KR100699286B1

KR100699286B1 - 뇌 종양 치료용 알긴산염 캡슐

Info

Publication number: KR100699286B1
Application number: KR1020017002450A
Authority: KR
Inventors: 브제르크빅롤프
Original assignee: 노르스크 히드로 아에스아
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2007-03-26
Also published as: JP2002523445A; CN1191823C; IS5855A; US20050180960A1; ZA200101464B; WO2000012066A1; BR9913326A; CA2340325A1; AU5538999A; NZ510167A; US6926888B1; RU2229287C2; NO983911D0; NO20010960D0; NO20010960L; AU760433B2; EP1105100A1; IL141501A; KR20010074851A; TR200100583T2

Abstract

본 발명은 CNS 종양 성장의 억제제인 분자를 발현시킬 수 있는 캡슐화된 생산 세포가 중추 신경계내에 편재화된 종양, 예컨대 뇌종양의 치료에 새로운 접근법을 제공하는 것에 관한 것이다.

Description

뇌 종양 치료용 알긴산염 캡슐{ALGINATE CAPSULES FOR USE IN THE TREATMENT OF BRAIN TUMOUR}

본 발명은 중추 신경계(CNS)내에 편재하는 종양, 및 제1 및 제2 (전이성) 뇌 척수 악성 종양의 치료 분야에 관한 것이며, 이 치료에 유용한 신규 조성물 및 전달 체계를 제공하는 것이다.

다른 전이성 종양과 비교해서, 제1 뇌종양(신경교)은 수개의 독특한 생물학적 특징을 갖는다. 이들은 중추 신경계내에 한정되고, 다른 기관으로의 전이성 확산은 실제 존재하지 않는다. 이들 종양은 높은 정도로 뇌에 침입하지만, 이들은 원래 발견되었던 위치에서 치료 후 재발하는 경향이 있다. 이 종양은 매우 이종적으로, 여러 표현형 성질들을 갖는 많은 세포 형태들로 이루어져 있다.

현재, 최선의 치료법은 수술 후에 방사선 요법과 화학 요법을 병용하는 것이다. 가장 악성 형태의 뇌종양(교아세포종)을 가진 환자들은 진단 후 약 10개월을 생존하는 심각한 예후를 받는다. 따라서, 이러한 특정 종양군에 대한 새로운 치료 방법의 필요성이 절박하다. 이들 종양은 이것의 원위치에 재발하는 경향이 있기 때문에, 새로운 국부 치료 방법이 필요하다. 또한, 이들 종양은 여러 표현 성질들을 갖는 많은 종양 세포들로 이루어져 있기 때문에, 최선의 치료법은 여러 형태의 종양 세포들을 목표로 할 수 있어야 한다.

중추 신경계내에 편재하고 때로는 완전 치료가 어려운 기타 종양으로는, 대교세포 및 희돌기교세포에서 유래한 다음 종양들을 들 수 있다:

성상세포종

- 저등급 성상세포종(성상세포종 등급 1 및 2)

- 퇴행성 성상세포종(성상세포종 등급 3)

- 신경교아세포종 다형(성상세포종 등급 4)

- 2차 신경교아세포종, 즉 저등급의 성상세포종과 구별되는

종양을 포함함.

- 1차 신경교아세포종, 즉 1차 신경교아세포종으로 새로이 발생하 는 종양

- 거대 세포 신경교아세포종

- 신경교육종

- 신경교종증 뇌종양

희돌기교종

- 희돌기교종(WHO 등급 II) 포함

- 퇴행성 희돌기교종(WHO 등급 III)

혼합 교종

- 희소성상세포종(WHO 등급 II)

- 퇴행성 희소성상세포종(WHO 등급 III)

상의종양

- 상의세포종(WHO 등급 II)

- 퇴행성 상의세포종 (WHO 등급 III)

- 상의하세포종(WHO 등급 I)

배 종양

- 중추 신경아세포종

- 상의아세포종

- 수아세포종

- 천막상 PNETs

신경아세포종

- 후각 신경아세포종

- 부신 및 교감신경계의 신경아세포 종양

이들 종양의 대부분에 있어, 최선의 제1 치료법은 수술 후에 방사선 요법 및/또는 화학 요법을 병용하는 것이다. 그러나, 때로는 수술 절차로 종양을 완전히 제거하기가 어려우며, 후속의 방사선 요법과 화학 요법은 또한 방사성 내성 및/또는 치료 용량의 세포 독성 약을 전달하는 난점 때문에 종종 완전하게는 성공하지 못하였다.

최근 수 년 동안 유전자 요법에 많은 관심이 모아졌는데, 종양 유전자 발현의 완급 조절 또는 정상적인 종양 억제 유전자의 삽입에 의해 악성 종양 표현의 반전이 시도되었다. 면역 체계에 의해 종양의 인식과 거부를 강화시키도록 디자인된 면역 자극 인자(예, 사이토카인)가 또한 도입되었다. 또한, 세포를 변형시켜 유전자 생성물을 종양 세포로 직접 전달시키게 하여 약리학 제제에 대한 이들의 감작성을 증가시켰다. 이러한 발전상을 기술하는 논문으로는 (i) Curr Opin Oncol, 7, (1995), 94∼100, (ii) Curr Opin Biotechnol, 5, (1994), 611∼616, (iii) Cancer Res, 53, (1993), 2330∼2337, (iv) Hum Gene Ther, 4, (1993), 451∼460, (v) Hum Gene Ther, 5, (1994), 153∼164, 및 (vi) Trends Pharmacol. Sci, 14, (1993), 202∼208를 들 수 있다.

최근 수 년 동안 이와 같이 폭넓은 연구에도 불구하고, 악성 뇌종양에 대한 실험적 연구와 임상 치료 사이의 전이를 방해하는 큰 장애물이 있다. 첫번째 문제는 두개골내 이식 후에 유전자 변형 세포들의 면역 거부를 방해하는 것이다. 이것은 생산 세포들을 캡슐화함으로써 극복될 수 있다.

그러나, 이것은 뇌에 사용하기에 특히 적합한 재료를 찾아야 하는 다른 문제점을 낳는다. 뇌가 면역학적으로 신체의 다른 부분과는 다르지만(예를 들면, B 임파구 세포가 없음), 생물학적 활성 화합물(예, 내독소)의 작용에 특히 민감하다.

본 발명에 따르면, 본 발명자들은 면역 분리성 알긴산염 매트릭스가 CNS 종양 치료시 두개골내로 이식하는 생산 세포의 캡슐화에 특히 적합하다는 것을 발견하였다. 특히, 면역 분리성 알긴산염 매트릭스는 마이크로비드인 것이 바람직하다.

따라서, 광의의 특징에서 본 발명은 CNS 종양 성장의 억제제인 분자를 발현시킬 수 있는 캡슐화된 생산 세포를 제공하는 것으로서, 이 생산 세포는 면역 분리 성 알긴산염 매트릭스로 캡슐화된다. 이 분자는 펩타이드, 단백질 또는 다당류인 것이 바람직하며, 단일 클론 항체가 가장 바람직하다.

본 발명은 또한 종양 성장 억제제인 분자를 발현시킬 수 있는 캡슐화된 생산 세포를 종양 부위에 이식하는 것을 포함하는, CNS 종양 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 종양 성장 억제제인 분자를 발현시킬 수 있는 생산 세포를 면역 분리성 알긴산염 매트릭스 내에 캡슐화하는 것을 포함하는, CNS 종양 치료용 약학 생성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 CNS 종양 치료시 두개골내로 이식하는 생산 세포의 캡슐화에 면역 분리성 알긴산염 매트릭스를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 실시 형태에서, 본 명세서에서 사용하려는 생산 세포는, 종양 세포와 직접 작용하거나 또는 종양 세포 또는 숙주 세포 전달 경로와 간접 작용할 분자들(예, 단백질, 펩타이드 및 다당류)을 생성하는 유전학적으로 설계된 세포들을 포함한다. 본 명세서에서 의도한 기타 유용한 생산 세포는, 예를 들어 하이브리도마 세포와 같이 단일 클론 항체를 생성하는 특수 세포이거나, 또는 종양 억제 분자를 발현시킬 수 있는 자연 발생 세포이다.

종양 성장은 숙주와 특이 세포의 상호 작용에 좌우되며, 다소 복잡한 방법으로 종양 세포 성장을 조절하는 특이 성장 인자를 경유하여 매개되는 것으로 공지되어 있다. 이점에서 종양은 숙주에 의해 공급되는, 새로이 형성된 혈관을 경유하여 전달되는 영양물에 의존한다. 지난 몇 년간 수 개의 종양 세포/숙주 세포의 상호 작용 경로를 확인하였고 이것을 문헌에도 기술하였다.

따라서, 본 명세서에서 유용한 한 부류의 생산 세포는 종양/숙주 전달 경로와 작용할 단백질 또는 펩타이드를 발현시킬 수 있는 것들이다. 예를 들면, 유용한 생산 세포는 예를 들어 트롬보스폰딘, 엔도스타틴, 엔지오스타틴 및 프롤락틴과 같이 종양 신혈관 형성에 영향을 미치는 단백질 및 펩타이드와, 세포외 매트릭스에 대한 종양 세포의 관계를 방해하는 단백질(예, 금속프로테아제의 조직 억제제와 같은 프로테아제 억제제)와, 여러 부류의 인더루킨을 포함하여 면역 체계에 영향을 주고 단백질 및 펩타이드를 생성하는 것들을 포함한다.

