CN1320032A - 用于治疗脑肿瘤的藻酸盐包囊 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包囊的生产细胞,该细胞能表达CNS肿瘤生长抑制剂分子,提供了肿瘤,例如位于中枢神经系统内的脑肿瘤的新治疗方法。

Description

用于治疗脑肿瘤的藻酸盐包囊
本发明涉及肿瘤治疗领域，所述肿瘤位于中枢神经系统(CNS)内部并且是原发性或继发性(转移性)的恶性脑-脊髓肿瘤，本发明提供了该治疗方案中使用的新的组合物和给药系统。
与其它转移性肿瘤相比，原发性脑部治疗(神经胶质瘤)具有数种独特的生物学性质。它们局限于中枢神经系统，几乎不存在扩散到其它器官的转移性。即使这些肿瘤对脑表现出高度入侵性，治疗后在其原发部位仍具有复发的倾向。肿瘤是高度异质的，它们由多种不同表型性质类型的细胞组成。
目前选择的治疗方案是进行手术，然后进行放疗和化疗。大多数恶性脑肿瘤(恶性胶质瘤)患者诊断后预测的存活期大约为10个月。因此对这些肿瘤患者，急需一种新的治疗方案。由于肿瘤在其原发部位具有复发的倾向，因此需要新的局部治疗方案。另外，由于这些肿瘤由多种不同表型性质类型的细胞组成，因此选择不同的治疗方案应能靶向不同类型的肿瘤细胞。
位于中枢神经系统内的、通常难以成功治疗的其它肿瘤包括由星形神经胶质细胞和少突神经胶质细胞衍生的肿瘤，例如：星形细胞瘤
-低级星形细胞瘤(1级和2级星形细胞瘤)
-间变星形细胞瘤(3级星形细胞瘤)
-多形性成胶质细胞瘤(4级星形细胞瘤)
-包括继发性成胶质细胞瘤，即由较低级星形细胞瘤分化的肿瘤
-原发性成胶质细胞瘤，即重新以原发性成胶质细胞瘤形式出现的肿瘤
-巨细胞性成胶质细胞瘤
-神经胶质肉瘤
-脑神经胶质瘤病少突神经胶质细胞瘤
-包括少突神经胶质细胞瘤(WHO Ⅱ级)
-间变少突神经胶质细胞瘤(WOH Ⅲ级)混合性神经胶质瘤
-少突星形细胞瘤(WHO Ⅱ级)
-间变少突星形细胞瘤(WHO Ⅲ级)室管膜瘤
-室管膜细胞瘤(WHO Ⅱ级)
-间变室管膜细胞瘤(WHO Ⅲ级)
-室管膜下细胞瘤(WHO Ⅰ级)胚胎性瘤
-中枢成神经细胞瘤
-成室管膜细胞瘤
-成神经管细胞瘤
-幕上PNETs成神经细胞瘤
-成嗅神经细胞瘤
-肾上腺和交感神经系统的成神经细胞瘤
对于这些肿瘤中的大部分，首选治疗方案是进行手术，然后进行放疗和/或化疗。然而，通过外科手术通常难以完全除去肿瘤，同时接下来的放疗和化疗有时由于抗放射性和/或给予治疗剂量的细胞毒性药物存在困难也不能完全成功。
最近几年，很多人关注着基因治疗，尝试了通过下调致癌基因的表达或者插入正常肿瘤抑制基因来逆转恶性表型。也有人引入通过免疫系统用于促进肿瘤识别和排斥的免疫刺激因子，例如细胞因子。另外，也曾对细胞进行修饰以使其对肿瘤细胞直接释放基因产物，增强了它们对药物的敏感性。描述这些进展的论文包括：(Ⅰ)当代肿瘤学观点(Curr Opi Oncol),7,(1995),第94-100页；(ⅱ)当代生物技术观点(Curr Opin Biotechnol),5,(1994),第611-616页；(ⅲ)癌症研究(Cancer Res),53,(1993),第2330-7页；(ⅳ)人类基因治疗(Hum Gene Ther),4,(1993)，第451-60页；(ⅴ)人类基因治疗(Hum Gene Ther),5,(1994),第153-164页；和(ⅵ)药学趋势(Trends Pharmacol.Sci),14,(1993)，第202-208页。
尽管近几年进行了这些广泛的研究，但仍存在着妨碍恶性脑肿瘤的实验研究向临床治疗过渡的主要障碍。一个问题是在颅内植入后，防止基因修饰的细胞的免疫排斥反应。这一问题可通过包囊生产细胞克服。
然而，为寻找特别适用于脑的材料，又带来了其它问题。虽然，在免疫学上脑不同于机体的其它区域，例如它不存在B淋巴细胞，但它对生物活性化合物，例如内毒素的影响特别敏感。
根据本发明，我们发现免疫隔离性(immuno-isolating)藻酸盐基质特别适于在CNS肿瘤的治疗中包囊用于颅内植入的生产细胞。微球形式的免疫隔离性藻酸盐基质是特别优选的。
因此，从广义上说，本发明提供了包囊的能表达CNS肿瘤生长抑制剂分子的生产细胞，该生产细胞被包囊于免疫隔离性藻酸盐基质中。这类分子优选是肽、蛋白质或多糖，最优选是单克隆抗体。
本发明还提供一种治疗CNS肿瘤的方法，该方法包括在肿瘤部位植入包囊的生产细胞，所述生产细胞能表达所述肿瘤生长抑制剂分子。
再者，本发明提供了一种制备治疗CNS肿瘤的药物的方法，该方法包括将生产细胞包囊在免疫隔离性藻酸盐基质内，所述生产细胞能表达所述肿瘤生长抑制剂分子。
本发明还提供免疫隔离性藻酸盐基质在CNS肿瘤的肿瘤中用于包囊颅内植入用生产细胞的用途。
在本发明的实施方案中，本发明使用的生产细胞包括产生例如蛋白质、肽和多糖分子的基因工程化的细胞，所述分子直接相互作用于肿瘤细胞或者间接相互作用于肿瘤或宿主细胞通讯途径。本发明可用的其它生产细胞是产生单克隆抗体的专门化细胞，例如杂交瘤细胞，或者甚至是自然存在的能表达肿瘤抑制分子的细胞。
众所周知，肿瘤生长依赖于通过特异性生长因子介导的特定细胞与宿主间的作用，特异性生长因子以相当复杂的方式调节肿瘤细胞生长。在此，肿瘤依赖于宿主提供的通过新形成的血管输送的营养物质。近几年，已识别了数种肿瘤/宿主细胞作用途径，它们已被记载于文献中。
因此，本发明使用的一类生产细胞是能表达蛋白质或肽的生产细胞，所述蛋白质或肽将作用于肿瘤/宿主通讯途径。例如，有用的生产细胞包括产生影响肿瘤新血管形成的蛋白质和肽，例如血小板反应蛋白、内皮他丁(endostatin)、制管张素(angiostatin)和催乳素；干扰肿瘤细胞与胞外基质关系的蛋白质，例如蛋白酶抑制剂，如金属蛋白酶组织抑制剂；和影响免疫系统包括各类白介素的蛋白和肽。
