KR100969516B1 - 세포 생존력 및 기능을 향상시키는 도우넛형 세포 캡슐의제조 방법 및 세포 치료적용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 도우넛형 세포 캡슐을 제조하는 방법 및 이를 이용한 세포 치료 적용에 관한 것으로, 이로 인해 기존의 구형 (spherical form) 세포 캡슐이 갖는 단점인 캡슐중앙에 있는 세포로 물질의 확산(diffusion)이 제한되는 문제점을 극복하고 캡슐내의 모든 세포로 양분과 산소의 공급을 향상시킬 수 있어 capsule 내의 세포 생존력이 향상되게 된다.

본 발명에 따르면, 수화겔(hydrogel) 및 생체분해성 고분자로 만든 캡슐의 형태가 적혈구와 같이 납작하고 중앙에 구멍이 나 있어 캡슐 내에 분포한 모든 세포로 세포배양액 혹은 주위 조직으로부터 양분과 산소가 원할히 공급됨으로써 세포 생존력(cell viability)이 증가되고 세포의 기능이 증가됨을 확인함으로써 이 도우넛형 세포 캡슐이 통증, 당뇨병, 파킨슨병등에 효율적인 새로운 세포치료 방법이 될 것으로 기대된다.

도우넛형 세포 캡슐, 세포 치료, 수화젤, 생체분해성 고분자, 케라틴, 통증, 당뇨병, 파킨슨병

Description

세포 생존력 및 기능을 향상시키는 도우넛형 세포 캡슐의 제조 방법 및 세포 치료적용 {A method for preparing Doughnut shaped cell encapsulation having improved cell viability and function, and its application}

본 발명은 캡슐내의 세포 생존력과 기능을 개선시키는 도우넛형 세포 캡슐을 제조하는 방법 및 이를 이용한 세포 치료 방법에 관한 것이다.

면역 보호와 3차원 세포 배양 환경을 제공하는 세포 캡슐화(cell encapsulation) 기술은 세포를 고분자 물질의 막으로 둘러싸거나 코팅하여 반투과막을 만들어 면역세포 등 특정한 크기 이상의 분자의 유입을 통제하여 캡슐내 세포를 보호하고 적절한 환경을 유지시켜 주는 것이다. 이같은 수화젤의 응용은 지금까지 주로 의약학 분야에 응용되어 왔으며 세포를 캡슐화하기 위한 수화젤에 이용될 수 있는 친수성 고분자는 매우 다양하며 주로 다당류 및 일부 다중전해질 등이 많이 이용되어 왔다.

그 중, 지금까지 캡슐화를 위해 가장 많이 사용되고 연구된 소재는 천연고분자 물질인 알지네이트 (alginate)이다. 알지네이트는 β-D-만누론산(mannuronic acid)과 α-L-글루론산 (guluronic acid)의 중합체로 주로 해조류나 박테리아에 의해 생산된다.

알지네이트를 구성하는 우론산 (uronic acid)들은 말단에 카복실기를 가지므로 음전하를 띤다. 따라서 Mg²⁺,Ca²⁺,Sr²⁺,Ba²⁺와 같은 2가의 양이온들을 첨가하면 물리적 가교(physical crosslinking)가 형성되므로 도 1에 도시한 바와 같이 수화젤을 만들 수 있다.

관련 종래 기술로는 미국 특허 제7128931호로서 "공유 결합으로 층을 이룬 반투과성 캡슐을 만드는 방법", 미국 특허 제6911217호로서 "생물학적 물질을 겔로 캡슐화 하는 방법", 미국 특허 제7153519호로서 "Free radical에 의해 폴리머로 합성되는 물질을 이용하여 조직, 세포, 생물학적 물질을 포집하는 방법" 및 한국 특허 출원 제10-2004-7009920로서 "배양 및 캡슐화된 췌장줄기세포" 기술을 찾아볼 수 있다.

그러나 캡슐내의 세포로 양분과 산소의 공급이 원활하지 않으면 세포의 생존력이 약해지므로 따라서 세포의 기능 저하를 불러오게 된다. 양분과 산소의 공급은 실핏줄에 의해 공급이 안 될 경우 단순 확산(simple diffusion)에 의해서는 1~2mm³ 크기의 조직이 되면 힘들어진다. 상기 기술들은, 주로 알지네이트 chemistry에 의해 형성된 캡슐에 해당하는 것으로 구형(sphere) 형상을 띠므로 구의 중앙에 있는 세포는 상대적으로 확산이 제한되어 세포 생존력에 지장이 있다는 단점을 갖는다.

