BRPI1008258A2 - composiÇço biopolimÉrica para o encapsulamento de cÉlulas, mÉtodo de produÇço de uma composiÇço biopolimÉrica para o encapsulamento de cÉlulas, mÉtodo para promover a citoproteÇço de cÉlulas e uso de uma composiÇço biopolimÉrica para o encapsulamento de cÉlulas - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇçO BIOPOLIMÉRICA PAPA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, MÉTODO DE PRODUÇçO DE UMA COMPOSIÇçO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, MÉTODO PAPA PROMOVER A CITOPROTEÇçO DE CÉLULAS E USO DE UMA COMPOSIÇçO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS. A presente invenção refere-se a uma composição biopolimérica para o encapsulainento de células à base de alginato, pelo menos um componente glicosaminoglicano, preferencialmente o sulfato de condroitina, e pelo menos um componente da matriz extracelular, preferencialmente a laminina, bem como seu processo de produção. Além disso, são revelados um método para promover a citoproteção que utiliza a referida composição e o uso desta composição na preparação de um medicamento útil no transplante de células.

Description

COMPOSIÇÃO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, MÉTODO PARA PROMOVER A CITOPROTEÇÃO DE CÉLULAS E USO DE UMA COMPOSIÇÃO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS

Campo da Invenção A presente invenção situa-se no campo da biotecnologia e diz respeito a uma composição biopolimérica para o encapsulamento de células, seu processo de preparação, assim como um método para promover a citoproteção e o uso de uma composição biopolimérica na preparação de um medicamento útil no transplante de células.

Antecedentes da Invenção A busca da imunoproteção de células (citoproteção) transplantadas iniciou-se em 19 64, quando a idéia de envolver células com membranas ultrafinas de polímeros foi proposta, o que introduziu na literatura cientifica os termos "células artificiais" e "bioencapsulamento" (Chang TM. 1964. Sèmipermeable microcapsules. Science 14 6:524-525). O bioencapsulamento consiste numa barreira imunoprotetora para as células e o princípio metodológico visa revestir células e/ou grupamentos celulares com uma membrana artificial, semipermeável, que preserve a integridade morfológica e funcional (Calafiore R, Basta G. 1995. Microencapsulation of pancreatic islets: theoretical principies, technologies and practice. Ricordi C, editor. Austin: R G Landes Company. 12 p) .

O processo de encapsulamento de células deve mantê-las viáveis e protegidas dentro de uma membrana permeável a nutrientes, Ionsf oxigênio e outros compostos necessários á manutenção das funções metabólicas, porém impermeável às bactérias, aos linfócitos e às macromoléculas responsáveis pelas reações imunológicas e inflamatórias, que resultam na rejeição do implante. Existe na literatura um vasto número de trabalhos que relatam o uso do encapsulamento para a imunoproteção das células transplantadas (Calafiore R. 1997. Perspectives in pancreatic and islet cell transplantation for the therapy of IDDM. Diabetes Care 20 (5) :889-896; Korbutt GS, Mallett AG, Ao Z, Flashner M, Rajotte RV. 2004. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia 47 (10) :1810-1818; de Vos P, van Hoogmoed CG, van Zanten J, Netter S, Strubbe JH, Busscher HJ. 2003. Long- term biocompatibility, chemistry, and function of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials 24(2) :305- 312; Campo s-Lisboa, A.C.V. 2009. Obtention of human pancreatic islets for transplantation through an ihcrease in cell mass and an immunoisolation with biocompatible microcapsules. 121p. PhD Thesis - Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo; Cornolti R, Cattaneo I, Trudu M, Figliuzzi M, Remuzzi A. 2009. Effect of Islet Transplantation on Metabolic Glucose Control in Rats with Diabetes. Diabetes Technology and Therapeutics 11 (12) ;

Os materiais utilizados para o microencapsulamento apresentam composição variável. Dois tipos principais de materiais já foram estudados: polímeros termoplásticos e polímeros de hidrogel.

Dentre os polímeros termoplásticos estudados estão os poli (hidroximetil-acrilato-metilmetacrilato) (HEMA-MMA) , copolímeros de acrilonitrila (AN69) e polietilenoglicol (PEG) , os quais apresentam vantagens quanto à estabilidade da cápsula após o implante. Entretanto, o uso de solventes orgânicos, necessários para a sua solubilização, interfere de sobremaneira na função celular (de Vos P, Hamel AF, Tatarkiewicz Κ. 2002. Considerations for successful transplantation of encapsulated pancreatic islets. Diabetologia 45 (2) :159-173) .

Dentre os hidrogéis estudados, como alginato, quitosana e agarose, o material que melhor se enquadra' aos padrões necessários a um biomaterial ideal é o alginato, um polissacarideo encontrado tanto na matriz intercelular de algas marrons quanto recobrindo, extracelularmente, algumas espécies de bactérias. Os alginatos são polímeros lineares não ramificados que contêm os resíduos de ácido 1,4-β-ϋ- manurônico (M) e ácido 1,4-a-L-gulurônicos (G). Esses resíduos estão interligados, em blocos de homopolímeros de M (M-M-M) , homopolímeros de G (G-G-G) e heteropolímeros MG, podendo ser alternados. (M.-G-M-G) ou não. Tanto a proporção como a distribuição desses dois monômeros diferem segundo a fonte do alginato e determinam importantes propriedades físico-químicas para sua aplicação (Moe ST, Draget Kl, Skja k-Brnk G, Smidsrüd O. 1995. Alginates., Stephen AM ed. New York: M Dekker. 245-286).

