WO2012079142A1 - Composição biopolimérica para o encapsulamento de células, método de produção de uma composição biopolimérica para o encapsulamento de células, método para promover a citoproteção de células e uso de uma composição biopolimérica para o encapsulamento de células - Google Patents

Composição biopolimérica para o encapsulamento de células, método de produção de uma composição biopolimérica para o encapsulamento de células, método para promover a citoproteção de células e uso de uma composição biopolimérica para o encapsulamento de células Download PDF

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Ana Carolina Vale Campos LISBÔA
Gisella Grazioli
Ana Lúcia Campanha RODRIGUES
Leticia Labriola
Mari Cleide Sogayar
Thiago Rennó Dos Mares GUIA
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Cellprotect Biotecnologia Ltda-Me
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Definitions

  • BIOPOLIMERIC COMPOSITION FOR CELL ENCAPSULATION METHOD FOR PRODUCTION OF A BIOPOLIMERIC CELL ENCAPSULATION, METHOD FOR PROMOTING
  • the present invention is in the field of biotechnology and concerns a biopolymer cell encapsulation composition, its preparation process, as well as a method for promoting cytoprotection and the use of a biopolymer composition in the preparation of a medicament useful in cell transplantation.
  • the cell encapsulation process must keep them viable and protected within a membrane permeable to nutrients, ions, oxygen and other compounds needed to maintain metabolic functions, but impervious to bacteria, lymphocytes and macromolecules responsible for immune and inflammatory reactions. , what result in implant rejection.
  • There is a large body of literature reporting the use of encapsulation for immunoprotection of transplanted cells (Calafiore R. 1997. Perspectives in pancreatic and islet cell transplantation for the therapy of IDD. Diabetes Care 20 (5): 889-896; Korbutt GS, Mallett AG, Ao Z, Flashner, Rajotte RV 2004.
  • Diabetologia 47 10: 1810-1818; de Vos P, van Hoogmoed CG, van Zanten J, Netter S, Strubbe JH, Busscher H. 2003. Long-term biocompatibility, chemistry, and function of microencapsulated pancreatic islets Biomaterials 24 (2): 305-312; Campos-Lisbôa, ACV 2009.
  • thermoplastic polymers and hydrogel polymers.
  • thermoplastic polymers studied are poly (hydroxymethyl acrylate methyl methacrylate) (HEMA-MMA), acrylonitrile copolymers (AN69) and polyethylene glycol (PEG), which have advantages regarding capsule stability after implantation.
  • HEMA-MMA poly (hydroxymethyl acrylate methyl methacrylate)
  • AN69 acrylonitrile copolymers
  • PEG polyethylene glycol
  • alginate a polysaccharide found both in the intercellular matrix of brown algae and extracellularly covering some species of bacteria.
  • Alginates are unbranched linear polymers that contain the residues of 1,4- ⁇ - ⁇ -manuronic acid (M) and 1,4-cc-L-guluronic acid (G). These residues are interconnected, in blocks of M homopolymers (M-M-M), G homopolymers (G-G-G) and MG heteropolymers, and can be alternated (M-G-M-G) or not.
  • alginate has the greatest advantages, since: a) it does not interfere with cell function (from Haan BJ, Faas MM, from Vos P. 2003. Celi transplantation 12 (6) ): 617-625), b) capsule confection occurs under physiological conditions (room temperature, physiological pH and isotonic solutions) and c) remains stable for years in small and large animals, including humans (Soon-Shiong P, Heintz RE, Merideth N, Yao QX, Yao Z, Zheng T, Murphy M, Moloney MK, Schmehl M, Harris M, et al 1994. Insulin independence in a type 1 diabetic patient after encapsulated islet transplantation Lancet 343 (8903): 950-951).
  • this material has two characteristics that are highly desirable for biocompatibility of a membrane: hydrophilia and malleability. Hydrophilicity allows the surface tension between the fluids and adjacent tissues to be minimal, reducing protein adsorption and cell adhesion to the biomaterial, which is undesirable to microencapsulation by restricting the diffusion of oxygen and nutrients.
  • the malleability of hydrogels amortizes mechanical irritation events to adjacent tissues (from Vos P, Hamel AF, Tatarkiewicz K. 2002. Considerations for successful transplantation of encapsulated pancreatic islets. Diabetologia 45 (2): 159-173).
  • the alginate changes from soluble to gelled state under physiological conditions not detrimental to encapsulated cells.
  • Alginate microcapsules are prepared by extruding the cell mixture suspended in a sodium alginate solution through a drop generator (infusion pump). Irogrogotes are collected in a solution of divalent ions, such as calcium or barium, to become gel microspheres containing cells within them.
  • divalent ions such as calcium or barium
  • the divalent ions present in the gelling solution establish ionic bonds with the carboxyls present in the G-blocks (GGG homopolymers) and in the alternate blocks MG (MG-MG or MG-GG) leading to the formation of structures called "egg cartons" ( Donati I, Holtan S, Morch YA, Borgogna M, Dentini M, Skj ak-Braek G. 2005. New hypothesis on the role of alternate sequences in calcium alginate gels Biomacromolecules 6 (2): 1031-1040) and formation of microcapsules.
  • Diabetes Care 29 (1): 137-138; Elliott RB, Escobar L, Tan PL, Muzina M, Zwain S, Buchanan C. 2007.
  • Extracellular matrix components such as laminin may be used to mimic the extracellular matrix in microcapsules.
  • the contact of microencapsulated cells with extracellular matrix elements ensures the availability of a more suitable microenvironment for graft viability and functionality, reducing stress and cell death processes, if used as therapy for diseases.
  • Laminin I also had beneficial effects when added to human pancreatic islet culture medium in a monolayer adherent culture in vitro experiment (Labriola L, Montor WR, Krogh K, Lojudice FH, Goldberg AC, Eliaschewitz FG, Sogayar MC 2007.
  • Beneficiary effects of prolactin and laminin on human pancreatic islet-cell cultures Molecular and cellular endocrinology 263 (1-2): 120-133) and the works of Weber et al. (2007 and 2008) present in vitro results of adding laminin to a microcapsule made with a different biomaterial (PEG) than that used in the present invention (Weber LM, Hayda KN, Haskins K, Anseth KS, 2007.
  • WO2009 / 000955 discloses particles of polymeric material containing cells within them, such particles having improved mechanical strength. This increase in strength is achieved through the functionalization of the polymeric material that forms the microcapsule using specific peptide that binds to cell membrane proteins. However, for effective protection against the immune response to encapsulated and transplanted cells, it is necessary to coat the microcapsules with a pore-closing outer membrane such as poly-L-lysine.
  • Patent document O2008 / 077402 discloses microcapsules comprising one or more active substances embedded in a matrix to protect these compounds from exposure to oxygen, moisture, irradiation and also against physical influences such as pressure, physical and / or chemical degradation, providing to these substances increased durability. Said microcapsules further comprise an alginate / calcium complex in a ratio of approximately 0.1-5.0% (w / w). The described microcapsules may be used for the preparation of tablets and other products including an active substance.
  • WO 2007/046719 discloses a composition comprising high manuronic acid alginate and a polycation having a polydispersion index of less than 1.5.
  • the composition is particularly useful for making microcapsules containing live allo- or xenogeneic transplantation cells. Such microcapsules are said to be superior in their durability and functional and structural integrity when compared to conventional alginate capsules. Effective immunoprotection is related to the use of polycation. However, recent studies have shown that the presence of these polycations results in an activation of the immune system of the implant recipient, culminating in the loss of function of transplanted microencapsulated cells.
  • Patent document WO2003 / 094898 discloses alginate polymer encapsulated biomedical materials.
  • Alginate capsules are subjected in a liquid vehicle to the presence of an unsaturated ethylene monomer and an initiator in order to induce polymerization of the unsaturated monomer, and thus to increase the strength of the capsule.
  • microcapsules require a polycation coating and can also be treated with poly-L-lysine to reduce their tendency to induce an immune response when implanted in an animal.
  • poly-L-lysine to reduce their tendency to induce an immune response when implanted in an animal.
  • calcium ions are employed, which are easily lost to the medium.