이에 본 발명의 일 목적은 구형 세포캡슐 (spherical shaped cell capsule)이 갖는 diffusion limit를 극복할 수 있는 도우넛 형태의 캡슐을 제조하는 방법을 제공하려는데 있다. 도우넛 형태의 세포캡슐의 개발로 세포의 장기간 생존력 및 기능을 향상시킴으로써 효과적인 세포 치료방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 1차 배양된 세포를 단백질 기반 수화젤 및 생체분해성 고분자 중 선택된 1종 이상과 혼합하여 혼합액을 만든 다음, 상기 혼합액을 실린지를 넣고 산성조건하에서 점적하 시킴으로써 납작하고 중앙에 구멍을 지닌 도우넛형 세포 캡슐을 수득하는 방법을 개발한 것이다.

이 방법을 이용하여 통증, 당뇨병, 파킨슨병등에 효과적인 세포 치료방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

세포를 채취하여 1차 배양한다. 이때 세포로는 의약학적으로 유용한 세포이면 한정하는 것은 아니며, 일례로 통증치료, 당뇨병, 파킨슨 병에 유용한 세포를 들 수 있다. 대표적으로는, 신경전달물질 분비 세포에 해당하는 크로마핀 (chromaffine) 세포와 insulin을 분비하는 췌장세포를 사용할 수 있다. 참고로, 이 하 실시예에서는 7개월된 돼지의 부신에서 채취한 크로마핀 세포를 사용하였다.

이때 단백질 기반 수화젤로는 케라틴, 키토산(chitosan), 하이알론산 (hyaluronic acid), 젤라틴(gelatin) 등의 수화젤이 사용가능하다. 이중, 케라틴은 머리카락, 손톱, 표피 등을 이루는 단백질로써 수용성 케라틴은 thiol을 써서 케라틴의 SS 결합을 환원시켜 만들어진다. 환원된 상태의 SH 기는 공기중 산소에 불안정하며 케라틴이 가진 마이크로 피브릴 분자구조로 인해 용액조건 (온도, pH, ionic strength)에서 즉시 self assembly를 하는 특성을 갖고 있다.

1차 배양된 세포를 단백질 기반 수화젤, 생체고분자 중 중 선택된 1종 이상과 혼합한 다음 실린지를 넣고 산성 조건하에서 점적하시킴으로써 도우넛형 세포 캡슐을 수득하게 된다. 이때 생체고분자로는 이에 한정하는 것은 아니나 알지네이트, 폴리(L-리신) 등 공지된 물질을 사용하면 좋다. 또한 수화겔과 생체고분자를 함께 사용하는 것이 기계적 강도의 개선 측면에서 바람직하다.

이때 수백만 개의 세포를 포함하는 PBS나 매질과 수화겔 및/또는 생체고분자의 부피비(v/v%)는 1:1 이하의 범위로 하면 충분한 것으로, 물론 수화겔 혹은 생체고분자의 분자량 혹은 물리화학적인 성질에 의해 그 비율이 다르기는 하나 세포의 volume이 초과할 경우 세포가 matrix에 함입될 확률이 낮아질 위험이 있어 바람직하지 않다.

또한 단백질 기반 수화젤과 생체분해성 합성고분자의 혼합시 함량비는 혼합 물 총 중량을 기준으로 5-9:5-1, 바람직하게는 약 8:2 범위내인 것이 적절하다. 이때 생체분자성 합성고분자의 비가 증가하면 단백질 기반 수화겔의 약점인 낮은 기계적 강도를 개선 및 강화시키지만 단백질 기반 수화겔보다 증가할 경우 self assembly 효율이 떨어지고 단백질 수화겔이 가진 생리활성도가 상대적으로 감소하여 cell viability가 떨어지는 단점이 될 수 있다.

또한, 수화젤로서 케라틴 등 단백질 기반 수화젤을 사용시에는 사용하기에 앞서 감마 방사선으로 살균 처리하는 것이 보다 바람직하며, 세포와 수화젤 및/또는 생체 고분자를 혼합한 다음 실린지를 이용하여 점적하시키는 것이 둥근 캡슐의 모양을 형성하는 측면에서 바람직하다.

