確認した。
分離及び増殖 老人男性細胞は、PAL3と命名し、間葉幹細胞16,18を分離及び培養するための基準プロトコルに従って、67歳の被験者から採取した骨格筋標本から分離した。
凍結保存した細胞を融解し、1ウェルにつき1×103細胞を1%ゼラチン含有96穴ウェルの平板(Cornig、コーニング、ニューヨーク州)15,16に撒いた。前記細胞系を非誘導CMのみか、又はインスリンとデキサメタゾンの両方もしくはそのどちらか一方を添加したCMを使用して、比較又は対照分析システムで培養し、誘導された表現型発現7、15を確かめた。この測定法において、インスリンは、分化決定済み前駆細胞の表現型発現を促進するが、多能性幹細胞での分化決定やその後の表現型発現の誘導には影響がない。対照的に、デキサメタゾンは、多能性幹細胞での分化決定や表現型発現を誘導するが、前駆幹細胞の表現型発現を変えない。
製品の指示書又は記載に従って培養した。21 胚性細胞、神経組織の外胚葉マーカー、表皮、筋肉の中胚葉マーカー、軟骨、骨、線維芽細胞、内皮性細胞、内胚葉性マーカーに特異的な下記の一次抗体で染色した。1)胚性細胞:段階特異的胚性抗原―1[MC―480、発生生物学研究室ハイブリドーマ・バンク(Developmental Studies Hybridoma Bank)、アオイワシティ、アイオワ州、DSHB]、段階特異的胚性抗原―3[MC―631,DSHB]、段階特異的胚性抗原―4[MC―813−70, DSHB]、ヒト癌胎児性抗原[HCEA, Sigma]、癌胎児性抗原[CD66, Vector Laboratories,Inc. バーリンゲーム、カリフォルニア州];2)神経組織の外胚葉マーカー:神経前駆細胞[FORSE―1, DSHB]、ネスチン−1[HNES、Chemicon、テメキュラ、カリフォルニア州]、ネスチン−2[Rat―401, DSHB]、ネスチン−3[MAB353, Chemicon]、ニューロン[8A2, DSHB]、ニューロン・マーカー[S―100,Sigma]、神経膠[CNPase, Sigma]、 ニューロフィラメント[RT97, DSHB]、ニューロフィラメント−200[N―200, Sigma]、表皮:ケラチノサイト[VM―1,DSHB];3) 筋の中胚葉マーカー:ミオゲニン [F5D, DSHB]、サルコメアミオシン[MF―20, DSHB]、速筋型骨格筋ミオシン [MY―32, Sigma]、ミオチン重鎖[ALD58, DSHB]、ミオシン強鎖[A4.74, DSHB]、 平滑筋αアクチン[1A4,Sigma]、軟骨:11型コラーゲン[CIICI,DSHB]、11型コラーゲン[II―4CII, ICN BiomedicalsInc、オーロラ、オハイオ州]、IX型コラーゲン[D1―9,DSHB]、骨: 骨サイアロン・プロテイン−11[WV1D1,DSHB]、オステポンチン[MP111,DSHB]、線維芽細胞:ヒト線維芽細胞特異的タンパク質 [1B10,Sigma]、内皮細胞:内皮細胞表面マーカー[P 1 H 12, Accurate、ウェストベリー、ニューヨーク州]、PECAM [P2B1,DSHB]、VCAM [P8B1,DSHB]、E−セレクチン [P2H3,DSHB]、ヒト特異的CD34シアロムチン[HCD34]; 3) 内胚葉マーカー:ヒト特異的α−フェトプロテイン[HAFP,Vector]、ヒト特異的胃腸フェイステル上皮特異的抗原[HESA,Sigma] 。二次抗体は、ビオチン抗羊IgG抗体 [Vector]、もしくはビオチン抗マウスIgG 抗体[Vector]からなるか、又はVecstatin ABC Kit [Vector]に含まれる。第三プローブは、Vecstatin ABC Kit [Vector]に含まれるアビジン−HRPからなる。ペルオキシダーゼ(Peroxidase) [blue,Vector]用の不溶性HRP培養基であるSubstrate Kit、DAB Substrate、 及び AEC Staining Kit [red,Sigma]を用いて、抗体結合を視覚化した。様々な色の培養基を使い、同じ培養ウェルで多種多様な染色を連続して実施可能にした。
上記に記載のように培養を続けた。15、22 pH1.0のアルシアンブルー6,16,23を用い、軟骨の特性であるコンドロイチン・サルフェイト及びケラタン・サルフェイト・プロテオグリカンを同定した。スダンブラックB及びオイルレッドーO染色法6、16,22,23を用い、脂肪細胞の特性である中性飽和脂質を同定した。フォン・コッサ染色法6,16,23を用い、骨の特性であるリン酸カルシウムを同定した。
細胞は、継代17代目 (NHDF2) 及び39代目 (PAL3)を各々経て、進行性の増殖16,20をした。NHDF2は70回を超える細胞倍加、PAL3は200回を超える細胞倍加をし、その平均倍加時間は12〜24時間で、1世代あたり4〜6倍加をした。上記のように、細胞を調べた。結果を前記に記載したように評価した。前記細胞系は、ヘイフリックの限界(Hayflick’s Limit)を超えて増殖後も、胚様細胞の同一性も、また誘導能力も消失しなかったことがこれらの結果から示唆される。
36年齢ヒト真皮線維芽細胞(CF―NHDF2, catalog #CC―2511,lot #16280,Clonetics,サンディエゴ、カリフォルニア)を亜密集的な培養物として女性成体真皮細胞を獲得した。到着後直ぐに、前記細胞を、平板培養C(PM―C)に移した。PM―Cは、89% (v/v) のOpti―MEM 基底培養(catalog #22600―050, GIBCO)からなり、その成分は0.01 mMの β―メルカプトエタノール(Sigma) 、10% (v/v)ウマ血清(HS9,lot number 90H―0701,Sigma)、 1%の抗真菌性抗生物質溶液(GIBCO)、2U/ml ADF (抗分化因子、 MorphoGen Pharmaceuticals,Inc.ニューヨーク、ニューヨーク州)で、pH 7.4とした。細胞を、空気95%/二酸化炭素5%、37℃の給湿性の部屋におき、1週間に3回培地を交換して、増殖させて融合状態にした。細胞をトリプシンで放出し、基準プロトコルに従って凍結保存した。凍結した細胞を融解し、PM−C培地内に播き、融合状態まで増殖させ、トリプシンで放出し、再び培地に置き、融合段階まで増殖させた。細胞を採取した。インスリンーデキサメタゾン分析及びフローサイトメトリ(流動細胞光度測定法)用に、細胞に継代番号を付けて収集した。
以下の形態について、細胞を分析したのち培養物をスクリーニングした。:細胞質に対する細胞核の比率が大きい小星状細胞(潜在的幹細胞)、双極細胞(潜在的筋芽細胞)、紡錘細胞(潜在的線維芽細胞)、多核性直線細胞及び多核性分岐細胞(潜在的骨格筋管)、細胞内フィラメントを有する単核多角形細胞(潜在的平滑筋細胞)、細胞内フィラメントを有する二核多角形細胞 (潜在心筋細胞)、屈折細胞内小疱を有する単核細胞(潜在的脂肪細胞)、細胞内小疱を持たない単核細胞(潜在的内肺葉細胞)、丸石型様表現型の単核シート状細胞(潜在的内肺葉細胞)、細胞周囲のマトリックス・ハロー(暈)を有する円形細胞(潜在軟骨細胞、細胞周囲のマトリックス・ハロー(暈)を有する円形細胞の集合体(潜在的軟骨小節)、3次元マトリックス・ハロー(暈)を胞埋する円形集合細胞(潜在骨小節)、網目状の細胞過程を有する単核細胞(潜在的ニューロン細胞)
各製品の指示書もしくは(Young et al.1998b)の記載に従って培養を行った。培養物は、胚マーカー(アルカリ性ホスファターゼ)で以下のように染色した。軟骨(コンドロイチン・サルフェイト・プリテオグリカン及びケラタン・サルフェイト・プリテオグリカン)には、コンドロイチナーゼAC(ICN Biomedicals,クリブランド、オハイオ州)又はケラタナーゼ(ICN Biomedicals)の分解と共にアルシアンブルー(Alcian Blau 8GS,Chroma―Gesellschaft, Roboz Surgical Co.)とサフラニンO(Chroma Gesellschaft)をpH1.0として用い、細胞周囲と細胞外の両方又はそのどちらか一方のマトリックスにあるコンドロイチン・サルフェイト・グリコサミノグリカン又はケラタン・サルフェイト・グリコサミノグリカンの産生を検証した。脂肪細胞(中性飽和脂質)には、スダンブラックB(Roboz Surgical Co.ワシントン市.)及びオイル・レッドO(Sigma) を用い、骨(リン酸カルシウム)に対しては、前処理としてのEGTA(エチレングリコール・ビス・ [β―アミノエチルエーテル] N,N,N’,N’−テトラ酢酸、Sigma)と混合して、フォン・コッサ染色(Silber Protein, Chroma―Gesellschaft) を用い、推定上の石灰化した骨のスピクラ内にリン酸カルシウムの産生を検証した。純アルシアンブルー(Perf―AB)は Fisher―Aldrichから購入した。pH1.0の アルシアンブルー(AB 1. 0)と サフラニンO(SO 1. 0)とスダンブラックB(SBB)と フォン・コッサ(vK) は、Chroma―Gesellschaft (Roboz)から購入した。
(Young et al. 1992b)の記載もしくは各製品の指示書に従って培養を行った。筋、軟骨、骨、内皮細胞の指標となる中胚葉マーカー、外胚葉マーカー、及び内胚葉マーカーのそれぞれに特異的抗体で培養物を以下のように染色した。中胚葉マーカー:筋(ミオゲニン [F5D,発生生物学研究室ハイブリドーマバンク,DSHB]、サルコメアミオシン[MF―20,DSHB]、速筋型骨格筋ミオシン[MY―32, Sigma]、ミオチン重鎖[ALD―58, DSHB]、ミオシン強鎖[A4.74,DSHB]、平滑筋 (平滑筋αアクチン[1A4, Sigma])、軟骨(11型コラーゲン[CIIC1, DSHB] とIX [D1―9, DSHB])、骨(骨サイアロン・プロテイン [WV1D1, DSHB]、オステオポンチン[MP111,DSHB])、内皮細胞(内皮細胞表面マーカー[H Endo,Accurate]);外胚葉マーカー: (内皮細胞[151―Ig, DSHB]、神経前駆細胞[FORSE―1, DSHB]、ネスチン[RAT―401,DSHB]、ニューロフィラメント[RT97, DSHB]、ニューロン[8A二,DSHB]);内胚葉マーカー:(α−フェトプロテイン [HAFP,Chemicon]、上皮細胞[HA4cl9, DSHB])