  • the process to stabilize the capsules comprises a series of steps involving more time in some physiological solutions and changes in temperature and preç ⁇ o C0 2, which may lead to a loss of viability of cells which are very sensitive to these changes.
  • WO1991 / 009119 describes a composition containing biological material for transplantation or implantation, which comprises barium salt polymerized alginate, preferably barium chloride.
  • the microcapsule may additionally contain hyaluronic acid and poly-L-lysine.
  • the microcapsule of this invention is described as negatively charged, which increases protein release and limits the invasion of immunoglobulins.
  • Such microcapsules may be used for encapsulating Langerhans islets for insulin production.
  • recent studies have shown that the use of polycations to close pores and consequent acquisition of immunoprotection causes an undesirable immune reaction around the microcapsules, compromising implant viability and functionality.
  • pancreatic islets relates to reduced insulin synthesis and secretion, mainly due to the mechanisms of apoptosis and cellular stress, as well as Use of a large number of pancreatic islet cells to make microcapsules viable for pancreatic islet transplantation in patients diagnosed with diabetes.
  • the slow pace of conventional microcapsules in achieving normoglycemia after microencapsulated pancreatic islet cell transplantation in a patient diagnosed with diabetes is also a problem.
  • biopolymer compositions that have not only good mechanical properties, but also provide improved survival and functionality of encapsulated cells, avoid the use of undesirable polycation, and which can be prepared by less costly processes.
  • Figure 1 presents an experiment performed with microcapsules made using the barium ions-containing polymerization solution.
  • the initial condition is given by the amount of barium ions (in ppm) present in the microcapsule wash solution after production.
  • These microcapsules were maintained in culture for 24h or 7 days in a standard greenhouse (static condition) or kept in rotation for 24h or 7 days (rotational condition) and the supernatant (culture medium) was collected for subsequent determination of barium content. released by the capsules.
  • Figure 2 shows the expression of genes related to apoptosis, cell stress, hypoxia and the two rat insulins in Alg-SC or Alg-SC-LN microencapsulated murine pancreatic islet samples maintained in culture under normal conditions for 48 hours.
  • H Gene expression was normalized to the hprt gene, whose expression is constitutive. * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01 and *** p ⁇ 0.001.
  • Alg-SC Chondroitin Alginate + Sulphate
  • Alg-SC-LN Chondroitin Sulphate + Laminin Alginate.
  • Figure 3 shows the glycemia of streptozotocin-induced Type 1 Diabetes mellitus mice transplanted with 750 microencapsulated murine pancreatic islets in Alg-SC and Alg-SC-LN.
  • animals that received only bare pancreatic islets, animals that received sham capsules and non-diabetic animals were used.
  • the graph shows the mean and standard error of each condition.
  • the line dashed shows the limit below which animals are considered normoglycemic.
  • Alg-SC Chondroitin Alginate + Sulphate
  • Alg-SC-LN Alginate + Sulphate
  • Figure 4 shows the oral glucose tolerance test performed on sham control animals (transplanted with bare islets), non-diabetic control animals, and diabetic animals transplanted with Alg-SC or Alg-SC-LN microencapsulated rat pancreatic islets.
  • the points represent the means ⁇ SEM. This test was done 60 days after islet implantation.
  • Figure 5 shows the oral glucose tolerance test performed on sham control (non-diabetic transplanted), non-diabetic control animals and diabetic animals transplanted with Alg-SC or Alg-SC-LN microencapsulated rat pancreatic islets.
  • the points represent the means ⁇ SEM. This test was done 150 days after islet implantation.
  • Figure 6 shows the graft survival curve of 750 Alg-SC or Alg-SC-LN microencapsulated murine pancreatic islets transplanted into streptozotocin-induced mice with Type 1 Diabetes mellitus.
  • Alg-SC Chondroitin Alginate + Sulphate
  • Alg-SC-LN Chondroitin Sulphate + Laminin Alginate.
  • the results show that up to 200 days the graft functionality of the Alg-SC-LN biomaterial remains in about 60% of the transplanted animals and is significantly higher than the functionality of the Alg-SC microencapsulated graft.
  • Mantel-Cox test * p ⁇ 0.05.
  • Figure 7 shows the biocompatibility assessment of the Alg-SC and Alg-SC-LN biopolymers against the incubation of microcapsules with RA 264-7 cell line macrophages and expression level analysis.
  • IL-1-beta Figure 7A
  • TNF-alpha Figure 7B
  • HPRT housekeeping gene HPRT was used for data normalization.
  • As negative control macrophages incubated without microcapsules were used.
  • As positive control macrophages with bacterial lipopolysaccharides (LPS) and non-purified biopolymer for clinical use (Alg-Sigma).
  • Results show the absence of macrophage activation (cytokine expression) in contact with the biomaterials Alg-SC and Alg-SC-LN, showing that they are biocompatible, non-immunogenic. Biological triplicate with experimental duplicates. One-Way Anova Test with Tukey's Back Test. ** p ⁇ 0.01.
  • Alg-SC Chondroitin Alginate + Sulphate
  • Alg-SC-LN Chondroitin Sulphate + Laminin Alginate.
  • Figure 8 shows the relative protein expression of Bax (Figure 8A), Bcl-xL ( Figure 8B) and Xiap (Figure 8C) proteins in Alg-SC or Alg-SC-LN microencapsulated islets by the Western Blot technique. normalized according to GAPDH protein expression. * p ⁇ 0.05 and ** p ⁇ 0.01.
  • Alg-SC Chondroitin Alginate + Sulphate
  • Alg-SC-LN Chondroitin Sulphate + Laminin Alginate.
  • the present invention also relates to a method of producing said composition, which by means of specifically adjusted parameters ensures the efficiency of the composition in shorter production time. Further, objects of the present invention are a method for promoting cytoprotection and the use of the biopolymer composition developed for the manufacture of a medicament for use in cell transplantation.
  • This new biopolymer composition has found superior properties and benefits that guarantee biocompatibility (Figure 7), the function and viability of microencapsulated cells, which is crucial not only for their therapeutic or prophylactic activities to be achieved, but also for ensuring maximum viability and longevity of transplanted cells.
  • microcapsules which are gelled by divalent cation solution, such as barium ions
  • divalent cation solution such as barium ions
  • compositions for encapsulating alginate-based cells, glycosaminoglycan components and extracellular matrix components are not known.
  • One object of this invention relates to a biopolymer composition for alginate-based cell encapsulation, glycosaminoglycan components such as chondroitin sulfate, and extracellular matrix components.
  • Extracellular matrix components may be one or more of elastin, entactin-1, fibrillin, fibronectin, fibrin, fibrinogen, fibroglycan, fibromodulin, fibrin, glyipican, vitronectin, laminin, nidogen, matriline, perlecane, heparin, heparan sulfate, heparan sulfate proteoglycans, decorina, filaggrin, keratin, syndecane, agrin, integrins, agrecane, biglican, hyaluronan, hyaluronan binding proteins, serglycine, tenascin, nidogen, chondronectin, thrombospondin, versicana, hb-gam, dermatan sulfate, kerat Collagen (including type IV and XVIII), fibrillar collagen (including type I, II, III, V and XI), F
  • the alginate: chondroitin sulfate ratio is about 4: 1 and laminin is present in a final concentration of about 10 pg.mlT 1 .
  • Another object of this invention relates to a method for promoting protection of encapsulated cells (cytoprotection) through the use of an alginate-based biopolymer composition, glycosaminoglycan components such as chondroitin, and extracellular matrix components such as laminin, according to the invention. with the present invention.
  • Another object of this invention is the use of an alginate-based biopolymer composition, glycosaminoglycan components such as chondroitin, and extracellular matrix components such as laminin according to the present invention for the preparation of a useful medicine in cell transplantation.
  • the developed biopolymer composition induces important changes in the expression of apoptosis related genes.
  • the effector caspase gene 3 which is activated at the end of the apoptotic cascade, has its expression reduced in cells microencapsulated with the biopolymer composition of this invention.
  • the bcl-2 anti-apoptotic gene is increased in microencapsulated cells of said composition ( Figure 2).
  • Expression of anti-apoptotic proteins Bcl-xL and Xiap are also increased in Alg-SC-LN microencapsulated islets compared to Alg-SC microencapsulated islets ( Figure 8).
  • the claimed biopolymer composition increases the expression ratio of the bcl-2 and bax (bcl-2 / bax) genes, which shows that microencapsulation with this composition protects cells against apoptosis.
  • Increased ratios of bcl-2 / bax and bcl-xL / bax expression at both gene and protein levels show a decreased susceptibility of the cell to apoptosis (BROWN et al., 2007) ( Figure 2).
  • the biopolymer composition developed in microencapsulation models of pancreatic islet cells increases the expression of rat insulin 1 gene, which may lead to increased percentage of ⁇ cell precursors that differentiate into mature ⁇ cells. This composition also re-establishes cell-cell and matrix-cell contact, which is essential for maintaining cell viability and functionality ( Figure 2). 5)
  • the developed cell encapsulation method utilizes a reduced number of pancreatic islet cells required for cell transplantation. For the current state of the art, the average number of islets of mice required to reverse the diabetic state of mice is around 1,450.
  • the biopolymer composition developed in this invention achieves normoglycemia after transplantation in a shorter time than the current state of the art.
  • the presence of extracellular matrix components such as laminin in the composition of this invention reduces the range of normoglycemia after transplantation by up to 4 days. In the clinic, this may mean fewer days of hospitalization due to faster patient recovery ( Figure 3).
  • the biocompatibility of the Alg-SC and Alg-SC-LN biomaterials was demonstrated by assay in which capsules composed of these biomaterials were cultured with macrophages.
  • the method of producing the biopolymer composition consists in optimally mixing the alginate with at least one glycosaminoglycan component, preferably chondroitin sulfate, together with at least one extracellular matrix component, preferably laminin.
  • This mixing is done at the time of microencapsulation, as is the mixing of the biomaterial with the cells. This last mixture should be performed as quickly as possible, as the direct and long contact of the ungelled biomaterial with the cells can cause detrimental effects on their viability and functionality. This procedure should be performed only when the entire microencapsulation apparatus is prepared for the preparation of microcapsules. The cells should be pelleted by centrifugation and thoroughly homogenized in the biomaterial by adding this mixture to a syringe which is attached to the microcapsule-making apparatus.
  • Cell encapsulation may be directed to stem cells, muscle cells, pancreatic cells, chondrocytes, liver cells, central nervous system cells, renal cortex cells, vascular endothelial cells, skin cells, thyroid and parathyroid cells, adrenal cells, thymic cells, ovarian cells, germline cells, embryos or cells that include recombinant genetic material.
  • a syringe pump is used to expel the biopolymer mixture with the cells.
  • a coaxial air flow around the needle it is possible to detach the drop at the desired time, thus being able to control the size of the microcapsules.
  • the distance between the needle tip and the gelling solution is adjusted so that the microcapsules gently reach the bottom of the container where they are deposited, thus avoiding mechanical shocks that may cause deformation.
  • the height between the tip of the needle from which the biomaterial containing the cells comes out and the gelling solution may be between 5 and 10 cm.
  • the flow of biomaterial containing cells can be expelled through the needle with flow ranging between 15 and 30 mL.h -1 .
  • Coaxial compressed air flow can vary between 2.0 and 2.5 L.rnin "1 , and can generate microcapsules still considered ideal between 500 and 1000 ⁇ .
  • the diameter of the microcapsules is dependent on the ion used for gelation, the concentration of the gelation solution and the air flow.
  • the microcapsules fall into a polymerization (gelling) solution composed of divalent ions such as BaCl 2 or CaCl 2 , preferably BaCl 2 , and buffered with 4- (2-hydroxyethyl) -1 acid. - piperazineethanesulfonic - HEPES at pH 7.4. It is important to note that gelation is performed under physiological conditions, causing no harmful effects to cells.
  • the biomaterial changes from soluble to gelled state.
  • Laminin and chondroitin sulfate which are contained in the biomaterial, remain anchored in the alginate-ion networks, helping to close the formed mesh and forming appropriately sized pores.
  • the microcapsules remain in the solution for a further 5 minutes. After this incubation step, the microcapsules are rapidly filtered. Excess ions used for gelling the biomaterial are removed by successively washing the microcapsules in 0.15 M NaCl.
  • the microcapsule formed around the cells is permeable to insulin, glucose, nutrients and oxygen and impervious to immune system molecules and cells, preventing direct contact between the transplanted graft and the patient's immune system in cases of cell transplantation or therapy. cell phone.
  • biopolymer is diluted in NaCl 0.15 mol.L -1 solution to a final concentration of 1.2% alginate.
  • the biopolymer is formed by 4: 1 alginate: chondroitin sulfate and laminin-1 is added to this mixture at a final concentration of 10 g.mL -1 .
  • the cell suspension should be carefully and rapidly homogenized in the NaCl biopolymer solution.
  • the gelling barium chloride solution is 0.02 mol L "1 plus HEPES 20 mmol. L" 1 (Sigma), pH 7.2.
  • EXAMPLE 2 Making the microcapsules and parameters used to obtain a microcapsule of optimal size, shape and stability.
  • the distance between the needle tip and the gelling solution was adjusted to 7.5 cm. At the end of the process, the microcapsules remain in the solution for a further 5 minutes. After this incubation step, the microcapsules are rapidly filtered and washed with 0.15 mol.L -1 NaCl.

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Abstract

A presente invenção refere-se a uma composição biopolimérica para o encapsulamento de células à base de alginato, pelo menos um componente glicosaminoglicano, preferencialmente o sulfato de condroitina, e pelo menos um componente da matriz extracelular, preferencialmente a laminina, bem como seu processo de produção. Além disso, são revelados um método para promover a citoproteção que utiliza a referida composição e o uso desta composição na preparação de um medicamento útil no transplante de células.

Description

COMPOSIÇÃO BIOPOLIMERICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO BIOPOLIMERICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, MÉTODO PARA PROMOVER A
CITOPROTEÇÃO DE CÉLULAS E USO DE UMA COMPOSIÇÃO BIOPOLIMERICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS
Campo da Invenção
A presente invenção situa-se no campo da biotecnologia e diz respeito a uma composição biopolimérica para o encapsulamento de células, seu processo de preparação, assim como um método para promover a citoproteção e o uso de uma composição biopolimérica na preparação de um medicamento útil no transplante de células.
Antecedentes da Invenção
A busca da imunoproteção de células (citoproteção) transplantadas iniciou-se em 1964, quando a idéia de envolver células com membranas ultrafinas de polímeros foi proposta, o que introduziu na literatura científica os termos "células artificiais" e "bioencapsulamento" (Chang TM. 1964. Semipermeable microcapsules . Science 146:524-525). O bioencapsulamento consiste numa barreira imunoprotetora para as células e o princípio metodológico visa revestir células e/ou grupamentos celulares com uma membrana artificial, semipermeável, que preserve a integridade morfológica e funcional (Calafiore R, Basta G. 1995. Microencapsulation of pancreatic islets: theoretical principies, technologies and practice. Ricordi C, editor. Austin: R G Landes Company. 12 p) .
0 processo de encapsulamento de células deve mantê-las viáveis e protegidas dentro de uma membrana permeável a nutrientes, íons, oxigénio e outros compostos necessários à manutenção das funções metabólicas, porém impermeável às bactérias, aos linfócitos e às macromoléculas responsáveis pelas reações imunológicas e inflamatórias, que resultam na rejeição do implante. Existe na literatura um vasto número de trabalhos que relatam o uso do encapsulamento para a imunoproteção das células transplantadas (Calafiore R. 1997. Perspectives in pancreatic and islet cell transplantation for the therapy of IDD . Diabetes Care 20 (5) : 889-896; Korbutt GS, Mallett AG, Ao Z, Flashner , Rajotte RV. 2004. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia 47 (10) : 1810-1818; de Vos P, van Hoogmoed CG, van Zanten J, Netter S, Strubbe JH, Busscher HJ. 2003. Long- term biocompatibility, chemistry, and function of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials 24 (2): 305- 312; Campos-Lisbôa, A.C.V. 2009. Obtention of human pancreatic islets for transplantation through an increase in cell mass and an immunoisolation with biocompatible microcapsules . 121p. PhD Thesis - Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo; Cornolti R, Cattaneo I, Trudu , Figliuzzi M, Remuzzi A. 2009. Effect of Islet Transplantation on Metabolic Glucose Control in Rats with Diabetes. Diabetes Technology and Therapeutics 11 (12);
Os materiais utilizados para o microencapsulamento apresentam composição variável. Dois tipos principais de materiais já foram estudados: polímeros termoplásticos e polímeros de hidrogel.
Dentre os polímeros termoplásticos estudados estão os poli (hidroximetil-acrilato-metilmetacrilato) (HEMA-MMA) , copolímeros de acrilonitrila (AN69) e polietilenoglicol (PEG) , os quais apresentam vantagens quanto à estabilidade da cápsula após o implante. Entretanto, o uso de solventes orgânicos, necessários para a sua solubilização, interfere de sobremaneira na função celular (de Vos P, Hamel AF, Tatarkiewicz K. 2002. Considerations for successful transplantation of encapsulated pancreatic islets. Diabetologia 45 (2) : 159-173) .
Dentre os hidrogéis estudados, como alginato, quitosana e agarose, o material que melhor se enquadra aos padrões necessários a um biomaterial ideal é o alginato, um polissacarideo encontrado tanto na matriz intercelular de algas marrons quanto recobrindo, extracelularmente, algumas espécies de bactérias. Os alginatos são polímeros lineares não ramificados que contêm os resíduos de ácido 1,4-β-ϋ- manurônico (M) e ácido 1 , 4-cc-L-gulurônicos (G) . Esses resíduos estão interligados, em blocos de homopolímeros de M (M-M-M) , homopolímeros de G (G-G-G) e heteropolímeros MG, podendo ser alternados (M-G-M-G) ou não. Tanto a proporção como a distribuição desses dois monômeros diferem segundo a fonte do alginato e determinam importantes propriedades físico-químicas para sua aplicação (Moe ST, Draget Kl, Skja k-Brnk G, Smidsrúd O. 1995. Alginates. Stephen AM ed. New York: M Dekker. 245-286) .
Entre os hidrogéis, o alginato detém as maiores vantagens, uma vez que: a) não interfere na função das células (de Haan BJ, Faas MM, de Vos P. 2003. Factors influencing insulin secretion from encapsulated islets. Celi transplantation 12 (6) : 617-625) , b) a confecção das cápsulas ocorre em condições fisiológicas (temperatura ambiente, pH fisiológico e soluções isotônicas) e c) permanece estável por anos em pequenos e grandes animais, incluindo o ser humano (Soon-Shiong P, Heintz RE, Merideth N, Yao QX, Yao Z, Zheng T, Murphy M, Moloney MK, Schmehl M, Harris M, et al. 1994. Insulin independence in a type 1 diabetic patient after encapsulated islet transplantation. Lancet 343 (8903) : 950-951) . Além disso, este material apresenta duas características que são altamente desejáveis para a biocompatibilidade de uma membrana: hidrofilia e maleabilidade. A hidrofilicilidade permite que a tensão superficial entre os fluidos e os tecidos adjacentes seja mínima, reduzindo a adsorção de proteínas e adesão celular ao biomaterial, o que é indesejável ao microencapsulamento por restringir- a difusão de oxigénio e nutrientes. Já a maleabilidade dos hidrogéis amortiza os eventos de irritação mecânica aos tecidos adjacentes (de Vos P, Hamel AF, Tatarkiewicz K. 2002. Considerations for successful transplantation of encapsulated pancreatic islets. Diabetologia 45 (2) : 159-173) . Além disso, o alginato passa do estado solúvel para o estado gelificado em condições fisiológicas não prejudiciais às células encapsuladas.
Microcápsulas de alginato são preparadas pela extrusão da mistura de células suspensas em uma solução de alginato de sódio através de um aparelho gerador de gotas (bomba de infusão) . icrogotas são coletadas numa solução de íons divalentes, como cálcio ou bário, tornando-se microesferas de gel contendo células em seu interior.
Os íons divalentes, presentes na solução de gelificação, estabelecem ligações iónicas com as carboxilas presentes nos blocos G (homopolímeros G-G-G) e nos blocos alternados MG (MG-MG ou MG-GG) levando à formação de estruturas denominadas "caixas de ovos" (Donati I, Holtan S, Morch YA, Borgogna M, Dentini M, Skj ak-Braek G. 2005. New hypothesis on the role of alternatxng sequences in calcium- alginate gels. Biomacromolecules 6 (2) : 1031-1040) e à formação de microcápsulas.
A técnica de microencapsulamento celular, utilizando diferentes tipos de biopolímeros, tem sido testada (Soon-Shiong P, Heintz RE, Merideth N, Yao QX, Yao Z, Zheng T, Murphy M, Moloney MK, Schmehl M, Harris M, et al. 1994. Insulin independence in a type 1 diabetic patient after encapsulated islet transplantation. Lancet 343 (8903) : 950-951; Calafiore R, Basta G, Luca G, Lemmi A, Montanucci MP, Calabrese G, Racanicchi L, Mancuso F, Brunetti P. 2006. Microencapsulated pancreatic islet allografts into nonimmunosuppressed patients with type 1 diabetes: first two cases. Diabetes Care 29 (1) : 137-138; Elliott RB, Escobar L, Tan PL, Muzina M, Zwain S, Buchanan C. 2007. Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation. Xenotransplantation 14 (2) : 157-161) e aplicada em ensaios clínicos em humanos para o Diabetes Mellitus Tipo 1 (www.reneuron.com; www.lctglobal.com e www.novocell.com) e para diferentes outras doenças (Murua A, Portero A, Orive G, Hernández RM, Castro M, Pedraz JL. Celi microencapsulation technology: Towards clinicai application, 2008) : anemias (Koo J, Chang TM. 1993. Secretion of erythropoietin from microencapsulated rat kidney cells: preliminary results. The International Journal of Artificial Organs 16 ( 7 ): 557-560 ) , nanismo (Chang PL, Shen N, Westcott AJ. 1993. Delivery of recombinant gene products with microencapsulated cells in vivo. Human Gene Therapy 4 (4 ): 433-440) , hemofilia B (Hortelano G, Al-Hendy A, Ofosu FA, Chang PL. 1996. Delivery of human factor IX in mice by encapsulated recombinant myoblasts: a novel approach towards allogeneic gene therapy of hemophilia B. Blood 87 ( 12 ): 5095-5103 ) , nefropatias (Cieslinski DA, David Humes H. 1994. Tissue engineering of a bioartificial kidney. Biotechnology and bioengineering 43 (7) : 678-681; Prakash S, Chang TM. 1996. Microencapsulated genetically engineered live E. coli DH5 cells administered orally to maintain normal plasma urea levei in uremic rats. Nature Medicine 2 (8) : 883-887) , hepatopatias ( ong H, Chang TM. 1986. Bioartificial liver: implanted artificial cells microencapsulated living hepatocytes increases survival of liver failure rats. The International Journal of Artificial Organs 9 (5) : 335-336) , insuficiências hipofisária (Aebischer et al., 1986) e do sistema nervoso central (Aebischer P, Panol G, Galletti PM. 1986. An intraperitoneal receptacle for macroencapsulated endocrine tissue. ASAIO
Transactions/American Society for Artificial Internai Organs 32 (1) : 130-133) , além de outras enfermidades, como câncer (Xu W, Liu L, Charles IG. 2002. Microencapsulated iNOS- expressing cells cause tumor suppression in mice. Faseb J 16(2) :213-215) .
Componentes da matriz extracelular, como a laminina, podem ser utilizados para promover a mimetização da matriz extracelular em microcápsulas . O contato das células microencapsuladas com elementos de matriz extracelular garante a disponibilidade de um microambiente mais adequado para a viabilidade e funcionalidade do enxerto, diminuindo processos de estresse e morte celular, caso este seja utilizado como terapia para doenças.
Estudos mostram a ação benéfica de laminina e de outros elementos da matriz extracelular em associação com outros tipos de biopolimeros, principalmente fotopolimerizáveis , diferentes daquele utilizado na presente invenção: já foi testada a adição de laminina ao polietilenoglicol (PEG), seguida do microencapsulamento de ilhotas pancreáticas e células beta MIN-6 de insulinoma murino, mostrando que a presença desse elemento de matriz extracelular promove uma melhora na função das células (Weber LM, Anseth KS. 2008. Hydrogel encapsulation environments functionalized with extracellular matrix interactions increase islet insulin secretion. Matrix Biology 27 (8) : 667-673; Weber LM, Hayda KN, Anseth KS . 2008. Cell-Matrix Interactions Improve b-Cell Survival and Insulin Secretion in Three-Dimensional Culture. Tissue Engineering: Part A. 14 ( 12 ): 1959-1968 ) .
O efeito da adição de laminina ao alginato puro recoberto com poli-L-lisina seguido do microencapsulamento de mioblastos também já é conhecido (Li AA, MacDonald NC, Chang PL. 2003. Effect of growth factors and extracellular matrix materiais on the proliferation and differentiation of microencapsulated myoblasts. J. Biomater. Sei. Polymer Edn 14 (6) : 533-549) . Esse trabalho mostra o aumento da proliferação das células em questão.
A laminina I também teve efeitos benéficos quando adicionada ao meio de cultura de ilhotas pancreáticas humanas em experimento in vitro de cultura aderente em monocamada (Labriola L, Montor WR, Krogh K, Lojudice FH, Genzini T, Goldberg AC, Eliaschewitz FG, Sogayar MC. 2007. Beneficiai effeets of prolactin and laminin on human pancreatic islet-cell cultures. Molecular and cellular endocrinology 263 (1-2) : 120-133) e os trabalhos de Weber et al. (2007 e 2008) apresentam resultados in vitro da adição de laminina a uma microcápsula confeccionada com um biomaterial (PEG) diferente daquele utilizado na presente invenção (Weber LM, Hayda KN, Haskins K, Anseth KS . 2007. The effeets of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials 28, 3004- 3011; Weber LM, Anseth KS . 2008. Hydrogel encapsulation environments functionalized with extracellular matrix interactions increase islet insulin secretion. Matrix Biology 27 (8) :667-673) .
O documento de patente WO2009/000955 descreve partículas de material polimérico que contém células em seu interior, sendo que tais partículas possuem resistência mecânica aprimorada. Este aumento de resistência é alcançado através da funcionalização do material polimérico que forma a microcápsula com a utilização de peptideo especifico que se liga a proteínas da membrana celular. Contudo, para uma proteção eficiente contra a resposta imune às células encapsuladas e transplantadas, é necessário revestir as microcápsulas com uma membrana externa que feche os poros, como poli-L-lisina . O documento de patente O2008/077402 revela microcápsulas que compreendem uma ou mais substâncias ativas embutidas numa matriz com o intuito de proteger estes compostos da exposição ao oxigénio, umidade, irradiação e também contra influências físicas como pressão, degradação física e/ou química, proporcionando a essas substâncias maior durabilidade. Referidas microcápsulas compreendem, ainda, um complexo de alginato/cálcio numa proporção de aproximadamente 0,1-5,0% (p/p). As microcápsulas descritas podem ser utilizadas para a preparação de tabletes e outros produtos que incluem uma substância ativa.
0 documento de patente WO 2007/046719 relata uma composição que compreende alginato de alto teor de ácido manurônico e um policátion que possui índice de polidispersão menor que 1,5. A composição é particularmente útil para a confecção de microcápsulas que contém células vivas para transplante do tipo alo- ou xenogênico. Tais microcápsulas são ditas superiores no que diz respeito à sua durabilidade e integridade funcional e estrutural, quando comparadas com cápsulas convencionais de alginato. A efetiva imunoproteção é relacionada ao emprego do policátion. Contudo, estudos recentes demonstraram que a presença destes policátions resulta em uma ativação do sistema imune do indivíduo que recebe implante, culminando com a perda da função das células microencapsuladas transplantadas . O documento de patente WO2003/094898 revela materiais biomédicos encapsulados em polímeros de alginato. As cápsulas de alginato são submetidas, num veículo líquido, à presença de um monômero insaturado de etileno e um iniciador, de forma a induzir a polimerização do monômero insaturado, e, portanto, aumentar a resistência da cápsula. Para apresentar imunoproteção, as microcápsulas precisam de um revestimento com policátions e podem ainda ser tratadas com poli-L-lisina para reduzir sua tendência de induzir uma resposta imune quando implantada em um animal . Para aumentar a resistência das microcápsulas, são empregados ions cálcio, que são perdidos para o meio com facilidade. O processo para estabilizar as cápsulas compreende uma série de etapas, envolvendo maior tempo em soluções pouco fisiológicas, além de alterações na temperatura e preção de C02, que podem levar a uma perda de viabilidade das células, que são bastante sensíveis a estas alterações. O documento de patente WO1991/009119 descreve uma composição que contém material biológico para transplante ou implante, que compreende alginato polimerizado com sal de bário, preferencialmente cloreto de bário. A microcápsula pode apresentar adicionalmente ácido hialuronico e poli-L-lisina. A microcápsula desta invenção é descrita como possuindo carga negativa, o que aumenta a liberação de proteínas e limita a invasão de imunoglobulinas . Tais microcápsulas podem ser utilizadas para o encapsulamento de ilhotas de Langerhans para a produção de insulina. Entretanto, estudos recentes demonstraram que o uso de policátions para o fechamento dos poros e consequente aquisição de imunoproteção provoca uma reação imune indesejável ao redor das microcápsulas, comprometendo a viabilidade e funcionalidade do implante.
Apesar de existir no estado da técnica o relato de amplo número de composições biopoliméricas para conferir certa imunoproteção às células encapsuladas, permanece ainda o desafio de mantê-las viáveis, funcionais e com longevidade duradoura. Esse desafio é consequência de uma série de condições deletérias às quais as células são submetidas durante o processo de encapsulamento.
Como principais desvantagens do atual estado da técnica, tem-se a elevada suscetibilidade das células encapsuladas a apoptose e ao estresse celular, devido às condições proporcionadas pelo biomaterial que as reveste. Apesar do uso de policátions como poli-L-lisina na microcápsula resultar em um estreitamento de poro, já foi comprovado que não é possível revestir estes policátions com alginato e que a inevitável exposição destas moléculas na superfície das microcápsulas resulta numa reação inflamatória deletéria às células microencapsuladas (de Vos P, Faas MM, Strand B, Calafiore R. Alginate-based microcapsules for immunoisolation of pancreatic islets. Biomaterials. 2006 Nov;27 (32) :5603-17) .
Além disso, outra desvantagem do estado da técnica, particularmente no que diz respeito ao encapsulamento de grupamentos celulares, como as ilhotas pancreáticas, relaciona-se à reduzida síntese e secreção de insulina, principalmente devido aos mecanismos de apoptose e estresse celular, bem como à utilização de uma grande quantidade de células de ilhotas pancreáticas para tornar as microcápsulas viáveis a um transplante de ilhotas pancreáticas em pacientes diagnosticados com Diabetes. Finalmente, também se detecta como problema a lentidão das microcápsulas convencionais em alcançar normoglicemia após o transplante de células de ilhotas pancreáticas microencapsuladas em paciente diagnosticados com Diabetes.
Assim, permanece a necessidade de composições biopoliméricas que apresentem não só boas propriedades mecânicas, mas também que proporcionem melhora na sobrevida e funcionalidade das células encapsuladas, evitar o uso dos indesejáveis policátion, e que possam ser preparadas por processos menos onerosos.
Descrição das figuras
A Figura 1 apresenta um experimento realizado com microcápsulas confeccionadas utilizando-se a solução de polimerização contendo ions bário. A condição inicial é dada pela quantidade de ions bário (em ppm) presentes na solução de lavagem das microcápsulas após a produção. Essas microcápsulas foram mantidas em cultura por 24h ou por 7 dias, em estufa comum (condição estática) ou mantidas em rotação durante 24h ou 7 dias (condição rotacional) e o sobrenadante (meio de cultura) foi coletado para posterior determinação do conteúdo de bário liberado pelas cápsulas.
A Figura 2 mostra a expressão de genes relacionados com apoptose, estresse celular, hipoxia e das duas insulinas de rato em amostras de ilhotas pancreáticas murinas microencapsuladas com Alg-SC ou com Alg-SC-LN e mantidas em cultura em condição de normóxia por 48 h. A expressão gênica foi normalizada em relação ao gene hprt, cuja expressão é constitutiva. *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001. Médias de triplicatas biológicas e triplicatas experimentais com cálculo do desvio padrão nas barras em cada uma das condições. Alg-SC: Alginato+Sulfato de Condroitina; Alg-SC-LN: Alginato+Sulfato de Condroitina+Laminina.
A Figura 3 apresenta a glicemia de camundongos com Diabetes mellitus do tipo 1 induzido por administração de estreptozotocina, e transplantados com 750 ilhotas pancreáticas murinas microencapsuladas em Alg-SC e Alg-SC- LN. Como controles, foram utilizados animais que receberam apenas ilhotas pancreáticas nuas, animais que receberam cápsulas vazias (sham) e animais não-diabéticos . 0 gráfico mostra a média e o erro padrão de cada condição. A linha tracejada mostra o limite abaixo do qual os animais são considerados normoglicêmicos . Alg-SC: Alginato+Sulfato de Condroitina; Alg-SC-LN: Alginato+Sulfato de
Condroitina+Laminina .
A Figura 4 mostra o teste oral de tolerância à glicose realizado em animais controle sham (transplantados com ilhotas nuas) , controle não diabéticos e em animais diabéticos transplantados com ilhotas pancreáticas de rato microencapsuladas com Alg-SC ou Alg-SC-LN. Os pontos representam as médias ± SEM. Esse teste foi feito 60 dias após o implante das ilhotas.
A Figura 5 mostra o teste oral de tolerância à glicose realizado em animais controle sham (transplantados com ilhotas nuas) , controle não diabéticos e em animais diabéticos transplantados com ilhotas pancreáticas de rato microencapsuladas com Alg-SC ou Alg-SC-LN. Os pontos representam as médias ± SEM. Esse teste foi feito 150 dias após o implante das ilhotas.
A Figura 6 apresenta a curva de sobrevivência do enxerto de 750 ilhotas pancreáticas murinas microencapsuladas com Alg-SC ou Alg-SC-LN transplantadas em camundongos portadores de Diabetes mellitus do tipo 1 induzido por administração de estreptozotocina . Alg-SC: Alginato+Sulfato de Condroitina; Alg-SC-LN: Alginato+Sulfato de Condroitina+Laminina. Os resultados mostram que até após 200 dias a funcionalidade do enxerto do biomaterial Alg-SC- LN se mantém em cerca de 60% dos animais transplantados e é significativamente maior que a funcionalidade do enxerto microencapsulado com Alg-SC. Teste de Mantel-Cox, * p<0,05.
A Figura 7 apresenta a avaliação da biocompatibilidade dos biopolimeros Alg-SC e Alg-SC-LN frente à incubação de micrococápsulas com macrófagos de linhagem celular RA 264-7 e análise da expressão ao nível de RNA de citocinas IL-l-beta (Figura 7A) e TNF-alfa (Figura 7B) expressas pelos macrófagos após 3h, 9h e 24 horas de incubação. Foi utilizado o gene housekeeping HPRT para normalização de dados. Como controle negativo foram utilizados macrófagos incubados sem microcápsulas . Como controle positivo, macrófagos com LPS ( lipopolissacarideos de bactérias) e biopolimero não-purifiçado para uso clinico (Alg-Sigma) . Resultados demonstram a ausência de ativação de macrófagos (expressão de citocinas) frente ao contato com os biomateriais Alg-SC e Alg-SC-LN, mostrando que os mesmos são biocompativeis, não-imunogênicos . Triplicata biológica com duplicatas experimentais. Teste One-Way Anova com teste a posteriori de Tukey. ** p<0,01. Alg-SC: Alginato+Sulfato de Condroitina; Alg-SC-LN: Alginato+Sulfato de Condroitina+Laminina .
A Figura 8 apresenta a expressão proteica relativa das proteínas Bax (Figura 8A) , Bcl-xL (Figura 8B) e Xiap (Figura 8C) , em ilhotas microencapsuladas com Alg-SC ou Alg- SC-LN através da técnica de Western Blot, normalizadas de acordo com a expressão da proteína GAPDH. * p<0,05 e ** p<0,01. Alg-SC: Alginato+Sulfato de Condroitina; Alg-SC-LN: Alginato+Sulfato de Condroitina+Laminina.
Descrição da Invenção
O conjunto dos fatores deficientes encontrados no estado da técnica para o encapsulamento de células levou ao desenvolvimento de uma nova composição biopolimérica para o encapsulamento de células que não só apresenta resistência mecânica aprimorada, mas também melhora a sobrevida e funcionalidade das células encapsuladas, ou seja, apresenta superior biocompatibilidade e estabilidade frente às demais microcápsulas apresentadas na literatura. Esses atributos são alcançados com o emprego de uma combinação específica de componentes, em quantidades específicas, que dispensam a necessidade do uso dos indesejáveis policátions e evitam métodos complicados de produção.
A presente invenção também está relacionada a um método de produção da referida composição, que por meio de parâmetros especificamente ajustados, garantem a eficiência da composição em menor tempo de produção. Ainda, são objetos da presente invenção um método para promover a citoproteção e o uso da composição biopolimérica desenvolvida para a fabricação de um medicamento para útil no transplante de células.
Encontrou-se nesta nova composição biopolimérica propriedades e benefícios superiores que garantem a biocompatibilidade (Figura 7), a função e viabilidade de células microencapsuladas, o que é primordial não apenas para que suas atividades terapêuticas ou profiláticas sejam alcançadas, mas também para que garanta a viabilidade e longevidade máxima de células transplantadas.
Os pesquisadores da presente invenção verificaram que a apoptose e o estresse celular podem ser reduzidos através da adição de elementos da matriz extracelular, como a laminina, em sistemas biopoliméricos baseados em alginato e sulfato de condroitina, de forma a evitar a morte celular e também promover a proliferação e a viabilidade celulares (Figuras 2 e 8) .
Além disso, os mesmos pesquisadores verificaram que a adição de sulfato de condroitina e laminina à composição do biopolímero de alginato garante o estreitamento dos poros e a proteção das células microencapsuladas de moléculas e células do sistema imune, resolvendo o problema que o microencapsulamento com alginato gelificado com cálcio cria, ao produzir microcápsulas com poros de dimensões maiores. Isso aumenta a resistência das microcápsulas e melhora a sobrevida e funcionalidade das células encapsuladas através de sinais moleculares citoprotetores (Figuras 2 e 8) .
A combinação de alginato, componentes glicosaminoglicanos, como o sulfato de condroitina, e componentes da matriz extracelular, como a laminina, para a confecção de microcápsulas, que são gelificadas através de solução de cátions divalentes, como os ions bário, apresenta-se como um grande avanço em relação ao atual estado da técnica por agregar propriedades biológicas vantajosas às microcápsulas. Mesmo sendo o bário um composto tóxico para o organismo uma vez estabelecendo ligações iónicas dentro da malha da microcápsula se torna indisponível para o meio e portanto não apresentando toxicidade ao indivíduo receptor do implante e às próprias células encapsuladas (Figura 1) .
O atual estado da técnica não revela composições biopoliméricas para o encapsulamento de células baseadas em alginato, componentes glicosaminoglicanos e componentes da matriz extracelular. Além disso, não são conhecidos métodos para a promoção da citoproteção que utilizam composições desta natureza, bem como o uso destas composições particulares para a preparação de um medicamento útil no transplante de células.
Um dos objetos desta invenção diz respeito a uma composição biopolimérica para o encapsulamento de células baseada em alginato, componentes glicosaminoglicanos, como o sulfato de condroitina, e componentes da matriz extracelular .
Os componentes da matriz extracelular podem ser um ou mais dentre elastina, entactina-1, fibrilina, fibronectina, fibrina, fibrinogênio, fibroglicano, fibromodulina, fibulina, glipican, vitronectina, laminina, nidogen, matrilina, perlecana, heparina, heparan sulfato, proteoglicanos do heparan sulfato, decorina, filagrina, queratina, sindecano, agrina, integrinas, agrecano, biglicano, hialuronan, proteínas ligadoras do hialuronan, serglicina, tenascina, nidogênio, condronectina, trombospondina, versicana, hb-gam, dermatan sulfato, queratan sulfato, Colágenos (incluindo tipos IV e XVIII), colágenos fibrilares (incluindo tipos I, II, III, V e XI), colágenos FACIT (tipos IX, XII, XIV) , outros colágenos (tipos VI, VII, XIII), colágenos de cadeia curta (tipos VIII, X), sulfato de condroitina (incluindo tipos a, c, d, e) , lumican e domínios, cadeias, fragmentos, mutantes ou análogos dos mesmos. De maneira particular, o componente da matriz extracelular é a laminina.
Na composição de acordo com a presente invenção a proporção de alginato : sulfato de condroitina é de cerca de 4:1 e laminina está presente numa concentração final de cerca de 10 pg.mlT1.
Outro objeto desta invenção relaciona-se a um método para promover a proteção de células encapsuladas (citoproteção) através da utilização de uma composição biopolimérica baseada em alginato, componentes glicosaminoglicanos, como a condroitina, e componentes da matriz extracelular, como a laminina, de acordo com a presente invenção.
Tem-se, ainda, como outro objeto desta invenção, o uso de uma composição biopolimérica baseada em alginato, componentes glicosaminoglicanos, como a condroitina, e componentes da matriz extracelular, como a laminina, de acordo com a presente invenção, para a preparação de um medicamento útil no transplante de células.
Várias são as vantagens da presente invenção em relação ao estado da técnica, sendo as mesmas pontuadas a seguir: 1) A composição biopolimérica desenvolvida induz modificações importantes na expressão de genes relacionados com a apoptose. O gene da caspase efetora 3, que é ativado no final da cascata apoptótica, tem a sua expressão reduzida em células microencapsuladas com a composição biopolimérica desta invenção. Além disso, o gene anti-apoptótico bcl-2, cujo produto é importante para a proteção das células contra os mecanismos de apoptose, tem a sua expressão aumentada em células microencapsuladas com a referida composição (Figura 2) . A expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-xL e Xiap também encontram-se aumentadas nas ilhotas microencapsuladas com Alg-SC-LN em comparação com ilhotas microencapsuladas com Alg-SC (Figura 8) .
2) A composição biopolimérica reivindicada aumenta a razão da expressão dos genes bcl-2 e bax (bcl-2/bax) , o que mostra que o microencapsulamento com essa composição protege células contra a apoptose. Razões aumentadas da expressão de bcl-2/bax e bcl-xL/bax, tanto ao nível gênico como ao nível protéico, mostram uma diminuição da suscetibilidade da célula a apoptose (BROWN et al., 2007) (Figura2) .
3) A composição biopolimérica desenvolvida diminui a expressão dos genes mcp-1 e hsp70, ambos relacionados ao estresse celular (Figura 2) .
4) A composição biopolimérica desenvolvida, em modelos de microencapsulamento de células de ilhotas pancreáticas, aumenta a expressão do gene de insulina 1 de ratos, que pode levar ao aumento do percentual de precursores de células β que se diferenciam em células β maduras. Esta composição também restabelece o contato célula-célula e célula-matriz, que é essencial para a manutenção da viabilidade e funcionalidade celular (Figura 2) . 5) O método de encapsulamento de células desenvolvido utiliza um número reduzido de células de ilhotas pancreáticas necessárias ao transplante celular. Para o atual estado da técnica, o número médio de ilhotas de ratos necessário à reversão do estado diabético de camundongos está em torno de 1.450. Utilizando-se a composição biopolimérica da presente invenção, conseguiu-se manter a normoglicemia em camundongos diabéticos durante mais de 200 dias através de um implante de apenas 750 ilhotas microencapsuladas, o que representa 48% menos ilhotas do que a quantidade relatada no estado da técnica (Figura 3) . A longevidade do enxerto foi significativamente superior nos camundongos que receberam ilhotas microencapsuladas com Alg-SC-LN (Figura 6) . A qualidade das ilhotas transplantadas foi avaliada ao longo do transplante através de teste oral de tolerância a glicose (TOTG) (Figuras 4 e 5) . Essa diferença é significativa quando se considera que tal redução pode representar a economia de um pâncreas para o transplante de ilhotas em seres humanos, uma vez que a média das cirurgias realizadas exige ilhotas (encapsuladas ou não encapsuladas) extraídas de dois ou mais pâncreas humanos para que o paciente diabético receptor tenha a sua glicemia normalizada.
6) Em modelo de microencapsulamento de células de ilhotas pancreáticas, a composição biopolimérica desenvolvida nesta invenção obtém normoglicemia após o transplante em um espaço de tempo mais curto em relação ao atual estado da técnica. A presença de componentes da matriz extracelular, como a laminina, na composição desta invenção, reduz em até 4 dias o alcance da normoglicemia após o transplante. Na clinica, isto pode significar menor número de dias de internação devido a uma recuperação mais rápida do paciente (Figura 3) . 7) A biocompatibilidade dos biomateriais Alg-SC e Alg-SC-LN foi demonstrada através de ensaio nos quais cápsulas compostas por esses biomateriais foram colocadas em cultura com macrófagos . A expressão de citocinas pró- inflamatórias IL-l-beta e TNF-alfa não foi estimulada nos macrófagos cultivados com esses biomateriais, em contraste com a expressão aumentada dessas citocinas em macrófagos cultivados com alginato do fabricante Sigma ou na presença de LPS (Figura 7) .
As formas alternativas e modificações dentro do escopo da presente invenção se tornarão facilmente detectáveis por alguém conhecedor do estado da técnica a partir da leitura das especificações a seguir e das referências de suporte apresentadas.
0 método de produção da composição biopolimérica consiste na mistura em proporções ideais do alginato com pelo menos um componente glicosaminoglicano, preferencialmente o sulfato de condroitina, juntamente com pelo menos um componente da matriz extracelular, preferencialmente a laminina.
Essa mistura é feita no momento do microencapsulamento, assim como a mistura do biomaterial com as células. Essa última mistura deve ser realizada da forma mais rápida possível, pois o contato direto e demorado do biomaterial não gelificado com as células pode causar efeitos danosos para a viabilidade e funcionalidade destas. Este procedimento deve ser realizado apenas quando toda a aparelhagem de microencapsulamento estiver preparada para a confecção das microcápsulas . As células devem ser sedimentadas, por centrifugação, e cuidadosamente homogeneizadas no biomaterial, adicionando-se esta mistura a uma seringa, a qual é acoplada ao aparelho que produz as microcápsulas . O encapsulamento de células poderá ser direcionado a células tronco, células musculares, células pancreáticas, condrócitos, células hepáticas, células do sistema nervoso central, células do córtex renal, células endoteliais vasculares, células da pele, células tireoidianas e paratireoidianas, células adrenais, células timicas, células ovarianas, células de linhagem germinativa, embriões ou células que incluem material genético recombxnante .
Para a confecção das microcápsulas, utiliza-se uma bomba de seringa para expulsar a mistura do biopolimero com as células. Através da aplicação de um fluxo de ar coaxial ao redor da agulha, é possível desprender a gota no momento desejado, sendo possível, portanto, controlar o tamanho das microcápsulas. A distância entre a ponta da agulha e a solução de gelificação é ajustada para que as microcápsulas atinjam delicadamente o fundo do recipiente onde são depositadas, evitando assim choques mecânicos que podem causar deformações. A altura entre a ponta da agulha de onde sai o biomaterial contendo as células e a solução de gelificação poderá estar entre 5 e 10 cm. 0 fluxo do biomaterial contendo as células pode ser expulso através da agulha com fluxo variando entre 15 e 30 mL.h-1. O fluxo de ar comprimido coaxial pode variar entre 2.0 e 2.5 L.rnin"1, podendo gerar microcápsulas ainda consideradas ideais entre 500 e 1000 μπι .
O diâmetro das microcápsulas é dependente do íon utilizado para a gelificação, da concentração da solução de gelificação e do fluxo de ar. Após o desprendimento da agulha, as microcápsulas caem numa solução de polimerização (gelificação) composta por íons divalentes, como por exemplo, BaCl2 ou CaCl2, preferencialmente BaCl2, além de ser tamponada com ácido 4- (2-hidroxietil) -1- piperazineetanosulfônico - HEPES em pH 7.4. É importante observar que a gelificação é realizada em condições fisiológicas, não causando efeitos nocivos para as células. Quando entra em contato com a solução de gelificação, o biomaterial, passa do estado solúvel para o estado gelifiçado. A laminina e o sulfato de condroitina, que estão contidos no biomaterial, permanecem ancorados nas redes de alginato-ions, ajudando a fechar a malha formada e formando poros de tamanho adequado.
Ao final do processo, as microcápsulas permanecem na solução por mais 5 minutos. Após esta etapa de incubação, as microcápsulas são rapidamente filtradas. 0 excesso de ions utilizados para a gelificação do biomaterial é retirado, através de lavagens sucessivas das microcápsulas em NaCl 0,15M.
A microcápsula formada ao redor das células é permeável à insulina, glicose, nutrientes e oxigénio e impermeável a moléculas e células do sistema imune, impedindo o contato direto entre o enxerto transplantado e o sistema imune do paciente, em casos de transplante de células ou terapia celular.
Outras aplicações técnicas também podem ser atribuídas a presente invenção como a produção em larga escala de moléculas derivadas de células, tecnologia reprodutiva e cultura de células dependentes de contato com outras células e/ou proteínas, além de outras, como na indústria alimentícia (microencapsulamento de leveduras para a produção de cerveja e microencapsulamento de sementes) e na indústria farmacêutica (microencapsulamento de biofármacos ou quimioterápicos ) .
Os exemplos seguintes são fornecidos com o intuito de ilustrar os principais aspectos da presente invenção. Deve-se ressaltar que, para aqueles que conhecem o estado da técnica, as descrições apresentadas a seguir, utilizadas pelos inventores desta invenção, podem ser consideradas como uma das várias formas pelas quais a invenção pode ser alcançada. É compreendido que mudanças empregadas na invenção podem ser efetivadas, obtendo-se, ainda, resultados iguais ou similares aos descritos no escopo desta invenção. A invenção é adicionalmente explicada por meio dos exemplos a seguir.
Exemplos
EXEMPLO 1: Preparação do biomaterial e da mistura do biomaterial com as células que se deseja microencapsular
0 biopolimero é diluído em solução de NaCl 0,15 mol.L-1, para uma concentração final de alginato de 1,2%. O biopolimero é formado por alginato : sulfato de condroitina na proporção de 4:1 e a laminina-1 é adicionada nessa mistura numa concentração final de 10 g.mL-1. A suspensão celular deve ser homogeneizada com cuidado e rapidez na solução de biopolímero-NaCl . A solução de gelificação é Cloreto de Bário 0,02 mol.L"1, acrescidas de HEPES 20 mmol . L"1 (Sigma), pH=7,2.
EXEMPLO 2: Confecção das microcápsulas e parâmetros utilizados para se obter uma microcápsula de tamanho, forma e estabilidade ideais.
São utilizadas 10.000 ilhotas por mL Alginato- Sulfato de Condroitina-Laminina ou 1,5 x IO6 células.mL-1 de biopolimero. As cápsulas foram obtidas pela extrusão da solução do biomaterial contendo ilhotas (ou células) através de uma microagulha com um fluxo de 19,9 mL.h-1, controlado por uma bomba de seringa (SP 500 J S do Brasil, Campinas, SP) . Através da aplicação de um fluxo de ar (ar comprimido medicinal, Air Products Brasil, LTDA) de 2,2 L.min"*1 ao redor da agulha. Após o desprendimento da agulha as microcápsulas caem numa solução de polimerização (gelificação) composta por BaCl2. Com o fluxo acima determinado, obtém-se microcápsulas com aproximadamente 700-800 μπι de diâmetro.
A distância entre a ponta da agulha e a solução de gelificação foi ajustada para 7,5 cm. Ao final do processo, as microcápsulas permanecem na solução por mais 5 minutos. Após esta etapa de incubação, as microcápsulas são rapidamente filtradas e lavadas com NaCl 0,15 mol.L-1.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. COMPOSIÇÃO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS caracterizada por consistir de alginato, pelo menos um componente glicosaminoglicano e pelo menos um
5 componente da matriz extracelular.
2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo componente glicosaminoglicano ser sulfato de condroitina.
3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, LO caracterizada pelo componente da matriz extracelular ser um ou mais dentre elastina, entactina-1, fibrilina, fibronectina, fibrina, fibrinogênio, fibroglicano, fibromodulina, fibulina, glipican, vitronectina, laminina, nidogen, matrilina, perlecana, heparina, heparan sulfato,
L5 proteoglicanos do heparan sulfato, decorina, filagrina, queratina, sindecano, agrina, integrinas, agrecano, biglicano, hialuronan, proteínas ligadoras do hialuronan, serglicina, tenascina, nidogênio, condronectina, trombospondina, versicana, hb-gam, dermatan sulfato, 0 queratan sulfato, Colágenos (incluindo tipos IV e XVIII), colágenos fibrilares (incluindo tipos I, II, III, V e XI), colágenos FACIT (tipos IX, XII, XIV) , outros colágenos (tipos VI, VII, XIII), colágenos de cadeia curta (tipos VIII, X) , sulfato de condroitina (incluindo tipos a, c, d,
15 e) , lumican e domínios, cadeias, fragmentos, mutantes ou análogos dos mesmos.
4. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2 , caracterizada pela proporção de alginato: sulfato de condroitina ser cerca de 4:1
30 5. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 3, caracterizada pelo fato de que laminina está presente numa concentração final de cerca de 10 pg.rnL"1.
6. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelas células serem selecionadas de uma ou mais dentre células tronco, células musculares, células pancreáticas, condrócitos, células hepáticas, células do sistema nervoso central, células do córtex renal, células endoteliais vasculares, células da pele, células tireoidianas e paratireoidianas, células adrenais, células timicas, células ovarianas, células de linhagem germinativa, embriões ou células que incluem material genético recombinante .
7. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 1,5 x IO6 células .mL-1 da composição biopolimérica .
8. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de (a) misturar alginato em concentração de cerca de 1,2% com um componente glicosaminoglicano, na proporção de cerca de 4:1; (b) adicionar um componente da matriz extracelular numa concentração final de cerca de 10 μg.mL-1 e (c) promover a polimerização utilizando-se cátions divalentes .
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os cátions divalentes são selecionados de ions cálcio ou bário.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que são adicionadas cerca de 1,5 x IO6 células .mL-1 de composição.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelas células serem selecionadas de uma ou mais dentre células tronco, células musculares, células pancreáticas, condrócitos, células hepáticas, células do sistema nervoso central, células do córtex renal, células endoteliais vasculares, células da pele, células tireoidianas e paratireoidianas, células adrenais, células tímicas, células ovarianas, células de linhagem germinativa, embriões ou células que incluem material genético recombinante .
12. MÉTODO PARA PROMOVER A CITOPROTEÇÃO caracterizado por encapsular células com a composição biopolimérica de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelas células serem selecionadas de uma ou mais dentre células tronco, células musculares, células pancreáticas, condrócitos, células hepáticas, células do sistema nervoso central, células do córtex renal, células endoteliais vasculares, células da pele, células tireoidianas e paratireoidianas, células adrenais, células tímicas, células ovarianas, células de linhagem germinativa, embriões ou células que incluem material genético recombinante .
14. USO DE UMA COMPOSIÇÃO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser na preparação de um medicamento útil no transplante de células.
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