상기 점적하 과정은 이에 한정하는 것은 아니나, 혼합액을 30게이지 니들에 넣고 니들 팁과 산성버퍼 용액간의 거리가 3cm 정도 되게 떨어뜨려 수행하는 것이 좋다.이같은 점적하 과정에 이어서 2-3시간동안 실내온 약 20~26℃ 하에 재치시켜 안정화시키는 것이 좋다. 이때 산성 조건이란 pH 4-6 정도이며 pH 4 미만에서는 공정상 세포 생존력이 현격히 떨어지고 pH 6을 초과하면 self assembly가 느리거나 되지 않는 문제점이 있다.

또한 캡슐레이션 작업은 세포를 인큐베이터 (37℃)에서 꺼내어 통상 세포배양실에서 행하여지므로 컨디셔닝이 되는 실내온에서 안정화시키는 것이 좋다.

이같은 안정화된 캡슐을 PBS로 세척한 다음 DMEM/F12 + 10% FBS 배양액으로 0.5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하는 것이 보다 바람직하다.

이와 같이 하여 얻어진 도우넛형 세포 캡슐은 납작하고 중앙에 구멍을 갖음으로써 캡슐내의 모든 세포로 양분과 산소의 공급을 향상시킬 수 있으므로 세포 생존력을 향상시킴으로써 세포의 기능을 개선시키게 되어 효과적인 세포 치료제로서 이용가능하다.

또한, 하기 실시예에서 규명한 바와 같이, 대표적인 분비 세포인 크로마핀 세포를 7개월된 돼지의 부신에서 채취하여 1차 배양한 뒤 동일한 수의 크로마핀 세포를 구형의 캡슐과 도우넛형의 캡슐로 제작하여 니코틴 자극에 의한 신경전달물질인 카테콜아민의 분비량을 20일 동안 HPLC 를 이용하여 분석하여 비교한 결과, 구형보다는 도우넛형으로부터 더 많은 카테콜아민이 분비됨을 확인할 수 있었다.

상술한 바에 따르면, 형태가 적혈구와 같이 납작하고 중앙에 구멍이 나 있어 캡슐 내의 모든 세포로 세포배양액 속의 혹은 주위 조직으로부터 양분과 산소의 공급이 향상됨으로써 세포 생존력이 증가되고 세포의 기능이 증가되므로 세포 치료 분야에 효과적이며 다양한 응용이 가능한 것이다.

도 1 내지 5를 참조하여 본 발명의 실시예에 대하여 구체적으로 게시한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다.

물질 및 방법

1. 크로마핀세포의 획득

7개월된 돼지의 부신을 주위 결체 조직과 함께 절제하여 50-100 ml의 Lock's 용액으로 세척하였으며, 무균적 조작으로 불필요한 결합 조직과 혈관을 제거한 후 노출된 부신의 바깥면을 Lock's 용액으로 다시 세척 후 50 ml의 digestion 버퍼에서 37℃로 20분간 배양하였다.

처리된 부신에서 피질 조직으로부터 수질 조직을 분리하여 잘게 조각 낸 후 50ml의 digestion 버퍼와 함께 진탕 용액기에 넣어 1시간 동안 37℃에서 다시 배양하였다.

분해된 조직은 폴리프로필렌 필터 (100μ직경)을 통해 여과시키며, 여과를 마친 세포 부유액은 40 ml Lock's 용액으로 약 5분 동안 원심 분리하였다. 원심분리후 얻어진 상층액은 폐기하고 세포 펠릿은 재부유시켜서 5분 동안 다시 원심 분리하였다.

최종 원심분리 후 세포 펠릿은 Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM)/ F12+10% FBS 배지에서 다시 부유시키고 5×10⁶ cells/dish의 농도에서 5ml의 조직 배양용 접시에 배양하였다. 이때 상기 조직 배양용 접시는 3일 동안 가습된 0.5%의 CO₂ 환경에서 37℃로 배양시킨 다음 사용하였다.