抗体 GAL―13、1A4、MY32、DE―U―10、HCEA、HESA、HFSP、CNPase、S―100、N―200、OROは、Sigmaから購入した。H―Endoは、AccurateScientificから購入した。HNESとMAB353はChemiconから購入した。HC―IIはICNから購入した。H―AFP、H―CD34、H―CD66、ALK―PHOSは、Vector Laboratoriesから購入した。MF―20はD.A.Fischmanによって、F5DはW.E.Wrightによって、 WV1D1はM. SolurshとA.Frazenによって、MP111はM.SolurshとA.Frazenによって、CIIC1はR.HolmdahlとK.Rubinによって、D1―9はX.―J.YeとK.Teratoによって、FORSE―1はP.Pattersonによって、RT97はJ.Woodによって、8A2はV.Lemmonによって、RAT―401は、S.Hockfieldによってそれぞれ開発され、(米国)分子遺伝学研究室(NICHD)の支援で開発された発生生物学研究室ハイブリドーマ・バンクからすべて入手し、アイオワ市のアイオワ大学生物科学部(The University of Iowa DepartmentofBiological Sciences,Iowa City,IA 52242)で保有し、MC―480、MC―631、MC―813−70はすべて認識胚性抗原であり、またすべて発生生物学研究室ハイブリドーマ・バンクから入手した。ALD―58、A4.74、P2B1、P8B1、P2H3、 VM―1もまた発生生物学研究室ハイブリドーマ・バンクから入手した。
拡大自己更新及び多系列分化の能力をもつ多能性幹細胞は、細胞分化、増殖及び分化に対する細胞の応答、又は細胞分化決定因子の研究のため及び、因子、作用物質又は化合物を同定し特徴づけする検定システム又は方法において及びいずれかのかかる因子、作用物質、化合物などをコードする遺伝子又は細胞の増殖、分化及び分化決定に関与する遺伝子を同定する上で、独特かつ有用な細胞供給源である。
始原幹細胞、始原幹細胞クローン及び多能性幹細胞クローンの混合個体群にアクセスできれば、これらの幹細胞の成長特性及び表現型発現に対するさまざまな生物活性因子(例えば組換え型成長因子、精製化合物及び新規誘発因子)の影響に取組むことが可能である。初期の研究では、我々は、これらの細胞を用いて14の生物活性因子を単独で及び組合わせた形でテストした(表18)。3つの一般的な活性カテゴリ(増殖、分化決定及び分化発達)が示された。BFは、刺激物質又は阻害物質効果のいずれかを生み出すことができた。効果は、全ての系列全体にわたり一般的であるか又は単数又は複数の特異的組織系列に制限されているかのいずれかであり得るものであった。
我々は、マウス多能性幹細胞クローン内でのMMPによる筋形成の誘発を検査するためにノーザンブロット分析を使用した。我々は同様に、ヒト間葉幹細胞内でのCDマーカー転写を検査するためにもこの技術を使用した。MMPは、出生前マウス多能性幹細胞クローンであるSwiss−XYP−7内でのマイオジェニン及びMyoD1遺伝子の発現のためmRNAの転写を誘発した(Rogers ら、 1995;Young ら、 1998a)。ノーザンブロット分析は同様に、アミノペプチダーゼ(CD13)、神経細胞付着分子(CD56)、及びThy−1(CD90)が、出生前及び出生後の両方のヒト間葉幹細胞内で細胞収獲時点で活発に転写されていることを示した(先行例を参照のこと)。
特定の細胞型を特徴づけし同定する上で、組織学的、機能的、免疫学的及び発現(例えばmRNA発現など)分析の組合せを利用することができる。例えば、特定の増殖、分化決定又は分化発達能力に関する既知の又は未知の生物活性因子を特徴づけするにあたっては、多能性胚種様幹細胞の固有の能力を特徴づけする上での先行例に示された特徴づけと同様に、これらの分析を利用することができる。表19は、細胞型を特徴づけする上で利用可能と思われる組織学的、免疫学的及びcDNAプローブのマーカーの一覧表を提供している。
(材料及び方法は、以下に記す場合を除き、上述の通りである)。
始原細胞及び多能性幹細胞を分離するため、結合組織を含む標本を無菌状態で収獲し、付加的な2倍の抗生物質−抗真菌性溶液を含む間葉幹細胞−1内で無菌フードまで輸送した(Lucas ら、 1995)。間葉幹細胞培地は、89%(v/v)の培地〔Earle の塩を伴うイーグル最小必須培養液、EMEM(GIBCO,Grand Island, NY)(Young ら、 1991)又は、0.01mMのβ−メルカプトエタノールを含むOpti−MEM(GIBCO)(Sigma Chemical Co., St., Louis, MO)(Young ら、 1998c,e)〕とそれに追加された10%の血清〔HS7(ロット番号17F−0218、Sigma)、HS4(ロット番号 49F−0082、Sigma)、HS3(ロット#3M0338、Bio−Whittaker, Walkersville, MD)(Young ら、 1998e)といったような予備選択されたウマ血清、又は2U/mlの抗分化因子を含む任意の非選択血清(ADF,Morphogen Pharmaceuticals, Inc., New York, NY)(Young ら、 1998c,e)〕、1%の抗生物質−抗真菌性溶液〔10,000単位/mlのペニシリン、10,000μg/mlのストレプトマイシン及びFungizon、 GIBCOといったような25μg/mlのアンフォテリシンB〕(Lucas ら、 1995)、pH7.4から成る。組織標本を10mlの間葉幹細胞−1中に置き、入念に細かく切り刻む。切り刻んだ後、組織懸濁液を20分間50×gで遠心分離に付す。上清を廃棄し、細胞ペレットの体積について見積りを行なう。細胞ペレットを、7ペレット体積のEMEM(又はOpti−MEM+0.01mMのβ−メルカプトエタノール)及び2ペレット体積のコラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液の中で再懸濁させて、酵素作用により細胞を放出させる(Lucas ら、 1995)。コラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液は、100mlのディスパーゼ溶液(Collaborative Research, Bedford, MA)に添加した50mlのEMEM(又はOpti−MEM+0.01mMのβメルカプトエタノール)中の37,500単位のコラゼナーゼ(CLS−1、Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ)から成る。最終的に得られた濃度は、250単位/mlのコラゲナーゼと、33.3単位/mlのディスパーゼであった(Young ら、 1992)。結果として得られた懸濁液を37℃で1時間撹拌して細胞を分散させ、300×gで20分間遠心分離させる。上清を廃棄し、組織ペレットを20mlの間葉幹細胞−1内で再懸濁させる(Lucasら、1995)。細胞を90μm及び20μmのNitex を通してふるいがけし、単一の細胞懸濁液を得る(Youngら、1991)。細胞懸濁液を10分間150×gで遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを10mlの間葉幹細胞−1内で再懸濁させる(Lucasら、1995)。細胞生存度をトリパンブルー排除検定により決定する(Youngら、1991)。細胞を、1%のゼラチンで被覆された(EM Sciences, Gibbstown, NJ)100mm培養皿(Falcon, Becton−Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)又はT−75培養フラスコ(Falcon)あたり細胞105個の割合で播種する。95%空気/5%CO2の加湿された環境の中で37℃で密集性に至るまで、細胞培養を増殖させる。密集状態になった時点で、細胞をトリプシンで放出させ、凍結保存する。−70℃〜−80℃の最終温度が達成されるまで7.5%(v/v)のジメチルスルフォキシド(DMSO,Morton Thiokol, Danvers, MA)を含有する間葉幹細胞−1中で細胞低速凍結させる(毎分1度の温度降下)(Young ら、 1991)。