另一类优选的生产细胞包括表达直接作用于肿瘤细胞本身的蛋白质或肽的那些。例如这类有用的生产细胞包括：产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体是直接作用于肿瘤受体，例如影响肿瘤细胞的细胞生长因子受体，如表皮生长因子受体(EGFr)、血小板衍生的生长因子受体AA和BB、酸性和碱性成纤维细胞生长因子受体、α-和β转化生长因子受体、不同类型的血管内皮生长因子受体(VEGFR-1和VEGFR-2)、具有免疫球蛋白和EGF-样结构域，如TIE-1和TIE-2/tek的酪氨酸激酶受体，肝细胞生长因子(分散因子)的；或者是直接对抗各类整联蛋白受体的单克隆抗体；直接对抗CD-44的单克隆抗体；直接对抗CDR/细胞周期蛋白复合物的单克隆抗体；直接对抗FAS的单克隆抗体；直接对抗细胞表面糖脂的单克隆抗体；直接对抗糖蛋白的单克隆抗体；和直接对抗由特异性致癌基因表达得到的蛋白质的单克隆抗体。
在某些情况下，特别引人注意的是可通过药理学手段启动或停止产生肿瘤生长抑制物质的生产细胞，例如可通过药理学诱导的基因表达，如四环素激活的基因表达的生产细胞。
可转染的任何细胞系均可用于本发明。细胞系应是永久的，即能进行无限细胞分裂的，并优选是非人的和非致瘤性的。
由美国典型培养物保藏中心，10350 Linden Lake Plaze,Manassas,Virginia 20109,USA自由出售的这类细胞系的例子是：细胞系    ATCC号      描述H528      HB 8509     小鼠B细胞骨髓瘤293       CRL 1573    人转化的初生胚胎肾NIH/3T3   CRL 1658    NIH瑞士小鼠，胚胎COS-7     CRL 1651    非洲绿猴，肾，SV40转化BHK-21    CCL 10      仓鼠肾，正常CV-1      CCL 70      非洲绿猴，肾，正常CHP-234   CRL-2272    成神经细胞瘤，脑，人Rat2      CRL-1764    胚胎，胸腺嘧啶核苷激酶突变
                  体，大鼠Namalwa   CL-1432     Burkitt淋巴瘤，人
根据本发明，将生产细胞包囊于免疫隔离性藻酸盐基质中，该基质能提供表达的能干扰肿瘤生长和渐进的蛋白质或其它分子而没有的稳定的原位递送系统，而没有生产细胞的免疫排斥反应。
将细胞包囊于藻酸盐颗粒是固定细胞和其它物质的熟知技术，据文献记载，这种技术以前被用于治疗糖尿病、生产单克隆抗体和其它医学领域。
PCT/WO 97/44065中提出本药物递送技术通过在脑肿瘤部位采用释放基因转移载体的包囊细胞进行体内基因治疗。用于包囊该细胞的囊包括两个部分：a)含活的封装的细胞的核心和b)包围所述核心的外套层。
本发明提供了简单得多的包囊方法和产品，其中用一步法将生产细胞使用免疫隔离的藻酸盐质量直接包囊。
藻酸盐是一种主要存在于棕色海藻中的多糖。它由两种类型的单糖组成：L-古洛糖醛酸(G)和D-甘露糖醛酸(M)。这些多糖单位以交替顺序的G和M嵌段(GM-嵌段)以及主要由G或M单位组成的嵌段(G-嵌段/M-嵌段)形式出现。
通过G-嵌段与多价阳离子，尤其是Ca2+的交联可获得胶凝特性。
为了使藻酸盐不是免疫活化的，G含量须高于15％。然而，为确保藻酸盐是免疫隔离性的，本发明更优选使用高G含量的藻酸盐，即G含量为50％或高于50％。因为本领域公知G/M-嵌段比率和不同嵌段的分布是影响通过与多价阳离子交联形成得到的凝胶的不同性质的关键因素。
另一个重要的因素是使用的藻酸盐的纯度。因此，本发明可使用的藻酸盐基质的一个优点是它们可以高纯质量生产，具有明确的组成和极低含量的杂质，例如内毒素。
本发明可使用的藻酸盐基质的第二个优点是通过将包含活细胞的藻酸盐溶液滴加到钙溶液中制备的藻酸盐微球中藻酸盐浓度由微球的中心向外部边缘逐渐升高。因此，在微球的中央产生了利于细胞存活、增殖和生产的最佳空间，其中有足够的养料和氧可供细胞利用。藻酸盐浓度较高的外部边缘产生屏障，这样微球内部的生产细胞不会从内部逃逸出来，免疫细胞也不能进入微球。
通常，作为细胞固定基质的藻酸盐的使用包括将细胞的悬浮液与藻酸钠(Na+alginate)溶液混合，之后将该混合物滴入含多价阳离子(一般是Ca2+)的溶液中。小液滴形成凝胶球的同时将细胞捕捉于离子交联的藻酸盐的三维点阵中。该固定方法可在非常温和的条件下进行，因此适合于绝大部分活细胞。关于该技术在理论和实践方面的描述，读者可参见文献“作为细胞固定基质的藻酸盐”，Smidsrod和Skjak-Braek，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)，1990年三月，Vol.8,No.3，第71-78页。
形成本发明的包囊生产细胞的藻酸钙小球的目前优选方法如下。将藻酸钠以1-2％的浓度溶于水或等渗盐水中。该藻酸盐溶液经膜过滤灭菌，然后加入生产细胞并调至等渗。通过手工，但优选用静电小球生成仪(在藻酸盐供料针和胶凝浴之间加载5-7 kV的静电势)将藻酸钠-生产细胞溶液滴加到氯化钙浴液(0.05-0.25M)中形成藻酸钙小球。通过调节针的直径(如从0.1mm-0.4mm)、流速(如从5 ml/小时-30 ml/小时)和加载电压，可产生100-400μm的相当均匀直径小球。通过调节胶凝浴中的盐浓度(0-200 mM NaCl)可控制小球的均匀性，较高的盐浓度得到的小球较高的均匀性。在胶凝浴中使小球硬化。
据认为，本发明的包囊的生产细胞在常规的外科手术切除大块肿瘤后放入肿瘤腔中。手术后不久，由于肿瘤的负担最小化，因此在复发之前许多患者进入无症状期。由于外科手术具有创伤性，因此残留的肿瘤细胞会试图与宿主建立新的生化作用途径。这包括形成新血管和向残留的肿瘤细胞重新提供肽生长因子。正是在当肿瘤的负荷处于最低时，通过本发明可进行最可能地有效的治疗。