Entre os hidrogéis, o alginato detém as maiores vantagens, uma vez que: a) não interfere na função das células (de Haan BJ, Faas MM, de Vos P. 2003. Factors influencing insulin secretion from encapsulated islets. Cell transplantation 12(6):617-625), b) a confecção das cápsulas ocorre em condições fisiológicas (temperatura ambiente, pH fisiológico e soluções isotônicas) e c) permanece estável por anos em pequenos e grandes animais, incluindo o ser humano (Soon-Shiong P, Heintz RE, Merideth N, Yao QX, Yao Z, Zheng T, Murphy M, Moloney MK, Schmehl M, Harris M, et al. 1994. Insulin independence in a type 1 diabetic patient after encapsulated islet transplantation. Lancet 343 (8903) :950-951) . Além disso, este material apresenta duas características que são altamente desejáveis para a biocompatibilidade de uma membrana: hidrofilia e maleabilidade. A hidrofilicilidade permite que a tensão superficial entre os fluidos e os tecidos adjacentes seja mínima, reduzindo a adsorção de proteínas e adesão celular ao biomaterial, o que é indesejável ao microencapsulamento por restringir- a difusão de oxigênio e nutrientes. Já a maleabilidade dos hidrogéis amortiza os eventos de irritação mecânica aos tecidos adjacentes (de Vos P, Hamel AF, Tatarkiewicz K. 2002. Considerations for successful transplantation of encapsulated pancreatic islets. Diabetologia 45(2):159-173). Além disso, o alginato passa do estado solúvel para o estado gelificado em condições fisiológicas não prejudiciais às células encapsuladas.

Microcápsulas de alginato são prepar_acLcLS pela extrusão da .mistura de células suspensas em uma solução dl alginato de sódio através de um aparelho gerador de gotas (bomba de infusão). Microgotas são coletadas numa solução de ions divalentes, como cálcio ou bário, tornando-se microesferas de gel contendo células em seu interior.

Os íons divalentes, presentes na solução de gelificação, estabelecem ligações iônicas com as carboxilas presentes nos blocos G (homopolímeros G-G-G) e nos blocos alternados MG (MG-MG ou MG-GG) levando à formação de estruturas denominadas "caixas de ovos" (Donati I, Holtan S, Morch YA, Borgogna M, Dentini M, Skjak-Braek G. 2 005. New hypothesis on the role of alternating sequences in calcium- alginate gels. Biomacromolecules 6(2) :1031-1040) e à formação de microcápsulas.

A técnica de microencapsulamento celular, util izando diferentes tipos de biopolímeros, tem sido testada (Soon-Shiong P, Heintz RE, Merideth N, Yao QX, Yao Z, Zheng T, Murphy M, Moloney MK, Schmehl M, Harris M, et al. 1994. Insulin independence in a type 1 diabetic patient after encapsulated islet transplantation. Lancet 343 (8903) : 950-951; Calafiore R, Basta G, Luca G, Lemmi A, Montanucci MP, Calabrese G, Raeanieehi L, Maneuso F, Brunetti P. 2006. Microencapsulated pancreatic islet allografts into nonimmunosuppressed patients with type 1 diabetes: first two cases. Diabetes Care 29 (1) :137-138; Elliott RB, Eseobar L, Tan PL, Muzina M, Zwain S, Buehanan C. 2007. Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation. Xenotransplantation 14 (2) :157-161) e aplicada em ensaios clínicos em humanos para o Diabetes Mellitus Tipo 1 (www.reneuron.com; www.lctglobal.com e www.novocell.com) e para diferentes outras doenças (Murua A, Portero A, Orive G, Hernández RM, Castro M, Pedraz JL. Cell microencapsuXatio-n technology: Towards clinicai application, 2008): anemias (Koo J, Chang TM. 1993. Secretion of erythropoietin from mi cr oencapsulated rat kidney cells: preliminary results. The International Journal of Artificial Organs 16 (7) :557-560), nãnismo (Chang PL, Shen N, Westcott AJ. 1993. Delivery of recombinant gene products with microencapsulated cells in vivo. Human Gene Therapy 4 (4) : 433-440), hemofilia B (Hortelano G, Al-Hendy A, Ofosu FA, Chang PL. 1996. Delivery of human factor IX in mice by encapsulated recombinant myoblasts: a novel approach towards allogeneic gene therapy of hemophilia B. Blood 87(12):5095-5103), nefropatias (Cieslinski DA, David Humes H. 1994. Tissue engineering of a bioartificial kidney. Biotechnology and bioengineering 43 (7) : 678-681; Prakash S, Chang TM. 1996. Microencapsulated genetically engineered Iive E. coli DH5 cells administered orally to maintain normal plasma urea levei in uremic rats. Nature Medicine 2 (8) : 883-887), hepatopatias (Wong H, Chang TM. 1986. Bioartificial liver: implanted artificial cells microencapsulated living hepatocytes increases survival of liver failure rats. The International Journal of Artificial Organs 9 (5) :335-336), insuficiências hipofisária (Aebischer et al., 1986) e do sistema nervoso central (Aebischer P, Panol G, Galletti PM. 1986. An intraperitoneal receptacle for macroencapsulated endocrine tissue. ASAIO

Transactions/American Society for Artificial Internai Organs 32 (1) : 130-133), al ém de outras enfermidades, como câncer (Xu W, Liu L, Charles IG. 2002. Microencapsulated iNOS- expressing cells cause tumor suppression in mice. Faseb J 16(2):213-215).