凍結保存した細胞を融解し、標準的プロトコルに従ってゼラチンで被覆された24ウェルの平板のウェル1個あたり5、10又は20×103個の細胞の割合で、間葉幹細胞−1内で平板固定する。初期平板固定から24時間後に、培地をテスト用培地(TM)1〜6(TM−1、TM−2、TM−3、TM−4、TM−5又はTM−6)へと変更する。TM−1〜TM−4は、Ultraculture(カタログ番号12〜725B、ロット番号、OMO 455〔TM−1〕、1M1724〔TM−2〕、2M0420〔TM−3〕又は2M0274〔TM−4〕、Bio−Whittaker, Walkersville, MD)、培地(EMEM又はOpti−MEM+0.01mMβ−メルカプトエタノール)及び1%の(v/v)抗生物質−抗真菌物質、pH7.4から成る。TM−5は、98%(v/v)の培地、1%(v/v)HS及び1%(v/v)抗生物質−抗真菌物質、pH7.4から成る。TM−6は、98.5%(v/v)の培地、0.5%(v/v)のHS及び1%(v/v)の抗生物質−抗真菌物質、pH7.4から成る。Ultraculture: 培地(EMEM又はOpti−MEM+0.01mMのβ−メルカプトエタノール):抗生物質(+抗真菌物質)を複数の比率で含むテスト用培地は、最低30日最高120日の培養期間について「定常状態」条件下で始原細胞及び多能性細胞の両方を維持した。さまざまな濃度のUltracultureを各々含む4つのテスト用培地(TM#’s1〜4)を使用した。各テスト用培地中に存在するUltraculture対培地対抗生物質の比率は、鳥の始原細胞及び多能性細胞の両方の個体群の中で定常状態条件を維持するその能力に基づいて、各々のUltracultureロットについて経験的に決定された。4つのUltracultureベースのテスト用培地は、以下の通りであった:TM−1=15%(v/v)Ultraculture(ロット番号OMO455);84%(v/v)培地;1%(v/v)抗生物質;TM−2=15%(v/v)Ultraculture(ロット番号1M1724);84%(v/v)培地;1%(v/v)抗生物質;TM−3=50%(v/v)Ultraculture(ロット番号.2M0420);49%(v/v)培地;1%(v/v)抗生物質;及びTM−4=75%(v/v)Ultraculture(ロット番号2M0274);24%(v/v)培地;1%(v/v)抗生物質。間葉幹細胞−1培地中のあらゆる潜在的共力成分を洗い出すために、テスト用培地単独の中での24時間の予備インキュベーションを使用する。24時間後に、テスト用培地を次のもののうちの1つに変更する。対照として、TM−1〜TM−6が単独で用いられる。始原細胞のクローンを同定するためには、始原細胞内の表現型発現マーカーの出現を加速する作用物質である2μg/mlのインシュリン(Sigma)を含むTM−1〜TM−6で培地を置換する(表18)。多能性細胞のクローンを同定するためには、一般的な非特異的系列誘発作用物質である10−10〜10−6Mのテキサメタゾン(Sigma)を含むTM−1〜TM−6で培地を置換する(表19)。対照及び処理対象培地は、一日置きに培地を変更して、さらに30〜45日間増殖させる。実験一回、濃度1つあたり4つの培養ウェルを使用する。0〜45日の期間中、培養を毎日のベースで形態的特徴の変化について主観的に検査する。表現型発現の改変は処理日数及び付随するインシュリン又はデキサメタゾン濃度と相関される。その後、立証された組織学的、機能的/組織化学的、ELICA/フローサイトメトリ、及び分子検定を用いて表現型発現マーカーを客観的に確認するためこれらのパラメータを利用して、実験を反復する(表19)。
階段希釈クローン原生分析を用いた以前の研究が、出生後のラット骨格筋に付随する結合組織から分離された予備多能性間葉幹細胞(PPMSC)のクローン個体群の存在を報告した。同様に階段希釈クローン原生分析を用いる現行の研究は、多能性幹細胞のもう1つのクローン個体群の存在を報告している。これら2つのクローン細胞系統間の比較分析は、類似性と差異を実証している。インシュリン/デキサメタゾン生物検定によって見極められるように、両方のクローン細胞系統共、系列が決定されていない。両方のクローン細胞系統共、外因性作用物質によって活性化されないかぎり血清を含まない培地内で静止状態にとどまる。そして両方のクローン細胞系統共、Hayflickの限界を超えて拡大自己更新能力をもつ。PPMSCクローンは、密集状態で接触阻害される。これとは対照的に、本書に報告されているクローンは接触制限されておらず、密集状態を超えて増殖し続けることになる。両方のクローン細胞系統は共に中胚葉由来の細胞(すなわち骨格筋、平滑筋、脂肪、軟骨、骨)を形成することになるが、一方本書で報告されるクローンは同様に、外胚葉由来(すなわち神経幹細胞、神経細胞)及び内胚葉由来(すなわち肝細胞)の細胞をも形成する。3つの一次胚葉から細胞を形成するその潜在能のため、我々はこの出生後ラットクローンを多能性原外胚葉様予備幹細胞と呼称した。この研究は、出生後の哺乳動物の体内の胚様予備幹細胞の保持及び、身体組織の正常な維持、修復及び再生におけるそれらの潜在的関与を示唆している。
胚幹細胞は、ヒトを含む霊長類とげっ歯類の尾胞、内部細胞塊及び生殖腺隆線内で同定された(Evans ら、1981;Martin, 1981;Thomson ら、1995,1998;Shamblott ら、1998;Gearhart ら、1999)。分離の後、これらの未分化細胞は、胚幹細胞抗原、陽性アルカリホスファターゼ染色、拡大自己更新能力及びテロメラーゼ活性についての免疫学的マーカーを発現する。in vitroでの発現が許された時点で、これらの細胞は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉由来の組織についての免疫学的マーカーを発現する(Thomson ら、1995,1998;Shamblott ら、1998;Gearhart ら、, 1999)。しかしながら、in vivoで移植された時点で、胚幹細胞は、自然発生的奇形腫を形成する(Thomson ら、1998;Grearhart ら、1999)。これらの独特の性質のため、胚幹細胞は、組織移植のためのドナー細胞の供給源として提案されてきた(Thomson ら、1995,1998;Shamblott ら、1998;Gearhart ら、1999)。
出生後ラット結合組織由来の幹細胞
出生後Spragne−Dawleyラットからの骨格筋を、単核細胞の分離、平板固定、密集状態までの増殖、トリプシン放出及び凍結保存のために処理した(Young ら、.2000a)。細胞を反復的に融解し、50の細胞倍加に達するまで膨張させた(Young ら、1991,1993,1998b;Young 2000)。個々のクローンは、階段希釈クローン原生分析によって生成された(Young ら、2000a)。各回のクローニングは、約20の細胞倍加という結果をもたらした。かくして、4回のクローニングは、結果として得られたクローンの中で約80の細胞倍加をもたらした。結果としてのクローンを増殖させ、トリプシンで放出させ、アリコートにし、凍結保存した(Young ら、1993,1998a,2000a;Rogers ら、1995)。本書で報告したクローンをラット−A2B2と呼称し、130の細胞倍加の後、多能性について徹底的に検査した。
分化決定された始原幹細胞又は分化未決定な多能性幹細胞のいずれかとしてのその同一性を見極めるために、無血清培地及びインシュリン及びデキサメタゾンを含有する無血清培地を用いて、ラット−A2B2を検査した。インシュリン、インシュリン様成長因子−I及びインシュリン様成長因子−IIといったような進行因子は、始原細胞内で表現型発現を加速するが、多能性幹細胞内の表現型発現の誘発に対しいかなる効果をもたない。(Young ら、1993,1998b;Young,2000)。これとは対照的に、デキサメタゾン、骨形態形成タンパク質−2及び筋形態形成タンパク質といったような系列誘発作用物質は、分化決定及び多能性細胞内での発現を誘発するが、始原細胞内での表現型発現は改変させない(Young ら、1993,1998a,b,1999,2000a;Young 2000)。従って、培養中に始原細胞が単独で存在する場合、デキサメタゾンでインキュベートされたものに比べて、インシュリン内でインキュベートされた培養について、発現された表現型の差異は全く存在しないことになる。培養が始原細胞及び多能性細胞の両方を含んで混合された場合には、インシュリンで処理されたものに比べデキサメタゾンで処理された培養中には、発現された表現型により大きな変動が存在することになる。培養が多能性細胞を単独で含有する場合、インシュリン処理された培養中には、発現された表現型が全く存在しなくなる。デキサメタゾンで処理された類似の培養は、多数の表現型の発現を示すことになる。かくして、デキサメタゾンとインシュリンの処理の効果を比較することによって、未知の細胞個体群の中の特定のタイプの始原細胞及び多能性細胞同定することができる(Young ら、1992,1995;Lucas ら、1993,1995;Pate ら、1993;Rogers ら、1995;Warejcka ら、1996)。
中胚葉表現型についての我々の標準的な形態学的生物検定(Youngら、1998a,b,1999,2000a;Young, 2000)は、外胚葉及び内胚葉系列に属する潜在的な分化した細胞型を内含するように増強された。検定全体を通して以下の形態について、培養をスクリーニングした。
P.Pattersonにより開発されたFORSE−1,S.Hockfield により開発されたRAT−401,J.Wood により開発されたRT−97,V. Lemmon により開発された8A2,S.Hockfield により開発されたRip, A.Hubbardにより開発された151−Ig,W.E.Wrightにより開発されたF5D,D.A.Fischmanにより開発されたMF−20,D.A.Fishman により開発されたALD−58,H.M.Blauにより開発されたA.4.74,R.Holmdahl及びK.Rubin により開発されたCIIC1,X.−J. Ye及びK.Teratoにより開発されたD1−9,M.Solursh 及びA.Frazenにより開発されたWVID1及びM.Sooursh及びA.Frazenにより開発されたMP111といった抗体を、NICHDの賛助の下で開発されたDevelopmental Studies Hybridoma Bankから入手し、アイオワ大学生物学部、Iowa City, IA52242により維持した。