确实，按照一个实施方案，本发明的一个特别优点是可同时植入数种不同类型的生产细胞以靶向影响脑或其它肿瘤渐进性生长的不同表型特征和微环境因素。为此，可建立在液氮温度下进行冷存的包括包囊的生产细胞的生产细胞库。然后从库中抽取与需治疗的宿主肿瘤的基因表达相符合的生产细胞。
例如，可采用下列方法确立需要何种生产细胞治疗肿瘤。首先对活检材料进行包括决定受体状况和表型的肿瘤定性。然后在原发性肿瘤切除术后多达60天，定向地植入合适选择的生产细胞，该生产细胞产生针对宿主肿瘤的受体状态的物质，例如单克隆抗体。
或者，在原发性肿瘤切除术后可直接植入产生抗血管生成的物质的生产细胞。
植入的生产细胞的剂量取决于各个患者的情况，通常对于每位患者植入的细胞总数应在106-1012个。各藻酸盐或其它包囊基质中的生产细胞数量取决于小球或其它包囊形式的大小。包囊的生产细胞一般通过外科手术放入原发性肿瘤切除术后的伤口部位。
正如下面详细描述的实验中所示，包囊的生产细胞存活、增殖并保持其特定的体外和体内表达期。该发现建立了用于脑肿瘤患者的新治疗方案，由此对所选择的靶向脑肿瘤生长和发育的所选特征的不同生产细胞进行包囊。在本文描述的实验中，我们发现从藻酸盐小球中释放的特定的MAbs可抑制肿瘤细胞转移，这通过干扰表皮生长因子受体得到了证实。我们还发现从脑内包囊的生产细胞中释放的特异性产物渗透进入了脑实质并可沿CFS途径分布。
下列实验将有助于理解本发明及其优点。下面对附图进行说明，其中：
附图1A-1C
包囊于藻酸盐的NIH 3T3细胞的光显微成像。所有短线均表示250μm。附图1A：包囊的当天。附图1B：培养3周后的包囊细胞。附图1C：培养9周后的包囊细胞。附图1D-1F：包囊于藻酸盐的NIH 3T3细胞的扫描共焦显微激光照片。存活细胞发射出绿色荧光(图中表现较亮的区域)，而死细胞发射出红色荧光(图中看不到)。所有短线均表示250 μm。附图1D：包囊的当天。附图1E：培养3周后的包囊细胞。附图1F：培养9周后的包囊细胞。附图1G：培养9周后，包囊于藻酸盐的BT4CnVlacZ细胞的β-半乳糖苷酶活性。短线表示500μm。附图2A-2D
包囊于藻酸盐小球的NIH 3T3细胞的流式细胞分析直方图。横轴表示流式细胞仪上的通道数量(相对DNA荧光)，纵轴表示各通道中细胞核的相对数量。附图2A：对照，单层培养。附图2B：包囊1周的细胞。附图2C：包囊3周的细胞。附图2D：包囊9周的细胞。附图3
从包囊于藻酸盐的H528杂交瘤细胞中释放的抗体(平均值±标准偏差)。横轴表示培养的天数，纵轴表示释放进入生长培养基中的抗体。通过第3级回归分析评价曲线。附图4
自4天后、未处理(对照)、用10 ng/ml EGF(EGF)刺激或者在包囊的杂交瘤细胞(EGF/H528)的存在下用10 ng/ml EGF刺激的GaMg小球的细胞的转移。附图5A-5H
植入大鼠脑部的包囊的H528杂交瘤细胞。附图5A：   大鼠脑的轴切片。H&E染色，短线表示5 mm。附图5B：   与附图5A相同的切片，表现植入部位内的包囊的H528细胞。H&E染色，短线表示500μm。附图5C-5H：脑内的单克隆抗体的释放和扩散的共焦激光扫描显微照片。附图5C、E和F在相同设置下拍摄。附图5G和5H也在相同设置下拍摄。附图5C：   远左侧处具有包囊的H528细胞的脑实质切片。短线表示150μm。在脑实质左侧看到强烈的荧光，其强度在进入脑至少1000μm处逐渐减弱。
在附图5D中进一步可看到荧光强度沿水平线的逐渐变化，其中纵轴表示相对荧光强度(0-255)。从左侧了看到强烈的荧光，进入脑实质后该荧光逐渐减弱。附图5E：   在蛛网膜下腔和下面的脑中发现了Mabs。短线表示75μm。附图5F：  对照中存在的弱荧光可能是由非特异性结合产生的。短线表示75μm。附图5G：  MAbs扩散到了血管周隙。短线表示50μm。附图5H：  比较而言，对照在血管周隙显示出较弱的免疫球蛋白结合。短线表示50μm。附图6：  放射免疫分析表明成功地建立了内皮他丁生产细胞。该附图的第二、第三和第四条带分别显示了从条件培养基、细胞部分和未转染的细胞的培养基中释放的内皮他丁的放射免疫分析。附图7：  内皮他丁藻酸盐疗法对肿瘤生长的影响。A图表示对照动物实例，其中植入了包囊在藻酸盐小球中的模拟转染细胞。脑部的较深色的区域是肿瘤区域。图B表示用包囊的产生内皮他丁的细胞进行治疗的动物实例。较深色区域表示肿瘤，在肿瘤的中央可见较大的坏死区域。
实验材料和方法1．细胞系
在实验中，使用四种不同类型的细胞系：
细胞系           保藏信息1、NIH 3T3           ATCC CRL/16582、BT4CnVlacZ        未保藏3、H528              ATCC HB 85094、GaMg             未保藏
小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞代表潜在的生产细胞系，即它能被基因工程化以表达对抗肿瘤生长，进展和发育具有作用的物质。如下将NIH 3T3细胞包囊在藻酸盐中并用于进行体外形态学、存活性和细胞动力学的研究。为研究包囊细胞的体内存活性，将包含NIH 3T3细胞的藻酸盐小球植入大鼠脑中。
BT4CnVlacZ细胞系最初从乙基亚硝基脲诱导的大鼠神经胶质瘤中发展而来，用细菌lacZ基因稳定转染并克隆到包含Moloney小鼠白血病病毒的长末端重复弹夹的质粒中，所述弹夹具有自鲁斯氏肉瘤内病毒启动子表达的新霉素耐药的基因。参见国家癌症研究杂志(J.Natl Cancer Inst),55(1975),第1177-87页和国际癌症杂志(Int.J.Cancer),71(1997),第874-80页。将该细胞用藻酸盐包囊并研究细菌的β-半乳糖苷酶的体外合成。