2. 크로마핀 세포의 캡슐화 포집

1) 알지네이트 - 폴리 (L-리신)- 알지네이트 ( APA ) 를 이용한 구형의 크로마핀 세포캡슐화 과정

소디움 알지네이트 (Junsei, Japan)를 0.9% 식염수에 1.4% (w/v)가 되도록 용해하며, 용액은 실린지 필터 (0.2㎛)로 분리하여 살균 처리하였다. 크로마핀 세포는 돼지의 부신 수질로부터 분리되어 배양용 접시에 3일간 배양된 것을 사용하였다.

트립신/EDTA 용액으로 세포를 배양용 접시로부터 떼어내고 살균 처리된 알지네이트 용액 300㎕와 혼합한다. 직경 0.15 mm의 주사 바늘로 20 ml/h의 속도로 세포와 알지네이트의 부유액을 1.5% 염화칼슘 용액이 담긴 비커 안에 떨어뜨렸다. 캡슐의 크기를 직경 0.5-1.0 mm로 조정하기 위하여 0.5 L/min의 공기를 주사 바늘 끝에 불어넣었다. 이때 캡슐은 염화칼슘 용액에서 15분 동안 경화시키기 위해 침잠시켜 두었다가 막 필터를 이용하여 PBS로 세척하였다.

폴리-L-리신(0.05% w/v, 분자량: 17,000-25,000, Sigma)으로 30분간 코팅시키고, 이를 1.1% CaCl₂ 용액과 0.85% NaCl 용액 순으로 세척하였다. 수집된 캡슐을 0.12% 소디움 알지네이트에 7분간 부유시켜 외부의 얇은 막을 형성한 후 0.85% NaCl 용액으로 서너 차례에 걸쳐 세척하였다.

완성된 캡슐은 6웰에 1×10⁶ cells/well의 농도로 각각 나누어 담고 DMEM/F12 + 10% FBS 배양액으로 0.5% CO₂, 37℃ 인큐베이터 내에서 배양하였다. 얻어진 캡슐의 현미경 사진을 배율 100배로 측정한 도 1에서 보듯이, 구형 캡슐을 확인할 수 있었다.

2) 케라틴을 이용한 도우넛형 크로마핀 세포 캡슐화 과정

도 2의 모식도를 참조하면, α+γ케라틴 (5 % w/v, pH=7.4)을 감마 방사선 (800 krads)으로 살균처리하였다. 크로마핀 세포는 돼지의 부신 수질로부터 분리되어 배양용 접시에 3일간 배양된 것을 사용하였다. 트립신/EDTA 용액으로 세포를 배양용 접시로부터 떼어내고 살균 처리된 케라틴용액 300㎕와 혼합하였다.

크로마핀 세포와 혼합된 케라틴 용액을 30게이지 니들에 넣고 니들 팁과 10㎖ pH 4~6의 산성버퍼 용액간의 거리가 3cm 되게 하여 떨어뜨린 후 2~3 시간동안 24℃하에 두었다. 안정화된 캡슐을 PBS로 3회 씻고. 완성된 캡슐은 6웰에 1×10⁶ cells/well의 농도로 각각 나누어 담고 DMEM/F12 + 10% FBS 배양액으로 0.5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 얻어진 캡슐의 현미경 사진은 배율 40배로 측정한 도 3에서 보듯이, 도우넛형 인 것을 확인할 수 있었다.

3) 케라틴 및 생체고분자를 이용한 도우넛형 크로마핀 세포 캡슐화 과정

상술한 2)의 세포와 케라틴만을 혼합하였을 때는 단백질 기반 케라틴 하이드로젤의 특성상 가교결합력이 낮아 기계적 강도가 낮은 정도에 불과한 문제점을 개선하기 위하여, 케라틴과 생체분해성 합성고분자 poly(l-lysine)을 8:2 (v/v%)로 섞어 세포를 캡슐화한 것을 제외하고는 상술한 2)의 과정을 반복하여 캡슐을 수득하였다.

얻어진 캡슐 사진은 도 4에서 보듯이, 규칙적이고 일정한 모양의 안정된 도우넛 캡슐이 만들어 졌으며 캡슐을 plate에서 plate로 옮길 때 그 형태가 유지되는 등의 실험을 통해 그 물리적인 성질이 더욱 개선됨을 확인하였다.