130の細胞倍加から出発して、ラット−A2B2クローンを融解し、ゼラチンで被覆されたT−25フラスコ1本あたり100×103細胞の割合で平板固定した。細胞を、密集後状態(7〜8日)まで増殖させ、トリプシンで放出させた(Young ら、. 1999,2000a)。細胞数は、フラスコ1本につき5〜6.5×106細胞又は一継代あたり5〜6細胞倍加の範囲内にあった。倍加時間は平均18〜24時間であった。細胞を約1〜11×106細胞/mlでアリコートにし、凍結保存した。密集を超えた増殖、トリプシンでの放出及び凍結保存の手順をさらに12継代、つまりクローニング後68の細胞倍加全体を通して反復した。こうして130の細胞倍加開始数と合わさって、198の細胞倍加を受けた細胞クローンが結果としてもたらされた。130〜198細胞倍加の各継代間隔で、細胞アリコートを、インシュリン及びデキサメタゾンと共に30〜45日間インキュベートし、形態学的、組織化学的及び免疫化学的に検査した。
分化能力
当初の(130細胞倍加)及び膨張した(130〜198の細胞倍加)比較/対比分析システムの両方において、インシュリン、テキサメタゾン及び/又は選択された血清でのインキュベーションの前後に、ラット−A2B2クローン細胞系統を分析した。平板固定から24時間後の培養の観察は、クローンA2A2(PPMSC)細胞系統の細胞サイズの約1/4〜1/2の非常に小さな細胞を明らかにした。これらのさらに小さな細胞は、大きい核対細胞質比を表わした。6週間の無血清テスト用培地内でのラット−A2B2クローンのインキュベーションは、細胞数の顕著な増大を結果としてもたらさず、平板固定から24時間後の細胞と同等の形態をもたらした。ラット−A2B2クローンを6週間インシュリンを伴うテスト用培地内でインキュベートした結果、接触阻害の喪失を実証する特徴の無い細胞の多重層がもたらされた。この多重細胞層は、アルカリホスファターゼ活性についての陽性の染色を実証した(表20)。これとは対照的に、デキサメタゾンを伴うテスト用培地、デキサメタゾン+インシュリンを伴うテスト用培地又はデキサメタゾン+インシュリン+選択された血清を伴うテスト用培地内でのラット−A2B2のインキュベーションは、アルカリホスファターゼ染色の喪失、ただし分化した表現型の発現、を結果としてもたらした。外胚葉、中胚葉及び内胚葉系列のためのマーカーを示す細胞が観察された。例えば、外胚葉系列マーカーを表示する細胞は、神経前駆体細胞、ネスチン、神経フィラメント、神経細胞、乏突起膠細胞及び上皮成長因子レセプタについての抗体を用いて同定された。中胚葉系列マーカーを表示する細胞は、筋原性系列についてはマイオジェニン、筋節ミオシン、速骨格筋ミオシン、ミオシン重鎖、ミオシン高速鎖及び平滑筋アクチン;脂肪細胞については飽和中性脂質;軟骨形成系列については硫酸化プロテオグリカンを含むII型コラーゲン、IX型コラーゲン及び軟質小結節;及び骨形性原系列については骨シャロタンパク、オステオポンチン及びリン酸カルシウムを含有する骨小結節についての抗体又は組織化学染色を用いて、同定された。内胚葉系列マーカーを表示する細胞は、肝細胞についての抗体を用いて同定された。外胚葉、中胚葉及び内胚葉系列細胞型を惹起する全ての処理は、分化された細胞としてそれらを識別するラット特異的主要組織適合性複合体−I(RMHC−I)エピトープを誘発した(表7)。
その多能性状態を維持しながらの拡大自己更新のための能力を決定するべく、130の細胞倍加後の12の継代の各々において、ラット−A2B2を検定した。各継代の後、ラット−A2B2クローンを、インシュリン/デキサメタゾン生物検定において、上述のとおり処理した。結果は、検定した全ての継代レベルにおいて同等で識別不能であった。
テロメラーゼ活性
テロメラーゼ活性の有無について198の細胞倍加でラット−A2B2を検定した。図2に示されているように、テロメラーゼ活性は、この198の細胞倍加数で、幹細胞内に比較的高レベルで存在していた。
出生後の多能性幹細胞
出生後のラットの骨格筋に付随する結合組織から分離された細胞の段階希釈クローン原生分析は、多数のクローンを生成した。この研究では、ラット−A2B2と呼称された1つのクローンが検査された。ラット−A2B2は、インシュリンを伴う又は伴わない長期インキュベーションに続く星状形態の改変を示さなかった(表20)。無血清培地又はインシュリンのいずれに対しても応答が欠如していたことは、このクローンが分化決定された始原幹細胞でないことを示唆していた(Young ら、1998a,b,1999,2000a;Young,2000)。これとは対照的に、これらの細胞によるアルカリホスファターゼ活性の発現は、これらの細胞が、胚幹細胞と一部の属性を共有していることを示唆していた(Thomas ら、1998;Gearhart ら、1999)。実際、インシュリン及び選択された血清を伴う又は伴わない状態でのデキサメタゾンとのインキュベーションは、表現型発現の改変を惹起した(表20)。これらの結果は、このクローンが、或る形の分化未決定な多能性幹細胞であることを示唆していた。中胚葉分化細胞型のみを実証したPPMSCクローン−A2A2(Young ら、2000a)とは対照的に、ラット−A2B2で指摘された表現型改変は3つの一次胚葉全て、すなわち外胚葉、中胚葉及び内胚葉について示された(表20)。指摘された表現型改変には、神経前駆体細胞、ネスチン、神経フィラメント、神経細胞、乏突起膠細胞、上皮成長因子レセプタ、筋芽細胞、骨格筋、平滑筋、脂肪細胞、軟骨、骨及び肝細胞の出現が含まれていた。外胚葉、中胚葉、及び内胚葉系列細胞型を惹起する全ての処理は、同様に、分化された細胞を同定するラット特異的主要組織適合性複合体−I(RMHC−I)エピトープをも誘発した(表20)。拡大自己更新についてクローンテストした時点で、我々は、その分化潜在能力の偏差を全く認識しなかった。最後に、198の細胞倍加で、ラット−A2B2はテロメラーゼ活性を実証した。
以前のクローン原性分析(Young ら、1993,1998a,2000a)と本研究を合わせると、予備幹細胞、分化決定された始原細胞及び分化未決定な多能性細胞の少なくとも2つの一般的カテゴリが示唆されている。予備幹細胞の各々の一般的カテゴリの中には、幹細胞のサブカテゴリもあるように思われる。我々も、そして他の人々も、多くのタイプの分化決定された始原幹細胞すなわち単能性幹細胞(Young ら、1993;Grounds,1999;Yotsuyanagi ら、1999;Gordon ら、2000)、二能性幹細胞(Young ら、1993;Bonner−Wier ら、2000;Ramiya ら、2000)、三能性幹細胞(Prokop, 1997;Yoo ら、1998; Pirtenger ら、1999)、及び多能性幹細胞(Palis and Segel,1998;McGuire,1998;Ratajczak ら、1998)の存在を指摘してきた。これらの例では、始原幹細胞は、特定の系列に特異的な細胞型を形成し、Hayflickの限界に適合し(Hayflick, 1965)、その後、プログラミングされた細胞の老化及び死枯を受ける。我々は同様に、分化未決定な多能性間葉幹細胞(Young ら、1993,1998a,2000a,Young,2000;Rogers ら、1995)及び分化決定を受けていない多能性原外胚葉幹細胞(本研究)をも分離しクローニングした。これらの多能性幹細胞は、分化未決定である。これらの細胞は、それが分化決定を受けない状態にとどまるかぎり、自己更新のための拡大された能力をもつ。多能性幹細胞は、外因性作用物質による作用を受けないかぎり、静止状態にとどまる。これらの幹細胞は、それらをいずれかの特定の組織系列に決定するために誘発性作用物質を必要とする。多能性幹細胞がひとたび特定の組織系列に決定されたならば、これらは、分化決定された始原幹細胞の特性の全てを呈する、すなわち系列制約のある表現型を形成しHalfbackの限界に適合することになる。この研究は、出生後の哺乳動物の体内の胚様予備幹細胞の保持、及び身体組織の正常な維持、修復及び再生におけるそれらの潜在的関与を示唆している。
** テスト用培地+インシュリンであるTM+Ins は、2mg/mlのインシュリンを含有するテスト用培地で構成されていた。
*** テスト用培地+誘発性作用物質であるTM+Inductine Agentsは、以下の組合せのうちの1つを含有するテスト用培地で構成されていた;
2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+0.5%のHS9;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+1%のHS9;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+5%のHS9;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+10%のHS9;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+1%のHS10;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+5%のHS10;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+10%のHS10;2mg/ml インシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+1%のMFCS1;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+5%のMFCS1;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+10%のMFCS1;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+15%のMFCS1;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+1%のHS9+3%のHS7;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+5%のHS9+3%のHS7;2mg/mlのインシュリン+10−6Mのデキサメタゾン+10%のHS9+3%のHS7;1%のHS7、3%のHS7、及び3%のHS7.