H528杂交瘤细胞系从美国典型培养物保藏中心(ATCC Rockville,MA)获得。通过融合NS-1-Ag4-1骨髓瘤细胞与来自BALB/c小鼠的脾细胞产生该细胞系，且其产生结合和阻断人表皮生长因子受体(EGFR)的EGF结合域的小鼠单克隆抗体(MAbs)(IgG2a)。用该细胞系研究藻酸盐包囊的细胞中MAb的体外和体内释放。
人神经胶质瘤细胞系GaMg已记述于抗癌研究(Anticancer Res),8(1988)第874-80页，以前已显示出可表达EGFR(柏林神经病理学报(Acta Neuropathol Berl),84(1992)，第190-197页)。在GaMg多细胞球和包囊的H528细胞间的共同培养体系中研究了GaMg细胞转移的特异性抑制。2、细胞培养
在80cm2培养烧瓶(Nunc,Roskilde,Denmark)中，用由补加下列成分的Dulbecco改进的Eagles培养基(DMEM)组成的完全生长培养基培养NIH 3T3和BT4CnVlacZ细胞系：10％加热灭活的新生小牛血清、四倍规定浓度的非必需氨基酸、2％L-谷氨酰胺、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)(所有生物制品购自BioWhittaker,Verviers,Belgium)。在80 cm2培养烧瓶(Nunc)中，在补加10％马血清的RPMI 1640生长培养基(BioWhittaker)中培养H528杂交瘤和GaMg细胞系。将GaMg单层细胞与3 ml 0.025％胰蛋白酶(BioWhittaker)混合进行胰蛋白酶化，并向基底包被有完全RPMI培养基中的0.5％纯净琼脂(Difco,Detroit,MI)(30)的80cm2培养烧瓶(Nunc)接种在20 ml完全RPMI培养基中的5*106个细胞引发小球体。在37℃、100％相对湿度、95％空气和5％CO2的条件下，使所有细胞系保持在标准组织培养箱中。3、藻酸盐的结构和性质
在这些实验中，用从棕色海藻北极昆布(Laminaria hyperborea)(LF 10/60)(Protanal,Drammen,Norway)得到的藻酸钠使生产细胞微囊化。该藻酸盐由两种单糖组成：α-L-古洛糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)。G-单位和M-单位以三种不同的嵌段类型：GG、MM和MG连接在一起，并且这些嵌段的比例和分布决定藻酸盐分子的化学和物理性质。某些二价阴离子，如Ca2+可强烈地连接两个独立的G-嵌段，这形成更广泛的藻酸盐骨架，其中G-嵌段形成强烈的连接。我们使用的藻酸盐藻酸盐具有含量高于60％的G-嵌段，导致高力学稳定性和高孔隙率，使其适于包囊产生次级代谢产物的细胞(参见生物技术趋势(Trends in Biotechnology),8(1990)，第71-78页)。电子扫描显微镜显示藻酸盐小球中的孔径为5-200 nm(33,34)。小球的力学强度、体积稳定性和孔隙率与古洛糖醛酸的含量有关。4、细胞的包囊
包囊的详细方法记载于“作为细胞固定基质的藻酸盐”，Smidsrod和Skjak-Braek，生物技术趋势(Trends inBiotechnology),1990年3月，Vol.8,No.3，第71-78页。
简单地说，是将分散在1.5％藻酸钠中的细胞小滴放入0.1 M Ca2+溶液中。聚合反应后，藻酸盐小球用DulbeccoPBS(DPBS；Sigma,St.Louis,MO)洗涤三次并用生长培养基洗涤一次。将包囊的细胞在盛有50 ml生长培养基的175cm2培养瓶(Nunc)中培养。生长培养基每三天更换一次，培养瓶每周替换一次。在37℃、100％湿度、95％空气和5％CO2条件下，使所有藻酸盐包囊的细胞保持于标准组织培养容器中。对于NIH 3T3和BT4CnVlacZ细胞系的所有实验，使用的细胞密度为6*106个细胞/毫升藻酸盐，小球大小为0.8-1.2mm。对于用H528细胞系进行的体外实验，使用的细胞密度为3*105个细胞/毫升藻酸盐，小球直径为2.3-2.5mm。对于用H528细胞系进行的体内实验，使用的细胞密度为3*105个细胞/毫升藻酸盐，小球直径为0.8-1.2mm。体外实验1、藻酸盐包囊的细胞的形态学和存活性
将6个小球转移到覆盖1.0 ml DPBS的6孔培养皿(Nunc)中，在包囊的当天、3天后和9周后，观察包囊于藻酸盐的NIH 3T3细胞的形态。用Nikon Diaphot光学显微镜观测小球并用Nikon F-301照相机拍照。将形态学实验进行两次。
通过两色荧光存活力分析仪(Live/DeadTM生活力/细胞毒性试验，Molecular Probes,Eugene,OR)，在包囊当天、3天后和9周后，观察藻酸盐小球内的细胞存活性。在完全生长培养基中，用2μM钙黄绿素-AM和4μM乙锭二均聚物制备标记溶液。在室温下，将藻酸盐小球分别放入覆盖有0.5 ml标记溶液的16mm多孔培养皿(Nunc)中并保持30分钟。之后，将它们转移到DPBS并立即检测。用Texas Red和FITC滤器光学，使用用氩-氪激光的激光共焦扫描显微镜(BioradMRC-1000,Hemel Hempstead,England)测定通过藻酸盐光学切面的荧光。在藻酸盐小球内120μm的平面处读取荧光。存活实验进行三次。
经过1、3和9周，研究包囊于藻酸盐中的BT4CnVlacZ细胞中β-半乳糖苷酶的产生。将小球用DPBS(pH=8.4)洗涤1分钟后，在DPBS中用0.2％戊二醛和2％甲醛固定10分钟。之后，用DPBS洗涤3次，每次5分钟，并用5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(x-gal；sigma)染色β-半乳糖苷酶活性。将溶于100μl二甲基甲酰胺中的1 mg/mlx-gal底物溶液与溶于DPBS的5 mM铁氰化钾(potassiumferricyanite)、5 mM亚铁氰酸钾和2 mM MgCl2(所有有生化试剂均购自E.Merck,Darmstadt,Germany)。在4℃保温至少24小时，检测β-半乳糖苷酶活性，以蓝色细胞质表示。2、藻酸盐包囊细胞的细胞动力学