또 다른 바람직한 생산 세포 부류는 종양 세포 그 자체와 직접 작용하는 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 것들로 구성된다. 예를 들면, 이 범주의 유용한 생산 세포로는, 예를 들어 종양 세포에 영향을 미치는 세포 성장 인자 수용체(예, 상피 성장 인자 수용체(EGFr), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 AA 및 BB, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 수용체, 형질전환 성장 인자 수용체 알파 및 베타, 여러 부류의 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR-1 및 VEGFR-2), 면역글로불린 및 EGF-유사 도메인을 갖는 티로신 키나제 수용체 부류물(예, TIE-1 및 TIE-2/tek, 간세포 성장 인자(분산 인자)))와 직접 작용하는 단일 클론 항체, 다양한 부류의 인테그린 수용체에 대해 유도된 단일 클론 항체, CD-44에 대해 유도된 단일 클론 항체, CDK/사이클린 착체에 대해 유도된 단일 클론 항체, FAS에 대해 유도된 단일 클론 항체, 세포 표면상의 당지질에 대해 유도된 단일 클론 항체, 당단백질에 대해 유도된 단일 클론 항체, 또는 특이 종양 유전자의 발현에서 유래된 단백질에 대해 유도된 단일 클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주들을 들 수 있다.

경우에 따라서, 종양 성장 억제 물질들의 생산이 약학적 수단에 의해 자유자재로 전환될 수 있는 생산 세포, 예를 들면 테트라사이클린 활성 유전자 발현과 같이 약학 유도성 유전자 발현을 갖는 생산 세포가 특히 중요하다.

형질감염이 가능한 임의의 세포주가 본 발명에서 사용될 수 있다. 상기 세포주는 영구적이어야 하는데, 즉 무제한적 세포 분열을 할 수 있어야 하며, 인간의 것이 아니고 비발암성인 것이 바람직하다.

미국 버지니아주 20109 매나사스 린덴 레이크 플라자 10350에 소재한 미국 모식균 배양 수집소(American Type Culture Collection)에서 시판중인 그러한 세포주의 예는 다음과 같다:

세포주 ATCC 번호 내역

H528 HB 8509 마우스 B 세포 골수종

293 CRL 1573 인간의 형질변형된 제1 태아 신장

NIH/3T3 CRL 1658 NIH 스위스 마우스, 태아

COS-7 CRL 1651 아프리카 녹색 원숭이, 신장, SV40 형질변형체

BHK-21 CCL 10 햄스터 신장, 정상

CV-1 CCL 70 아프리카 녹색 원숭이, 신장, 정상

CHP-234 CRL-2272 신경아세포종, 대뇌, 인간

레트2 CRL-1764 태아, 티미딘 키나아제 변종, 레트

나말와 CL-1432 버킷 임파종, 인간

본 발명에 따라, 상기 생산 세포는 생산 세포의 면역 거부 반응없이 종양 성장 및 진행을 방해할 수 있는 발현된 단백질 또는 기타 분자의 안정한 동시 전달계를 제공할 수 있는 면역 분리성 알긴산염 매트릭스로 캡슐화된다.

알긴산염 비드내 세포의 캡슐화는 세포와 기타 물질을 부동화시키는 공지된 기술로서, 상기 문헌에 기술된 바와 같이 당뇨병 치료, 단일 클론 항체 생산 및 기타 의학 분야에 이미 사용 중이다.

PCT/WO97/44065에서 뇌종양 부위에 유전자 이식 벡터를 방출하는 캡슐화된 세포들을 사용하는 생체내 유전자 요법으로 이러한 현재의 약 전달 기법을 제안하였다. 상기 세포를 캡슐화하는 데 사용되는 캡슐은 a) 살아있는 충전 세포를 포함하는 핵 부분 및 b) 상기 핵을 둘러싸는 외부 자켓인 2부분으로 구성된다.

본 발명은 더 단순한 캡슐화 방법과 제품을 제공하는데, 상질의 면역 분리 알긴산염을 사용하여 1단계 반응으로 직접 생산 세포를 캡슐화한다.

알긴산염은 갈조류에서 주로 발견되는 다당류이다. 이것은 2가지 형태의 단당류인 L-굴루론산 (G) 및 D-만뉴론산 (M)으로 이루어진다. 이들 다당류 유닛은 G와 M의 교차 서열 블록(MG-블록)과, 주로 G 유닛 또는 M 유닛으로 이루어지는 블록(G-블록/M-블록)이다.

겔 형성 성질은 다가 양이온, 특히 Ca²⁺으로 G-블록의 가교를 통해 이루어진다.

알긴산염이 면역학적으로 활성화되지 않게 하기 위해서, G 함량은 15% 이상이어야 한다. 그러나, 본 발명에 따르면 알긴산염의 면역 분리성을 명백히 하기 위해 고농도의 G 알긴산염(즉, G 함량이 50% 이상임)을 사용하는 것이 바람직하다. 당기술 분야에 공지된 바와 같이 G-블록/M-블록 비율 및 다른 블록들의 분포는 다가 양이온으로 가교를 통해 형성된 겔의 여러 성질들에 중요한 인자가 된다.

중요한 또 다른 특징은 사용되는 알긴산염의 순도이다. 따라서, 본 발명에 따른 사용 가능한 알긴산염 매트릭스의 장점은 이들 매트릭스가 잘 규정된 구성 성분과, 내독소와 같은 불순물을 극미량 함유하는 고순도 물질로 제조될 수 있다는 것이다.

본 발명에 따른 사용 가능한 알긴산염 매트릭스의 또 다른 장점은 생존 가능한 세포들을 함유하는 알긴산염 용액을 칼슘 용액에 적가시킴으로써 제조되는 알긴산염 마이크로비드의 알긴산염 농도가 마이크로비드의 중심부에서 외부 테두리쪽으로 갈수록 증가한다는 것이다. 그 때문에 세포가 생존하고 증식하며 생성되는 최적 공간은 상기 마이크로비드의 중심부에 생성됨으로써 충분한 자양분과 산소를 세포가 이용할 수 있다. 알긴산염 농도가 더 높은 외부 테두리는 막을 만들어서, 마이크로비드 내부의 생성 세포가 내부에서 탈출하지 못하도록 하고 면역학적 세포가 상기 비드내로 들어가지 못하게 한다.

일반적으로, 알긴산염을 세포들의 부동화 매트릭스로 사용하는 것은 세포의 현탁 용액을 Na⁺ 알긴산염 용액과 혼합시키는 것을 포함하고, 이후 상기 혼합물을 다가 양이온(주로 Ca²⁺)을 함유하는 용액에 적가시킨다. 방울들은 이온으로 가교된 알긴산염의 3차원적 격자내에 세포를 즉각적으로 포집하는 겔 구체를 형성한다. 이 부동화 방법은 매우 마일드한 조건하에서 수행될 수 있으므로 대부분의 살아있는 세포들과 양립할 수 있다. 상기 방법의 이론 및 실험 모두에 대한 상세 기술을 얻고자 한다면 다음 논문["Alginate as Immobilization Matrix for Cells", Smidsrod 및 Skjak-Braek, Trends in Biotechnology, 1990년 3월, Vol. 8, No. 3, 71∼78]을 참조하라.

본 발명에 의한 생산 세포-캡슐화된 알긴산칼슘 비드를 형성하는 현재의 바람직한 방법은 다음과 같다. 알긴산나트륨을 물 또는 생리 식염수에 1∼2% 농도로 녹인다. 알긴산염 용액을 멤브레인 멸균을 하고, 생산 세포를 첨가하여 등장성을 조절한다. 수동으로, 그러나 바람직하게는 알긴산염 공급물 탐침과 겔 중탕기 사이에 5 kv 내지 7 kv의 정전위를 형성시키는 정전기 비드 발생기를 사용하여 알긴산나트륨-생산 세포 용액을 염화칼슘(0.05∼0.25 M) 중탕기에 적가시킴으로써 알긴산칼슘 비드를 형성한다. 사용된 탐침 직경(예, 0.1 mm 내지 0.4 mm), 유속(예, 1시간 당 5 ml 내지 30 ml) 및 전압을 조절함으로써, 직경 100∼400 ㎛의 비교적 균일한 비드를 얻을 수 있다. 겔 중탕기에 염 농도(0 mM 내지 200 mM NaCl)를 조절함으로써 이들 비드의 균일도를 제어하는데, 염 농도가 높아질수록 비드는 더 균일해진다. 겔중탕기에서 상기 비드를 경화시킨다.

통상적인 큰 종양의 제거 수술 후, 본 발명의 캡슐화된 생산 세포를 종양 공동에 두도록 고안되었다. 수술하는 즉시, 종양의 부담은 최소화되고 많은 환자들은 재발하기 전에 증상이 없는 기간을 갖는다. 수술은 외상적인 일이기 때문에 잔존하는 종양 세포는 숙주와 새로운 생화학적 상호 작용 경로를 확립하려고 할 것이다. 이것은 새로운 혈관 형성 및 잔존하는 종양 세포로의 펩타이드 성장 인자의 새로운 공급을 포함한다. 본 발명에 의해 가능한 치료법이 가장 효과적일 때는 종양의 부담이 최소화되었을 때이다.

실제로, 한 실시 형태에 의한 본 발명의 특별한 장점은, 뇌종양 또는 다른 종양의 진행성 성장에 영향을 주는 여러 표현형 특징 및 미소 환경 인자를 목표로 하는 수 개의 다른 형태의 생산 세포들의 동시 이식을 쉽게 허용한다는 것이다. 이러한 목적을 위해, 액체 질소의 온도에서 동결 보존된 캡슐화된 생산 세포를 포함하는 생산 세포 은행이 설립될 수 있었다. 그 다음, 치료할 숙주 종양의 유전자형 발현과 부합하는 생산 세포를 상기 은행에서 인출할 수 있다.

종양 치료에 필요한 생산 세포를 얻기 위해, 일례로 다음 방법을 사용할 수 있다. 생체 검사 물질로 수용체 상태 및 표현형의 측정을 포함한 종양 특성화를 수행한다. 일차 종양 제거 수술 후 60일 이내에 숙주 종양의 수용체 상태에 대한 유도성 물질(예, 단일 클론 항체)을 생산하는 적당히 선택된 생산 세포를 입체 전략적으로 이식한다.

대안적으로, 주종양의 제거 수술 후 항맥관유래 물질들을 생산하는 생산 세포를 직접 이식할 수 있다.

물론, 이식된 생산 세포의 양은 각 환자의 정확한 상황에 의존하겠지만, 전형적으로 이식된 세포의 총수는 환자 당 10⁶개 내지 10¹²개 사이일 것이다. 물론, 각 알긴산염 또는 다른 캡슐 매트릭스내 생산 세포의 수는 비드의 크기 또는 다른 캡슐 형태에 좌우될 것이다. 일차 종양의 제거 수술 후, 일반적으로 수술에 의해 캡슐화된 생산 세포를 상처 부위에 둘 것이다.

하기에 상세히 기술될 실험들이 나타내는 바와 같이, 캡슐화된 생산 세포는 시험관 및 생체내에서 생존하고, 증식하며, 이들의 특이성 발현 기간을 유지할 수 있다. 이러한 발견은 뇌종양 질환 환자를 위한 새로운 종류의 치료법의 가능성을 개시함으로써 뇌종양 성장 및 발전의 특정 특징들을 목표로 하도록 선택되는 여러 생산 세포들을 캡슐화할 수 있다. 본 명세서에 기술된 실험에서, 본 발명자들은 알긴산염 비드에서 방출된 특이 MAbs는 상피 성장 인자 수용체의 방해를 기술한 바와 같이 종양 세포의 이동을 억제할 수 있음을 보여주었다. 본 발명자들은 또한 대뇌내의 캡슐화된 생산 세포에서 방출된 특이 생성물이 뇌 실질로 침투하여 CSF 경로를 따라 분포될 수 있음을 보여주었다.

하기 실험들은 본 발명과 본 발명의 장점을 이해하는데 도움이 될 것이다. 이제 수반한 도면에 대해 언급할 것이다:

도 1A∼1C

알긴산염으로 캡슐화된 NIH 3T3 세포의 광현미경 사진. 모든 선은 250 ㎛를 나타낸다.

도 1A: 캡슐화한 당일.

도 1B: 3주 배양 후의 캡슐화된 세포.

도 1C: 9주 배양 후의 캡슐화된 세포.

도 1D∼1F: 알긴산염으로 캡슐화된 NIH 3T3 세포의 스캐닝 공초점 레이저 현 미경 사진. 생존한 세포는 녹색 형광(본 도면에서 더 밝은 영역으로 표시됨)을 발하지만, 죽은 세포들은 적색 형광(여기서는 보이지 않음)을 발한다. 모든 선은 250 ㎛를 나타낸다.

도 1D: 캡슐화한 당일.

도 1E: 3주 배양 후의 캡슐화된 세포.

도 1F: 9주 배양 후의 캡슐화된 세포.

도 1G: 9주 배양 후, 알긴산염으로 캡슐화된 BT4CnVlacZ 세포의 β-갈락토시다아제 활성. 선은 500 ㎛를 나타낸다.

도 2A∼2D

알긴산염 비드로 캡슐화된 NIH 3T3 세포의 유량 세포 계산 히스토그램. 횡축은 유량 세포 계측기에 유량 채널 수(상대적인 DNA 형광)를 나타내지만, 종축은 각 채널내 세포핵의 상대적인 수를 나타낸다.

도 2A: 대조군, 단층 배양.

도 2B: 1주일 동안 캡슐화된 세포.

도 2C: 3주일 동안 캡슐화된 세포.

도 2D: 9주일 동안 캡슐화된 세포.

도 3

알긴산염으로 캡슐화된 H528 하이브리도마 세포의 항체 방출(평균값 ± 표준 오차). 횡축은 배양한 일수를 나타내고, 종축은 성장 매체로의 항체 방출을 보여준다. 3차 회귀분석법으로 커브를 추정하였다.

도 4

4일 후, GaMg 구상체로부터의 세포 이동, 비처리 세포(대조군), 10 ng/ml EGF로 자극된 세포(EGF), 또는 캡슐화된 하이브리도마 세포의 존재하에서 10 ng/ml EGF로 자극된 세포(EGF/H528).

도 5A∼5H

레트의 뇌로 이식된 캡슐화된 H528 하이브리도마 세포.

도 5A: 레트의 뇌 단층면. H&E-착색하고, 선은 5 mm를 나타낸다.

도 5B: 이식 부위 내부의 캡슐화된 H528 세포를 보여주는 도 5A와 동일한 단층면. H&E-착색하고, 선은 500 ㎛를 나타낸다.

도 5C∼5H: 대뇌의 단일 클론 항체의 방출 및 파종에 대한 공초점 레이저 스캐닝 현미경 사진. 또한 동일한 입출력비 조절로 도 5C, 5E, 5F, 5G 및 5H를 얻었다.

도 5C: 가장 왼쪽 영역에 캡슐화된 H528 세포를 갖는 뇌 실질의 단층면. 선은 150 ㎛를 나타낸다. 뇌 실질의 강한 형광은 왼쪽 편에 보이고, 뒤어어 뇌 쪽의 1000 ㎛ 이상에서 세기가 점차 감소한다.

도 5D에서는 횡축을 따라 형광 세기가 점차 변화하는 것을 더 도시하였는데, 종축은 상대적 형광 세기(0∼255)를 나타낸다. 강한 형광은 왼쪽에 보이고, 뇌 실질쪽으로 갈수록 점차 감소한다.

도 5E: MAbs는 지주막하 공간과 하부 뇌에서 발견되었다. 선은 75 ㎛를 나타낸다.

도 5F: 대조군에 나타난 약한 형광은 아마도 비특이적 결합에 의한 것이다. 선은 75 ㎛를 나타낸다.

도 5G: MAbs는 혈관주위 공간내에 더 확산되었다. 선은 50 ㎛를 나타낸다.

도 5H: 비교해서, 대조군은 혈관 주위 공간에서 면역 글로불린의 약한 결합을 보여주었다. 선은 50 ㎛를 나타낸다.

도 6: 엔도스타틴 생산 세포의 성공적인 확립을 보여주는 방사선 면역 분석. 상기 도면은 상태 조절 배지의 엔도스타틴, 제2 칼럼, 제3 칼럼 및 제4 칼럼 각각에서는 세포 분류물, 비감염 세포의 분류물 및 배지의 방사선 면역 분석을 보여준다.

도 7: 종양 성장에 대한 엔도스타틴 알긴산염 치료법의 효과. 그림 A는 알긴산염 비드로 캡슐화된 위형질성 감염 세포가 이식된 대조군 동물의 예를 보여준다. 뇌에서 더 어두운 부분은 종양 영역을 나타낸다.

그림 B는 캡슐화된 엔도스타틴 생산 세포로 처리한 동물의 예를 보여준다. 더 어두운 부분은 종양을 나타내고, 큰 괴사성 영역이 종양 중간에 보인다.

물질 및 방법

1. 세포주

본 실험에서는 4가지 다른 세포주를 사용하였다:

세포주 기탁물 내역

1. NIH 3T3 ATCC CRL/1658

2. BT4CnVlacZ 기탁되지 않음

3. H528 ATCC HB 8509

4. GaMg 기탁되지 않음

마우스 섬유아세포 NIH 3T3 세포는 종양의 성장, 진행 및 발전에 영향을 미치는 물질을 발현시키도록 유전자적으로 설계될 수 있다는 점에서 잠재성 생산 세포주를 나타낸다. NIH 3T3 세포는 후술되는 바와 같이 알긴산염으로 캡슐화되어 시험관에서 형태, 생육력 및 세포 반응속도론을 연구하는데 사용된다. 생체내에서 캡슐화된 세포의 생육력에 대한 연구에서, NIH 3T3 세포를 함유하는 알긴산염 비드를 또한 레트의 뇌로 이식하였다.

BT4CnVlacZ 세포주는 원래 에틸니트로소우레아 유래성 레트 신경교종으로부터 전개되고, 체내 로스(Rous) 육종 바이러스 프로모터로부터 발현되는 네오마이신 내성 유전자를 갖는 몰로니(Moloney) 쥐의 백혈병 바이러스 장말단 반복 카세트를 함유하는 플라스미드내로 클로닝된 박테리아성 lacZ 유전자로 안정하게 형질감염되었다. 참조[J. Natl Cancer Inst, 55, (1975), 1177∼1187 및 Int. J. Cancer, 71, (1997), 874∼880]. 알긴산염으로 상기 세포들을 캡슐화하고, 박테리아성 β-갈락토시다아제의 시험관내 합성을 연구하였다.

H528 하이브리도마 세포주는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC, 미국 매사추세츠주 록크빌 소재)에서 구입하였다. 상기 세포주는 NS-A-Ag4-1 골수종 세포를 BALB/c 마우스의 지라 세포와 융합시킴으로써 생성되었고, 이것은 인간의 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 EGF-결합 도메인에 결합되어 차단하는 마우스 단일 클론 항체(MAb) (IgG2a)를 생산한다. 이 세포주를 사용하여 알긴산염 캡슐화된 세포로부터의 시험관내 및 생체내 MAbs 방출을 연구하였다.

인간 신경교종 세포주 GaMg는 다음 문헌[Anticancer Res, 8, (1988), 874∼880]에 기술되어 있으며, EGFR을 발현하는 것도 이미 기술되었다[Acta Neuropathol Berl, 84, (1992), 190∼197]. GaMg 다중세포 구상체와 캡슐화된 H528 세포 사이의 공동 배양계에서 GaMg 세포 이동의 특이성 억제를 연구하였다.

2. 세포 배양

10% 신생 송아지의 열-비활성화된 혈청, 비필수 아미노산들의 규정 농도의 4배, 2% L-글루타민, 페니실린(100 IU/ml) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/ml)(모든 생화학 약품은 벨기에 베르비에르스 소재의 BioWhittaker에서 구입함)으로 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형 이글스 배지(DMEM)로 이루어진 완전 성장 배지로 80 cm² 배양 플라스크(Nunc, 덴마크 로스킬데 소재)에서 NIH 3T3 및 BT4CnVlacZ 세포주들을 성장시켰다. 10% 말 혈청(BioWhittaker)으로 보충된 RPMI 1640 성장 배지로 80 cm² 배양 플라스크(Nunc)에서 H528 하이브리도마 세포주 및 GaMg 세포주를 성장시켰다. 0.025% 트립신(BioWhittaker) 3 ml를 더 넣은 용액에서 GaMg 단층을 트립신화하고, 완전 RPMI 배지 20 ml 내 5*10⁶개의 세포를 완전 RPMI 배지 중의 0.5% 아가 노블(Difco, 미국 미시간주 디트로이트 소재)로 기저 코팅된 80 cm² 배양 플라스크(Nunc)에 파종하여 구상체를 개시하였다. 모든 세포주들을 37℃, 100% 상대 습도, 95% 공기 및 5% CO₂의 표준 조직 배양 항온기에서 두었다.

3. 알긴산염의 구조 및 성질

본 실험에서 갈조류 라미나리아 하이퍼보리아(LF 10/60)의 알긴산나트륨(Protanal, 노르웨이 드램멘 소재)을 생산 세포의 미소 캡슐에 사용하였다. 이것은 2가지 단당류, 즉 α-L-글루론산(G) 및 β-D-만뉴론산(M)으로 이루어진다. G-유닛 및 M-유닛은 3가지 다른 형태의 블록, 즉 GG, MM 및 MG로 서로 연결되고, 이들 블록의 비율 및 분산도는 알긴산염 분자의 화학적 성질 및 물리적 성질을 결정한다. Ca²⁺와 같은 몇가지 2가 양이온은 개별 G-블록들 사이를 강하게 연결하고, 이들 G-블록은 팽팽한 연결점을 형성하는 확대된 알긴산염 망상 구조의 형성을 개시한다. 본 발명자들이 사용한 알긴산염은 G 블록의 고함량(60% 이상)을 가지므로, 기계적 안정성 및 다공성이 높아지고, 2차 대사물 생산용 세포들을 캡슐화하는데 적합하게 된다(참조, Trends in Biotechnology, 8, (1990), 71∼78). 스캐닝 전자 현미경은 알긴산염 비드내 공극 크기가 5 nm 내지 200 nm(33,34) 사이임을 보여주었다. 상기 비드의 기계적 강도, 부피 안정성 및 다공성은 글루론산의 함량과 관련이 있다.

4. 세포의 캡슐화

사용된 캡슐화 방법은 다음 문헌["Alginate as Immobilization Matrix for Cells", Smidsrod 및 Skjak-Braek, Trends in Biotechnology, 1990년 3월, Vol.8, No.3, 71∼78]에 상세히 기술되어 있다.

간단히 말하자면, 1.5% 알긴산나트륨에 분산된 세포 방울은 0.1 M Ca²⁺ 용액으로 방출된다. 중합후, 둘베코 PBS(DPBS; Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)에서 알긴산염 비드를 3회 세척한 후, 성장 배지에서 1회 세척하였다. 성장 배지 50 ml를 함유하는 175 cm² 배양 용기(Nunc)에서 캡슐화된 세포를 배양하였다. 3일마다 성장 배지를 교환해 주고, 일주일에 한번씩 용기를 바꾸었다. 37℃, 100% 상대 습도, 95% 공기 및 5% CO₂의 표준 조직 배양 항온기에 모든 알긴산염 캡슐화된 세포들을 두었다. NIH 3T3 및 BT4CnVlacZ 세포주로 하는 모든 실험의 경우, 알긴산염 1 ml 당 6*10⁶개의 세포 농도 및 0.8 mm 내지 1.2 mm의 비드 크기를 사용하였다. H528 세포주로 하는 시험관내 실험의 경우, 알긴산염 1 ml 당 3*10⁵개의 세포 농도 및 2.3 mm 내지 2.5 mm의 비드 직경을 사용하였다. H528 세포주로 하는 생체내 실험의 경우, 알긴산염 1 ml 당 3*10⁵개의 세포 농도 및 0.8 mm 내지 1.2 mm의 비드 직경을 사용하였다.

시험관내 실험

1. 알긴산염 캡슐 세포의 형태학 및 생육력

캡슐화한 당일, 3주 및 9주 후, 알긴산염으로 캡슐화된 NIH 3T3 세포의 형태학을 DPBS 1.0 ml을 도말한 6-웰 접시(Nunc)로 이동시킨 6개 비드로 조사하였다. 니콘 다이아팟(Nikon Diaphot) 광 현미경으로 상기 비드를 검사하여, 니콘 F-301 카메라로 촬영하였다. 형태학 실험을 2회 실시하였다.

캡슐화한 당일, 3주 및 9주 후, 알긴산염 비드내에 세포의 생육력을 2색상 형광 생육력 검사법(라이브/데드(Live/Dead)™생육력/세포독성 검사, Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진 소재)로 검사하였다. 완전 성장 배지내 2 μM 칼세인-AM 및 4 μM 에티듐 동종 이합체로 표지 용액을 제조하였다. 실온에서 알긴산염 비드를 30분된 표지 용액 0.5 ml로 도말한 16-mm 다중웰 접시(Nunc)에 각각 두었다. 이후, 이들을 DPBS로 옮겨서 즉시 검사하였다. 텍사스 레드 앤드 핏크 광여과기(Texas Red and FITC filter optics)를 사용하고, 아르곤-크립톤 레이저의 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Biorad MRC-1000, 영국 헤멜 헴프스테드 소재)을 사용하여 알긴산염을 통해 광학 단층면의 형광을 측정하였다. 알긴산염 비드 내부의 평면 120 ㎛에 형광을 기록하였다. 생육력 실험을 3회 실시하였다.

1주, 3주 및 9주 동안 알긴산염으로 캡슐화된 BT4CnVlacZ 세포들내 β-갈락토시다아제의 생성을 연구하였다. 상기 비드를 DPBS(pH=8.4)에서 1분 동안 세척하고, 0.2% 글루타르알데히드와 2% 포름알데히드의 DPBS에 10분 동안 두었다. 이후, 이들을 DPBS에서 5분 동안 3회 세척을 하고, β-갈락토시다아제 활성 측정을 위해 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드(x-갈, Sigma)로 염색시켰다. 1 mg/ml x-갈로 이루어진 상기 기질 용액을 디메틸포름아미드 100 ㎕에 녹여서, DPBS에 용해된 5 mM 페리시안화칼륨, 5 mM 페로시안화칼륨 및 2 mM MgCl₂(모든 생화학 약품은 독일 다름스타드트 소재의 E. Merck에서 구입함)과 혼합시켰다. 이들을 4℃에서 24시간 이상 동안 항온시켜서, 청색으로 착색된 세포질로 나타나는 β-갈락토시다아제 활성을 연구하였다.

2. 알긴산염 캡슐 세포의 세포 반응속도론

유량 세포계측 DNA 분석법으로 캡슐화된 NIH 3T3 세포의 시험관내 세포 사이클 분포를 측정하였다. 1.5% 시트르산삼나트륨 2수화물(E. Merck)을 함유하는 완전 성장 배지에 상기 비드를 15분 동안 용해시킴으로써 캡슐화된 세포를 알긴산염에서 방출시킨 후, 4분 동안 140 g로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상기 세포를 완전 성장 배지에 2회 재현탁화시킨 후, 4분 동안 140 g로 원심분리하고, 빙냉된 96% 에탄올에 넣어 4℃에서 저장하였다. 유량 세포계측 분석을 하기에 앞서, 상기 세포를 37℃, 0.9% 생리 식염수(pH = 1.5)에서 0.5% 펩신(Sigma)와 함께 15분 동안 항온처리한 후, 분리한 핵을 0.9% 생리 식염수에 세척하고 1분 동안 리보뉴클레아제(Sigma)(0.9% 생리 식염수 1 ml 당 1 mg 농도)로 처리하였다. 프로피듐-요오드화물(Sigma)(0.9% 생리 식염수 1 ml 당 50 ㎍ 농도)를 상기 핵에 첨가함으로써 DNA를 염색하였다. 벡톤 디킨슨 팩소트(Becton Dickinson FACSort) 유량 세포계측기(Becton Dickinson, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 사용하여 세포의 DNA 함량을 측정하였다. 2개의 파라미터인 전분산성 및 측분산성 사이토그램을 1개의 파라미터인 DNA 히스토그램으로 게이팅시킴으로써 DNA 히스토그램을 얻었다. 총 5000개의 게이트된 핵을 계수함으로써 각 히스토그램을 얻었다. 유량-세포 계측 실험을 3회 반복하고, 다음 문헌[Radiat Environ Biophys, 12, (1975), 31∼39]에 기술된 바와 같이 세포 사이클 분포를 측정하였다.

3. 캡슐화된 하이브리도마 세포로부터 항체 방출

전술한 바와 같이 캡슐화한 당일에 1개의 비드 당 1.5*10³개의 H528 세포를 함유하는, 직경이 2.3 mm 내지 2.5 mm인 알긴산염 비드를 제조하였다. 0일, 1일, 5일, 12일, 19일, 23일, 30일 및 33일 후, 저장 배양물로부터 10개의 비드를 꺼내서 Mabs의 RPMI 배지로의 방출을 검사하였다. 상기 비드를 완전 RPMI 배지 0.5 ml(37℃)에 24개의 웰 접시(Nunc)로 이동시켰다. 6시간 항온시킨 후, 4개의 100 ㎕ 시료들을 각각 수거하여, 1.5 ml 원심 분리 시험관(Treff AG, 스위스, 데게르스하임 소재)에 넣고 -20℃에서 동결시켰다.

유량 세포계측기를 사용하여 시료내 MAbs의 농도를 측정하였다. DPBS에서 2 mM EDTA로 GaMg 단층 세포 배양물을 트립신화하였다. 상기 세포를 140 g으로 4분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, DPBS내 2% 파라포름알데히드 용액에 상기 세포를 1분 동안 넣어 두었다. 이후, 상기 세포를 140 g으로 4분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그 다음, 2 mM EDTA, 1% 소의 혈청 알부민 및 1 g/l의 글루코스를 포함하는 DPBS에서 상기 세포는 재현탁화되어서, 1개의 웰 당 1.7*10⁵개의 세포로 원뿔형 96 웰 플레이트(Nunc)에 분산되었다. 상기 셀을 340 g으로 4분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 이후, 상기 셀을 와류시키고, 채취한 MAb RPMI 배지(미희석물, 및 1:5, 1:20 및 1:100 DPBS 희석물)로 4℃에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 기준물로서 공지된 MAb 농도를 갖는 EGFR MAb (528) 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)를 사용하였다(농도 20, 5, 1, 0.2, 0.1 및 0.05 ㎍/ml). 2 mM EDTA, 1% BSA, 1 g/l 글루코스의 DPBS 용액으로 상기 세포를 2회 세척한 후, FITC-결합된 염소 항-마우스 면역 글루불린(Dako A/S, 덴마크 글로스트럽 소재)(1:20 희석물)으로 4℃에서 30분 동안 항온 처리하였다. 벡톤 디킨슨 팩소트 유량 세포계측기로 유량 세포의 수를 계산하였다. 단일 세포들를 검출하여 2개의 파라미터인 전산란성 및 측산란성 사이토그램으로 가시화시켜서 1개의 파라미터 FITC 히스토그램으로 게이팅하였다. 여기서 형광 세기를 측정하였다. 공지된 농도의 EGFR MAb의 다양한 적정 농도를 GaMg 세포상에 사용함으로써, GaMg 세포에 대한 기준물 항체 결합 커브를 얻었다. 알긴산염 비드를 함유하는 하이브리도마 세포로부터 채취한 배지에서 얻은 결과들을 비교함으로써, MAb 농도 커브를 얻었다.

4. 세포 이동

GaMg 구상체를 개별적으로 10 ng/ml EGF(Sigma)를 함유하는 완전 RPMI 배지 1.0 ml에 16 mm 다중웰 접시(Nunc)로 옮겼다. 이후, H528 세포를 함유하는 알긴산염 비드(각 웰에 3개의 알긴산염 비드)에 종양 세포를 노출시켰다. 대조군으로서, 10 ng/ml EGF가 있든 또는 없든간에 완전 RPMI 배지에 구상체를 노출시켰다. 접안렌즈에 보정 망선이 있는 광현미경을 사용하여 4일 동안 각 콜로니의 직각 직경을 매일 측정하였다. 상기 구상체 밖으로 이동하는 세포들에 의해 덮힌 원형 영역을 측정한 후, 세포 이동 지수로 사용하였다. 상기 실험을 2회 실시하였고, 각 실험에는 6개의 구상체를 사용하였다.

5. 엔도스타틴 생산 세포의 확립 및 증명: 비드로부터 엔도스타틴 방출

5A. 엔도스타틴 생산 세포의 확립

방법:

세포주 및 배양 조건.

포진 바이러스(Epstein-Barr virus) 핵 항원(EBNA)-1을 발현하는 인간 태아 신장 293 세포(293-EBNA)를 생산 세포주로서 사용하였다.

리포솜에 의해, 인간 엔도스타틴을 암호화하는 유전자를 포함하는 에피솜 발현 벡터 pCEP-Pu로 상기 세포를 형질감염시켜서, 0.5 ㎍/ml 퓨로마이신으로 선별하였다.

10% 태아 송아지의 열적 비활성화된 혈청, 4.5 g/l D-글루코스, 페니실린(100 IU/ml), 스트렙토마이신(100 ㎕/ml), 205 ㎍/ml 지네티신(G-418) 및 0.5 ㎍/ml 퓨로마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)로 이루어진 성장 배지를 함유하는 175 cm² 배양 플라스크(Nunc, 덴마크 록스킬데 소재)에서 형질감염된 세포(293-엔도)들을 전면 성장시켰다. 엔도스타틴 유전자가 없는 pCEP-Pu 벡터로 293 세포들을 감염시킴으로써 위형질 감염체를 얻어서, 동일한 조건(퓨로마이신을 제외함)하에서 성장시켰다(모든 생화학 제품들은 벨기에 베르비에르스 소재의 BioWhitaker에서 구입함).

이들 실험용으로 선택된 종양 세포주(BT4C)는 에틸니트로소우레아 유래성 레트 신경교육종(계대배양 번호 26)으로부터 전개되고, BD-IX의 동계종이다. 10% 신생 송아지의 열-비활성 혈청, 비필수 아미노산의 규정 농도의 4배, 2% L-글루타민, 페니실린(100 IU/ml) 및 스트렙토마이신(100 ㎕/ml)로 보충된 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)로 이루어진 완전 성장 배지의 80 cm² 배양 플라스크에서 상기 세포들을 전면 성장시켰다.

5b. 비드로부터 엔도스타틴 방출에 대한 평가

면역블롯

캡슐화된 엔도-293 및 293-EBNA로부터 상태 조절된 배지를 수거하여, 비드에서 엔도스타틴이 방출되는지를 측정하는 표준 SDS/PAGE 웨스턴 블롯팅에 사용하였다.

간단히, 시료를 12% SDS 겔상에서 분리하여 PVDP 니트로셀룰로스 막상에 블롯팅하였다. 상기 블롯을 100% 메탄올로 5분간, 증류수로 1분간, 블록킹 용액(0.05 M Tris/HCL, 0.45 M NaCl, 2% 트윈, pH 10.2)으로 4분간, 그리고 마지막으로 세척용 완충 용액(0.05 M Tris/HCL, 0.15 M NaCl, 0.05% 트윈 20, pH 10.2)으로 세척하였다. 그 다음, 상기 블롯을 토끼의 항인성 항혈청(세척용 완충액에 1:1000 희석함)으로 밤새 항온 처리하였다. 밤새 항온 처리한 후, DPBS로 블롯을 세척하고 돼지의 항토끼성 알칼리성 포스파타제 복합 IgG(DAKO, 덴마크)로 항온 처리하였다. 기질 염색 용액으로 항온(2분 내지 4분)시킴으로써 상기 밴드들을 가시화시켰다.

생체내 실험

1. 두개골내 이식

160 g 내지 250 g 중량의 수컷 동계교배된 BD-ID 레트들(36)에게 수돗물은 무제한 공급하고, 항온 및 항습에 12 시간의 명암 스케줄하에서 별도의 우리에 각각 가둬 두는 표준 펠릿 식이법을 적용하였다. 펜토바르비탈을 체중 100 g 당 0.4 ㎖ 농도로 복강내 투여하여 레트들을 마취시켰다. 중앙 시상 피부를 절개하고, 3.5 ㎜ 드릴로 브레그마 지점의 후방 4.2 ㎜ 및 시상 봉합 우측 2.5 ㎜에 천공을 만들었다. 흡입을 통해 피질 및 백질 조직을 깊이 2.0 ㎜까지 제거하고, NIH 3T3 세포들 또는 H528 세포들 중 어느 하나를 함유하는 8개 내지 14개의 알긴산염 비드(하루 경과한 비드)를 조직 공동에 놓았다. 상기 천공을 골랍으로 막고, 피부를 폴리아미드사로 봉합했다. 가열 램프하에서 1시간 동안 회복하도록 했다. 상기 동물을 관례적 지침에 따라 돌보았다. 레트를 하루에 한번씩 관찰하고, 격일로 무게를 달았다. 상기 이식 후, 모든 동물은 빠르게 회복되었으며, 관찰 주기 동안 병 또는 신경성 결손의 어떠한 징후도 나타내지 않았다.

2. 레트 뇌내 면역글로불린의 방출 및 파종

3 주와 9 주 후, CO₂를 흡입시켜 상기 레트를 치사시켰다. 뇌를 분리하여, 조직 텍(Tissue Tek; 미국 일리노이주 네이퍼빌에 소재한 마일스 라보라토리즈 인코포레이티드(Miles Laboratories Inc.) 제품)에 함침시키고 액체 질소로 냉각시킨 2-메틸부탄(E. Merck)에서 동결시켰다. 종단면(14 ㎛)을 레이쳐트-정 크리오컷(Reichert-Jung cryocut) 1800 냉동절단기(cryotome)(Leica, 독일 베즐라에 소재)상에서 절단하고, -20℃에 보관하였다. H528 캡슐화된 세포를 이식하여 3 주후 치사시킨 레트로부터 얻은 냉동 단면을 실온에서 아세톤에 5 분간 고정시킨 후, DBPS에서 5 분간 2회 세척하였다. 그후, 상기 단면을 FITC-결합된 염소 항-마우스 면역글로불린(Dako A/S; 1:20 희석)으로 실온에서 1 시간동안 항온 처리하였다. 그후, 5 분간 DPBS로 세척하였다. 상기 단면들을 리보뉴클레아제(Sigma)(0.9% 생리 식염수 1 ㎖ 당 0.5 ㎎의 농도)로 30 초 동안 처리하고, 그 단면에 프로피듐- 요오드화물(Sigma)(0.9% 생리 식염수 1 ㎖ 당 50 ㎍의 농도)를 첨가하여 핵을 염색하였다. 추가로, 상기 단면들을 DPBS로 5 분간 세척한 후, Vectashield(미국 캘리포니아주 버를링감에 소재한 벡터 라보라토리즈 인코포레이티드(Vector Laboratories Inc.) 제품)를 적재하였다. 아르곤-크립톤 레이저(Leica)를 장착한 레이카 TSC NT 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하고, TRITC 및 FITC 필터 광학물을 사용하여 형광성을 측정하였다. 실험 동물의 뇌 내부의 동일 깊이에서 채취한 단면들을 조사하고, 양 그룹 모두의 최대 형광 세기 영역을 적재하였다. NIH 3T3 세포를 이식하여 9 주후 치사시킨 레트로부터 얻은 냉동 단면을 조직학적 검사를 위해 헤마토크실린 및 에오신으로 염색하였다.

3. 알긴산염으로 캡슐화된 생산 세포에 대한 면역 응답

방법

이식 후, 1 주, 3 주 및 9 주에, BD-IX 레트의 뇌와 알긴산염 비드 사이의 경계 구간에서 면역 양성 세포%를 평가하였다. 뇌를 스터브(stub)에 적재하고, 조직-텍에 함침시킨 뒤, 액체 질소에서 냉동시켰다. 일련의 종단면 5 ㎛ 내지 10 ㎛를 레이처트-정 크리오스타트(Leica, 독일 베즐러에 소재) 상에서 절단하고, 슬라이드에 적재하여 면역 조직학 분석물로 제조하였다. 단면을 저온 아세톤에서 5 분간 고정시키고, 실온에서 10% 정상 토끼 혈청으로 30 분간 항온 처리하여, PBS 에 희석한 뒤, 10% 토끼 혈청에 희석된 마우스 단일 클론 항체(MAbs)와 함께 항습 챔버에서 4℃에서 밤새 항온시켰다. MAbs로 OX42, ED1, 및 ED2 항-레트 대식세포 MAbs, CD5 양성 T 세포에 대한 OX19, 및 CD45RA 양성 B 세포와 반응하는 OX33을 사 용하였다. 영국 옥스포드에 소재한 세로텍(Seotec)에서 상기 MAbs를 입수하였다.

1:300으로 희석된 비오틴화된 토끼 항-마우스 면역글로불린을 30 분간 적용하였다. 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 착물(ABC 착물/HRR, 덴마크 글로스트럽에 소재한 다코파츠(Dakopatts) 제품)을 제조업자의 지시에 따라 제조하고, 이것을 상기 단면과 30 분간 반응시켰다. 마지막으로, 착색된 반응 생성물의 전개를 위해 상기 단면을 3-아미노-9-에틸-카바졸을 함유하는 완충 용액으로 처리하였다. PBS에 세척한 후, 전부를 항온 처리하였다. 모든 제조물을 헤마토크실린으로 대비염색하고, 글리세르겔(Dakopatts)에 적재한 뒤, 광 현미경으로 분석하였다.

4. 엔도스타틴 알긴산염 요법이 종양 성장에 미치는 효과

청년기의 BD-IX 레트 수컷과 암컷(총 8 마리 + 20 마리의 대조군)에 에퀴테신을 체중 100 g 당 0.4 ㎖의 용량으로 복강내 주사하여 마취시켰다. 상기 레트들을 정위고정성(定位固定性) 틀(미국 투정가에 소재한 데이비드 코프 인스트루먼츠(David Kopf Instruments) 제품)에 고정시키고, 피부를 절개하여, 브레그마 지점의 후방 1 ㎜, 우측 3.0 ㎜에 2 ㎜의 천공을 만든 후, 이것의 깊이를 2.5 ㎜로 하였다. 뇌에 주사하였다. 뒤이어, 1x104 BT4C 신경교육종 세포를 2 ㎜ 깊이에 있는 알긴산염 비드의 측변 1 ㎜ 위치에 주사하였다. 알긴산염 비드는 대조군으로서 엔도스타틴 생성 293 세포 또는 293 위형질 감염체를 함유한다. 이식 받은 8 마리의 동물은 각각의 세포주를 형성하였다. 추가로, 정상 종양 진행 대조군으로서 8 마리에게 BT4C 세포를 단독으로 주사하였다.

마지막으로, 비드내 세포의 생체내 생육력의 대조군으로서, 나머지 4 마리의 대조군 동물은 293-엔도 세포만을 함유하는 알긴산염 비드를 주입하였다. (모든 주사의 경우) 3분에 걸쳐 서서히 주사한 뒤, 골랍으로 밀봉하고, 봉합하였다. 그 동물들이 수술에서 회복되는 것을 관찰하였다. 실험 기간동안, 항온 및 항습에서 상기 동물들을 쌍으로 수용하고, 표준 펠릿 식이요법을 실시하였으며, 수돗물은 자유로이 먹게 하였다.

결과

시험관내 실험

1. 알긴산염 캡슐 세포의 형태학 및 생육력

직경이 1.0 ㎜인 알긴산염 비드는 캡슐화한 당일에 약 6.5 x 10²개의 NIH 3T3 세포들을 함유하였다(도 1A). 그 세포들은 알긴산염 비드내에 고르게 분포되었으며, 외측 세포는 25∼50 ㎛ 테두리내에는 없다. 배양하는 동안, 알긴산염내의 세포 증식을 관찰되었고, 3 주 후에 세포 밀도가 증가하였다(도 1B). 배양 9 주 후, 다세포성 구상체를 알긴산염 비드내에서 관찰하였다(도 1C). 광 현미경에 의해 분석한 바와 같이, 비드의 90% 이상이 9 주 배양 후에도 그대로 였다. 약 1 주 배양 후, 몇개의 단세포가 알긴산염 비드로부터 성장 배지내로 이동하였는데, 단세포의 제한된 이동은 이후의 8주 배양 기간 동안 지속되었다.

공초점 레이저 스캐닝 현미경 연구를 통해 캡슐화된 세포의 약 90%가 캡슐화한 당일에 생육 가능한 상태였음을 알았다(도 1D). 배양 3 주 후, 원래 캡슐화된 세포의 약 50%가 생육 가능한 상태였다(도 1E). 생존하는 세포의 일부가 알긴산염에 적응하여 생육 가능한 다세포성 구상체를 형성하는데, 이것은 9 주후에 확실히 관찰될 수 있었다(도 1F). 이 시점에서, 비드내 생육 가능한 세포의 총수는 다세포 구상체 형성으로 인해 분석하기 어려웠다. 그러나, 도 1F에 도시된 바와 같이, 구상체내에 편재된 세포의 대부분은 생육 가능한 상태였다.

캡슐화된 BT4CnVlacZ 세포는 전체 관찰 기간인 9 주동안 일정하고 균일하게 분배된 β-갈락토시다아제 활성을 발현하였다(도 1G).

2. 알긴산염 캡슐화된 세포의 세포 반응속도론

NIH 3T3 세포의 유량 세포계측 히스토그램은 캡슐화 1 주 후에 알긴산염 비드내 세포배수성(倍數性)의 변화를 보여준다(도 2B). 이것은 아마도 2배체 대조군에 비해 다배체화를 나타내는 것이다(도 2A). 그러나, 3주 및 9주 후(도 2 C, 도 2D) 각각, 대조군과 마찬가지의 유사한 다배성 분포를 갖는 다배성의 표준화가 관찰되었다. S와 G₂M 상들에서 세포 증식 비율은, 시험관내에서 3주 및 9주 후에 각각 55% 및 60%인 것과 비교하여 대조군에서는 50%였다.

3. 캡슐화된 하이브리도마 세포로부터 항체 방출

캡슐화한 당일날의 끝무렵에 이미 성장 배지내에 MAbs가 13 ng/(㎖*시간)이 방출되었다(도 3). 면역글로불린의 비드 밖, 배지 내로의 확산 현상은 배양 다음날부터 꾸준히 증가하여, 12 일후에는 457 ng/(㎖*시간)의 농도에 이르렀다. 그 후, MAbs의 생성은 관찰 기간의 마지막 3 주 동안 약 400 ng/(㎖*시간)로 안정화되었다.

4 세포 이동

EGF로 자극된 GaMg 구상체 밖으로의 세포 이동은 광범위하였으며, 그 평균 과발육 면적은 대조군에 비해 두배였다(도 4). 그러나, H528 세포를 함유하는 알긴산염 비드가 EGF의 존재하에 첨가되는 경우, 세포 이동은 강하게 억제되었으며, 이는 캡슐화된 H528 생산 세포가 EGF 수용체에 대해 유도된 항체를 효과적으로 발현한다는 것을 입증한다.

5. 비드로부터 엔도스타틴 방출량 평가

비드로부터 수확한 조절 배지의 웨스턴 블롯으로부터 알 수 있는 바와 같이, 상당량의 엔도스타틴이 비드로부터 방출되었다(도 6). 방사능면역분석법을 통해, 캡슐화된 25000개의 세포를 갖는 10개의 엔도스타틴 생성 알긴산염 비드들(400 ㎛)은 24 시간마다 2.5 ㎍/㎖을 분비한다는 것을 알았다.

생체내 실험

1. 두개골내 이식

레트 뇌의 종단면들은 알긴산염 캡슐 NIH 3T3 세포를 지닌 이식 부위에 인접한 뇌 실질에서 변화가 적거나 없었음을 나타내었다(도 5A). 9 주 후, 두개골내 부종 또는 팽윤이 거의 관찰되지 않았다. 알긴산염 비드에서는 어떠한 세포의 과발육 현상도 없었으며, 생육 가능한 단세포와 다세포성 구상체를 모두 함유하였다(도 5B). 생육 가능한 세포는 비드의 중앙과 주변 모두에 분포되어 있었으며, 세포가 존재하지 않는 영역의 알긴산염은 세포 사이에 존재하였다. 이식용 구멍과 뇌 실질간의 경계 구간 근처에서 최소한의 세포 응집이 관찰되었다.

2. 레트 뇌 내부 면역글로불린의 방출 및 파종

캡슐화된 하이브리도마 세포를 갖는 이식 비드는 3 주 후 강한 녹색 형광으 로 용이하게 가시화되었다(도 5C). 면역글로불린은 알긴산염 비드로부터 1 ㎜ 이상 떨어진 거리의 뇌 조직에서 감지되었다(도 5C, 5D). 이식 부위의 접경으로부터 뇌로 갈수록 형광 세기가 점차 감소하였다. 두마리의 실험 동물에 대해, MAbs는 전체 대뇌 반구에서 감지되었으며, 여기에 이식물이 위치하였다(데이타에는 도시하지 않음). MAbs는 상기 대뇌 양 반구의 연수막에서 추가로 발견되었으며(도 5E), 가장 강한 형광이 우측 반구의 지주막하 영역에서 관찰되었다. 음성 대조군은 연수막에서 약한 형광을 보였으며, 이는 아마도 연수막 세포 상의 면역글로불린과 에피토프사이의 비특이적 결합에 의한 것으로 여겨진다(도 5F). 그러나, 뇌 실질은 음성이었다. MAbs는 두개골내 혈관의 혈관 주위 공간에 더 존재하였으며, 두 반구 사이의 형광 세기는 크게 다르지 않았다(도 5G). 대조군에 존재하는 약한 형광성 또한 아마도 비특이적인 결합에 의한 것으로 여겨진다.

3. 알긴산염으로 캡슐화된 생산 세포에 대한 면역 응답

단세포의 침윤을 알긴산염 비드에 인접한 뇌에서 관찰하였다. 침윤물 내 세포의 양은 1 주에서 9 주로 갈수록 감소하였다. 이식 1 주 후, 수상 다형태를 갖는 OX42 양성 마이크로글리아를 유조적에서 관찰하였으며, 반응성 마이크로글리아 및 침입성 단세포가 알긴산염 비드 쪽의 접경 구간에서 나타났다. ED1 및 ED2은 상기 접경 구간에 가까운 단세포를 염색한 반면, 뇌 실질내 다른 곳에서는 이들 MAbs에 의해 세포들이 거의 염색되지 않았다. 또한, 비드의 접경 구간에서 T와 B 세포의 제한된 수가 관찰되었다(표 I). 접경 구간에 있는 OX42 양성 세포의 양은 1 주째에 62%에서 9 주째에 20%로 감소하였다. 반면, ED1 양성 세포는 1 주째에 34%에서 9 주째에 7%로 감소하였다. ED2 양성 세포의 양(5%), T 세포의 양(14%) 및 B 세포의 양(1%)은 관찰 기간동안 단지 약간 변화하였다(표 I).

알긴산염내 NIH 3T3 세포를 이식한 지 9 주 후, 레트 뇌 조직에서의 세포 면역 응답

세포	면역응답
T 세포(CD5)	응답 없음
B 세포(CD45RA)	응답 없음
마크로글리아 및 대식세포(OX42)	높은 응답
대식세포 및 단세포(ED1/ED2)	약한 응답

4. 엔도스타틴 알긴산염 요법이 종양 성장에 미치는 효과

알긴산염내 엔도스타틴 생산 세포로 치료한 동물은 위형질성 감염 세포로 치료한 동물 보다 20% ±4% 오래 살았다. 자세한 조직학적 관찰 결과, 엔도스타틴-알긴산염 요법을 행한 종양에서 대형 괴사 영역이 발견되었다(도 7의 B 참조). 이러한 괴사 영역은 대조군에서는 보이지 않았다(알긴산염으로 캡슐화된 위형질성 감염 세포; 도 7의 A).

논의

전술한 실험 결과는 미소 캡슐화된 세포가 연장된 기간에 걸쳐 생존하고, 증식하며, 그 표현형 발현을 유지한다는 것을 입증하였다. 또한, 알긴산염 비드로부터 방출된 MAbs는 EGFR을 방해함으로써 시험관내에서 종양 세포 이동을 억제하는 성능을 지니고, MAbs는 레트 뇌내에 방출 및 파종된다는 것을 알았다.

광 현미경으로 볼 수 있는 바와 같이, NIH 3T3은 시험관내에서 알긴산염에 적응되어, 캡슐화 후 며칠내로 증식을 시작하였다. CLSM 연구를 통해 캡슐화한 당일에 세포 생육성은 약 90%임이 밝혀졌다. 배양시, 첫 3 주동안 초기 포획된 세포의 약 50%가 비드내에서 괴사하였다. 그러나, 9 주 후, 남아있는 세포는 알긴산염 내에 다세포성 구상체를 형성할 수 있음을 보였다. 알긴산염 내에서 관찰된 세포 괴사는 다른 연구를 통해 보고되어졌는데, 이는 산소, 영양소 및 폐기물의 감소된 확산 현상에 기인하는 것일 수 있다. 결과적으로, 증식 세포 수와 괴사 세포 수 사이에 평형이 이루어질 수 있다. 더 바람직한 확산 속도는 비드 크기를 감소시키거나, 공극 크기를 증가시키는 G 유닛의 함량을 증가시키거나 또는 알긴산염 농도를 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 상기 확산 현상은 비드 내 초기 캡슐화된 세포의 수에 좌우된다. 알긴산염 자체는 비독성이므로, 이를 비드 내에서 관찰된 세포 괴사의 원인으로 볼 수는 없다.

BT4CnVlacZ 세포는 배양 9 주 동안 강하고 균일하게 분포된 β-갈락토시다아제 활성을 보여준다. 이러한 결과는 특이적인 유전자 생성물이 알긴산염 비드 내에서 장기간동안 생성될 수 있음을 입증한다.

유량 세포계측 히스토그램은 NIH 3T3 세포가 알긴산염 내에서 1 주 후, 2배수성에서 다배수성으로 변화한다는 것을 보여준다. 이것은 세포핵이 분열하지만, 경성 알긴산염 망상 구조내의 제한된 공간으로 인해 세포가 초기에는 세포질분열을 진행할 수 없음을 나타내는 것이다. 따라서, 이중핵 및 삼중핵을 갖는 단세포가 얻어질 것이다(도 2 B). 그러나, 3 주 후의 세포 사이클 분포는 대조군의 것과 유사하였다. 이것은 세포가 알긴산염 내에서 일정한 적응 기간을 필요로 하며, 이중핵 및 삼중핵을 갖는 단세포가 되어서, 세포질분열을 완료하든지 또는 괴사할 것이라는 것을 나타낸다. 9 주 후의 히스토그램은 3 주 후의 히스토그램과 유사하였으나, 증식 단계에서 세포가 증가했음을 나타내었다. 이 세포 사이클 분포의 분석은 증식 세포수가 대조군에 대해 50%로부터, 9 주 후에는 약 60%까지 증가하였음을 보여준다. 이것은 NIH 3T3 세포의 장시간의 배양 기간 동안 더 높은 증식 성능을 갖는 세포를 알긴산염 비드 내에서 선택하였기 때문일 것이다.

캡슐화된 H528 하이브리도마 세포로부터의 항체 방출은 실질적으로 12일에서 33일까지 약 400 ng/㎖*시간 농도로 일정하였다. 이것은 배양 12 일 후에는 MAb-분비성 하이브리도마 세포의 안정한 농도가 얻어진다는 것을 보여준다. 이러한 발견은 안정한 단일클론 항체 생성이 고농도에서 달성된다는 것을 보여주는 것이기 때문에, 임상적 상황에서 매우 중요하다.

GaMg 구상체 밖으로의 세포 이동은 EGF의 존재하에서 촉진된다. EGF 자극된 구상체에 H528 캡슐화된 세포를 첨가함으로써, 상기 이동은 억제되고, 상기 과발육 면적은 대조군의 것과 유사하였다. 이것은 파라크린 세포 증식 메카니즘이 이들 MAbs에 의해, 아마도 EGFR의 EGF-결합 도메인을 차단하는 것에 의해 저해됨을 시사한다.

중추신경계(CNS) 밖의 다른 기관내 알긴산염-캡슐화된 생산 세포의 이식은 알긴산염 비드의 섬유아세포 과발육을 나타내므로, 이는 세포 괴사 및 이식 실패를 초래한다(Transplantation, 54 (1992) 제769∼774면). 고유 배치 및 CNS 내 섬유아세포의 결핍으로 인해, 동일한 세포 과발육이 본 발명의 연구에서는 관찰되지 않았 다(도 5A, 도 5B). 조성에 따라, 알긴산염은 몇몇 예에서 단세포를 자극하여 고농도 사이토킨을 생성함으로써 체내 면역 응답을 개시하는 것으로 알려져 왔다. 알긴산염의 사이토킨 자극성 부분은 M-유닛이다. 그러므로, G-유닛 함량이 높은 알긴산염이 본 발명의 실험에서 선택되어 뇌내 면역 응답을 최소화시킨다. 추가의 실험에서, 본 발명자들은 뇌 내에서 알긴산염 캡슐 세포에 대한 면역 응답이 낮음을 발견하였다. 단지 일부의 마이크로글리아 세포들만이 이식된 비드에 인접한 뇌 조직과 결합하였다. 이러한 관찰은 또한 알긴산염-캡슐화된 생산 세포가 뇌 치료에 효과적임을 보여준다. 이식 부위와 뇌 실질 사이의 접경 구간 근처에는 최소한의 응집 현상이 존재하였다. 이거은, 전술한 바와 같이 이식물에 대한 마일드한 면역 응답 때문에 NIH 3T3 세포가 알긴산염 비드로부터 이탈하는 것에 기인하고/하거나, 조직 손상 치유 과정에 기인한 것일 수 있다. 그러나, 알긴산염을 이탈하는 적은 수의 생산 세포가 문제를 일으킬 수 있으리라고는 여겨지지 않는다. 왜냐하면, 이들 세포는 정상적인 이식편 대 숙주 거부반응 메카니즘에 의해 보호되기 때문이다. 그러나, 필요에 따라 폴리-L-리신의 층으로 비드를 커버하거나 또는 세포를 캡슐화하기 전에 조사시키는 방법 등에 의해 세포 이탈을 막는 조치를 취할 수 있다. 이로써, 이들의 증식 성능이 억제된다. 면역글로불린은 알긴산염 비드로부터 방출되고, 이식 부위의 접경으로부터 1 ㎜ 이상 떨어진 위치에서 뇌 실질 내로 파종된다. 또한, 실험 동물들 중 두마리에서, 이식편이 위치하고 있는 전체 대뇌내 반구에서 MAbs가 감지되었다. 이러한 파종은 수동적 확산 공정에 기인한 것일 수 있다. 또한, MAbs가 지주막하 영역 및 비르코브-로빈(Virchov-Robin)의 혈관주위 공간내에 서 편재되어 있었다. 이러한 확산은 CNS 내 뇌척수 유체의 일정한 흐름에 의해 조절되는 것으로 여겨진다. 흥미롭게도, 종양 세포는 뇌에서 동일한 파종 경로를 따르므로, 알긴산염 캡슐 세포에 의해 생성되는 성분으로의 접근이 가능하게 된다.

요약하면, 전술한 실험들은 캡슐화된 생산 세포가 시험관내 및 생체내에서 장시간 동안 알긴산염내에서 생존하고 증식한다는 것을 보여준다. β- 갈락토시다아제와 같은 유전자 생성물은 수주의 배양 기간 동안 캡슐화된 BT4CnVlacZ 세포의 세포질내에서 생성된다. 캡슐화된 하이브리도마 세포는 추가로 시험관내 및 생체내에서 다량의 MAbs를 생성하고 방출한다. GaMg 종양 세포 전이는 캡슐화된 H528 세포의 존재하에서 억제된다. 또한, 캡슐화된 H528 세포의 이식물은 레트 뇌에서 MAbs를 생성하고 방출하며, MAbs는 뇌 실질내, 지주막하 및 혈관 주위 공간 내에도 파종된다. 그러므로, 본 발명은 CNS 종양 치료법으로 유망한 방법이다.

Claims

CNS 종양 성장 저해제인 단백질, 펩티드, 다당류 또는 모노크로날 항체의 1종 또는 다수종을 발현할 수 있는 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들로서, 상기 생산 세포 또는 세포들은 캡슐화 매트릭스에 캡슐화되고, 또 이 캡슐화 매트릭스는 L-굴루론산의 함량%가 15 이상인 면역 분리성 알긴산염이며, 상기 단백질, 펩티드, 다당류 또는 모노크로날 항체는

(a) 트롬보스폰딘, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 또는 프로락틴;

(b) 프로테아제 저해제;

(c) 인터루킨; 또는

(d) 표피 성장인자 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 AA 및 BB, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 수용체, 형질전환 성장 인자 수용체 알파 및 베타, 여러 부류의 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR-1 및 VEGFR-2), 면역글로불린-유사 및 EGF-유사 도메인을 갖는 티로신 키나제 수용체(예, TIE-1 및 TIE-2/tek, 간세포 성장 인자(분산 인자)); CD-44; CDK/사이클린 복합체; 세포 표면상의 당지질; FAS: 당단백질; 및 특이성 종양 유전자의 발현에서 유래한 단백질에 결합되거나, 또는 상호 작용하는 단일 클론 항체인 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
제1항에 있어서, 상기 알긴산염에서의 L-굴루론산의 함량%가 50 이상인 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
제1항에 있어서, 상기 알긴산염에서의 L-굴루론산의 함량%가 60 내지 80인 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
제1항에 있어서, 상기 알긴산염에서의 L-굴루론산의 함량%가 80 내지 100인 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
제1항에 있어서, 상기 단백질, 펩티드, 다당류 또는 모노크로날 항체의 상기 발현은 외부 약리학적 제제에 의해 개폐될 수 있는 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
제1항에 있어서, 상기 캡슐화된 생산 세포가 비드 또는 마이크로비드로 존재하는 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
제1항에 있어서, 상기 CNS 종양은 뇌종양인 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
제1항에 있어서, 상기 알긴산염은 내독소가 거의 없는 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
제1항에 있어서, 상기 캡슐화된 생산 세포가 캡슐의 외부 테두리로 갈수록 알긴산염 농도가 증가하는 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
삭제
제1항에 있어서, 상기 단백질, 펩티드, 다당류 또는 모노크로날 항체가 표피 성장인자 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 AA 및 BB, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 수용체, 형질전환 성장 인자 수용체 알파 및 베타, 여러 부류의 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR-1 및 VEGFR-2), 면역글로불린-유사 및 EGF-유사 도메인을 갖는 티로신 키나제 수용체(예, TIE-1 및 TIE-2/tek, 간세포 성장 인자(분산 인자)); CD-44; CDK/사이클린 복합체; FAS; 세포 표면상의 당지질; 당단백질; 및 특이성 종양 유전자의 발현에서 유래한 단백질에 결합되거나, 또는 상호 작용하는 단일 클론 항체인 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
제1항에 따른 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들을 제조하는 방법으로서, 1 단계 과정으로 생산 세포를 캡슐화하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 따른 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들을 제조하는 방법으로서, 1종 또는 다수종의 살아있는 세포를 함유하는 알긴산염 용액을 칼슘-함유 용액에 적가하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 따른 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 CNS 종양 치료용 약학 조성물.
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제1항 내지 제9항 및 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질, 펩티드, 다당류 또는 모노크로날 항체는 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 트롬보스폰딘, 또는 프로락틴인 것인 캡슐화된 생산 세포 또는 세포들.
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