同種異系ドナーを用いたこれまでの移植研究は、宿主組織内の炎症反応の誘発を実証している。対宿主移植片病と呼ばれるこの反応は、ドナーと宿主組織の間のHLA不整合に起因して発生する。本研究の目的は、出生後の非近交系SDラット由来のラット多能性原外胚葉様幹細胞クローンが、成体の非近交系SDラット内の対宿主移植片反応を誘発することになるか否かを見極めることにあった。
PPMSCの分離のために用いられたものと同じプロトコルに従ってROSA26LacZ標識付け済みマウス(ROSA26 PPSCと記されている)及びラット骨格筋(RmSC−1と記されている)からPPSCを分離し、同じ選択されたウマ血清を含むPPMSCのために用いられたのと同じ培地内でこれを培養した(Lucas ら、 Wound Rep. Reg. 3;457−468)。ROSA26マウスは、B−ガラクトシダーゼを発現する遺伝子導入マウスであり、Jackson Laboratoriesから得られた。RmSC−1細胞を、Lucas ら、 (Lucas ら、 Wound Rep. Reg.3;457−468)に記述されているように、雄及び雌のラット新生児の骨格筋から分離した。デキサメタゾンで処理されたROSA26PPSC及びRmSC−1PPSCの培養中で、神経細胞−脂肪細胞、骨格筋管、軟骨細胞、骨芽細胞などと並んで培養内で中胚葉表現型が分化した。PPMSCのために使用された分離手順は同様に、神経ならびに中胚葉表現型へと分化できる細胞を分離する能力をもっている。
上述のプロトコルを用いて、C3TF細胞と呼称された17才の女性の真皮から、幹細胞が分離され、Young ら、 により提供された(Young, H.E. ら、(1991)Journal of Tissue Culture Methods 13:275−284;Young, H.E. ら、 (1992a)Journal of Tissue Culture Methods 14:85−92)。C3TF細胞は、核型分析され、46,XXの正常な雌であることが証明された(図41)。この核型は、C3tF細胞が37の細胞倍加にあるときに実施された。37の細胞倍加後、CT3F細胞は半分に分割され、10%の選択された血清HS10の存在下及び15%の選択された血清MFCS1の存在下という2つの異なる培養条件下に置かれた。幹細胞、多能性間葉幹細胞及び多能性胚様幹細胞のPPMSC及びPPELSCと呼ばれる2つの個体群が、それぞれこれらの血清条件下で分離された。PPMSC細胞は、いずれか及び全ての間葉細胞型を形成する能力を有する。PPELSC細胞は、中胚葉、外胚葉及び内胚葉系列内の細胞型を形成する能力をもつ。CDマーカーフロー分析がこれら2つの細胞個体群について実施された。PPMSCと呼ばれる個体群は、72の細胞倍加にあり、一方PPELSCと呼ばれる個体群は、CDマーカー分析が実施されたとき70の細胞倍加があった。分析においては、58のCDマーカーが利用された。
本研究の目的は、ヒトの幹細胞療法のために生来の出生後多能性幹細胞又は出生後多能性幹細胞で誘発された造血幹細胞を使用することの実行可能性を見極めることにある。67才の男性及び17才の女性に由来する出生後ヒト多能性幹細胞を、生来の及び造血誘発された幹細胞として個別に、亜致死の照射を受けた免疫不全NOD/SCIDの中に、マウス造血幹細胞と同時移植される。マウス内へのヒトの細胞の取込みを同定するためには、マウスの血液及び骨髄中の細胞上のヒト特異的CD45抗原発現が使用されることになる。ヒト幹細胞の造血再増殖活性に同定するためには、B細胞、顆粒球、巨核球及び赤血球についてのCDマーカープロフィールが使用される。マウス細胞と混合されたヒト特異的CD45抗原を発現するヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒトの幹細胞がマウス内に取込まれたことを表わす。骨髄球及びリンパ球の両方の系列のヒト造血CDマーカーが発現するヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒト幹細胞が造血系を再生しつつあることを表わす。
使用された動物は全て、T細胞の漏出性の徴候について予備テストされた免疫不全NOD/SCIDである(n=各グループにつき6)。動物は、表21内で以下で示されているとおりにグループ分けされ処理される。
移植されたマウス及び対照のマウスからの血液(1)及び骨髄(2a、b、c)を、輸注から8週(マウス3匹)及び12週(マウス3匹)後に分析する。FACScanを用いたマルチパラメータフローサイトメトリ分析でヒト造血CDマーカーについて細胞(1、2a)を染色する。B細胞、顆粒球及び赤血球についてのCDマーカープロフィールを用いて、マウス組織内のヒト細胞の取込みを同定する。各実験において、移植を受けていないマウスからの細胞を負の対照として同じ抗体で染色する。マウスの細胞と混合された造血マーカーを発現するヒト細胞の同定は、陽性のエンドポイントとして役立ち、ヒト幹細胞が骨髄様及びリンパ様の両方の区画内で造血系を再生しつつあることを表わす。
NOD/SCIDマウスは、亜致死の照射(300cGy)を受け、尾静脈を経由して、マウス一匹あたり4.8×10(Mo#1−3)又は1.2×106(Mo#4−6)の割合で、CT3F PPELSC細胞の注射を受けた。さらに高い細胞濃度では、マウスは生き延びなかった。最近の実験では、注射溶液(0.2%のBSA及び20U/mlのヘパリンを伴うIMDM)の中に20U/mlのヘパリンを内含し、マウス1匹あたり3×106(n=1)を注入することができた。
出生後のラット骨格筋を収獲し、間葉幹細胞を分離した。クローン原生分析は、多能性幹細胞がまさに実際出生後の哺乳動物の体内に存在していること、そしてそれらがクローニング後少なくとも4つの間葉系列組織(例えば骨格筋、脂肪、軟骨及び骨)を形成するその能力を保持することを明らかにした。その後クローンを、ゲノム標識付け後の多能性保持及び拡大自己更新について検査した。この能力は、β−ガラクトシダーゼでのゲノム標識付けの後及び拡大自己更新すなわち、クローニング後の200+の細胞倍加の後も保持された。結合組織基質内の多能性幹細胞の存在及び、クローニング、遺伝子トランスフェクション及び拡大自己更新後のその多能性保持は、これらの幹細胞が遺伝子療法及び/又は出生後の動物内の組織の修復及び再生にとって重要な貢献を果たす可能性があるということを示唆している。
ゲノム標識付け
10%のウマ血清(GIBCO−BRL)、5mMのHepes(GIBCO−BRL)、50U/mlのペニシリン−50mg/mlのストレプトマイシン(GIBCO−BRL)及び50U/mlの組換え型ヒト抗分化因子(ADF、Morphogen Pharmaceuticals, Inc., NY)を伴う、修正イーグル培地(MEM)(GIBCO−BRL,Life Technologies, Cergy Pontoise, France)の中で、クローン(ラット−A2B2)(以上の実施例11で記述)を成長させた。核ターゲティングされたLacZ遺伝子を発現する安定したラット−A2B2細胞系統(nls−LacZ)を、プラスミドpUT651(選択可能な報告された遺伝子Sh ble::lacZ)を用いて構築した。血清を含有する培地内で6ウェルのプラスチック皿(Falcon)(Becton Dickinson, Le pont−de claix, France) 上で5×103細胞/cm2の割合で細胞を平板固定し、一晩付着させた。次に、無血清培地(Opti−mem, GIBCO−BRL)内で16時間リポフェクチン試薬(Gibco−BRL)を用いて2mgのPUT651と共に細胞を一晩インキュベートした、トランスフェクションを受けた細胞を、250mgのゼオシン(Invitrogen, Netherlands)が追加された選択培地内へ1:10に分割した。最高レベルのβ−Galを発現する12の耐性クローンのうちの1つのクローンをサブクローニングし使用した。組織化学的及び免疫化学的技術により、β−Gal発現を評価した。室温で10分間2%のパラホルムアルデヒド内で固定するか又は氷冷メタノール内で5分間固定した後、PBS内で洗い流し、色素産生基板X−Galでの組織化学染色及びポリクローナル(Chemicon, Temecula, CA)抗β−Gal抗体(Couffinhal ら、1997)での免疫染色により、細胞内でLacZ発現を評価した。ラット免疫グロブリン(Vector)に予め吸着されたビオチン化抗マウスIgGと共にVector−HRP−DAB発現系(Vector−Labs)を用いて抗体結合を視覚化した。
凍結保存したクローンを融解し、標準的プロトコルに従いゼラチンで被覆された24ウェルの平板の1ウェルにつき5、10又は20×103細胞の割合で間葉幹細胞−1培地中で平板固定した。最初の平板固定から24時間後に、培地をテスト用培地(TM)1〜4(TM−1、TM−2、TM−3、TM−4)又は5(TM−5)に変更した。テスト用培地(TM)は、最低培養中で30日、最長培養中で120日間鳥類の始原細胞及び多能性細胞の両方を「定常状態」条件下で維持するUltraculture:EMEM:抗生物質を複数の比率で含んでいた。各々さまざまな濃度のUltracultureを含む4つのテスト用培地(TM#s1〜4)を使用した。各テスト用培地内に存在するUltraculture対EMEM対抗生物質の比率は、鳥類の始原細胞及び多能性細胞の両方の個体群において定常状態の培養条件を維持するその能力に基づき、各々のUltracultureロットについて経験的に決定された。4つのUltracultureベースのテスト用培地は以下のとおりであった: TM#1=15%(v/v)のUltraculture(ロット番号OMO455);84%の(v/v)EMEM:1%(v/v)の抗生物質;TM#2=15%(v/v)のUltraculture(ロット番号1M1724):84%(v/v)のEMEM:1%(v/v)の抗生物質;TM#3=50%(v/v)のUltraculture(ロット番号2M0420);49%(v/v)のEMEM:1%(v/v)抗生物質;及びTM#4=75%(v/v)のUltraculture(ロット番号2M0274);24%(v/v)EMEM:1%(v/v)の抗生物質;TM−1〜TM−4は、Ultraculture(カタログ番号12−725B、ロット番号OMO455[TM−1]、1M1724[TM−2]、2M0420[TM−3]、又は2M0274[TM−4]、Bio−Whittaker, Walkersville ;MD)、EMEM1、及び1%(v/v)Pen/Strep、pH7.4 で構成されていた。TM−5は、98%(v/v)のEMEM、1%(v/v)HS、及び1%(v/v)のPen/Strep,pH7.4で構成されていた。
「RAT−A2B2」と呼ばれるクローン(実施例11に記述)を、β−ガラクトシダーゼレトロウイルストランスフェクションによりゲノム標識付けの後に評価した。全ての評価を通して、A2B2細胞は、インシュリンでのインキュベーションの間、表現型発現内のいかなる変化も示さなかった。しかしながら、A2B2細胞は、ゲノム標識付けの後一定の濃度範囲のデキサメタゾンでインキュベートした時点で多数の形態を示した。認められた表現型発現の変化は、筋原性、脂肪形成、軟骨形成及び骨形成形態学的なものであった。A2B2細胞は、星状形態の保持及び接触阻害の喪失についてのクローン原性分析中に特定的に選択された。しかし、ひとたび特定の系列に決定するすなわち系列特異的始原細胞となるように誘発された時点で、RAT−A2B2は、密集状態で接触阻害を呈する。
毎年何百人ものアメリカ人が組織喪失又は末期器官不全に悩まされている。これらの患者に対する国レベルの合計健康管理費は年間4000億ドルを超えている。現在、これらの障害を治療するため米国では年間800万件以下の外科手術が実施され、4000〜9000万日の入院日数が必要とされている。同種異系間療法は無数の生命を救い改善したが、それでも不完全な解決法であるにとどまっている。同種異系間組織移植及び外科的介入は、決定的なドナー不足、長期罹病率及び死亡率によって著しく制限されている(Langer and Vacanti,1993)。この調査の長期的目的は、再生及び修復のためのHLA整合ドナー組織として及び遺伝子療法のための潜在的送達ビヒクルとして使用するための自己由来の多能性幹細胞の有用性を見極めることにある。自己由来のドナー組織として多能性幹細胞が利用されるためには、生体内部にそれらが存在していること、分離が容易であること、その表現型発現を操作できること、適応力があること、既存の組織内に取込まれること、生存能力があることそして機能性があることが必要である。
1)レトロウイルスベクターを用いてPPSCに遺伝子を送達し、感染したPPSCがその多能性を維持する能力をテストすること。 2)萎縮した筋肉に移植した時点で分散し筋線維と融合する能力をPPSCに発現するmyoDと対照間で比較すること。
1つの長期的最終目的は、出生後骨格筋の成長を増強させるため細胞による方法及び/又は薬理学的方法を使用することにある。PPSCは、神経筋疾患、不使用、宇宙飛行、長期ベッド療養及び老化において発生する萎縮した骨格筋の治療のための1つの潜在的戦略を表わしている。出生後骨格筋の成長という最終目的を達成しようとして、次の4つの異なるやり方で細胞に遺伝子を送達するためにレトロウイルスが利用されてきた:すなわち 1)移植後に筋原性細胞を追跡するべくb−ガラクトシダーゼといったようなマーカーを送達するため;2)細胞生理学における特定的なシグナリング経路の関与を研究するべくリポータ構成体を送達するため;3)転写因子を過剰発現するため;4)特定のシグナリング経路の遺伝子阻害物質を送達するため。場合によっては、筋肉消耗のための細胞療法としてPPSCを使用する目的で、まず最初にPPSC内にマーカー遺伝子を安定した形で導入し、細胞の多能性が維持されることを見極めることが必要である。さらに、正常な及び萎縮した骨格筋の中での移植されたPPSCの挙動を見極めることが必要である。MyoDは、非筋細胞が筋原性となるように誘発すると同時に幹細胞内での筋形成を誘発することのできる筋肉特異的転写因子である。我々は、次にPPSCの動員及び萎縮した筋線維内への取込みの効果を増大させるmyoDの強制発現の能力をテストすることになる。