4) 카테콜아민 측정을 위한 시험관 실험

알지네이트 및 케라틴으로 만들어진 각각의 크로마핀 세포 캡슐을 배양한 지 3일 후, 배양액을 흡입기로 제거한 후 HBSS로 2회 세척하였다. HBSS + 아스코르베이트 용액을 각 웰에 5ml씩 넣고 30분간 반응시켜 basal 데이터를 얻었다.

HBSS + 아스코르베이트를 제거한 후 HBSS용액으로 2회 세척 후 HBSS용액과 20μ㏖ 니코틴을 각 웰에 5ml씩 넣고 1시간동안 반응시켰다. 반응 후 HBSS로 세척한 후 DMEM/F12 + 10% FBS 배양액으로 교체하여 30분 후에 각각 샘플링하였다.

각각의 샘플은 0.5 M HCl과 함께 -70℃에서 보관한 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) (coulometric detector [Coulochem II, ESA, Bedford, MA], guard cell 450 mV, 기준 전극 +250 mV, 작동 전극 -250 mV)로 카테콜아민을 측정하였다.

그 결과를 도 5에 정리하였다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 케라틴으로부터 만들어진 도우넛형 돼지 크로마핀세포 캡슐과 대조예로서 알지네이트로 만들어진 구형 돼지 크로마핀세포 캡슐로부터 니코틴 자극을 한 후 분비된 카테콜아민을 20일 동안 HPLC (Mobile phase : 50mM 소디움 포스페이트, 50mM 시트르산, 20mM 옥탄 술폰산, Flow rate: 0.3ml/min, C18 reversed-phase 4.6250mm 칼럼. 25^oC, 카테콜아민은 total potential +770 mV하에서 전기화학적 검측에 의해 모니터링하였다)로 측정한 결과를 대비한 그래프로서, 카테콜라민 분비가 도우넛형 캡슐에서 유의하게 많이 분비됨을 알 수 있다.

도 1은 일반적인 구형 세포 캡슐의 현미경 사진(배율 X100)이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 도우넛형 세포 캡슐의 제작 모식도이다.

도 3는 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 케라틴을 이용한 도우넛형 세포 캡슐의 현미경 사진(배율 X40)이다.

도 4는 본 발명의 다른 실시예에 의해 케라틴과 생체분해성 합성고분자 폴리-L-리신과 혼합한 것으로부터 얻어진 도우넛형 세포 캡슐의 디지털 사진이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 의해 얻어진 케라틴으로부터 만들어진 도우넛형 돼지 크로마핀세포 캡슐과 대조예로서 알지네이트로 만들어진 구형 돼지 크로마핀세포 캡슐로부터 니코틴 자극을 한 후 분비된 카테콜아민을 측정한 결과를 대비한 그래프이다.

Claims (17)

1. 세포를 케라틴 및 폴리(L-리신)과 혼합하여 혼합액을 만든 다음, 상기 혼합액을 실린지를 넣고 산성 조건 하에서 점적하시킨 후 2-3시간동안 20-26℃ 하에 재치하여 안정화 시키는 과정을 포함하는, 납작하고 중앙에 구멍이 있는 도우넛 타입의 세포 캡슐을 형성하는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 점적하는 상기 혼합액을 30게이지 니들에 넣고 니들 팁과 산성버퍼 용액간의 거리가 3cm가 되게 하여 떨어뜨려 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 안정화된 캡슐을 PBS로 세척한 다음 DMEM/F12 + 10% FBS 배양액으로 0.5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법
6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 통증치료, 당뇨병, 파킨슨병에 유용한 세포인 것을 특징으로 하는 방법
7. 제6항에 있어서, 상기 세포는 신경전달물질 분비 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법
8. 제7항에 있어서, 상기 신경전달물질 분비 세포로는 돼지의 부신 수질로부터 분리되어 3일 동안 배양된 크로마핀 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 세포는 인슐린을 분비하는 췌장 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법
10. 삭제
11. 제1항에 있어서, 상기 케라틴을 사용하기에 앞서 감마 방사선으로 살균처리하는 것을 특징으로 하는 방법
12. 삭제
13. 제1항에 있어서, 상기 케라틴 및 폴리(L-리신)과의 혼합시 함량비는 혼합물 총 중량을 기준으로 5-9:5-1 범위내인 것을 특징으로 하는 방법
14. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 산성 조건은 pH 4-6 범위 내인 것을 특징으로 하는 방법
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제

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