通过流式细胞术DNA分析测定包囊的NIH 3T3细胞的体外细胞周期分布。通过将小球溶于含1.5％二水合柠檬酸三钠(E.Merck)的完全生长培养基中，使包囊的细胞从藻酸盐中释放15分钟，然后在140g离心4分钟，和除去上清液。将细胞再在完全生长培养基中悬浮两次，于140g离心4分钟，在冰冷的96％乙醇中固定并贮藏于4℃。在进行流式细胞分析前，将细胞在37℃用在0.9％生理盐水中0.5％胃蛋白酶(Sigma)保温15分钟(pH=1.5)，然后将分离的细胞核用0.9％生理盐水洗涤，再用核糖核酸酶(Sigma)(0.9％生理盐水中的1 mg/ml溶液)处理1分钟。将碘化丙锭(Sigma)(0.9％生理盐水中的50 μg/ml溶液)加到细胞核中进行DNA染色。用Becton Dickinson FACSort流式细胞分析仪(Becton Dickinson,Palo Alto,CA)测定细胞的DNA含量。通过将两种参数的前散和侧散细胞图门控(gating)到一种参数的DNA直方图得到DNA直方图。通过计数5000门控的细胞核总数得到各直方图。将流式细胞分析实验重复三次，如Radiat EnvironBiophys,12(1975)，第31-39页中所述测定细胞周期的分布。3、由包囊的杂交瘤细胞释放抗体
如上所述，制备直径为2.3-2.5mm的藻酸盐小球，在包囊当天每个小球包含1.5*103个H528细胞。分别在包囊后0、1、5、12、19、23和33天，从储备培养液中取出10个小球，检测释放到RPMI中的Mab。在0.5 ml完全RPMI培养基中(37℃)，将小球转移到24孔培养皿(Nunc)中。保温6小时后，收集4份样品，每份100μl，放入1.5 ml离心试管(Treff AG,Degersheim,Switzerland)中并冷冻于-20℃。
用流式细胞分析测定样品中的Mab浓度。在DPBS中，单层GaMg细胞培养物用2 mM EDTA胰蛋白酶消化。然后将细胞在140g离心4分钟，除去上清液，将该细胞在DPBS中用2％多聚甲醛溶液固定1分钟。之后，使细胞在140g离心4分钟，除去上清液。然后将细胞再悬浮于含2mM EDTA、1％牛血清白蛋白和1 g/l葡萄糖的DPBS中，并以1.7*105个细胞/孔的密度分配到圆锥形96孔培养板(Nunc)中。将细胞在340g离心4分钟，除去上清液。之后，将细胞涡旋并在4℃用得到的MAbRPMI培养基(未稀释的，以及用DPBS以1∶5、1∶20和1∶100比例稀释的稀释液)保温2小时。用已知MAb浓度(浓度为20、5、0.2、0.1和0.05μg/ml)的EGFR MAb(528)抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)作为参考。将细胞用DPBS中的2 mM EDTA、1％BSA和1 g/l葡萄糖洗涤两次，然后在4℃与FITC结合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako A/S,Glostrup,Denmark)(1∶20稀释液)保温30分钟。用Becton Dickinson FACSort流式细胞仪进行流式细胞分析。通过两种参数的前散和侧散细胞图观测单细胞并选通一种参数的FITC直方图，其中测定荧光强度。通过采用针对GaMg细胞的已知浓度的EGFRMAb的不同滴度，获得GaMg细胞的参照抗体结合曲线。通过比较用从包含杂交瘤的藻酸盐小球中得到的培养基获得的结果，得到MAb浓度曲线。4、细胞转移
在1.0ml含10 ng/ml EGF(Sigma)的完全RPMI培养基中，将GaMg球分别转移到16mm多孔培养皿(Nunc)中。之后，使肿瘤细胞与包含H528细胞的藻酸盐小球接触(每孔中三个藻酸盐小球)。作为对照，使小球与含或不含10 ng/ml EGF的完全RPMI培养基接触。用具有肉眼校准标线的光学显微镜每天测定每个集落的正交直径，连测4天。然后测定从小球转移出来的细胞覆盖的环形面积并将其用作细胞转移的指数。该实验进行两次，每次实验使用6个小球。5、内皮他丁生产细胞的建立和证明：从小球中释放内皮他丁5A、内皮他丁生产细胞的建立方法：细胞系和培养条件：将表达Epstein-Barr病毒核心抗原(EBNA)-1的人肾胚胎肾293细胞(293-EBNA)作为生产细胞系。
通过脂质体(liposomal)并用0.5％μg/ml嘌呤霉素选择，用包含编码人内皮他丁的基因的游离型表达载体pCEP-Pu转染该细胞。
使转染后的细胞(293-endo)在含由补加有下列成分的Dulbecco改良Eagles培养基组成的生长培养基的175 cm2培养烧瓶(Nunc,Roskilde,Denmark)中生长至辅满：10％加热灭活的胎牛血清、4.5 g/l D-葡萄糖、青霉素(100 IU/ml)和链霉素(100μl/ml)、205 μg/ml遗传霉素(G-418)和0.5μg/ml嘌呤霉素。通过用不含内皮他丁基因的pCEP-Pu载体转染293细胞产生模拟转染细胞并使其在相同条件下生长，除了嘌呤霉素(所有生物制品购自Biowhitaker,Verviers,Belgium)。
为这些实验选择的肿瘤细胞系(BT4C)来自乙基亚硝基脲诱导的大鼠胶质肉瘤(传代数26)并在DBIX具有同基因。在80 cm2培养烧瓶中，用由补加下列成分的Dulbecco改良的Eagles培养基组成的完全生长培养基使该细胞系生长至辅满：10％加热灭活的胎牛血清、四倍规定浓度的非必需氨基酸、2％L-谷氨酰胺、青霉素(100 IU/ml)和链霉素(100 μg/ml)。5b、由小球释放内皮他丁的评价免疫印迹
收集包囊的endo-293293-EBNA的条件培养基并用于标准SDS/PAGE蛋白质印迹，以测定小球是否释放了内皮他丁。
简单地说，经12％SDS凝胶分离样品并印迹于PVDP硝酸纤维素膜上。将印迹用100％甲醇洗涤5分钟，蒸馏水洗涤1分钟，封闭溶液(0.05 M Tris/HCl,0.45 M NaCl,2％土温，pH 10.2)洗涤4分钟，最后用洗涤缓冲液(0.05 M Tris/HCl,0.15 M NaCl,0.5％土温，pH 10.2)洗涤15分钟。然后将印迹与兔抗人抗血清(洗涤缓冲液中的1∶1000稀释液)保温过夜，然后印迹以DPBS洗涤并与猪抗兔碱性磷酸酶结合的IgG(DAKO,Denmark)保温。通过与底物染色的溶液保温(2-4分钟)形成可见的条带。体内实验1、颅内植入
使重160g-250g的雄性同系繁殖BD-IX大鼠(36)保持标准颗粒食物，对其饮用水没有限制，分开圈养于温度是湿度恒定的以12小时白昼和黑夜间隔的环境中。以0.4 ml/100g体重的浓度腹膜内给予戊巴比妥使大鼠麻醉。通过中等前后向切口，在前囟后4.2mm和前后向缝线右侧2.5mm用3.5mm钻钻一个孔。吸取皮层和白质组织达2.0mm深度，将包含NIH 3T3或H528细胞的8-14个藻酸盐小球(制得一天的小球)放入该组织腔。用骨蜡封闭该孔并用聚酰胺缝线缝合皮肤。用加热灯使其恢复1小时。按照惯例指导进行动物互护理。每天观察一次大鼠，并隔天称重。在植入后所有动物都恢复很快，在观察期间没有显示出任何病症或者神经学缺陷。2、大鼠脑内免疫球蛋白的释放和播散
在3和9周后，通过CO2吸入法处死大鼠。除去脑组织，包埋在Tissue Tek(Miles Laboratories Inc.,Naperville,IL)并冷冻在用液氮冷却的2-甲基丁烷(E.Merck)中。在Reichert-Jung1800低温切片机(Leica,Wetzlar,Germany)上切取轴向切片(14μm)，并贮存于-20℃。在室温下，将由植入包囊的H528细胞并在3周后处死的大鼠得到的低温切片在丙酮中固定5分钟，然后用DPBS洗涤两次，每次5分钟。在室温下，将该切片与FITC-结合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako A/S；1∶20稀释液)保温1小时，之后用DPBS洗涤5分钟。该切片用核糖核酸酶(Sigma,0.5 mg/ml在0.9％生理盐水中)处理30秒，通过将碘丙锭(Sigma,50μg/ml在0.9％生理盐水中)加到切片中对核进行染色。再将切片用DPBS洗涤5分钟，然后用Vectashield(Vector Laboratories Inc.,Burlingame,CA)封固。使用用氩-氪激光和FITC滤器光学的Leica TCS NT激光同焦扫描显微镜测定荧光。观察从实验动物脑内相同深度取出的切片，研究两组中最大荧光强度的区域。将由植入NIH 3T3细胞并在9周后处死的大鼠得到的低温切片用苏木精和曙红染色以进行组织学检查。3、对包囊于藻酸盐中的生产细胞的免疫反应方法
在植入后1、3和9周，评价在BD-IX大鼠的脑与藻酸盐小球的边界区域免疫阳性细胞的百分数。将残留脑组织进行封固、包埋于tissue-tek并冷冻在液氮中。在Reichert Jung Cryostat(Leica,Wetzlar,Germany)制备一系列5-10μm轴向切片并封固于载波片上，用于免疫组织学分析。将切片在冷丙酮中固定5分钟，并在室温下与用PBS稀释的10％正常兔血清保温30分钟，之后在4℃的潮湿环境中与在10％兔血清中稀释的小鼠单克隆抗体(mAbs)保温过夜。使用下列mAbs:OX42、ED1和ED2抗大鼠巨噬细胞mAbs、OX19抗CD5阳性T细胞和与CD45RA阳性B细胞反应的OX33。mAbs得自Serotec,Oxford,UK。加入以1∶300稀释的生物素标记的兔抗小鼠免疫球蛋白并保持30分钟。按照制造商推荐的方法制备抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABCcomplex/HRP,Dakopatts,Glostrup,Denmark)，并使其与切片反应30分钟。最后，切片用含3-氨基-9-乙基-咔唑的缓冲液处理，以形成有色反应产物。在所有保温之后，用PBS洗涤。将所有制品用苏木精复染，封固于Glycergel(Dakopatts)并用光学显微镜进行分析。4、内皮他丁-藻酸盐疗法对肿瘤生长的影响
以0.4 ml/100 g体重的剂量腹膜内注射Equithesine麻醉两种性别的低龄成年大鼠(总计8只，加20只对照)。将大鼠固定在定向架上(David Kopf Instruments,Tujunga,USA)，在前囟后1mm和右侧3.0mm切开皮肤形成2mm的洞并插入至2.5mm深度。用注射器注射到脑内。然后在深度为2mm的藻酸盐小球边1mm处注射1x104 BT4C胶质肉瘤细胞。藻酸盐小球含有生产内皮他丁的293细胞或293-模拟转染细胞(作为对照)。接受植入的8只动物形成了各种细胞系。另外，作为正常周发育的对照，对8只动物仅注射BT4C细胞。
最后，作为小球内细胞体内存活的对照，剩余的4只对照动物仅接受含293-endo细胞的藻酸盐小球。用3分钟将注射器缓慢抽回(对所有注射都是如此)并用骨蜡和缝线进行封闭缝合。使动物进行术后恢复并观察。在实验期间，所有动物在配对圈养在温度和湿度恒定的条件下，给予标准颗粒食物并提供自由进水。
结果体外实验1、藻酸盐包囊细胞的形态学和存活率
直径为1.0mm的藻酸盐小球，在包囊当天包含约6.5*102个NIH3T3细胞(附图1A)。细胞均匀地分布于藻酸盐小球内，具有无细胞的外部边缘25-50μm。培养期间，在藻酸盐内观察到细胞增殖，3周后，细胞的密度增高了(附图1B)。培养9周后，在藻酸盐小球内观察到了多细胞体球(附图1C)。通过光学显微镜检查，培养9周后，90％的藻酸盐小球仍保持完好。在培养约1周后，少量单细胞从藻酸盐中转移出来进入生长培养基中，这限制了单细胞在接下来的8周培养期间的运动。
激光共焦扫描显微镜研究表明在包囊的当天，约90％包囊的细胞仍是存活的(附图1D)。培养3周后，约50％最初包囊的细胞是存活的(附图1E)。在9周后，可清楚地观察到一些适应于藻酸盐并形成了多细胞体球的存活细胞(附图1F)。此时，由于多细胞体球的形成，使小球内的存活细胞总数难以估计。然而，从附图1F可以看出，位于球体中的绝大部分细胞是存活的。
在整个9周的观察期间，包囊的BT4CnVlacZ细胞表达了恒定的和均匀分布的β-半乳糖苷酶活性。2、藻酸盐包囊细胞的细胞动力学
NIH 3T3细胞的流式细胞分析直方图显示了包囊1周后的藻酸盐小球内细胞倍性的变化(附图2B)。与二倍体对照相比(附图2A)，这可能表示着多倍体化。然而在3和9周后，分别都观察到了倍性的正常化(附图2C、2D)，具有与对照类似的二倍体分布。在S和G2M期的对照的增殖细胞的分数是50％，相比之下，在体外3周和9周后，该分数分别是55％和60％。3、由包囊的杂交瘤细胞释放抗体
在包囊的第一天结束时，已释放到生长培养基中的MAb为13ng/(ml*hr)(附图3)。在第二天培养期间，从小球中释放出来进入培养基中的免疫球蛋白也稳定地增加了，在12天后，其浓度达到457ng/(ml*hr)。在最后3周观察期间，产生的MAb也稳定在约400ng/(ml*hr)。4、细胞转移
自用EGF刺激的GaMg球出来的细胞转移是广泛的，细胞平均向外生长的区域是对照的两倍(附图4)。然而，当将含H528细胞的藻酸盐小球加到有EGF存在的环境中时，大大地抑制了细胞的转移，这表明该包囊的H528生产细胞有效地表达了抗EGF受体的抗体。5、小球释放内皮他丁的评价
从小球得到的条件培养基的蛋白质印迹可以看出，从小球释放出了显著量的内皮他丁(附图6)。放射免疫分析表明10个具有25000包囊细胞的产生内皮他丁的藻酸盐小球(400μm)分泌2.5μg/ml/24hr。体内实验1、颅内植入
大鼠脑的轴向切片显示相邻于带有藻酸盐包囊的NIH 3T3细胞的植入部位的脑实质基本没有变化或没有变化(附图5A)。9周后，基本上没有观察到颅内水肿或肿胀。藻酸盐小球不存在任何的细胞过度生长，它同时包含单细胞和多细胞体球(附图5B)。存活的细胞同时分布在小球的中央和边缘，在细胞之间也存在没有细胞的藻酸盐区域。还观察到在植入孔和脑实质之间的边界区域附近聚集的细胞最少。2、大鼠脑内免疫球蛋白的释放和播散
通过强烈绿色荧光很容易看到3周后的包囊杂交瘤细胞的植入小球(附图5C)。在距离藻酸盐小球至少1 mm的距离处可检测到免疫球蛋白(附图5C、5D)，从植入部位的边界向脑，荧光强度逐渐降低。对于两组实验动物，检测了存在移植体的整个脑半球的MAb(未显示数据)。发现MAb还存在于大脑两个半球的柔脑膜中(附图5E)，在右半球蛛网膜下可看到强烈的荧光。阴性对照在柔脑膜中显示出弱荧光，这可能是由免疫球蛋白与柔脑膜中细胞的表位之间的非特异性结合产生的(附图5F)。但脑实质是阴性的。MAb还存在于脑内血管的血管腔隙，两个半球间的荧光强度没有明显差别(附图5G)。对照中存在的弱荧光还可能是由非特异性结合产生的(附图5H)。3、对包囊于藻酸盐的生产细胞的免疫反应
观察了相邻于藻酸盐小球的脑中的单核细胞浸润。浸润的细胞量从第1周至第9周降低。植入1周后，在实质中看到了OX42阳性的树枝状小胶质细胞，反应性小胶质细胞和侵入性单核细胞出现在朝向藻酸盐小球的边界区域。ED1和ED2染色的单核细胞接近该边界区域，但在脑实质中别处没有什么细胞通过这些mAb染色。在小球的边界区域还观察到了有限的T细胞和B细胞(表Ⅰ)。该边界区域的OX42阳性细胞的数量从第1周的62％降低到第9周的20％，而ED1阳性细胞从第1周的34％降低到第9周的7％。ED2阳性细胞(5％)、T细胞(14％)和B细胞(1％)的数量在观察期间仅有一定程度的变化(表Ⅰ)。
表Ⅰ
植入藻酸盐中的NIH 3T3细胞9周后大鼠脑组织中的细胞免疫反应
细胞 免疫反应性
T细胞(CD5) 没有反应性
B细胞(CD45RA) 没有反应性
小胶质细胞和巨噬细胞(OX42) 高度反应性
巨噬细胞和单核细胞(ED1/ED2) 微弱反应性
4、内皮他丁藻酸盐-疗法对肿瘤生长的影响
用藻酸盐中产生内皮他丁的细胞处理的动物生存期较用模拟转染细胞处理的动物延长20％±4％。详细的组织学观察揭示了接受内皮他丁-藻酸盐疗法的肿瘤中出现大面积坏死区域(参见附图7，图B)。但在对照组中从未观察到这类坏死区域(包囊于藻酸盐的模拟转染细胞；附图7，图A)。讨论
上述实验结果清楚地证明微囊化细胞在延长的时间段内存活、增殖和保持其表型表达。还表明从藻酸盐小球中释放的MAb通过干扰EGFR具有体外抑制肿瘤细胞转移的能力，并且该MAb释放和播散到大鼠脑内。
通过光学显微镜可以看出，NIH 3T3细胞体外适应藻酸盐并在包囊后数天内开始增殖。CLSM研究表明在包囊当天的细胞存活率约为90％。在培养的头3周期间，起初包囊细胞的约50％死于小球内。但是，9周后，藻酸盐小球内剩余的细胞显示出形成多细胞球体的能力。其它人也有关于在藻酸盐内观察到细胞死亡的报告，这可能是由于氧、营养物和废物扩散的减少，最终异致增殖和死亡细胞的数量达到了平衡。通过降低小球直径、提高G-单位含量，其将增加孔径，或改变藻酸盐浓度，可获得更有利的扩散率。此外，扩散依赖于起初小球中包囊细胞的数量。藻酸盐本身是无毒的，因此观察的小球内细胞死亡不应归因于藻酸盐。
在9周培养期间，BT4CnVlacZ细胞表现出强烈和均匀分布的β-半乳糖苷酶活性。这些结果表明在延长期间的藻酸盐小球内还可产生特异性基因产物。
流式细胞分析研究显示在藻酸盐中1周后，NIH 3T3细胞由二倍体变为多倍体。这表明细胞核分裂了，但由于牢固的藻酸盐骨架有限的空间，最初细胞不能进行胞质分裂。由此形成了具有两个或三个细胞核的单细胞(附图2B)。但在3周后，细胞周期的分布与对照相似。这表明在藻酸盐内细胞需要适应周期，具有两个三个细胞核的单细胞或完成其胞质分裂或死亡。9周后的直方图与3周后的直方图类似，但表明增殖期的细胞增多了。细胞周期分布分析表明增殖细胞的数量自对照的50％增加至9周后的约60％。这可能是由于在NIH 3T3细胞的延长培养期间藻酸盐小球内选择的细胞具有较高增殖能力。
在13-22天，从包囊的H528杂交瘤细胞中释放的抗体基本上恒定在约400 ng/ml*hr，这表明在培养12天后，建立了稳定密度的分泌的MAb的杂交瘤细胞。该发现对临床具有重要意义，因为这表明稳定地产生了高水平的单克隆抗体。
在EGF存在下刺激细胞从GaMg球向外转移。通过向EGF洗涤的球中加入包囊的H528细胞，转移被抑制了，并且向外的生长区域与对照类似。这暗示了旁分泌细胞增殖机制受到这些Mab的抑制，这可能是由于阻断了EGFR的EGF-结合区域。
在中枢神经系统(CNS)以外的其它器官植入藻酸盐包囊的生产细胞显示藻酸盐小球的成纤维细胞的过度生长，导致细胞死亡和移植失败(移植(Transplantation),54(1992)，第769-774页)。由于独特的部位，CNS中不存在成纤维细胞，因此在本发明的研究中没有观察到相同的细胞过度生长(附图5A、5B)。根据其组成，在某些情况下，已表明藻酸盐在体内通过刺激单核细胞产生高水平的细胞因子引发免疫反应。藻酸盐的细胞因子刺激的部分是M-单位。因此为使脑内免疫反应降到最低，选择具有高含量G-单位的藻酸盐进行我们的实验。在进一步的实验中，我们发现藻酸盐包囊的细胞在脑内产生低的免疫反应，仅在接近植入小球的脑组织中集合一些小胶质细胞。这些观察结果还表明藻酸盐包囊的生产细胞对于脑内是具有吸引力的治疗。在植入部位和脑实质间的边界区域周围观察到最少的细胞聚集。这可能是因为从藻酸盐小球中逃逸出的NIH 3T3细胞，因为对上述植入物的温和免疫反应，和/或因为组织创伤愈合过程。但认为从藻酸盐中逃逸出少量生产细胞不存在问题，因为这些细胞由正常移植物-宿主排斥反应机制对付。然而，如果需要，也可加入防止细胞从小球中逃逸的步骤，例如通过用聚L-赖氨酸层覆盖该小珠或通过在包囊前进行辐射，由此抑制其增殖能力。免疫球蛋白从藻酸盐小球中释放出来并播散到脑实质距植入部位的边界处至少1mm远处。在两组实验动物中，检测了存在植入物的整个脑半球的MAb。这种播散可能是由于被动扩散的过程。MAb还存在于柔脑膜中和Virchov-Robin的血管周隙。这种扩散很可能是通过CNS内恒定流动的脑脊液介导的。有趣的是，肿瘤细胞在脑内也沿着该相同播散途径，这使它们易于接近藻酸盐包囊的细胞产生的成分。
总之，上面公开的实验显示包囊于藻酸盐内的生产细胞在延长的时间内体外和体内存活和增殖。在培养的数周期间，包囊的BT4CnVlacZ细胞的胞浆内产生了基因产物，例如β-半乳糖苷酶。包囊的杂交瘤细胞还在体外和体内生产和释放高水平的MAb。GaMg肿瘤细胞的转移在包囊H528细胞的存在下受到抑制。植入大鼠脑内的包囊的H528细胞还产生和释放MAb，并且MAb播散到脑实质内以及蛛网膜下腔和血管周隙。因此，本发明代表了一种有前景的CNS肿瘤治疗手段。

Claims (19)

1、一种包囊的生产细胞，该细胞能表达CNS肿瘤生长抑制剂分子，其中包囊基质是免疫隔离性藻酸盐。
2、权利要求1的包囊的生产细胞，其中所述分子是能作用于肿瘤/宿主通讯途径的蛋白质或肽。
3、权利要求2的包囊的生产细胞，其中所述蛋白质或肽能影响肿瘤新血管形成。
4、权利要求2的包囊的生产细胞，其中所述蛋白质或肽能干扰肿瘤细胞与胞外基质之间的关系。
5、权利要求1的包囊的生产细胞，其中所述分子是能直接作用于肿瘤细胞的蛋白质或肽。
6、权利要求5的包囊的生产细胞，其中所述生产细胞是能表达单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述抗体能直接作用于肿瘤的受体。
7、前述任一项权利要求的包囊的生产细胞，其中所述分子的表达能通过外部药理剂启动或停止。
8、权利要求1的包囊的生产细胞，其中藻酸盐的G-单位含量高于15％，更优选高于约50％。
9、权利要求8的包囊的生产细胞，其中藻酸盐的G含量为60％-80％。
10、权利要求1的包囊的生产细胞，其中藻酸盐的G含量为80％-100％。
11、权利要求1任一的包囊的生产细胞，是小球或微球形式的。
12、前述任一项权利要求的包囊的生产细胞，其中所述肿瘤是脑肿瘤。
13、一种治疗CNS肿瘤的方法，包括在肿瘤部位植入免疫隔离性藻酸盐包囊的生产细胞，该生产细胞能表达所述肿瘤生长抑制剂分子。
14、权利要求13的方法，其中所述包囊的生产细胞如权利要求1-12任一项中所定义。
15、权利要求13或14的方法，其中在所述肿瘤外科切除术后植入所述生产细胞。
16、一种治疗CNS肿瘤的药物的制备方法，包括将能表达所述肿瘤生长抑制剂分子的生产细胞包囊于免疫隔离性基质中。
17、一种免疫隔离性藻酸盐用于制备包囊的生产细胞的用途，所述包囊的生产细胞在脑肿瘤外科切除术后植入脑内，所述生产细胞能表达所述肿瘤生长抑制剂分子。
18、权利要求17的用途，其中的藻酸盐是高纯度的，不含内毒素的质量的。
19、权利要求17的用途，其中所述藻酸盐的G含量至少为15％，更优选为高于50％。
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