免疫不全 scid/bgマウスがPPSC移植の受容体として使用されることになる。Scid/bgマウスは、機能的T及びB細胞が欠損しており、低い天然キラー活性しかもたない。scid/bgマウスは、より安定したSCID表現型を示し、一般に異系移植片移植のためのより優れた受容体である。
I.PPMSC(多能性間葉幹細胞)及びPPELSC(多能性胚様幹細胞)に対するlacZ遺伝子のレトロウイルスを媒体とした遺伝子移入の効率を見極める。
a)確立された技術を用いて2種類の幹細胞をレトロウイルスにより感染させる。
b)感染から48時間後に、単一の細胞内のb−ガラクトシダーゼ発現について酵素検定を実施する。感染を受けた細胞は青色となる。
c)青色細胞の%を評定する。
d)青色細胞の百分率が低い場合、レトロウイルス感染プロトコルを反復するが、6〜8時間離して2回の感染を使用する。
e)b〜cまでを反復する。
f)方法の再現性を決定するため最高の百分率の青色細胞を与えるプロトコルを用いて実験を2回反復する。
a)最高の百分率の青色細胞を与えるプロトコルで細胞を感染させる。
b)感染から24時間後に、細胞をトリプシン処理し、ELICA検定で使用するため96ウェル平板内に細胞を平板固定する。対照として、96ウェルの平板内に未感染細胞も据え付ける。同じく、細胞の形態を観察するべく12ウェルの平板内に細胞を据え付ける。
c)感染から48時間後に、培地を誘発性培地に変更する。
d)感染から2〜6週間後に、前述したデキサメタゾン方法を用いて96ウェルの平板内で特定的細胞表現型(±レトロウイルス感染)の誘発をテストする。
e)12ウェルの平板上でb−ガラクトシダーゼ酵素検定を実施し、表現型誘発の形態学的徴候が青色細胞内で発生するか否かを観察する。
f)対照とレトロウイルス感染を受けた細胞の間で特定の表現型の誘発を比較する。
a)移植の2週間前に、脛側前筋の脱神経萎縮を誘発するため scid/bgマウス内の坐骨神経の一側性横断切開を実施する。
b)レトロウイルスを発現するmyoD又は対照のいずれかでPPSCを感染させる。感染から48時間後、平行な平板内で免疫組織化学を用いてmyoD発現についてテストする。
c)下表22に記すとおり、各々の脛側前筋内に細胞を移植する:
1) 筋線維の内側の青色核の数を評定する。これらは、筋原性系列に転換し宿主の内因性筋線維と融合したPPSCを表わしている。
2) 注入部位との関係において青色核の分布を比較する。
3) 筋原性系列に転換し筋線維と融合する、PPMSCを発現するmyoD及び対照とPPELSCを発現するmyoD及び対照の能力を比較する。
4) 萎縮した筋肉対正常な筋肉の一関数として上述の3)で得られたデータを分析する。
エンドポイントというのは、マーカー遺伝子でレトロウイルス感染させられた多能性幹細胞がその多能性を維持し移植時点で筋肉の広い部域全体にわたり分散し、宿主の内因性筋線維と高効率で融合する能力である。成功は、PPMSC及びPPELSCをLacZ遺伝子で高効率まで感染させそれらにその多能性を維持させる能力により決定されることになる。移植実験は、移植細胞が筋肉の幅及び長さ全体にわたり分散し萎縮した筋線維に高効率で融合した場合に、成功したものとみなされる。
その造血内皮細胞能力及び共通の造血内皮前駆体細胞からの内皮細胞分化に関与するシグナルプロセスを査定するために、(以上の実施例16で記述された)B−galでのトランスフェクションを受けたラットA2B2細胞及びROSA26PPSC細胞を利用した。
Claims (26)
- 生後動物細胞または組織に由来する、自己再生可能でかつ内胚葉、外胚葉および中胚葉系統の細胞に分化可能な多能性胚様幹細胞であって、該幹細胞は、段階特異的胚抗原SSEA−4細胞表面マーカーを発現し、かつ、外因性作用物質によって分化するように活性化されない限り培養培地内で静止状態にとどまり、該外因性作用物質は、分化決定誘導剤であり、該培養培地がウマ血清を補充した調整培地を含み、該調整培地が、Opti−MEM;β−メルカプトエタノール;および抗生物質−抗真菌剤溶液から成る、幹細胞。
- 前記幹細胞が、前記外因性作用物質によって分化するように活性化されない限り培養培地のみの中で静止状態にとどまる、請求項1に記載の幹細胞。
- ヒト細胞である、請求項1に記載の幹細胞。
- (a)請求項1〜3のいずれかに記載の多能性胚様幹細胞、および
(b)該幹細胞の増殖を支持し得る培地
を含む培養物。 - 増殖因子または分化決定因子をさらに含む、請求項4に記載の培養物。
- 前記幹細胞がヒト細胞である、請求項4に記載の培養物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の多能性胚様幹細胞を単離する方法であって、
(a)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で、生後動物供給源から入手した細胞を緩徐に凍結する工程であって、ここで、緩徐な凍結の間に、温度が毎分1℃低下する、工程;および
(b)該細胞を培養する工程
を包含する、方法。 - 請求項1〜3のいずれかに記載のクローン性多能性胚様幹細胞を単離する方法であって、(a)−80℃の最終温度に到達するまで、7.5%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する培地中で、生後動物供給源から入手した細胞を緩徐に凍結する工程であって、ここで、緩徐な凍結の間に、温度が毎分1℃低下する、工程;
(b)該細胞を培養する工程;
(c)該培養された細胞をクローン密度に希釈する工程;
(d)該希釈された細胞を培養する工程;および
(e)単一の細胞を有するそれらの培養物を増殖させる工程
を包含する、方法。 - 請求項8に記載の方法によって樹立した、クローン性多能性胚様幹細胞株。
- 遺伝子操作された細胞であり、かつ、目的の遺伝子またはタンパク質を発現する、請求項1〜3のいずれかに記載の幹細胞。
- 遺伝子操作された多能性胚様幹細胞を産生する方法であって、
(a)少なくとも1つのマーカー遺伝子または目的の遺伝子を含むDNA構築物で、請求項1〜3のいずれかに記載の多能性胚様幹細胞をトランスフェクトする工程;
(b)該多能性胚様幹細胞において該マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現を選択する工程;および
(c)工程(b)において選択された幹細胞を培養する工程
を包含する、方法。 - 請求項11の方法によって産生される、遺伝子操作された多能性胚様幹細胞。
- ヒト細胞である、請求項12に記載の幹細胞。
- 分化決定因子である作用物質の存在または活性を検出する方法であって、
A.請求項1〜3のいずれかに記載の幹細胞と、分化決定因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;および
B.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された該細胞の系統を決定する工程、
を包含し、ここで、該接触された細胞の系統は、該サンプルにおける分化決定因子の存在または活性を示す、方法。 - 分化未決定な細胞の分化決定を作用物質、化合物または因子が変調する能力を試験する方法であって、
A.幹細胞を分化未決定な細胞として維持する増殖培地において、請求項1〜3のいずれかに記載の幹細胞を培養する工程;
B.試験下で該作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された該細胞の系統を決定する工程
を包含する、方法。 - 分化未決定な細胞の分化決定を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングする方法であって、
A.幹細胞を分化未決定な細胞として維持する増殖培地において、請求項1〜3のいずれかに記載の幹細胞を培養する工程;
B.試験下で該作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された該細胞の系統を決定する工程
を包含する、方法。 - 増殖因子である作用物質の存在または活性を検出する方法であって、
A.請求項1〜3のいずれかに記載の幹細胞と、増殖因子である作用物質を含有することが疑わしいサンプルとを接触させる工程;および
B.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された該細胞の増殖および系統を決定する工程、
を包含し、ここで、分化決定を伴わない該接触された細胞の増殖は、該サンプルにおける増殖因子の存在または活性を示す、方法。 - 分化未決定な細胞の増殖を作用物質、化合物または因子が変調する能力を試験する方法であって、
A.幹細胞を分化未決定な細胞として維持する増殖培地において、請求項1〜3のいずれかに記載の幹細胞を培養する工程;
B.試験下で該作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された該細胞の増殖および系統を決定する工程
を包含する、方法。 - 分化未決定な細胞の増殖を変調する能力について作用物質、化合物または因子をスクリーニングする方法であって、
A.幹細胞を分化未決定な細胞として維持する増殖培地において、請求項1〜3のいずれかに記載の幹細胞を培養する工程;
B.試験下で該作用物質、化合物または因子を添加する工程;および
C.mRNA発現、抗原発現または他の手段によってそのようにして接触された該細胞の増殖および系統を決定する工程
を包含する、方法。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の幹細胞を含む、宿主に多能性胚様幹細胞を移植するための組成物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の多能性胚様幹細胞を含む、精製された多能性胚様幹細胞を宿主に提供するための組成物。
- 目的のタンパク質または遺伝子を発現するDNAまたはRNAを含むベクターをトランスフェクトされた、請求項1〜3のいずれかに記載の多能性胚様幹細胞を含む、目的のタンパク質もしくは遺伝子をin vivo投与するための組成物。
- 治療有効量の請求項1〜3のいずれかに記載の多能性胚様幹細胞、または、それから誘導される細胞もしくは組織を含む、哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全および/または他の疾患状態を予防および/または治療するための組成物。
- 治療有効量の請求項1〜3のいずれかに記載の多能性胚様幹細胞、または、それから誘導される細胞もしくは組織を含む、哺乳動物における組織修復または移植のための組成物。
- 哺乳動物の細胞衰弱、障害および/または機能不全の治療のための薬学的組成物でであって、
A.治療有効量の請求項1〜3のいずれかに記載の多能性胚様幹細胞、または、それから誘導される細胞もしくは組織;および
B.薬学的に受容可能な媒体またはキャリア
を含む、薬学的組成物。 - 増殖因子または分化決定因子をさらに含む、請求項25に記載の薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US40489599A | 1999-09-24 | 1999-09-24 | |
US09/404,895 | 1999-09-24 | ||
US66850800A | 2000-09-22 | 2000-09-22 | |
US09/668,508 | 2000-09-22 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015225380A Division JP6539188B2 (ja) | 1999-09-24 | 2015-11-18 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018225193A Division JP2019076094A (ja) | 1999-09-24 | 2018-11-30 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018174948A JP2018174948A (ja) | 2018-11-15 |
JP6545335B2 true JP6545335B2 (ja) | 2019-07-17 |
Family
ID=31720744
Family Applications (8)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001525326A Pending JP2004504003A (ja) | 1999-09-24 | 2000-09-25 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2010272045A Withdrawn JP2011103885A (ja) | 1999-09-24 | 2010-12-06 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2011084816A Pending JP2011167198A (ja) | 1999-09-24 | 2011-04-06 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2013232006A Pending JP2014054258A (ja) | 1999-09-24 | 2013-11-08 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2015225380A Expired - Lifetime JP6539188B2 (ja) | 1999-09-24 | 2015-11-18 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2017016498A Pending JP2017079792A (ja) | 1999-09-24 | 2017-02-01 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2018159129A Expired - Lifetime JP6545335B2 (ja) | 1999-09-24 | 2018-08-28 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2018225193A Pending JP2019076094A (ja) | 1999-09-24 | 2018-11-30 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