Componentes da matriz extracelular, como a laminina, podem ser utilizados para promover a mimetização da matriz extracelular em microcápsulas. 0 contato das células microencapsuladas com elementos de matriz extracelular garante a diSponrbilidade de um microambiente mais adequado para a viabilidade e funcionalidade do enxerto, diminuindo processos de estresse e morte celular, caso este seja utilizado como terapia para doenças.

Estudos mostram a ação benéfica de laminina e de outros elementos da matriz extracelular em associação com outros tipos de biopolimeros, principalmente

fotopolimerizáveis, diferentes daquele utilizado na presente invenção: já foi testada a adição de laminina ao polietilenoglicol (PEG), seguida do microencapsulamento de ilhotas pancreáticas e células beta MIN-6 de insulinoma murino, mostrando que a presença desse elemento de matriz extracelular promove uma melhora na função das células (Weber LM, Anseth KS. 2008. Hydrogel encapsulation environments functionalized with extracellular matrix interactions increase islet insulin secretion. Matrix Biology 27 (8) :667-673; Weber LM, Hayda KN, Anseth KS. 2008. Cell-Matrix Interactions Improve b-Cell Survival and Insulin Secretion in Three-Dimensional Culture. Tissue Engineering: Part Α. 14 (12):1959-1968) .

O efeito da adição de laminina ao alginato puro recoberto coni po 1 i—L-1 i s ina seguido do microencapsulamento de mioblastos também já é conhecido (Li AA, MacDonald NC, Chang PL. 2003. Effect of growth factors and extracellular matrix materiais on the proliferation and differentiation of microencapsulated myoblasts. J. Biomater. Sei. Polymer Edn 14 (6) : 533-549) . Esse trabalho mostra o aumento da proliferação das células em questão.

A laminina I também teve efeitos benéficos guando adicionada ao meio de cultura de ilhotas pancreáticas humanas em experimento in vitro de cultura aderente em monocamada (Labriola L, Montor WR, Krogh K, Lojudice FH, Genzini T, Goldberg AC, Eliaschewitz FG, Sogayar MC. 2-0 07. Beneficiai effects of prolactin and Iamxnin on human pancreatic islet-cell cultures. Molecular and cellular endocrinology 263(1-2):120-133) e os trabalhos de Weber et ai. (2007 e 2008) apres-entam resultados in vitro da adição de laminina a uma microcápsula confeccionada com um· biomaterial (PEG) diferente daquele utilizado na presente invenção (Weber LM, Hayda KN, Haskins K, Anseth KS. 2007. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell funetion within hydrogels funetionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials 28, 3004- 3011; Weber LM, Anseth KS. 2008. Hydrogel encapsulation environments funetionalized with extracellular matrix interactions increase islet insulin secretion. Matrix Biology 27 ( 8):667-673) .

0 documento de patente W02009/000955 descreve partículas de material polimérico que contém células em seu interior, sendo que tais partículas possuem resistência mecânica aprimorada. Este aumento de resistência é alcançado através da funcionalização do material polimérico que forma a microcápsula com a utilização de peptideo especifico que se liga a proteínas da membrana celular. Contudo, para uma proteção eficiente contra a resposta imune às células encapsuladas e transplantadas, é necessário revestir as microcápsulas com uma membrana externa que feche os poros, como poli-L-lisina. 0 documento de patente W02008/077402 revela microcápsulas que compreendem uma ou mais substâncias ativas embutidas numa matriz com o intuito de proteger estes compostos da exposição ao oxigênio, umidade, irradiação e também contra influências físicas como pressão, degradação física e/ou química, proporcionando a essas substâncias maior durabilidade. Referidas microcápsulas compreendem, ainda, um complexo de alginato/cálcio numa proporção de aproximadamente 0,1-5,0% (p/p). As microcápsulas descritas podem ser utilizadas para a preparação de tabletes e outros produtos que incluem uma substância ativa.

0 documento de patente WO 2007/046719 relata uma composição que compreende alginato de alto teor de ácido mahurônico e um policátion que possui índice de polidispersão menor que 1,5. A composição é particularmente útil para a confecção de microcápsulas que contém células vivas para transplante do tipo alo- ou xenogênico. Tais microcápsulas são ditas superiores no que diz respeito à sua durabilidade e integridade funcional e estrutural, quando comparadas com cápsulas convencionais de alginato. A efetiva imunoproteção é relacionada ao emprego do policátion. Contudo, estudos recentes demonstraram que a presença destes policátions resulta em uma ativação do sistema imune do indivíduo que recebe implante, culminando com a perda da função das células microencapsuladas transplantadas.0 documento de patente W02003/094898 revela materiais biomédicos encapsulados em polímeros de alginato. As cápsulas de alginato são submetidas, num veículo líquido, à presença de iam monômero insaturado de etileno e um iniciador, de forma a induzir a polimerização do monômero insaturado, e, portanto, aumentar a resistência da cápsula. Para apresentar imunoproteção, as microcápsulas precisam de um revestimento com policátions e podem ainda ser tratadas com poli-L-lisina para reduzir sua tendência de induzir uma resposta imune quando implantada em um animal. Para aumentar a resistência das microcápsulas, são empregados ions cálcio, que são perdidos para o meio com facilidade. 0 processo para estabilizar as cápsulas compreende uma série de etapas, envolvendo maior tempo em soluções pouco fisiológicas, além de alterações na temperatura e preção de CO2, que podem levar a uma perda de viabilidade das células, que são bastante sensíveis a estas alterações. 0 documento de patente W0199Í/009119 descreve uma composição que contém material biológico para transplante ou implante, que compreende alginato polimerizado com sal de bário, preferencialmente cloreto de bário. A microcápsula pode apresentar adicionalmente ácido hialurônico e poli-L-lisina. A microcápsula desta invenção é descrita como possuindo carga negativa, o que aumenta a liberação de proteínas e limita a invasão de imunoglobulinas. Tais microcápsulas podem ser utilizadas para o encapsulamento de ilhotas de Langerhans para a produção de insulina. Entretanto, estudos recentes demonstraram que o uso de policátions para o fechamento · dos poros e conseqüente aquisição de imunoproteção provoca uma reação imune indesejável ao redor das microcápsulas, comprometendo a viabilidade e funcionalidade do implante.

Apesar de existir no estado da técnica o relato de amplo número de composições biopoliméricas para conferir certa imunoproteção às células encapsuladas, permanece ainda o desafio de mantê-las viáveis, funcionais e com longevidade duradoura. Esse desafio é conseqüência de uma série de condições deletérias às quais as células são submetidas durante o processo de encapsulamento.

Como principais desvantagens do atual estado da técnica, tem-se a elevada suscetibilidade das células encapsuladas a apoptose e ao estresse celular, devido às condições proporcionadas pelo biomaterial que as reveste. Apesar do uso de policátions como poli-L-lisina na microcápsula resultar em um estreitamento de poro, já foi comprovado que não é possível revestir estes policátions com alginato e que a inevitável exposição destas moléculas na superfície das microcápsulas resulta numa reação inflamatória deletéria às células microencapsuladas (de Vos P, Faas MM, Strand B, Calafiore R. Algina.te-b.as.ed microcapsules for immunoi solation of pancreatic islets. Biomaterials. 2006 Nov;27(32):5603-17) .

Al ém disso, outra desvantagem do estado da técnica, particularmente no que diz respeito ao encapsulamento de grupamentos celulares, como as ilhotas pancreáticas, relaciona-se à reduzida síntese e secreção de insulina, principalmente devido aos mecanismos de apoptose e estresse celular, bem como à utilização de uma grande quantidade de células de ilhotas pancreáticas para tornar as microcápsulas viáveis a um transplante de ilhotas pancreáticas em pacientes diagnosticados com Diabetes. Finalmente, também se detecta como problema a lentidão das microcápsulas convencionais em alcançar normoglicemia após o transplante de células de ilhotas pancreáticas microencapsuladas em paciente diagnosticados com Diabetes.

Assim, permanece a necessidade de composições biopoliméricas que apresentem não só boas propriedades mecânicas, mas também que proporcionem melhora na sobrevida e funcionalidade das células encapsuladas, evitar o uso dos indes ej áveis policátion, θ que possam sei? preparadas por processos menos onerosos.

Descrição das figuras

A Figura 1 apresenta iam experimento realizado com microcápsulas confeccionadas utilizando-se a solução de polimerização contendo ions bário. A condição inicial é dada pela quantidade de ions bário (em ppm) presentes na solução de lavagem das microcápsulas após a produção. Essas microcápsulas foram mantidas em cultura por 2 4h ou por 7 dias, em estufa comum (condição estática) ou mantidas em rotação durante 24h ou 7 dias (condição rotacional) e o sobrenadante (meio de cultura) foi coletado para posterior determinação do conteúdo de bário liberado pelas cápsulas.

A Figura 2 mostra a expressão de gene-s relacionados com apoptose, estresse celular, hipóxia e das duas insulinas de rato em amostras de ilhotas pancreáticas murinas microencapsuladas com Alg-SC ou com Alg-SC-LN e mantidas em cultura em condição de normõxia por 4 8 h. A expressão gênica foi normalizada em relação ao gene hprt, cuja expressão é constitutiva. *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0, 001. Médias de triplicatas biológicas e triplicatas experimentais com cálculo do desvio padrão nas barras em cada uma das condições. Alg-SC: Alginato+Sul f ato de Condroitina; Alg-SC-LN: Alginato+Sulfato de

Condroitina+Laminina.

A Figura 3 apresenta a glicemia de camundongos com Diabetes mellitus do tipo 1 induzido por administração de estreptozotocina, e transplantados com 750 ilhotas pancreáticas murinas microencapsuladas em Alg-SC e Alg-SC- LN. Como controles, foram utilizados animais que receberam apenas ilhotas pancreáticas nuas e animais que receberam cápsulas vazias (sham). O gráfico mostra a média e o erro padrão de cada condição. O tracejado vermelho mostra o limite abaixo do qual os animais são considerados normoglicêmicos. Alg-SC: Alginato+Sulfato de Condroitina; Alg-SC-LN: Alginato+Sulfato de Condroitina+Laminina.

A Figura 4 mostra o teste oral de tolerância à glicose realizado em animais controle ou em animais diabéticos transplantados com ilhotas pancreáticas de rato microencapsuladas com Alg-SC ou Alg-SC-LN ou com ilhotas nuas. Os pontos representam as médias ± SEM. Esse teste foi feito após 2 meses do implante das ilhotas.

A Figura 5 mostra o teste oral de tolerância à glicose realizado em animais controle ou em animais diabéticos transplantados com ilhotas pancreáticas de rato microencapsuladas em Alg-SC ou Alg-SC-LN ou com ilhotas nuas. Os pontos representam as médias ± SEM. Esse _te.s_te foi feito após 150 dias do implante das ilhotas.

Descrição da Invenção 0 conjunto dos fatores deficientes encontrados no estado da técnica para o encapsulamento de cé~lulas levou ao desenvolvimento de uma nova composição biopolimérica para ■ o encapsulamento de células que não só apresenta resistência mecânica aprimorada, mas também melhora a sobrevida e funcionalidade das células encapsuladas, ou seja, apresenta superior biocompatibilidade e estabilidade frente às demais microcápsulas apresentadas na literatura. Esses atributos são alcançados com o emprego de uma combinação especifica de componentes, em quantidades especificas, que dispensam a necessidade do uso dos indesejáveis policátions e evitam métodos complicados de produção.

A presente invenção também está relacionada a um método de produção da referida composição, que por meio de parâmetros especificamente ajustados, garantem a eficiência da composição em menor tempo de produção. Ainda, são objetos da presente invenção um método para promover a citoproteção e o uso da composição biopolimérica desenvolvida para a fabricação de um medicamento para útil no transplante de células.

Encontrou-se nesta nova composição biopolimérica propriedades e benefícios superiores que garantem a função e viabilidade de células microencapsuladas, o que é primordial não apenas para que suas atividades terapêuticas ou profiláticas sejam alcançadas, mas também para que garanta a viabilidade e longevidade máxima de células transplantadas.

Os pesquisadores da presente invenção verificaram que a apoptose e o estresse celular podem ser reduzidos através da adição de elementos da matriz extracelular, como a laminina, em sistemas biopoliméricos baseados em alginato e sulfato de condroitina, de forma a evitar a morte CeLuXar e também promover a proliferação e a viabilidade celulares (Figura 2).

Além disso, os mesmos pesquisadores verificaram qu.e a adição de sulfato de condroitina e laminina à composição do biopolímero de alginato garante o estreitamento dos poros e a proteção das células microencapsuladas de moléculas e células do sistema imune, resolvendo o problema que o microencapsulamento com alginato gelificado com cálcio cria, ao produzir microcápsulas com poros de dimensões maiores. Isso aumenta a resistência das microcápsulas e melhora a sobrevida e funcionalidade das células encapsuladas através de sinais moleculares citoprotetores.

A combinação de alginato, componentes

glicosaminoglicanos, como o sulfato de condroitina, e componentes da matriz extracelular, como a laminina, para a confecção de microcápsulas, que são gelificadas através de solução de cátions divalentes, como os íons bário, apresenta-se como um grande avanço em relação ao atual estado da técnica por agregar propriedades biológicas vantajosas às microcápsulas. Mesmo sendo o bário um composto tóxico para o organismo uma vez estabelecendo ligações iônicas dentro da malha da microcápsula se torna indisponivel para o meio e portanto não apresentando toxicidade ao indivíduo receptor do implante e às próprias células encapsuladas (Figura 1).

0 atual estado da técnica não revela composições biopoliméricas para o encapsulamento de células baseadas em alginato, componentes glicosaminoglicanos e componentes da matriz extracelular. Além disso, não são conhecidos métodos para a promoção da citoproteção que utilizam composições desta natureza, bem como o uso destas composições particulares para a preparação de um medicamento útil no transplante de células

Um dos objetos desta invenção diz respeito a uma composição biopolimérica para o encapsulamento de células baseada em alginato, componentes glicosaminoglicanos, como o sulfato de condroitina, e componentes da matriz extracelular.

Os componentes da matriz extracelular podem ser um ou mais dentre elastina, entactina-1, fibrilina, fibronectina, fibrina, fibrinogênio, fibroglicano,

fibromodulina, fibulina, glipican, vitronectina, laminina, nidogen, matrilina, perlecana, heparina, heparan sulfato, proteoglicanos do heparan sulfato, decorina, filagrina, queratina, sindecano, agrina, integrinas, agrecano, biglicano, hialuronan, proteínas ligadoras do hialuronan, serglicina, tenascina, nidogênio, condronectina,

trombospondina, versicana, hb-gam, dermatan sulfato, queratan sulfato, Colágenos (incluindo tipos IV e XVIII), colágenos fibrilares (incluindo tipos I, II, III, V e XI), colágenos FACIT (tipos IX, XII, XIV) , outros colágenos (tipos VI, VII, XIII), colágenos de cadeia curta (tipos VIII, X), sulfato de condroitina (incluindo tipos a, c, d, e) , lumican e domínios, cadeias, fragmentos, mutantes ou análogos dos mesmos. De maneira particular, o componente da matriz extracelular é a laminina.

Na composição de acordo com a presente invenção a proporção de alginato:sulfato de condroitina é de cerca de 4:1 e laminina está presente numa concentração final de cerca de 10 μg.mL~1.

Outro objeto desta invenção relaciona-se a um método para promover a proteção de células encapsuladas (citoproteção) através da utilização de uma composição biopolimérica baseada em alginato, componentes

glicosaminoglicanos, como a condroitina, e componentes da matriz extracelular,, como a laminina, de acordo com a presente invenção.

Tem-se, ainda, como outro objeto desta invenção, o uso de uma composição biopolimérica baseada em alginato, componentes "glicosaminoglicanos, como a condroitina, e componentes da matriz extracelular, como a laminina, de acordo com a presente invenção, para a preparação de um medicamento útil no transplante de células.

Várias são as vantagens da presente invenção em relação ao estado da técnica, sendo as mesmas pontuadas a seguir:

1) A composição biopolimérica desenvolvida induz modificações importantes na expressão de genes relacionados com a apoptose. O gene da caspase efetora 3, que é ativado no final da cascata apoptótica, tem a sua expressão reduzida em células microencapsuladas com a composição biopolimérica desta invenção. Além disso, o gene anti-apoptótico bcl-2, cujo produto é importante para a proteção das células contra os mecanismos de apoptose, tem a sua expressão aumentada em células microencapsuladas com a referida composição (Figura 2) .

2) A composição biopolimérica reivindicada aumenta a razão da expressão dos genes bcl-2 e bax (bcl-2/bax), o

que mostra que o microencapsulamento com essa composição protege células contra a apoptose. Razões aumentadas da expressão de bcl-2/bax e bcl-xL/bax, tanto ao nivel gênico como ao nivel protéico, mostram uma diminuição da suscetibilidade da célula a apoptose (BROWN et al., 2007) (Figura2) .

3) A composição biopolimérica desenvolvida diminui a expressão dos genes mcp-1 e hsp70, ambos relacionados ao estresse celular (Figura 2).

4) A composição biopolimérica desenvolvida, em modelos de . microencapsulamento de células de ilhotas

pancreáticas, aumenta a expressão do gene de insulina 1 de ratos, que pode levar ao aumento do percentual de precursores de células β que se diferenciam em células β maduras. Esta composição também restabelece o contato célula-célula e célula-matriz, que é essencial para a manutenção da viabilidade e funcionalidade celular (Figura 2) .

5) 0 método de encapsulamento de células desenvolvido utiliza um número reduzido de células de

ilhotas pancreáticas necessárias ao transplante celular. Para o atual estado da técnica, o número médio de ilhotas de ratos necessário à reversão do estado diabético de camundongos está em torno de 1.450. Utilizando-se a composição biopolimérica da presente invenção, conseguiu-se manter a normoglicemia em camundongos diabéticos durante 364 dias através de um implante de apenas 750 ilhotas microencapsuladas, o que representa 4 8% menos ilhotas do que

a. 4uaiiLJ.uauc L c-lci lci<-ici nu cSi.auu u.ci Lcuilj-oa \ ι; xy uj. a ~> j . a. qualidade das ilhotas transplantadas foi avaliada ao longo do transplante através de teste oral de tolerância a glicose (TOTG) (Figura 4 e 5). Essa diferença é significativa quando se considera que tal redução pode representar a economia de um pâncreas para o transplante de ilhotas em seres humanos, uma vez que a média das cirurgias realizadas exige ilhotas (encapsuladas ou não encapsuladas) extraídas de dois ou mais pâncreas humanos para que o paciente diabético receptor tenha a sua glicemia normalizada.

6) Em modelo de microencapsulamento de células de ilhotas pancreáticas, a composição biopolimérica desenvolvida nesta invenção obtém normoglicemia após o transplante em um espaço de tempo mais curto em relação ao atual estado da técnica. A presença de componentes da matriz extracelular, como a laminiria, na composição desta invenção, reduz em até 4 dias o alcance da normoglicemia após o transplante. Na clínica, isto pode significar menor número de dias. de internação devido a uma recuperação mais rápida do paciente (Figura 3).

As formas alternativas e modificações dentro do escopo da presente invenção se tornarão facilmente detectáveis por alguém conhecedor do estado da técnica a partir da leitura das especificações a seguir e das referências de suporte apresentadas.

0 método de produção da composição biopolimérica consiste na mistura em proporções ideais do alginato com pelo menos um componente glicosaminoglicano,

preferencialmente o sulfato de condroitina, juntamente com pelo menos um componente da matriz extracelular, preferencialmente a laminina.

Essa mistura é feita no momento do microencapsulamento, assim como a mistura do biomaterial com as células. Essa última mistura deve ser realizada da forma mais rápida possível, pois o contato direto e demorado do biomaterial não gelificado com as células pode causar efeitos danosos para a viabilidade e funcionalidade destas. Este procedimento deve ser realizado apenas quando toda a aparelhagem de microencapsulamento estiver preparada para a confecção das microcápsulas. As células devem ser sedimentadas, por centrifugação, e cuidadosamente homogeneizadas no biomaterial, adicionando-se esta mistura a uma seringa, a qual é acoplada ao aparelho que produz as microcápsulas.

0 encapsulamento de células poderá ser direcionado a células tronco, células musculares, células pancreáticas, condrócitos, células hepáticas, células do sistema nervoso central, células do córtex renal, células endoteliais vasculares, células da pele, células tireoidianas e paratireoidianas, células adrenais, células tímicas, células ovarianas, células de linhagem germinativa, embriões ou células que incluem material genético recombinante.

Para a confecção das microcápsulas, utiliza-se uma bomba de seringa para expulsar a mistura do biopolímero com as células. Através da aplicação de um fluxo de ar coaxial ao redor da agulha, é possível desprender a gota no momento desejado, sendo possível, portanto, controlar o tamanho das microcápsulas. A distância entre a ponta da agulha e a solução de gelificação é ajustada para que as microcápsulas atinjam delicadamente o fundo do recipiente onde são depositadas, evitando assim choques mecânicos que podem causar deformações. A altura entre a ponta da agulha de onde sai o biomaterial contendo as células e a solução de gelificação poderá estar entre 5 e 10 cm. O fluxo do biomaterial contendo as células pode ser expulso através da agulha com fluxo variando entre 15 e 30 mL.h-1. O fluxo de ar comprimido coaxial pode variar entre 2.0 e 2.5 L.min-1, podendo gerar microcápsulas ainda consideradas ideais entre 500 e 1000 pm.

O diâmetro das microcápsulas é dependente do ion utilizado para a gelificação, da concentração da solução de gelificação e do fluxo de ar. Após o desprendimento da agulha, as microcápsulas caem numa solução de polimerização (gelificação) composta por ions divalentes, como por exemplo, BaCl2 ou CaCl2, preferencialmente BaCl2, além de ser tamponada com ácido 4-(2-hidroxietil)-1-

piperazineetanosulfônico - HEPES em pH 7.4.

É importante observar que a gelificação é realizada em condições fisiológicas, não causando efeitos nocivos para as células. Quando entra em contato com a solução de gelificação, o biomaterial, passa do estado solúvel para o estado gelif .içado. A laminina e o sulf ato de condroitina, que estão contidos no biomaterial, permanecem ancorados nas redes de alginato-ions, ajudando a fechar a malha formada e formando poros de tamanho adequado.

Ao final do processo, as microcápsulas permanecem na solução por mais 5 minutos. Após esta etapa de incubação, as microcápsulas são rapidamente filtradas. 0 excesso de ions utilizados para a gelificação do biomaterial é retirado, através de lavagens sucessivas das microcápsulas em NaCl 0,15M.

A microcápsula formada ao redor das células é permeável à insulina, glicose, nutrientes e oxigênio e impermeável a moléculas e células do sistema imune, impedindo o contato direto entre o enxerto transplantado e o sistema imune do paciente, em casos de transplante de células ou terapia celular.

Outras aplicações técnicas também podem ser atribuídas a presente invenção como a produção em larga escala de moléculas derivadas de células, tecnologia reprodutiva e cultura de células dependentes de contato com outras células e/ou proteínas, além de outras, como na indústria alimentícia (microencapsulamento de leveduras para a produção de cerveja e microencapsulamento de sementes) e na indústria farmacêutica (microencapsulamento de biofármacos ou quimioterápicos).

Os exemplos seguintes são fornecidos com o intuito de ilustrar os principais aspectos da presente invenção. Deve-se ressaltar que, para aqueles que conhecem o estado da técnica, as descrições apresentadas a seguir, utilizadas pelos inventores desta invenção, podem ser consideradas como uma das várias formas pelas quais a invenção pode ser alcançada. É compreendido que mudanças empregadas na invenção podem ser efetivadas, obtendo-se, ainda, rjas-uJ-tado-s iguais ou similares aos descritos no escopo desta invenção. A invenção é adicionalmente explicada por meio dos exemplos a seguir.

Exemplos

EXEMPLO 1: Preparação do biomaterial e da mistura do biomaterial com as células que se deseja microencapsular

0 biopolímero é diluído em solução de NaCl 0,15 mol.L-1, para uma concentração final de alginato de 1,2%. 0 biopolímero é formado por alginato:sulfato de condroitina na proporção de 4:1 e a laminina-1 é adicionada nessa mistura numa concentração final de 10 μg.mL-1. A suspensão celular deve ser homogeneizada com cuidado e rapidez na solução de biopolímero-NaCl. A solução de gelificação é Cloreto de Bário 0,02 mol.L-1, acrescidas de HEPES 20 mmol.L-1 (Sigma), pH=7,2.

EXEMPLO 2: Confecção das microcápsulas e parâmetros utilizados para se obter uma microcápsula de tamanho, forma e estabilidade ideais.

São utilizadas 10.000 ilhotas por mL Alginato- Sulfato de Condroitina-Laminina ou 1,5 χ IO6 células.mL_1 de biopolimero. As cápsulas foram obtidas pela extrusão da solução do biomaterial contendo ilhotas (ou células) através de uma microagulha com um fluxo de 19,9 mL.h-1, controlado por uma bomba de seringa (SP 500 JMS do Brasil, Campinas, SP) . Através da aplicação de um fluxo de ar (ar comprimido medicinal, Air Products Brasil, LTDA) de 2,2 L.min"1 ao redor da agulha. Após o desprendimento da agulha as microcápsulas caem numa solução de polimerização (gelificação) composta por BaCl2. Com o fluxo acima determinado, obtém-se microcápsulas com aproximadamente 700-800 pm de diâmetro.

A distância entre a ponta da agulha e a solução de gelificação foi ajustada para 7,5 cm. Ao final do processo, as microcápsulas permanecem na solução por mais 5 minutas. Após esta etapa de incubação, as microcápsulas são rapidamente filtradas e lavadas com NaCl 0,15 mol.L-1.

Claims (14)

1. COMPOSIÇÃO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS caracterizada por consistir de alginato, pelo menos um componente glicosaminoglicano e pelo menos um componente da matriz extracelular.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo componente glicosaminoglicano ser sulfato de condroitina.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo componente da matriz extracelular ser um ou mais dentre elastina, entactina-1, fibrilina, fibronectina, fibrina, fibrinogênio, fibroglicano, fibromodulina, fibulina, glipican, vitronectina, laminina, nidogen, matrilina, perlecana, heparina, heparan sjuLfa-to-, proteoglicanos do heparan sulfa±o, decorina, CiIagrina, queratma, sindecano, agrina, integrinas, agrecano, biglicano, hialuronan, proteínas ligadoras do hialuronan, serglicina, tenascina, nidogênio, condronectina, trombospondina, versicana, tib-gam, dermatan sulfato, queratan sulfato, Colágenos (incluindo tipos IV e XVIII), colágenos fibrilares (incluindo tipos I, II, III, V e XI) , colágenos FACIT (tipos IX, XII, XIV), outros colágenos (tipos VI, VII, XIII), colágenos de cadeia curta (tipos VIII, X) , sulfato de condroitina (incluindo tipos a, c, d, e) , lumican e domínios, cadeias, fragmentos, mutantes ou análogos dos mesmos.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2 , caracterizada pela proporção de alginato:sulfato de condroitina ser cerca de 4:1

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 3, caracterizada pelo fato de que laminina está presente numa concentração final de cerca de 10 pg.mL-1.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelas células serem selecionadas de uma ou mais dentre células tronco, células musculares, células pancreáticas, condrócitos, células hepáticas, células do sistema nervoso central, células do córtex renal, células endoteliais vasculares, células da pele, células tireoidianas e paratireoidianas, células adrenais, células timicas, células ovarianas, células de linhagem germinativa, embriões ou células que incluem material genético recombinante.

7. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende cerca de 1,5 χ IO6 células .mL-1 da composição biopolimérica .

8. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de (a) misturar alginato em concentração de cerca de 1,2% com um componente glicosaminog-lic-ano, na proporção de cerca de. 4:1,; (b) adicionar um componente da matriz extracelular numa concentração final de cerca de 10 μg.mL~1 e. (c) promover a polimerização utilizando-se cátions divalentes.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os cátions divalentes são selecionados de ions cálcio ou bário.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que são adicionadas cerca de 1,5 χ IO6 células.mL-1 de composição.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelas células serem selecionadas de uma ou mais dentre células tronco, células musculares, células pancreáticas, condrócitos, células hepáticas, células do sistema nervoso central, células do córtex renal, células endoteliais vasculares, células da pele, células tireoidianas e paratireoidianas, células adrenais, células tímicas, células ovarianas, células de linhagem germinativa, embriões ou células que incluem material genético recombinante.

12. MÉTODO PARA PROMOVER A CITOPROTEÇÃO caracterizado por encapsular células com a composição biopolimérica de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7.

13.

MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelas células serem selecionadas de uma ou mais dentre células tronco, células musculares, células pancreáticas, condrócitos, células hepáticas, células do sistema nervoso central, células do córtex renal, células endoteliais vasculares, células da pele,- células tireoidianas e paratireoidianas, células adrenais, células tímicas, células ovarianas, células de linhagem germinativa, embriões ou células - que incluem. material genético recombinante. 14. USO DE UMA COMPOSIÇÃO BIOPOLIMÉRICA PARA O ENCAPSULAMENTO DE CÉLULAS, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser na preparação de um medicamento útil no transplante de células.