Family Applications Before (6)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001525326A Pending JP2004504003A (ja) | 1999-09-24 | 2000-09-25 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2010272045A Withdrawn JP2011103885A (ja) | 1999-09-24 | 2010-12-06 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2011084816A Pending JP2011167198A (ja) | 1999-09-24 | 2011-04-06 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2013232006A Pending JP2014054258A (ja) | 1999-09-24 | 2013-11-08 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2015225380A Expired - Lifetime JP6539188B2 (ja) | 1999-09-24 | 2015-11-18 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
JP2017016498A Pending JP2017079792A (ja) | 1999-09-24 | 2017-02-01 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018225193A Pending JP2019076094A (ja) | 1999-09-24 | 2018-11-30 | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100239542A1 (ja) |
EP (2) | EP2333049A1 (ja) |
JP (8) | JP2004504003A (ja) |
AT (1) | ATE426016T1 (ja) |
DE (1) | DE60041821D1 (ja) |
DK (1) | DK1218489T3 (ja) |
NZ (1) | NZ518601A (ja) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009001509A (ja) * | 2007-06-19 | 2009-01-08 | Univ Nagoya | 脂肪組織由来幹細胞を用いた組織再生用組成物 |
US9057051B2 (en) | 2008-10-31 | 2015-06-16 | Katholieke Universiteit Leuven | Optimized methods for differentiation of cells into cells with hepatocyte progenitor phenotypes, cells produced by the methods, and methods of using the cells |
EP2456860B1 (en) * | 2009-07-21 | 2018-09-05 | ABT Holding Company | Use of stem cells to reduce leukocyte extravasation |
SG10201404280XA (en) * | 2009-07-21 | 2014-10-30 | Abt Holding Co | Use of stem cells to reduce leukocyte extravasation |
US20110206647A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-08-25 | Abt Holding Company | Modulation of Angiogenesis |
WO2011106476A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Abt Holding Company | Modulation of microglia activation |
CA2798895A1 (en) | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Abt Holding Company | Modulation of splenocytes in cell therapy |
US10130736B1 (en) | 2010-05-14 | 2018-11-20 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
US8883210B1 (en) | 2010-05-14 | 2014-11-11 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
US9352003B1 (en) | 2010-05-14 | 2016-05-31 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
US9090878B2 (en) | 2010-06-17 | 2015-07-28 | Katholieke Universiteit Leuven | Methods for differentiating cells into hepatic stellate cells and hepatic sinusoidal endothelial cells, cells produced by the methods, and methods for using the cells |
SG188280A1 (en) | 2010-08-24 | 2013-04-30 | Univ Minnesota | Non-static suspension culture of cell aggregates |
WO2014123930A2 (en) * | 2013-02-05 | 2014-08-14 | Williams Joseph L | Prevention and treatment of tissue fibrosis |
PT2983680T (pt) | 2013-04-12 | 2020-10-29 | Abt Holding Co | Melhoria de órgãos para transplante |
JP2016519939A (ja) | 2013-05-22 | 2016-07-11 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California | 多能性ヒト脂肪成体幹細胞:単離、キャラクタリゼーションおよび臨床的意味 |
AU2014296259B2 (en) | 2013-07-30 | 2017-04-27 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same |
CA3177726A1 (en) | 2015-05-21 | 2016-11-24 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Modified demineralized cortical bone fibers |
US10912864B2 (en) | 2015-07-24 | 2021-02-09 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same |
US11052175B2 (en) | 2015-08-19 | 2021-07-06 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cartilage-derived implants and methods of making and using same |
JP6918003B2 (ja) | 2016-01-21 | 2021-08-11 | エイビーティー ホールディング カンパニー | 創傷治癒のための幹細胞 |
JP6870731B2 (ja) | 2017-04-13 | 2021-05-12 | 日本製鉄株式会社 | Snめっき鋼板及びSnめっき鋼板の製造方法 |
GB2584664B (en) * | 2019-06-10 | 2023-05-24 | Newcells Biotech Ltd | Improved retinal organoids and methods of making the same |
CA3162268A1 (en) | 2019-11-20 | 2021-05-25 | Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Method for freezing neural cells |
KR102179463B1 (ko) * | 2019-12-06 | 2020-11-16 | 서울대학교 산학협력단 | 닭의 대흉근으로부터 확립된 근아섬유세포주 및 이를 이용한 생리활성물질 스크리닝 방법 |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3654090A (en) | 1968-09-24 | 1972-04-04 | Organon | Method for the determination of antigens and antibodies |
USRE31006E (en) | 1968-09-24 | 1982-08-03 | Akzona Incorporated | Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other |
NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
US4016043A (en) | 1975-09-04 | 1977-04-05 | Akzona Incorporated | Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies |
US4491632A (en) | 1979-10-22 | 1985-01-01 | The Massachusetts General Hospital | Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor |
US4444887A (en) | 1979-12-10 | 1984-04-24 | Sloan-Kettering Institute | Process for making human antibody producing B-lymphocytes |
US4342566A (en) | 1980-02-22 | 1982-08-03 | Scripps Clinic & Research Foundation | Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes |
DE3167442D1 (en) | 1980-07-07 | 1985-01-10 | Nat Res Dev | Improvements in or relating to cell lines |
US4341761A (en) | 1980-07-25 | 1982-07-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Antibodies to immunogenic peptides and their use to purify human fibroblast interferon |
US4466917A (en) | 1981-02-12 | 1984-08-21 | New York University | Malaria vaccine |
US4493890A (en) | 1981-03-23 | 1985-01-15 | Miles Laboratories, Inc. | Activated apoglucose oxidase and its use in specific binding assays |
US4451570A (en) | 1981-03-26 | 1984-05-29 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line |
US4399121A (en) | 1981-11-04 | 1983-08-16 | Miles Laboratories, Inc. | Iodothyronine immunogens and antibodies |
US4427783A (en) | 1981-12-14 | 1984-01-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunoassay of thymosin α1 |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4493795A (en) | 1983-10-17 | 1985-01-15 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Synthetic peptide sequences useful in biological and pharmaceutical applications and methods of manufacture |
JPS63216476A (ja) * | 1987-03-05 | 1988-09-08 | Rikagaku Kenkyusho | 無血清凍結保存用培地 |
AU4543193A (en) | 1992-06-22 | 1994-01-24 | Henry E. Young | Scar inhibitory factor and use thereof |
JPH06217764A (ja) * | 1993-01-22 | 1994-08-09 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 細胞凍結保存用組成物 |
US5906934A (en) | 1995-03-14 | 1999-05-25 | Morphogen Pharmaceuticals, Inc. | Mesenchymal stem cells for cartilage repair |
IL128348A (en) * | 1996-08-19 | 2008-08-07 | Univ Massachusetts | Method of producing embryonic or stem like cell lines by transplantation of cell nuclei from animal or mammal, such cells and uses thereof |
EP0929664A1 (en) * | 1996-09-23 | 1999-07-21 | Ontogeny, Inc. | Hematopoietic stem cells and methods for generating such cells |
US5903934A (en) | 1996-10-21 | 1999-05-18 | Sears, Iii; Leonard W. | Sanitary fixtures for use with a mobile patient lift |
JPH10179165A (ja) * | 1996-12-27 | 1998-07-07 | Norin Suisansyo Chikusan Shikenjo | 抗体磁気ビーズを用いた生殖幹細胞の分離、精製と幹細胞株の樹立方法 |
US6331406B1 (en) * | 1997-03-31 | 2001-12-18 | The John Hopkins University School Of Medicine | Human enbryonic germ cell and methods of use |
EP1007631B2 (en) * | 1997-07-14 | 2009-02-18 | Osiris Therapeutics, Inc. | Cardiac muscle regeneration using mesenchymal stem cells |
WO1999027076A1 (en) * | 1997-11-25 | 1999-06-03 | Arc Genomic Research | Pluripotent embryonic stem cells and methods of obtaining them |
DK1226233T3 (da) * | 1999-08-05 | 2011-10-03 | Abt Holding Co | Multipotente voksne stamceller og fremgangsmåder til isolering heraf |
EP1218489B1 (en) * | 1999-09-24 | 2009-03-18 | Cybios LLC | Pluripotent embryonic-like stem cells, compositions, methods and uses thereof |
-
2000
- 2000-09-25 DE DE60041821T patent/DE60041821D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-25 EP EP10179746A patent/EP2333049A1/en not_active Withdrawn
- 2000-09-25 JP JP2001525326A patent/JP2004504003A/ja active Pending
- 2000-09-25 EP EP07022415A patent/EP1903107A1/en not_active Withdrawn
- 2000-09-25 NZ NZ518601A patent/NZ518601A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-09-25 DK DK00965390T patent/DK1218489T3/da active
- 2000-09-25 AT AT00965390T patent/ATE426016T1/de not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-04-27 US US12/768,411 patent/US20100239542A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-06 JP JP2010272045A patent/JP2011103885A/ja not_active Withdrawn
-
2011
- 2011-04-06 JP JP2011084816A patent/JP2011167198A/ja active Pending
-
2013
- 2013-11-08 JP JP2013232006A patent/JP2014054258A/ja active Pending
-
2015
- 2015-11-18 JP JP2015225380A patent/JP6539188B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2017
- 2017-02-01 JP JP2017016498A patent/JP2017079792A/ja active Pending
-
2018
- 2018-08-28 JP JP2018159129A patent/JP6545335B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2018-11-30 JP JP2018225193A patent/JP2019076094A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1903107A1 (en) | 2008-03-26 |
JP2014054258A (ja) | 2014-03-27 |
JP6539188B2 (ja) | 2019-07-03 |
EP2333049A1 (en) | 2011-06-15 |
US20100239542A1 (en) | 2010-09-23 |
JP2016063818A (ja) | 2016-04-28 |
ATE426016T1 (de) | 2009-04-15 |
JP2018174948A (ja) | 2018-11-15 |
DE60041821D1 (de) | 2009-04-30 |
JP2019076094A (ja) | 2019-05-23 |
JP2011103885A (ja) | 2011-06-02 |
JP2017079792A (ja) | 2017-05-18 |
JP2011167198A (ja) | 2011-09-01 |
NZ518601A (en) | 2004-10-29 |
JP2004504003A (ja) | 2004-02-12 |
DK1218489T3 (da) | 2009-06-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6545335B2 (ja) | 多能性胚様幹細胞、その組成物、方法および使用 | |
EP1218489B1 (en) | Pluripotent embryonic-like stem cells, compositions, methods and uses thereof | |
US9617513B2 (en) | Pluripotent embryonic-like stem cells, compositions, methods and uses thereof | |
Qu-Petersen et al. | Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration | |
Ladurner et al. | Spatial distribution and differentiation potential of stem cells in hatchlings and adults in the marine platyhelminth Macrostomum sp.: a bromodeoxyuridine analysis | |
US8426198B2 (en) | In vitro differentiated cell and human embryonic stem cell population | |
Petropavlovskaia et al. | Identification and characterization of small cells in the adult pancreas: potential progenitor cells? | |
CA2867953C (en) | Regulating stem cells | |
EP1254952A1 (en) | Cells capable of differentiating into heart muscle cells | |
BR112014020119A2 (pt) | cultura de células-tronco mesenquimais | |
JP2005502352A (ja) | 組織脂肪由来幹細胞および格子状物質 | |
AU2009244308A1 (en) | Methods and compositions for inducing brown adipogenesis | |
Young et al. | Clonogenic analysis reveals reserve stem cells in postnatal mammals. II. Pluripotent epiblastic‐like stem cells | |
US9422522B2 (en) | Method of producing adipocytes from fibroblast cells | |
US20120294837A1 (en) | Methods of isolating and culturing mesenchymal stem cells | |
WO2014141392A1 (ja) | 平行線維性結合組織の製造方法 | |
AU2011202123B2 (en) | Pluripotent embryonic-like stem cells, compositions, methods and uses thereof | |
Morad | Mesenchymal stem cells: Differentiation, hematopoietic support and possible application in cell and gene therapy for osteoarthritis | |
LaBarge | Bone marrow-derived myogenesis | |
Rossi | Skeletal muscle reconstruction through in vivo tissue engineering and characterization of satellite cell heterogeneity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180828 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181029 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181130 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20181130 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20181206 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190425 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190425 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190614 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190618 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6545335 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |