CN110075316A - 特异性靶向癌细胞的输送系统及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
公开用于预防、治疗或抑制受试者的癌细胞的生长或转移的多种方法。其中一种方法包括向受试者施用治疗有效量的肿瘤相关抗原结合配体包覆的含有细胞毒性剂的行星球磨(PBM)纳米颗粒的步骤。
Description
本申请是申请号为201280050727.X(国际申请号为:PCT/US2012/049988),申请日为2012年8月8日,发明名称为“特异性靶向癌细胞的输送系统及其使用方法”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求2011年8月15日提交的第61/523,626号临时申请的优先权。该临时申请的全部内容通过引用并入到本发明中。
技术领域
本申请总体上涉及输送系统和癌症的治疗。特别地,本申请涉及使用纳米颗粒的细胞毒性剂的运输。
背景技术
全身性毒性是与破坏细胞的分裂和复制的能力的许多细胞毒性药物相关联的主要问题。例如,尽管有一些益处,基于铂的药物(例如卡铂、顺铂、奥沙利铂、沙铂、三铂替群妥英(triplatin tetranin)等)、天然酚类(例如小豆蔻、姜黄素、高良姜、生姜、内亚胡椒、姜黄等),植物碱和紫杉烷类(例如喜树碱、多西他赛、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春新碱等)、其它的烷基化剂(例如六甲蜜胺、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、乙撑亚胺、六甲蜜胺、肼、异环磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法仑、亚硝基脲、胡椒碱、丙卡巴肼、链佐星、替莫唑胺、塞替派、三嗪等)、肿瘤抗生素和蒽环类抗生素(例如博莱霉素、色霉素、更生霉素、道诺红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)、拓扑异构酶抑制剂(例如安吖啶、依托泊苷、伊立替康、替尼泊苷、托泊替康等)、抗代谢物(5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、腺苷脱氨酶抑制剂、卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、奈拉滨、喷司他丁有丝分裂抑制剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂等)以及各种抗肿瘤药(例如天门冬酰胺酶、贝沙罗汀、雌莫司汀、羟基脲、异维甲酸、米托坦、培加帕酶、类维生素A、维生素A酸等)在抑制癌细胞中是非常有效的。然而,它们的效用仍不确定,存在复杂性和问题。例如,基于铂的药物不是治疗癌症的首选,因为这些药物容易被健康组织吸收,且只有少于1%的施用药物到达细胞内靶标(例如肿瘤细胞的细胞核/DNA)。结果,基于铂的和其他癌症药物可能对健康组织毒性极高。因此,需要一种输送系统,专门针对癌细胞的细胞毒性剂的递送。
发明内容
本申请的一个方面涉及一种用于特异性地靶向癌细胞的系统,其包含用高亲和力和选择性的肿瘤细胞配体涂覆并含有细胞毒性剂的行星球磨(PBM)纳米颗粒。
本申请的另一个方面涉及一种用于在需要的受试者中治疗癌症的方法,包括对所述受试者施用有效量的用于特异性地靶向癌细胞的系统,其包含用高亲和力和选择性的肿瘤细胞配体涂覆并含有细胞毒性剂的行星球磨(PBM)纳米颗粒。
本申请的另一个方面涉及在需要的受试者中抑制癌转移,包括对所述受试者施用有效量的用于特异性地靶向癌细胞的系统,其包含用高亲和力和选择性的肿瘤细胞配体涂覆并含有细胞毒性剂的行星球磨(PBM)纳米颗粒。
本申请的另一个方面涉及在需要的受试者中诱导调节性T(Treg)细胞的细胞凋亡,包括对所述受试者施用有效量的用高亲和力和选择性的肿瘤细胞配体涂覆并含有对Treg细胞有细胞毒性的药剂的行星球磨(PBM)纳米颗粒。
附图说明
图1示出了用于制造可生物降解的行星球磨(PBM)纳米颗粒的示例性方法。
图2是由姜黄素调节的分子靶标的图。
图3示出了通过乳腺癌组织和细胞系的叶酸受体的表达。
图4示出了乳腺癌(BrCa)细胞的PBM纳米颗粒介导的细胞凋亡。
图5示出了在MDA-MB-231-Luc异种移植中PBM纳米颗粒介导的肿瘤消退。
图6示出了CD4+CD25高FoxP3+(Treg)细胞的PBM纳米颗粒介导的细胞凋亡。
图7示出了叶酸受体(FRs)由PC3和PTEN-CaP2肿瘤表达,而不是由细胞系或正常细胞表达。
图8示出了在体外顺铂负载的叶酸包覆的PBM纳米颗粒介导的PC3细胞的破坏。
图9示出了接受顺铂溶液(8mg/kg/周)或包含顺铂的叶酸涂覆的XP包层纳米颗粒的移植有PC3-luc瘤的小鼠的肿瘤消退。
图10示出了涂覆和未涂覆的PBM纳米颗粒的粒径分布。
图11示出了涂覆有表面结合叶酸的聚己内酯的PBM纳米颗粒。
图12示出了前列腺肿瘤特异性PBM颗粒的ζ电势。
图13示出了叶酸受体由前列腺细胞系和肿瘤的表达。
图14示出了负载PBM纳米颗粒的姜黄素孵育的PC3细胞的凋亡。
图15示出了制造PBM纳米颗粒的示例性的图。
图16示出了心室内和骨内(intratibialy)注入PC3肿瘤细胞的老鼠。
图17示出了前列腺肿瘤特异性PBM纳米颗粒的粒度分布。
图18示出了前列腺肿瘤特异性PBM纳米颗粒的ζ电势。
图19示出了PBM纳米颗粒处理过的前列腺癌细胞的TUNEL和DRAQ5染色。
图20显示PBM纳米颗粒介导的癌细胞与正常细胞的凋亡。
图21显示PBM纳米颗粒运输到细胞核和TUNEL染色。
具体实施方式
陈述以下的详细描述以使所属领域的任何技术人员能够制造和使用本发明。为了解释的目的,阐述具体的术语以提供对于本发明的完全理解。然而,对于本领域技术人员来讲,显而易见的是这些具体的描述不是实施本发明必需的。具体应用的描述仅作为典型的实例。本发明并不试图限定于所示实施例,而是使与本发明所公开的原理和特征与尽可能广泛的范围相一致。
除非另有限定,否则所使用的与本发明相关的科学和技术术语应该具有由本领域的普通技术人员通常理解的含义。此外,除非上下文另有要求,单数术语应包括复数,复数术语应包括单数。
释义
当在本发明中使用时,下列术语具有以下含义:
当用于本发明中时,术语“癌症(cancer)”指的是恶性新生物或恶性赘生物,是一组细胞显示出不受控制的生长,侵入和破坏邻近组织,有时通过淋巴或血液转移或扩散到身体的其他部位的一类疾病。癌症的这三种恶性与不侵入或转移的良性肿瘤区分开来。术语“癌症”在此包括“癌”、“肉瘤”、“淋巴瘤”、“白血病”、“黑色素瘤”、“胚细胞瘤”和“母细胞瘤”。
当用于本发明中时,术语“肿瘤”指的是由细胞的异常生长而形成的肿瘤或固体病变。肿瘤可以是良性的、恶性前的或恶性的。
当用于本发明中时,术语“癌(carcinoma)”是指一种侵入性恶性肿瘤,包括转化的上皮细胞或未知组织来源的转化细胞,但它们具有与上皮细胞相关的特定的分子的或组织学的特征,例如细胞角蛋白或细胞间桥的产生。本发明的典型的癌包括黑色素瘤、卵巢癌、阴道癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛细胞瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脑癌、成神经管细胞瘤、神经外胚层瘤、神经胶质瘤、垂体癌和骨癌。
当用于本发明中时,术语“肉瘤”是指由结缔组织产生的癌症,例如骨、软骨、脂肪和神经组织,每一种从起源于骨髓外的间充质细胞中的细胞发育而来,即一种由在从胚胎的中胚层发育的许多组织中的一种组织中的转化细胞产生的癌症。因此,肉瘤包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血管和造血组织的肿瘤。例如,骨肉瘤来自骨,软骨肉瘤来自软骨,脂肪肉瘤来自脂肪,平滑肌肉瘤来自平滑肌。典型的肉瘤包括:Askin肿瘤、葡萄状肉瘤(botryodies)、软骨肉瘤、Ewing's-PNET、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤。软组织肉瘤的次级分类包括:腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤、上皮样肉瘤骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、Kaposi肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。
当用于本发明中时,术语“淋巴瘤”是指由离开骨髓并在淋巴结中成熟的造血细胞所产生的免疫系统的淋巴细胞的癌症。淋巴瘤通常呈现为实体瘤。典型的淋巴瘤包括:小淋巴细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病、塞泽里综合征(sezary syndrome)、原发性皮肤CD30-阳性T细胞淋巴增生性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非指定外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。典型霍奇金淋巴瘤的代表形式包括:结节性硬化、混合细胞性、富淋巴细胞、淋巴细胞耗尽或非耗尽。
当用于本发明中时,术语“白血病”是指由离开骨髓并在血液中成熟的造血细胞所产生的癌症。白血病是涵盖广泛疾病的广义术语。反过来,它是称为血液肿瘤的更广泛的一组疾病的一部分。白血病被细分成各种大类,第一部是介于白血病急性和慢性形式之间。急性白血病的特征在于,未成熟的血细胞的数量迅速增加。由于这种细胞的聚集,使骨髓无法产生健康的血细胞。慢性白血病的特征是相对成熟的白血细胞的过度积聚,但仍然不正常。通常经过几个月或几年的发展,细胞以比正常细胞高得多的速率产生,导致血液中许多异常的白血细胞。白血病也通过影响血细胞细分。这种区分将白血病划分为淋巴细胞或淋巴细胞性白血病和髓细胞或骨髓性白血病。在淋巴细胞或淋巴细胞性白血病中,癌性变化发生在一类通常会形成为淋巴细胞的骨髓细胞中。在骨髓细胞或骨髓性白血病中,癌性变化发生在一类通常形成为红细胞的骨髓细胞中、某些其它类型的白细胞和血小板中。结合这两种分类,共提供四种主要类型。在这四个主要类型的每一种中,通常有几种小类。也有这种分类方法以外的罕见的类型。典型的白血病包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、T-细胞幼淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞性白血病、未成熟骨髓单核细胞性白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、伯基特细胞白血病、成熟T-细胞白血病。
当用于本发明中时,术语“黑色素瘤”是一种黑素细胞的癌症或恶性肿瘤。黑素细胞是产生暗色素、黑色素(负责皮肤的颜色)的细胞。它们主要在皮肤中发生,但在身体的其他部位也发现过,包括肠和眼睛。黑色素瘤分为以下定型和亚型:恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑素瘤、黏膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、黑色素瘤促纤维增生、无色素性黑色素瘤、软组织恶性黑色素瘤、有小痣样细胞的黑色素瘤、有斯皮茨痣特征的黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤。
当用于本发明中时,术语“生殖细胞肿瘤”是指由生殖或多能干细胞衍生的癌症,包括存在于睾丸(精原细胞瘤)或卵巢(无性细胞瘤)的那些细胞。生殖细胞肿瘤可以是癌性或非癌性肿瘤。生殖细胞通常发生在性腺(卵巢和睾丸)内,起源于性腺外的生殖细胞肿瘤可能是在胚胎发育过程中的错误所导致的出生缺陷。生殖细胞肿瘤大致分为两大类:生殖细胞瘤的或精原细胞瘤的和非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤。典型的生殖细胞瘤的或精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤包括:生殖细胞瘤、无性细胞瘤和精原细胞瘤。典型的非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤包括:胚胎癌、内胚窦瘤或卵黄囊瘤(EST,YST)、绒毛膜癌、成熟性畸胎瘤、皮样囊肿、未成熟畸胎瘤、恶性转化畸胎瘤、多胚瘤、性腺胚细胞瘤和混合型GCT。
当用于本发明中时,术语“胚细胞瘤”是指由未成熟前体细胞或胚胎组织衍生的癌症。
当用于本发明中时,术语“BrCa”指的是乳腺癌。在这里使用的术语“PCa”是指前列腺癌。
当用于本发明中时,术语“转移”是指癌症或癌从一个器官或部分扩散到另一个非相邻的器官或部分。
当用于本发明中时,术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分,即含有与抗原特异性结合(发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。术语“抗体”在最广泛的意义上使用,特别地覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体),以及抗体片段,只要它们表现出期望的生物学活性。由“特异性结合”或“发生免疫反应”是指该抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇发生反应,不与其它多肽发生反应(即结合)或与其它多肽以更低的亲和力结合。术语“抗体”还包括包含全长抗体的一部分(通常是其抗原结合区或可变区)的抗体片段。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;双抗体、线性抗体、单链抗体(scFv)分子;以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在本发明的某些实施方式中,例如,可能理想的是使用抗体片段而非完整抗体来提高肿瘤穿透。在这种情况下,为了增加其血清半衰期,可能理想的是使用已通过本领域已知的任何方法修饰的抗体片段。
当用于本发明中时,术语“单克隆抗体”指从实质上同质的抗体群获得的抗体,即除了可能天然发生的少量存在的突变之外,构成群体的各个抗体是相同的。特别地,在本发明中单克隆抗体包括“嵌合”抗体,以及此类抗体的片段,只要它们表现出期望的生物学活性,其中,重链和/或轻链的一部分与由特定物种衍生的或属于特定抗体类别和亚类的抗体中的序列相同或同源,而其余的链是与由其他物种衍生的或属于其他抗体类别和亚类的抗体中的序列相同或同源。
非人抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体),其中,来自受体的高变区残基由来自非人物种(供体抗体),例如小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和力和/或能力的非人灵长类动物的高变区残基替换。用于制备人源化的和其它嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。
“双特异性抗体”是具有对于至少两种不同抗原的结合特异性的抗体。用于制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。
“异源结合抗体(heteroconjugate antibodies)”的使用也在本发明的范围之内。异源结合抗体由两种共价连接的抗体组成。例如,有人提出此类抗体使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)。可以设想,可以用合成蛋白质化学中已知的方法(包括涉及交联剂的方法)在体外制备该抗体。
本申请还考虑使用“免疫偶联物(immunoconjugates)”,包含与诸如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素,或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)的细胞毒性剂结合的抗体。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链(ricin A chain)、相思豆毒蛋白A链(abrin A chain),蒴莲根毒素A链(modeccin Achain)、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单孢霉烯族毒素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射性偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
为治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物,包括人类、非人类的灵长类动物、家畜和农畜,以及动物园、运动或宠物动物,例如狗、马、猫、牛等,优选地,所述哺乳动物是人。
当用于本发明中时,术语“治疗(treat、treating或treatment)”是指减轻或消除疾病和/或其并发症的方法。当用于本发明中时,术语“预防(prevent、preventing或prevention)”是指限制受试者罹患疾病和/或其并发症的方法。在某些实施方式中,“预防(prevent、preventing或prevention)”是指降低罹患疾病和/或其并发症的风险的方法。
术语“抑制”是相对的术语,相对于参照试剂,如果施用药剂后,反应或状态从数量上减弱,或者,如果施用药剂后,其被减弱,则药剂抑制反应或状态。类似地,术语“防止”并不一定意味着药剂完全消除了反应或状态,只要消除了反应或条件中的至少一种特性即可。因此,可以减少或防止肿瘤生长或反应(例如病理反应)组合物,可以但不必完全消除上述增长或反应,只要生长或反应可测量地减弱,例如,比在没有药剂的生长或反应或者与参照药剂相比,减少至少约50%,例如至少约70%、或约80%,或甚至约90%(即至其10%以下)。
术语“提高水平”指的是高于在相关领域中通常限定或使用的正常或对照水平的更高水平。例如,在组织中免疫染色增加的水平是本领域的普通技术人员认为比在对照组织中的免疫染色水平更高的水平。
当用于本发明中时,术语“生物样品”是指生物来源的材料,其可以是体液或身体产物,例如血液、血浆、尿液、唾液、脊髓液、粪便、汗液或呼出的空气。生物样品还包括组织样品和细胞样品。
在本发明中,范围可以表示为从“约”一个特定值,和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时,另一种实施方式包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地,当数值表示为近似值时,通过使用先行词“约”,可以理解的是,该特定值形成另一种实施方式。可以进一步理解为,每个范围的端点相对于另一端点是显著的,并且独立于另一端点。也可以理解的是,本发明中公开了一些值,并且除了该值本身,每个值在本发明中也以“约”的特定值公开。例如,如果公开了“10”的值,那么“约10”也被公开。正如本领域技术人员的适当理解,还应当理解的是,当以“小于或等于”某值公开该值时,“大于或等于该值”以及数值间可能的范围也被公开。例如,如果公开了“10”的值,则“小于或等于10”以及“大于或等于10”也被公开。
在本申请的上下文中,“有效量”是指足以实现有益的或期望的结果的组合物的量,例如,预防或治疗疾病的有效量。“疾病”指会受益于抗体治疗的任何状态,包括癌和化学抗性。这包括慢性和急性疾病,或包括使哺乳动物易于罹患所讨论的疾病的那些病理状态的疾病。
携带特异性靶向癌细胞的纳米颗粒的药物
本申请的一个方面涉及携带特异性靶向特定细胞的纳米颗粒的药物,例如肿瘤细胞和调节性T细胞(Treg细胞)。在一些实施方式中,携带纳米颗粒的药物包括一个行星球磨纳米颗粒核,一种或多种细胞毒性剂,以及一种或多种细胞靶向剂。在某些实施方式中,所述一种或多种细胞毒性剂包括姜黄素,所述一种或多种细胞靶向剂包括叶酸。在某些其它实施方式中,一种或多种细胞毒性剂包含姜黄素和一种或多种其他细胞毒性剂。本申请的携带药物的纳米颗粒允许使用较低剂量的细胞毒性药物,降低不良反应,提高疗效,并减少药物被迅速从靶标肿瘤或癌细胞清除的可能性。例如,本申请的携带药物的纳米颗粒能够靶向并由乳腺或前列腺癌细胞吸收,从而有效地将化学治疗剂运送到癌细胞中的细胞内靶标,并携带充足的药物以完成细胞凋亡过程来限制化学抗性和全身毒性的可能性。
行星球磨(PBM)纳米颗粒
如在本发明中所用,术语“PBM纳米颗粒”和“XPclad纳米颗粒”是相同的,可以互换使用。在一些实施方式中,所述PBM纳米颗粒的直径的范围为0.1nm-60μm、0.1nm-1μm、0.1nm-500nm、0.1nm-200nm、1nm-200nm、5nm-60μm、5nm-30nm、30nm-80nm、30nm-180nm、80nm-1μm、180nm-1μm、200nm-1μm、1μm-6μm、4μm-12μm和10μm-60μm。在其它实施方式中,所述PBM纳米颗粒可以是生物可降解的纳米颗粒。可以使用一种新配方的方法来产生大小均匀,100%的疏水性或亲水性药物负载效率,含有用于靶向递送的后续涂层并控制用于全身性、口服或皮肤运送的表面的logP(用于亲脂性:亲水性分布的度量)的颗粒,以制造PBM纳米颗粒。
本申请中描述的PBM纳米颗粒表示使用行星球磨机以产生均匀尺寸的,100%的疏水性或亲水性药物负载效率,含有用于靶向递送的后续涂层并控制用于全身性、口服或皮肤运送的表面的logP的颗粒的新型纳米颗粒制剂方法。这些是通过以RES设计表面特性靶向乳腺肿瘤的FR1和无间隙的FR4表达Treg细胞的均匀大小的颗粒得到的PBM纳米颗粒的首次研究。
在一些实施方式中,所述PBM纳米颗粒包括纳米基质芯,包括一种或多种可生物降解的聚合物或多糖,例如藻酸盐、纤维素、胶原蛋白和淀粉。其它合适的可生物降解的聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚羟基丁酸酯-戊酸酯(PHBV)、聚乙烯醇(PVA)、聚对苯二甲酸乙酯(PET)、聚乙交酯-丙交酯、聚己内酯(PCL)、乳酸-ε-己内酯共聚物(PLCL)、聚二噁烷酮(PDO)、聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)、聚(氨基酸)、聚二噁烷酮、聚草酸酯、聚酐、聚(磷酸酯)、聚原酸酯以及它们的共聚物。在某些实施方式中,所述纳米颗粒核心的基质包括PEG和选自藻酸盐、纤维素、胶原蛋白和淀粉的聚合物或多糖的混合物。细胞毒性剂的分子截留在纳米颗粒核基质中。在一些实施方式中,细胞毒性剂在基质芯的形成过程中与生物可降解聚合物和多糖混合。在其他实施方式中,首先形成基质芯,在随后的阶段中加载细胞毒性剂。
在一些实施方式中,所述基质的核心是通过将生物聚合物(例如藻酸盐、纤维素、胶原蛋白和淀粉)溶解在水中以形成水溶液,将细胞毒性剂加入到该水溶液中以形成生物聚合物/细胞毒性剂的混合物,并任选地将另一种聚合物(例如PEG)加入到该生物聚合物/细胞毒性剂的混合物中以形成最终混合物。将该最终混合物干燥为颗粒或片剂的形式,然后在受控的温度(<37℃)下使用行星式球磨机研磨。可以通过行星球磨的速度和时间控制纳米颗粒的尺寸。在一些实施方式中,所述纳米颗粒的尺寸范围为0.1至5nm、5至30nm、30至80nm、30至180nm、180至1000nm或200至1000nm。研磨速度范围为100-600rmp,优选200-400rmp。
在其它实施方式中,所述PBM纳米颗粒进一步用释放控制聚合物涂覆以控制内含物释放的时间、提高颗粒的机械强度和/或稳定PBM纳米颗粒中的活性成分。适合的用于释放控制涂层的聚合物包括但不限于聚己内酯(PCL)和聚乙二醇。在其它实施方式中,所述PBM纳米颗粒可以被进一步涂布,与肿瘤特异性或细胞/组织特异性的靶向剂结合或修饰。所述肿瘤特异性或细胞/组织特异性的靶向剂的实例包括但不限于赖氨酸、多肽、抗体和叶酸。
如图1所示,由于PEG-涂层和具有负的LogP值,可生物降解的行星球磨(PBM)纳米颗粒具有提高的包封药物的血清半衰期。
目前有几种用于药物递送的纳米载体:聚合物、胶束、树枝状聚合物、脂质体、白蛋白、病毒、碳纳米管以及氧化硅/金属。然而这些纳米颗粒存在一定的限制(即非均匀的尺寸、难以制造和/或缺乏靶向),降低了它们的实用性。
在一些实施方式中,通过涂布口服抗癌剂(包括但不限于沙铂、卡培他滨、厄洛替尼)配制成用于口服递送的PBM纳米颗粒。用于口服递送的纳米颗粒调节:用于肠道吸收的表面logP值,在首过效应中水解的共聚物的添加,通过肝脏胆道系统无肝毒性地转运,对原发或转移性肿瘤(包括乳腺癌和前列腺肿瘤)的靶向-全身性传递。也可制成制剂以包括用于检测微转移灶和活化处理的基板。
细胞毒性药剂
具有不同的胞内靶标的各种细胞毒性药剂可以诱导细胞凋亡的相同表型。这意味着细胞毒性药剂的细胞毒素活性不是完全依赖于特定的药物-靶标相互作用,而且还依赖于癌细胞的凋亡(细胞信号传导)系统的活性。细胞毒性药剂的实例包括但不限于基于铂的药物(例如卡铂、顺铂、奥沙利铂、沙铂、三铂替群妥英和卡铂等)、天然的酚类(例如小豆蔻、姜黄、高良姜、生姜、内亚胡椒、姜黄等)、植物生物碱和紫杉烷类(例如喜树碱、多西他赛、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春新碱等)、其它的烷基化剂(例如六甲蜜胺、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、乙撑亚胺、六甲蜜胺、肼、异环磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法仑、亚硝基脲、胡椒碱、丙卡巴肼、链佐星、替莫唑胺、塞替派、三嗪等)、肿瘤抗生素和蒽环类抗生素(例如博莱霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)、拓扑异构酶抑制剂(例如安吖啶、依托泊苷、伊立替康、替尼泊苷、托泊替康等)、抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、腺苷脱氨酶抑制剂、卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、奈拉滨、喷司他丁有丝分裂抑制剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂等)以及杂抗肿瘤药(例如天冬酰胺酶、贝沙罗汀、雌莫司汀、羟基脲、异维甲酸、米托坦、培门冬酶、类视黄酸、维A酸,等等)。
基于铂类的治疗法广泛使用,通过破坏DNA和通过细胞色素C释放及随后的半胱天冬酶激活来诱导细胞凋亡而发挥功能。许多化疗耐药的细胞系对于基于铂的药物(例如多西紫杉醇和卡铂)更敏感。但是,这些药物有许多副作用,包括但不限于:嗜中性白血球减少症、肝功能障碍、贫血(70%)、恶心(40%)、感染(20%)、神经肌肉功能障碍(15%)、肾功能衰竭,以及可能的心脏毒性-接受此种治疗的患者死亡率上升为1.7%。这些副作用意味着需要创新方法,从而克服或规避药物疗效的内在机理、耐药性、毒性以及同时阻碍早期原发性或预发性(例如,转移性三重阴性)疾病。
尽管以多西他赛进行了广泛的临床试验,对于其功效和毒性仍有较高水平的不可预测性,这限制了其应用。多西他赛由CYP3-介导的氧化进行代谢,,这导致具有降低了的细胞毒性的代谢产物。这种排除途径部分是由药物外排转运体ABCB1支配,但在ABCB1基因中的C1236T多态性显著地降低多西他赛清除率。也有证据表明,在编码的DNA修复基因中的多态性(例如NER和BER)和代谢灭活酶可能有助于在抗肿瘤功效以及卡铂毒性方面的个体差异。几种机制说明,赋予毒性,降低敏感性和对于卡铂(包括外排泵(例如ABCB1))的耐受性,提高解毒酶,分别与NER和BER相关。在以基于铂类的疗法的背景下,这些多态性可以减少NER/BERd的功能和铂-DNA损伤的修复。
在一种具体的实施方式中,所述细胞毒性剂是姜黄素。在另一种实施方式中,所述细胞毒性剂包含姜黄素和一种或多种其他细胞毒性剂。
在另一种具体实施方式中,所述细胞毒性剂选自化疗剂、放射性偶联物、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性的任何其他药剂。
在另一种实施方式中,所述化疗剂选自基于铂的药物、天然酚、植物生物碱和紫杉烷类、其他烷化剂、肿瘤抗生素和蒽环类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物以及各种抗肿瘤药物。
在又一种实施方式中,所述放射性偶联物包含选自212Bi、131I、131In、90Y、188Tu和186Re的放射性同位素。
在又一种实施方式中,所述抗体能够与选自以下的肿瘤相关抗原结合:腺苷受体、αVβ3整合素、氨肽酶P、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白1、趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、Ras、P53、Her2/Neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂B4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶和酪氨酸激酶。
在又一种实施方式中,所述对于癌细胞有细胞毒性的药剂选自白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素、单端孢子菌霉菌毒素以及它们的片段。
姜黄素
姜黄素(姜黄素diferuloylmethane)是一种来源于植物姜黄的多酚,通常称为姜黄。其在印度草药学中保持高度地位,众所周知的作为“具有抗氧化剂、抗炎、抗致癌、抗增殖和抗血管生成特性的身体清洁剂”的疏水性天然化合物。然而姜黄素的疏水性导致其生物利用性差,这阻碍了姜黄素的功效和作为抗癌剂的有效作用。因此,关键的挑战是将姜黄素直接递送到肿瘤细胞以提高其效用,并诱导癌细胞的死亡,同时防止损害正常细胞。
能够克服姜黄素较差的生物利用性并避免网状内皮系统(RES)间隙的长循环纳米颗粒会导致具有增加的通透性和有缺陷的淋巴引流(即增强通透性和保留EPR效应)的肿瘤的聚集。这些纳米尺寸的媒介的吸收有许多优点,包括由于靶向给药而显著地减少全身毒性。这些纳米颗粒防止化学抗性的出现也是合理的。纳米颗粒能够靶向并由前列腺肿瘤吸收,会有效地递送姜黄素以扰乱细胞内的靶标,并在生物利用上充分地诱导肿瘤细胞的凋亡过程。
释放控制聚合物涂层
所述释放控制聚合物涂层控制释放内含物的时间,增加涂层PBM纳米颗粒的机械强度,和/或稳定PBM纳米颗粒的活性成分。适合的释放控制涂层的聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚己内酯(PCL)、化学改性PCL和它们的混合物。在一些实施方式中,所述控制释放聚合物涂层PBM纳米颗粒进一步以针对特异性靶标(例如,肿瘤细胞或Treg细胞)的细胞靶向药剂涂布、结合或修饰。
细胞靶向药剂
细胞靶向药剂允许含药物的纳米颗粒靶向附加物中的细胞的特定类型。细胞靶向药剂的实例包括但不限于结合到或靶向肿瘤相关抗原的小分子(例如叶酸、腺苷、嘌呤)和大分子(例如肽或抗体)。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于腺苷受体、αVβ3、氨肽酶P、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白-1、趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、Ras、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂B4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶以及和酪氨酸激酶。在一些实施方式中,细胞靶向药剂是与叶酸受体(FRs)特异性结合的叶酸或叶酸衍生物。
所述还原性叶酸载体(RFC)是低亲和力、高容量系统,其介导还原性叶酸在药理(μM)浓度下吸收到癌细胞中。生理叶酸的浓度在5至50nM的范围内。因此,存在高亲和力的人FRs并由一个家族基因编码,其同源产物称为FRα、β、γ、δ型,其也分别描述为FR1、FR2、FR3、FR4。膜同种型FR1、FR2和FR4可以结合并运输叶酸或叶酸衍生物进入细胞内,而FR3缺少膜锚定点并从细胞中分泌。FR1和FR2分别以类似但不同的亲和力结合叶酸和6S 5-甲酰四氢叶酸(即亚叶酸钙),亲和力1.5nM对0.35nM(叶酸)以及和800nM对7nM(亚叶酸钙)。6S 5-甲基四氢叶酸是在血液中占主导地位的叶酸,并对于FR1和FR2具有相似的亲和力,分别为55nM和1nM。而PC3人前列腺癌细胞在培养基中不显著表达FR(例如FR1),FRs是由PC3肿瘤表达。FRs还通过BrCa细胞表达,与不良后果或通过这些受体运输叶酸(不管对于甲氨蝶呤的抗性)有关。
大多数非增殖性组织缺乏功能性FR表达。在增殖性正常组织中的FR表达仅限于某些上皮细胞的腔表面,从而无法进入循环。然而,在恶性肿瘤和白血病中存在的高水平的FR2(高亲和力受体)暴露于循环中,使得它们成为用于肿瘤特异性疗法的有吸引力的候选者。肾脏(其中FR1(中度亲和力受体)的表达在近端小管)由排除肾小球滤过的FR-靶向性治疗来保护。进一步保护是肾叶酸保护机制的结果,其中,通过肾小管细胞的FR-介导的内吞后,还有叶酸的迅速分解和运输穿过基底膜进入血液。
癌细胞的氨甲喋呤抗性主要依赖于在二氢叶酸还原酶基因中的变化,降低的细胞内聚谷氨酸、增加的经由RFC流出和运输;由于这种治疗是通过FR结合和运输,仅仅适度地影响甲氨蝶呤耐药肿瘤的作用,因此,不太可能存在对本申请的生物降解的行星球磨(PBM)纳米颗粒的抗性。
在PBM纳米颗粒中叶酸作为靶向剂的应用还允许肿瘤细胞和调节性T(Treg)细胞。广泛认可的是,大量的Treg细胞抑制肿瘤的免疫力。具体而言,T reg细胞抑制(外部和自身)反应性T细胞,而不是通过接触-依赖或细胞因子(例如IL-10、TGF-β等)分泌杀死它们。FR4在Treg细胞中选择性地上调。已经表明FR4的抗体阻断耗尽Treg细胞并引起荷瘤小鼠的肿瘤免疫。因此,携带细胞毒性剂的叶酸-涂层PBM纳米颗粒将吸收用于其破裂的FR-表达细胞,其包括直接(即BrCa细胞)和间接(即乳腺肿瘤相关及周边Treg细胞)抑制肿瘤发展。
在另一种实施方式中,所述靶向剂是能够结合肿瘤相关抗原的选自但不限于以下各项的抗体或肽:腺苷受体、αVβ3、氨肽酶P、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白-1、趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂B4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
治疗方法
本申请的另一个方面涉及用于在所需要受试者中治疗癌症的方法,其包括给所述受试者施用有效量的包括含有细胞毒性剂和细胞靶向剂的行星球磨(PBM)纳米颗粒的药物组合物。在一些实施方式中,所述细胞靶向剂是叶酸或叶酸衍生物。
含有药物的PBM纳米颗粒是能够抗巨噬细胞的吞噬作用并避免网状内皮系统(RES)间隙的长循环纳米颗粒,这反过来,将导致具有增加的透气性和有缺陷的淋巴引流(即增强通透性和保留-EPR效应)的肿瘤积聚。这些纳米尺寸的载体的吸收有许多益处。由于靶向递送,本申请的含药物的PBM纳米颗粒显著地减少全身毒性。
在其它实施方式中,本申请的含药物的PBM纳米颗粒防止耐药性的出现。耐药性通过两个主要机制介导:(i)足够量的细胞毒性药物未到达所述靶向细胞(和胞内作用位点)和(ii)细胞凋亡机制的诱导后未能完成细胞死亡。能够靶向并由乳腺肿瘤吸收的纳米颗粒有效地递送化学治疗剂和细胞内的靶标,并携带足够的药物以完成细胞凋亡过程。
在一些实施方式中,所述癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和生殖细胞瘤。
在另一种实施方式中,所述癌是前列腺癌。在一些其它实施方式中,所述癌症是前列腺癌并且本申请的药物组合物有效量的维生素D结合施用。在一些男性的极低的维生素D状态也在PCa过程中显示。此外,抗癌药物相关的低钙血症通常是温和的,但如果患者有预先存在维生素D缺乏,则可能是严重的。由于基于铂类的癌症治疗和调节NER基因的靶标以调节DNA修复(这有助于前列腺癌的发展和对药物的反应),维生素D能有效防止肾毒性。
在又一种实施方式中,所述癌是乳腺癌。
在另一种具体实施方式中,所述细胞毒性剂是姜黄素。
在另一种具体实施方式中,所述细胞毒性剂选自化疗剂、放射性偶联物、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性的任何其他药剂。
在另一种实施方式中,所述化疗剂选自基于铂的药物、天然酚、植物生物碱和紫杉烷类、其他烷化剂、肿瘤抗生素和蒽环类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物以及各种抗肿瘤药物。
在又一种实施方式中,所述放射性偶联物包含选自212Bi、131I、131In、90Y、188Tu和186Re的放射性同位素。
在又一种实施方式中,所述能够结合肿瘤相关抗原的抗体或肽包括但不限于以下各项:腺苷受体、αVβ3、氨肽酶P、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白-1、趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂B4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
在又一种实施方式中,对癌细胞有细胞毒性的试剂选自白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链,蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素,以及它们的片段。
在另一种具体实施方式中,所述细胞毒性剂包括天然苯酚和选自化学治疗剂、放射性偶联物、抗体、肽、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性的任何其他药剂中的一种或多种其他细胞毒性剂。
本申请的另一个方面涉及在需要的受试者中抑制癌转移,包括对所述受试者施用有效量的包括含有细胞毒性剂和细胞靶向剂的行星球磨(PBM)纳米颗粒的药物组合物。在一些实施方式中,所述细胞靶向剂是叶酸或叶酸衍生物。
在一种具体实施方式中,所述癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。
在另一种实施方式中,所述癌是前列腺癌。
在又一种实施方式中,所述癌是乳腺癌。
在另一种具体实施方式中,所述细胞毒性剂是姜黄素。
在另一种具体实施方式中,所述所述细胞毒性剂选自化学治疗剂、放射性偶联物、抗体、肽、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性的任何其他药剂。
在另一实施方式中,所述化疗剂选自基于铂的药物、天然酚、植物生物碱和紫杉烷类、其他烷化剂、肿瘤抗生素和蒽环类、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物以及各种抗肿瘤药物。
在又一种实施方式中,所述放射性偶联物包含选自212Bi、131I、131In、90Y、188Tu和186Re的放射性同位素。
在又一种实施方式中,所述能够结合肿瘤相关抗原的抗体或肽包括但不限于以下各项:腺苷受体、αVβ3、氨肽酶P、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白-1、趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂B4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
在又一种实施方式中,对癌细胞有细胞毒性的试剂选自白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链,蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素,以及它们的片段。
在另一种具体实施方式中,所述细胞毒性剂包括姜黄素和选自化学治疗剂、放射性偶联物、抗体、肽、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及对癌细胞有细胞毒性的任何其他药剂中的一种或多种其他细胞毒性剂。
在另一种具体实施方式中,靶向配体包括能够与以下肿瘤相关抗原结合的抗体或肽,但不限于此:腺苷受体、αVβ3、氨肽酶P、α-胎儿蛋白、癌抗原125、癌胚胎抗原、小窝蛋白-1、趋化因子受体、丛生蛋白、癌胚抗原、CD20、上皮性肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、RAS、P53、HER2/neu、ErbB2、ErbB3、ErbB4、叶酸受体、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原、嘌呤受体、辐射诱导的细胞表面受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂B3、丝氨酸蛋白酶抑制剂B4、鳞状细胞癌抗原、血小板反应蛋白、肿瘤抗原4、肿瘤相关糖蛋白72、酪氨酸酶、酪氨酸激酶等。
本申请的另一个方面涉及在需要的受试者中诱导调节性T(Treg)细胞的细胞凋亡,其包括:对所述受试者施用有效量的包括含有细胞毒性剂和细胞靶向剂的行星球磨(PBM)纳米颗粒的药物组合物。在一些实施方式中,所述细胞靶向剂是叶酸或叶酸衍生物。
本发明的另一个方面涉及含有一种以上的化学治疗剂的叶酸涂层的可生物降解的PBM纳米颗粒在治疗癌症的发展中的应用。负载多西紫杉醇或卡铂的叶酸涂覆PBM纳米颗粒增强了对肿瘤的治疗效果,降低毒性,并通过靶向和诱导BrCa细胞和Treg细胞的细胞凋亡以增加肿瘤免疫力。
本申请的另一个具体方面涉及涂布有叶酸的负载姜黄素的PBM纳米颗粒的靶向递送以增强体内效力并改进现有的化学预防癌症的策略。
本发明的另一个方面是与受试者预先的治疗结合,给受试者用含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒治疗,同时或之后,用至少一种治疗有效量的其它治疗剂(包括但不限于不包含在PBM纳米颗粒的姜黄素或化疗剂)。在一些实施方式中,所述不包含在PBM纳米颗粒中的化学治疗剂选自卡铂、顺铂、多西他赛和奥沙利铂。
本申请的药物组合物可以用已知的方法对受试者给药,例如作为推注的或通过连续输注一段时间的静脉内给药、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。在某些实施方式中,本申请的药物组合物直接给药至肿瘤或癌组织,包括在侵入性手术中直接给药至肿瘤床。本申请的药物组合物也可以放置在固体支持物(例如海绵或纱布)上施加到受感染的组织中。本申请的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒可以以通常接受的药学上可接受的载体来施用。可接受的载体包括但不限于生理盐水、缓冲盐水和生理盐水中的葡萄糖。
例如,适当剂量(“治疗有效量”)的本申请的药物组合物取决于待治疗的疾病、病情的严重程度和状态进程、本申请的药物组合物给药是用于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史、对包含在所述药物组合物中的细胞毒性剂的反应、所使用的细胞毒性剂的种类以及主治医师的诊断。本申请的药物组合物可以适当地一次或在一系列治疗中施用给患者,并且可以在自诊断起的任何时间施用给患者。本申请的药物组合物可以作为单独治疗或者与对于所讨论的治疗状态中有用的其他药物或疗法相结合来给药。
在一些实施方式中,本申请的药物组合物含有姜黄素,以0.1mg/kg至100mg/kg、0.5mg/kg至100mg/kg、0.1mg/kg至50mg/kg、0.5mg/kg至50mg/kg、1.0mg/kg至20mg/kg、2.5mg/kg至50mg/kg、2.5mg/kg至20mg/kg以及5mg/kg至10mg/kg的日姜黄素剂量范围给药。含姜黄素的PBM纳米颗粒可以连续给药,每小时,每天4次,每天3次,每天2次,每天一次,或者每2、3、4、5、6和7天一次,或者每1、2、3或4周一次。
作为一般的建议,无论是通过一次或多次给药,包含在PBM纳米颗粒中的治疗有效量的每种细胞毒剂(例如姜黄素或顺铂),以约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的范围给药。在一种具体实施方式中,包含在PBM纳米颗粒中的每种细胞毒剂以以下范围给药:从约1ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、约1ng/kg体重/天至大约10ng/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至大约10μg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约1μg/kg体重/天至约10μg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约10μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约100μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天,约1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天、约10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。
在另一种实施方式中,包含在PBM纳米颗粒中的每种细胞毒性剂以以下范围给药:每个体给药约10ng至约100ng、每个体给药约10ng到约1μg、每个体给药约10ng到约10μg、每个体给药约10ng到约100μg、每个体给药约10ng到约1mg、每个体给药约10ng到约10mg、每个体给药约10ng至约100mg、每次注射约10ng至约1000mg、每个体给药约10ng到约10,000mg、每个体给药约100ng至约1μg、每个体给药约100ng至约10μg、每个体给药约100ng至约100μg、每个体给药约100ng至约1mg、每个体给药约100ng至约10mg、每个体给药约100ng至约100mg、每次注射约100ng至约1000mg、每个体给药约100ng至约10,000mg、每个体给药约1μg到约10μg、每个体给药约1μg到约100μg、每个体给药约1μg到约1mg、每个体给药约1μg到约10mg、每个体给药约1μg到约100mg、每次注射约1μg到约1000mg、每个体给药约1μg到约10,000mg、每个体给药约10μg到约100μg、每个体给药约10μg到约1mg,每个体给药约10μg到约10mg、每个体给药约10μg到约100mg、每次注射约10μg到约1000mg、每个体给药约10μg到10,000mg、每个体给药约100μg到约1mg、每个体给药约100μg至约10mg、每个体给药约100μg至约100mg、每次注射约100μg至约1000mg、每个体给药约100μg至约10,000mg、每个体给药约1mg至约10mg、每个体给药约1mg到约100mg、每次注射约1mg至约1000mg、每个体给药约1mg到约10,000mg、每个体给药约10mg至约100mg、每次注射约10mg至约1000mg、每个体给药约10mg至约10,000mg、每次注射约100mg至约1000mg、每个体给药约100mg至约10,000mg以及每个体给药约1000mg到约10,000mg。包含在PBM纳米颗粒中的化学治疗剂可以每天、或每2、3、4、5、6和7天、或每1、2、3或4周给药。
在其他的具体实施方式中,包含在PBM纳米颗粒中的每种细胞毒性剂的给药量为或是约为:0.0006mg/天、0.001mg/天、0.003mg/天、0.006mg/天、0.01mg/天、0.03mg/天、0.06mg/天、0.1mg/天、0.3mg/天、0.6mg/天、1mg/天、3mg/天、6mg/天、10mg/天、30mg/天、60mg/天、100mg/天、300mg/天、600mg/天、1000mg/天、2000mg/天、5000mg/天或10,000mg/天。正如预期的那样,所述剂量取决于患者的病情、体重、年龄和状况。正如预期的那样,所述剂量取决于患者的病情、体重、年龄和状况。
所述含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒可以按照适当地或表明的通过丸剂或通过连续输注的单剂量,或通过丸剂或通过连续输注作为多剂量来给药。例如,多剂量可以每天多次,每日一次,每2、3、4、5、6或7天,每周,每2、3、4、5或6周或每月一次给药。然而,其它剂量方案也可利用。此疗法的进程易于通过常规技术来监测。
在本发明的具体实施方式中,治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒可以作为唯一的治疗剂给需要的受试者给药。在具体实施方式中,治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒杀死肿瘤或癌症细胞或促进其凋亡。在另一种具体实施方式中,治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌的形成。在进一步的具体实施方式中,治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌细胞从现有的肿瘤或癌细胞中的迁移或转移。在又一具体实施方式中,治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌症细胞侵入非癌组织。
在本发明的具体实施方式中,治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒可以与一种或多种附加的治疗有效的细胞毒性剂结合以施用给需要的受试者。一种或多种附加的治疗有效的细胞毒性剂也可以在具有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒施用之前、与其同时、和/或之后来施用。
在具体的实施方式中,治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒增强所述的一种或多种附加的治疗学上有效的细胞毒性剂杀死肿瘤或癌症细胞的有效性。在一种更具体的实施方式中,治疗有效量的包含细胞毒性剂的PBM纳米颗粒减少了所述的一种或多种附加的治疗学上有效的细胞毒性剂用于杀死肿瘤或癌症细胞所需要的量。在一种更具体的实施方式中,治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌症细胞从已形成的肿瘤或癌迁移或转移,增强所述的一种或多种附加的治疗学上有的细胞毒性剂杀死肿瘤或癌症细胞的局部有效性。在又一种具体实施方式中,治疗有效量的含有细胞毒性剂的PBM纳米颗粒抑制或防止肿瘤或癌症细胞向非癌组织侵入,增强所述的一种或多种附加的治疗学上有效的细胞毒性剂杀死肿瘤或癌症细胞的局部有效性。
在另一种实施方式中,所述的PBM纳米颗粒包含对癌细胞具有细胞毒性的药剂。在一些实施方式中,所述对癌细胞具有细胞毒性的药剂选自白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素,以及它们的片段。
本发明通过下面的实施例进一步说明,而不应该解释为限制。本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请,以及图和表的内容,通过引用并入本发明。
实施例1:制备行星球磨纳米颗粒
首先,将10%至15%(w/v)的藻酸盐、纤维素、胶原蛋白、淀粉、乳糖、其它生物聚合物或它们的混合物(赋形剂/生物聚合物)溶解在水中,并使用均化器混合。接着,将10%至20%(w/v)的蛋白质(例如BSA或IgG)或大分子(例如钆、紫杉醇和顺铂等)(w/v)在4℃下加入到赋形剂/生物聚合物溶液中。接着,将10%PEG(w/v)加入到生物聚合物-细胞毒性剂溶液中,并搅拌30分钟。离心后,将溶液倒入约3mm3压片机并干燥。然后在控制的温度条件下(<37℃)用行星式球磨机研磨上述药片。所得到的颗粒可以单独使用(即未涂覆的),或者通过在1000rpm的连续搅拌下涂布5%、10%或20%的PCL溶液(在二氯甲烷中)。最后用水漂洗PCL包衣生物聚合物-PEG颗粒,干燥并以粉末贮存。
PCL活化和肽偶联:活化PCL以将肽或底物(例如叶酸)连接到其表面上用于颗粒的靶向递送。首先,将2g的PCL溶解于6ml无水二噁烷中,并在50℃的水浴中加热2小时以溶解聚合物,然后冷至室温(RT)。2ml的N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(N,N'disuccinimidylcarbonate)(153.7mg/ml,在无水丙酮中)和2ml吡啶溶液(4.745mg/ml,在无水丙酮中)与PCL悬浮液在室温下连续搅拌下6小时进行混合。然后用具有1μm孔隙尺寸的G2玻璃纤维过滤该混合物以除去沉淀物。用4体积的乙醚将得到的上清液沉淀。沉淀物在丙酮中再悬浮,用乙醚再次沉淀。然后干燥已活化的或活性的PCL,并于4℃下贮存。
然后将活化的PCL偶联到赖氨酸或来自肽的任何游离胺基。将所需的肽或氨基酸(例如赖氨酸)溶解在0.1M Na.取代.2HPO4、0.1M硼酸,2mg/ml的浓度,pH值为8.5。接着,在4℃下将所述溶解在乙腈中的活化的PCL与肽或氨基酸以8:1的比例(活化的PCL:肽或氨基酸)搅拌混合过夜,用玻璃滤器过滤除去过量的活化未偶联的PCL。
颗粒的涂覆:用溶解在二氯甲烷中的各种浓度(例如5%、10%和10%)的PCL或结合胺的PCL连续搅拌(1000rmp)涂布已知量和尺寸的颗粒。通过离心分离后除去上清液,将所得到的PCL涂覆颗粒从PCL涂布液中分离。所得PCL涂覆的纳米球经过过滤、风干,在4℃下贮存。
热分析:使用珀金埃尔默钻石DSC(PerkinElmer Diamond DSC)进行差示扫描量热法(DSC)和热重/差热分析。首先,在氮气氛中,以恒定的速率(每分钟10℃)将约1mg颗粒从30℃加热到250℃。然后完成颗粒的热重曲线。
蛋白质负载的量化和表征:在其内含物结合之后,在37℃下,进行了pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水中PCL包覆的生物聚合物PEG颗粒的体外释放研究。在37℃下,将约100mg颗粒在100ml PBS或柠檬酸tris缓冲液中悬浮并消化以确定其释放速率。还使用0.1、0.22或0.45μm的微孔过滤器过滤颗粒。含蛋白质的内含物溶解于PBS或柠檬酸tris缓冲盐水中,并使用洛瑞蛋白质测定法(Lowry's protein assay)测定释放速率。在聚合物包衣的微粒的情况下,每48小时收集样品,同时更换PBS以模仿宿主的无限渗透状态。
圆二色性光谱分析也用于评价分子组装相比于标准或包封蛋白(例如BSA或IgG)的规律性。通过测量它们的以Δε方式表示的圆二色性并将它们与作为标准的未封装的蛋白质比较以确定释放的蛋白质的分子内结构(例如α-螺旋、β片层等)的构象。
颗粒大小、电荷和形态分析:通过使用马尔文颗粒大小和电荷分析仪(激光粒度仪)对颗粒进行激光衍射分析其粒径。颗粒分散在dH2O中,分析电荷和大小。用扫描电子显微镜(SEM)表征PCL涂覆的生物聚合物PEG颗粒的表面形态。对于SEM分析,颗粒是通过将干燥的颗粒分配到粘在铝桩的双面粘合带的一侧来制备。然后使用极化SC S00-喷射涂布机用金涂覆该桩,至其厚度为20至30nm。然后将样品引入到扫描电子显微镜的样品室,并检测表面形态。通过首先将1mg样品和100mg干燥溴化钾粉末混合以得到的PCL包覆生物聚合物-PEG颗粒制剂的不同阶段的红外光谱。接着,使用傅里叶变换红外光谱仪测定样品的红外光谱。
对于将纳米颗粒上浆,以下的方向提供指导。在一般情况下,通过使用填充有一到三个20mm和10至60个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐,并使用保持在200至400rmp的研磨速度,以控制粒度范围为5至30nm、30至180nm、0.2至1μm、1至6μm、4至12μm或10至60μm。该研磨间隔时间应设置为10分钟,随后进行15分钟的静止周期。10至25个循环(研磨和静止)允许>99.5%的颗粒尺寸范围为5至30nm、30至180nm、0.2至1μm、1至6μm、4至12μm或10至60μm。当研磨罐的尺寸增大到>50ml(例如125ml、500ml等),球的数量随罐体积的增加而成比例的增加。
通过研磨球和活动-静止周期的颗粒尺寸调节的实例:使用填充有三个20mm和10个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐,并使用保持在400rmp的研磨速度,可以获得范围为5至30nm的颗粒尺寸。该研磨间隔时间应设置为10分钟,随后进行15分钟的静止周期。15至25个周期(研磨和静止)导致>99.5%的颗粒尺寸范围从5nm到30nm。
使用填充有三个20mm和10个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐,并使用保持在400rmp的研磨速度,可以获得范围为30至180nm的颗粒尺寸。该研磨间隔时间应设置为10分钟,随后进行15分钟的静止周期。15至20个周期(研磨和静止)导致>99.5%的颗粒尺寸范围从30至180nm。
使用填充有三个20mm和10个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐,并使用保持在300rmp的研磨速度,可以获得范围为0.2至1μm的颗粒尺寸。该研磨间隔时间应设置为10分钟,随后进行15分钟的静止周期。15至20个周期(研磨和静止)导致>99.5%的颗粒尺寸范围从0.2至1μm。
使用填充有2个20mm和13个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐,并使用保持在300rmp的研磨速度,可以获得范围为1至6μm的颗粒尺寸。该研磨间隔时间应设置为10分钟,随后进行15分钟的静止周期。20至25个周期(研磨和静止)导致>99.5%的颗粒尺寸范围从1至6μm。
使用填充有2个20mm和13个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐,并使用保持在250rmp的研磨速度,可以获得范围为4至12μm的颗粒尺寸。该研磨间隔时间应设置为10分钟,随后进行15分钟的静止周期。15至20个周期(研磨和静止)导致>99.5%的颗粒尺寸范围从4至12μm。
使用填充有1个20mm和16个10mm的球和待包裹样品和赋形剂的50ml的研磨罐,并使用保持在200rmp的研磨速度,可以获得范围为10至60μm的颗粒尺寸。该研磨间隔时间应设置为10分钟,随后进行15分钟的静止周期。10至15个周期(研磨和静止)导致>99.5%的颗粒尺寸范围从10至60μm。
赋形剂/生物聚合物浓度对颗粒特性的影响:用在dH2O赋形剂/生物聚合物溶液)中约10%(w/v)的藻酸钠、约8%(w/v)纤维素或约10%(w/v)淀粉生产具有不同尺寸的颗粒(5nm至60μm±平均尺寸的10%)。低于2%(w/v)的藻酸钠、纤维素或淀粉,发现平均尺寸变化不大于10%的颗粒的产率较低。在大于15%的海藻酸钠或10%的纤维素时,赋形剂/生物聚合物溶液保持高粘性,不能用于片剂形成和随后的颗粒制备。类似地,淀粉(赋形剂/生物聚合物)溶液需要加热到50℃维持20分钟,以获得最佳的溶解性和粘度,淀粉的浓度不能超过12%(w/v)。
赋形剂/生物聚合物溶液的粘度也对颗粒的形态具有显著的影响。随着赋形剂/生物聚合物溶液浓度(>1%(w/v))的增加,颗粒变得更光滑和球形的。然而,<10%的赋形剂/生物聚合物溶液产生出理想的颗粒尺寸。在藻酸钠、纤维素或淀粉的浓度(w/v)分别为10%、8%或10%时,对于纳米或微颗粒的产生实现了最佳的产率。因此,在随后的研究中,准备上述最佳浓度用于研磨成颗粒的3mm3片剂的产生。
研磨速度和行星球的尺寸对于颗粒尺寸的影响:如上面的实例所示,行星球磨装置的研磨速度(Retsch PM100)和研磨球的尺寸在控制颗粒大小方面发挥了显著作用。改变转速从0到100rpm进行20分钟,并用10个10mm加3个20mm的球,导致颗粒尺寸范围从20至50μm;而以速度为100至200rpm的转速进行20分钟,得到10至20μm的微粒。调节速度为200至300rpm的转速进行20分钟,并使用50个5mm加15个10mm球,导致颗粒尺寸范围从1至5μm。增加转速从300到400rpm,并使用100个5mm球,导致颗粒尺寸范围为0.5至1μm。
先研磨片剂产生-20至50μm尺寸的微粒以产生<500nm的颗粒。使用100个3mm球加500个2mm球在400至600rpm下将所得到的微粒进一步研磨20分,以产生尺寸范围为5至500nm的纳米颗粒。再进一步增加速度并未对尺寸的减小有任何显著的效果。
颗粒蛋白截留和负载效率:BSA负载可以从4至25%(w/v)变化。在>20%(w/v)负载蛋白时,研磨后形成的产物颗粒积聚且形态异常。在纳米或微颗粒中具有100%的效率的BSA负载的可以实现的最高限为约20%。
无涂层的和PCL-涂层的生物聚合物-PEG颗粒的形态:由SEM来看,显而易见的是,与无涂层颗粒相比,通过PCL-涂层修饰的颗粒表面表现平整、均匀。以多种PCL涂布的颗粒表面特征出现额外的平滑。然而,在体外释放内含物之后,颗粒的表面由光滑球形变为粗糙的、非球形的,并形成空泡。
实施例2:肿瘤相关抗原配体涂层和负载对乳腺癌细胞的化学治疗剂的PBM纳米颗
粒
用于偶联至叶酸的聚己内酯-聚乙二醇共聚物涂布~20nm直径的负载细胞毒性药物的可生物降解的行星球磨(PBM)纳米颗粒。叶酸涂布的PBM纳米颗粒进一步负载多西紫杉醇、卡铂或顺铂。使用20μM的顺铂溶液的初级细胞和细胞系的孵化,导致在24小时的培养后,BrCa细胞(MCF-7、MDA-MB-231和4T1)和正常(初级)乳房上皮细胞的>90%的细胞死亡。然而,含有10倍以下的化学治疗剂的PBM纳米颗粒被吸收,并分别诱导与顺铂、多西紫杉醇或卡铂溶液相同水平的BrCa细胞凋亡,但不是原发性乳腺上皮细胞。此外,通过静脉注射接受顺铂溶液(8mg/kg/周)或顺铂包裹叶酸涂布的PBM纳米颗粒(相当于顺铂剂量=0.08mg/kg/周)的携带乳腺肿瘤的小鼠产生显著的(以及类似的)肿瘤消退。接受顺铂溶液的小鼠比天然的或PBM纳米颗粒处理过的小鼠具有显著更高的肾脏和肝脏的毒性。据了解,类似表达高水平的叶酸受体α(FRα/FR1)的肿瘤细胞,T调节性(Treg)细胞表达FRγ(FR4),并且FR4阻断增强的肿瘤免疫。因此,本申请的新型PBM纳米颗粒增强BrCa治疗效果,降低毒性,提高乳腺肿瘤免疫。
PBM纳米颗粒(含卡铂或紫杉醇)介导的肿瘤消退是具有特征的。纳米颗粒可用于治疗MDA-MB-231-萤光素酶阳性(LUC),以及MCF-7-luc的异种移植肿瘤(发展之前和之后)。在一些实施方式中,Caliper/Xenogen IVISTM生物光子成像系统用于测量乳腺肿瘤的负载量。使用Aperio Scanscope和Spectrum软件,通过免疫组织化学(IHC)的离体肿瘤的体外分析和形态分析,确定在乳腺肿瘤中细胞凋亡的变化(半胱天冬酶-3和阳性-9)和增生(Ki67阳性)的表型。
图3示出了高亲和力的叶酸受体(FR)由BrCa肿瘤和细胞系表达。
图4示出了负载顺铂、多西紫杉醇或卡铂的叶酸涂布的PBM纳米颗粒选择性地靶向BrCa细胞和诱导其中的细胞凋亡。
图5示出了通过静脉注射接受顺铂溶液(8mg/kg/周)或含顺铂(相当于顺铂剂量=0.08mg/kg/周)的叶酸涂布的PBM纳米颗粒的MDA-MD-231-luc的荷瘤小鼠产生显著的肿瘤消退。通过静脉注射接受顺铂溶液(8mg/kg/周)或含顺铂(相当于顺铂剂量=0.08mg/kg/周)的叶酸涂布的PBM纳米颗粒的MDA-MD-231-luc的荷瘤小鼠产生显著的肿瘤消退。
接受顺铂溶液的的荷瘤小鼠具有比天然的或PBM纳米颗粒治疗的小鼠显著更高的肾脏和肝脏的毒性。荧光素酶表达人类BrCa细胞(MDA-MB-231-luc;ERNeg PRNeg Her2Neg和MCF-7-luc;ERPos PRPos Her2Pos)的原位乳腺脂肪垫注射后,描述PBM纳米颗粒(含有卡铂或紫杉醇)介导的肿瘤消退的特征。肿瘤发展或肿瘤消退之后,含有多紫杉醇、卡铂或不加药物的texas红染料的叶酸涂布的PBM纳米颗粒递送后,是使用Caliper/Xenogen IVIS-100成像系统是对荷瘤Nu/Xid小鼠的非侵入性成像。通过免疫组织化学的体外分析确定在乳腺肿瘤中细胞凋亡(半胱天冬酶-3和阳性-9)的变化和用新型PBM纳米颗粒处理过的肿瘤的表型。NIH-III小鼠用于移植MDA-MB-231-luc和MCF-7-luc的细胞系。
PBM纳米颗粒影响肿瘤发展、免疫,分别使用4T1-LUC-synograft和新型PyMT-luc小鼠模型来确定自发性肿瘤发展。使用Caliper/Xenogen IVIS-100成像系统对临床相关的移植(4T1)和自发性(PyMT)乳腺肿瘤的发展进行非侵入性监测。使用Aperio组织学扫描仪和分析系统进行的免疫组织化学和显微形态分析测量在乳腺肿瘤中细胞凋亡的变化(半胱天冬酶-3和阳性-9)和增生(Ki67阳性)的表型。此外,描述对于CD25、FR4、FoxP3的、IL-10和/或TGF-β1的表达,和抑制Th1/Th2细胞增殖能力的外周的、淋巴结和肿瘤相关的T细胞的数量和活性的特征。
本申请的PyMT-LUC转基因小鼠是通过首先将小鼠跨越3代交配以创造F3 MMTV-LUC小鼠。随后F3 MMTV-LUC小鼠与PyMT小鼠繁殖创造PyMT-luc小鼠。
图6示出PBM纳米颗粒选择性地杀死调节性T细胞(FOXP3+CD25Hi),但不是T辅助(FoxP3-CD25Lo)细胞。类似于表达高水平FR的癌细胞,T调节性(Treg)细胞表达FRγ(FR4),并且FR4封锁增强的肿瘤免疫;以及(vi)显示我们可以选择性地破坏Treg细胞(FOXP3+CD25Hi),但不是T辅助细胞。图3-5提供了生物学和临床基本原理以显示新型负载多西紫杉醇或卡铂的叶酸涂层PBM纳米颗粒增强对肿瘤的治疗效果,降低毒性,并通过靶向和诱导BrCa和Treg细胞死亡来增加肿瘤免疫以减少与化疗相关的健康差距。
实施例3:肿瘤细胞靶向和化疗-负载PBM纳米颗粒对前列腺癌细胞的影响
用聚己内酯-聚乙二醇共聚物和叶酸涂布~20nm直径的负载细胞毒性药物的可生物降解的PBM纳米颗粒。使用20μM顺铂对PCa细胞(PC3和PTEN-CaP2)和正常前列腺上皮细胞(PrEC和RWPE-1)的处理导致>90%的细胞死亡。含有100倍以下顺铂的PBM纳米颗粒被吸收,并诱导与顺铂溶液相同的水平的前列腺癌细胞凋亡,但并没有显著影响正常细胞。接受顺铂溶液(8mg/kg/周)或叶酸包覆的PBM纳米颗粒(含0.08mg/kg/周的等效剂量顺铂)的荷瘤小鼠产生了显著(以及类似)的肿瘤消退。然而,接受顺铂溶液的小鼠比天然的或PBM纳米颗粒处理过的小鼠具有显著更高的肾脏和肝脏的毒性。PCa细胞表达高水平的叶酸受体α(FRα/FR1);类似地,T调节性(Treg)细胞表达FRγ(FR4),并且FR4阻断增强的肿瘤免疫。尽管有维生素D缺乏、小窝蛋白1的表达和NER的基因型相关的健康差距,PBM纳米颗粒增强了肿瘤治疗效果,降低毒性,并提高乳腺肿瘤免疫。
图7示出FR是由PC3和PTEN-CaP2肿瘤表达,而不是由细胞系或正常细胞表达。
如图8所示,负载顺铂的叶酸涂覆的PBM纳米颗粒选择性地靶向体外PC3细胞的破坏。
如图9所示,通过静脉注射接受顺铂溶液(8mg/kg/周)或叶酸包覆的纳米颗粒(等效顺铂剂量=0.08mg/kg/周)的PC3-luc荷瘤小鼠表现出显著肿瘤消退。然而,重要的是,如表2所示,接受顺铂溶液的小鼠比天然的或纳米颗粒处理过的小鼠具有显著更高的肾脏和肝脏的毒性。
表2 经过6剂量(每周)顺铂溶液或XPclad纳米颗粒之后血液化学的变化
超出正常范围的显著变化以粗体突出显示。
实施例4:肿瘤相关抗原的靶向和姜黄素-负载的PBM纳米颗粒对前列腺癌细胞的
影响
本申请的PBM纳米颗粒具有超出现存的用于将姜黄素递送到癌细胞的纳米载体的许多优点。如图10和11所示,生产PBM纳米颗粒的方法迅速(约4小时),可重复地(SD=5nm;LogP=-1.1±0.3)产生~25nm尺寸的纳米颗粒。如图12所示,涂覆有偶联至叶酸聚己内酯-聚乙二醇共聚物负载姜黄素的可生物降解的纳米颗粒具有~60mV的ζ电位。
图13显示由在SCiD小鼠中建立的PCa细胞和PCa肿瘤的FRs的表达。
如图14所示,负载姜黄素的叶酸涂覆的PBM纳米颗粒选择性地靶向PCa细胞并诱导细胞凋亡。使用通过流式细胞仪的图像流多光谱成像来测量各种PCa细胞对于纳米姜黄素和游离姜黄素的治疗的反应。我们的结果表明,姜黄素的PBM制剂在杀死癌细胞方面是高度有效的(70-85%),甚至在比游离姜黄素的IC50更低的浓度。重要的是,单独的纳米载体显示几乎没有毒性。初步数据表明PBM纳米颗粒提供了一种创新的方式来封装姜黄素以获得通过FRs的仅以特异性肿瘤靶向更有效的姜黄素介导作用。
实施例5:PBM纳米颗粒介导的肿瘤消退
骨内注射雄激素非依赖性和荧光素酶表达人PC3细胞(PC3-Luc;ARNegPTENNeg),并给予正常和维生素D缺乏的饮食小鼠PTEN-CAP2-luc(ARPos PTEN-/-)后,描述PBM纳米颗粒(含奥沙利铂或紫杉醇)介导的肿瘤消退的特征。给接受维生素D缺乏的或正常的饮食的NIH-III或B6雄性小鼠分别在左胫骨注射PC3-luc或PTEN-CaP2-luc细胞以模拟发展的(骨转移)PCa。肿瘤发展之后,使用Caliper/Xenogen IVIS-100成像系统在未阉割小鼠中非侵入性地成像。肿瘤发射发光>105光度/秒/cm2后,将一组小鼠阉割以模拟雄激素切除,而第二组不处理。随后,给小鼠静脉注射治疗,每周0、0.1或10mg/kg多西他赛或奥沙利铂,或含有0.1mg/kg有效剂量多西他赛或奥沙利铂加德克萨斯红或者没有药物加德克萨斯红的叶酸涂覆的XPclad纳米颗粒。对小鼠每周进行成像来监测肿瘤发展/消退。当阴性对照(只给予盐水载体)中的肿瘤超过108光度/秒/cm2时,在每个组的群体都死亡。使用AperioScanscope和Spectrum软件,利用通过(IHC)的体外分析确定在前列腺肿瘤中细胞凋亡的变化(半胱天冬酶-3和-9)和从以新型XPclad纳米颗粒处理过的小鼠中切除的肿瘤中的增生(Ki67)表型。微观和形态分析确定对前列腺肿瘤细胞凋亡的治疗意义和在PCa细胞的频率或生存的变化。除了每周的生物发光成像之外,监测血液化学和外周血白细胞亚群以评价肿瘤或药物相关毒性。通过质谱法,血液样品用于确定血清多西他赛和奥沙利铂的PK/PD。
细胞系和细胞培养
两种正常前列腺上皮细胞系(PREC和RWPE-1),一种良性(PTEN-P2-luc)以及两种PTEN缺失和雄激素非依赖性前列腺癌细胞系(PC3-luc和PTEN-CaP2-luc)用于该项研究。从Clonetics-BioWhittaker公司获得PrEC细胞,并在PrEMB培养基(Clonetics-BioWhittaker公司)中培养。从ATCC获得RWPE-1,并在补充0.05mg/ml牛垂体提取物和5ng/ml表皮生长因子的因子的角质形成细胞无血清培养基(K-SFM;Gibco)中生长。从Caliper/Xenogen获得PC3-luc细胞。在含有2mM L-谷氨酰胺的,并用10%胎牛血清(FBS)(Sigma,St Louis,MO)调节为在37℃下包含1.5g/L碳酸氢钠(ATCC)含有5%CO2的Ham氏F12K培养基中培养PC3-Luc细胞。在Ham氏F12K培养基中5个通道之后,将PC3细胞转移到含有10%胎牛血清FBS的RPMI-1640。PTEN-P2-Luc和PTEN-CaP2-Luc细胞由Hong Wu博士提供。PTEN-P2-Luc和PTEN-CaP2-Luc细胞将在补充有10%胎牛血清、25μg/ml牛垂体提取物、5μg/ml的牛胰岛素和6ng/mL的重组人表皮生长因子的DMEM(Sigma-Aldrich)中进行培养。
动物
NIH-III和B6雄性小鼠购自Jackson实验室。将动物圈养并在莫尔豪斯学院的医学动物设施中维持在常规的圈养条件下的微生物隔离的笼子中。遵循由生命科学国家研究委员会的实验动物资源委员会的关爱委员会提出的指导方针以减少动物的疼痛和痛苦。用106PTEN-P2-luc(匹配的良性)、PTEN-CaP2-luc(前列腺癌)或PC3-luc细胞在八到十周大的小鼠的右胫骨注射。为了评价荷尔蒙激素切除对于细胞毒性药物或PBM纳米颗粒敏感性的影响,另一组老鼠在前列腺肿瘤检测后阉割。
PBM纳米颗粒、多西他赛和奥沙利铂治疗
原发肿瘤(通过非侵入性的成像测量)的建立净增长>105光度/秒/cm2之后,每周用PBS单独地、在100μl PBS中的12mg/kg或0.12mg/kg多西紫杉醇和12mg/kg或0.12mg/kg奥沙利铂给阳性和阴性对照小鼠静脉内注射。小鼠重约20g;因此,小鼠接受~240μg或~2.4μg细胞毒性药物。实验组每周用60μg含0.4%w/w磺基罗丹明101酰氯(德克萨斯红荧光染料;TxRed)叶酸-结合的或未结合的PBM纳米颗粒单独、在100μl PBS中的(0.4%w/w)+奥沙利铂(4%w/w)或TxRed(0.4%w/w)+多西他赛(4%w/w)静脉内给药(Prewett等,Clinical CanerResearch,13:3432-3440 2007)。当用PBM纳米颗粒递送时,小鼠接受100倍以下的多西他赛或奥沙利铂(即2.4μg,而不是每只小鼠240μg)。
PCa肿瘤发展、毒性和PK/PD分析
使用25规格×5/8”注射针通过腹腔注射8周,小鼠每周注射萤火虫荧光素150mg/kg(Caliper/Xenogen)。通过使用IVIS Caliper/Xenogen成像系统的对小鼠非侵入性成像评价PC3-luc、PTEN-P2-luc和PTEN-CAP2-luc细胞系的肿瘤生长和转移。可能的是,单独的细胞系具有活性的荧光素酶(luc)基因的不同拷贝。随后,使用Living图像软件(Caliper/Xenogen)的Pearson积差相关分析用于检测光度表达的增加、肿瘤生长和转移之间的相互关系的显著性。在死亡者中收集血清,并测量尿素N2、肌酸、磷、钙、钠、钾、氯、碳酸氢盐、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、胆固醇、总胆红素、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白比、葡萄糖淀粉酶。使用MSM的分析化学和蛋白质分析谱核心设备通过液相色谱质谱法测量每周采集血清样品中和死亡的小鼠器官中的多西他赛和奥沙利铂。
免疫组织化学、显微镜检查和分析
将来自小鼠的石蜡包埋的切除肿瘤组织切片(6μm厚),装在带正电的Superfrost载玻片(Fisher Scientific)上并干燥过夜。切片在二甲苯中脱蜡,随后,用一系列醇[100%、]95%和80%乙醇/二次蒸馏H2O(v/v)]处理,并在PBS(pH 7.5)中再水化。用Tris-柠檬酸靶标恢复溶液在95℃下将切片孵育20分钟并使其另外冷却20分钟,接着在Tris缓冲盐水-吐温20(pH7.6)中连续漂洗。用3%的过氧化氢将切片孵育12分钟以阻断内源性过氧化物酶,并用PBS(pH7.5)洗涤。用PBS洗涤后,在蛋白质封闭溶液[在PBS中的5%正常人血清/0.5%正常山羊血清(v/v)]中将切片孵育20分钟。根据制造商的实验方案使用来自DAKO的信号放大系统。简言之,将载玻片在以下各项中依次孵育15分钟中间插入洗涤:抗AR(Millipore/Upstate)、抗胱天蛋白酶-3(Cedarlane实验室)、抗胱天蛋白酶-9(SantaCruz)、抗CD4(Biolegend)、抗嗜铬粒蛋白A(Zymed实验室)、抗-细胞角蛋白5(Covance)、抗细胞角蛋白8(Covance)、抗FoxP3(Biolegend)、抗-IL-10(Biolegend)、抗Ki67(Novocastra实验室)和/或1:200稀释的抗突触素(Zymed实验室)初级Abs、生物素化的山羊抗兔Abs、链霉亲和素-生物素复合物、扩增试剂以及过氧化物酶标记的链霉亲和素(Vector实验室)。通过用二氨基联苯胺/过氧化氢(DAB;Sigma)作为底物孵育载玻片来目测阳性反应。然后用蒸馏水漂洗切片,用Gill苏木精(Sigma)复染色,并安装通用支架(Research Genetics)。将对比样品单独暴露于第二Ab用于非特异性染色。
通过ScanScope GL系统使用40×物镜扫描整个前列腺的所有横剖面,之后是在相同解剖部位所有免疫染色的无损压缩和评价。来自载玻片的图像数字化之后,使用用于标准化和公正的结果控制的复杂的计算机运算自动分析所得到的数字图像。在SpectrumPlus软件(Aperio技术)的帮助下进行切片的形态分析。使用Spectrum Plus算法进行自动图像分析ⅰ)正像素数和颜色重叠合法用于测量和量化单位面积两种以上染色的亮度(例如,半胱天冬酶-9表达的增加);ⅱ)免疫组织化学膜图像分析用于检测单个的细胞膜相关染色和测量的亮度和完整性(例如细胞角蛋白5和8的变化);iii)免疫组织化学核图像分析算法检测单个核的核染色并测量它们的亮度(例如Ki67+核数目的变化)。基于它们的强度,将细胞核分类为0、1+、2+和3+;ⅳ)Micromet专门设计用于检测肿瘤细胞在正常组织中的微小转移。
肿瘤组织和单细胞分离
外科手术切除原发肿瘤和器官(例如肺、肝、骨)。部分肿瘤固定在甲醛中用于免疫组织化学评价,其余的用来建立单细胞悬浮液用于随后的Amnis Image Stream和流式细胞计数分析。切割两端后用注射器吸出骨髓瘤。切除来自肝脏和肺的继发性肿瘤。用手术刀和注射针以将样品切成碎片并释放到细胞悬液中机械地制备肿瘤细胞的单细胞悬液。用胶原酶(Ⅳ型)过夜消化未分解好或产生差的细胞悬液的纤维瘤。在RPMI中洗涤回收的细胞悬浮液。通过55-75%的不连续的Ficoll-Hypaque密度梯度(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)离心从其他细胞类型分离出肿瘤细胞。简言之,将细胞(在5ml RPMI的细胞)的混合物放置在梯度的55%聚蔗糖-泛影葡胺的顶部,覆盖超过75%的聚蔗糖-泛影葡胺,并在室温下700×g离心25分钟。收集来自55%的聚蔗糖-泛影葡胺的顶部的肿瘤细胞并在RPMI、50单位/ml盘尼西林、50pg/ml链霉素、5050pg/ml庆大霉素、10mM HEPES缓冲液和2mM L-谷氨酰胺(完全培养基)中洗涤。
对结果的解释
多西他赛或奥沙利铂的最佳的(10mg/kg/周)但不是次优的(0.1mg/kg/周)治疗剂量导致PC3-luc和PTEN-CAP2-luc的肿瘤消退,但也导致了显著的肝和肾毒性(即提高的AST和ALT、低钙血症和低血糖症)。阉割不会减缓PC3-luc肿瘤的生长,但最初减缓PTEN-CAP2-luc肿瘤的发展,之后是持续地增长。维生素D缺乏症对多西他赛和奥沙利铂毒性产生有害影响,而不是针对这些药物的肿瘤消退功效。在给予正常或缺乏维生素D的饮食的小鼠中,通过含多西他赛或奥沙利铂的XPclad纳米颗粒显著地抑制了雄激素敏感的和荷尔蒙非反应的PCa生长。由于ARNeg细胞对于给予铂类的疗法敏感性更高,含奥沙利铂的纳米颗粒比多西他赛针对PC3-luc更有效。在次优剂量的细胞毒性药物单独诱导显著的肿瘤消退的情况下,该剂量降低到1.0mg/kg,相对于由纳米颗粒递送的10μg/kg同等药物的剂量。
实施例6:PBM纳米颗粒对自发性肿瘤和调节性Treg细胞的发育的影响
使用cPten-/-PBcre4+luc+或cPten-/-PBcre4+luc+cav1+(阉割或未阉割)小鼠分析PBM纳米颗粒对自发性肿瘤和Treg细胞的发育的影响。在从鼠科动物PIN(6周龄)、侵入性腺癌(>9周龄)、在12周龄的转移性淋巴结、肺和可能的骨的PCa发展期间,每周对作为阴性肿瘤对照的无Cre基因的Ptenfloxed/floxedluc+和雄性cPten-/-PBcre4+luc+或cPten-/-PBcre4+luc+cav1+(阉割或未阉割)小鼠进行成像。9周龄之后,在<9周龄的小鼠中肿瘤允许发展到从荧光检测105光度/秒/cm2的净增长。一组老鼠被阉割以研究雄激素非依赖性激素非反应性PCa,另一组不阉割,以雄激素进一步研究PTEN基因介导的PCa的发展。随后,每周以0或10mg/kg多西他赛或奥沙利铂、含有0.1mg/kg有效剂量的多西他赛或奥沙利铂加得克萨斯红或不加药物的得克萨斯红的叶酸涂覆的PBM纳米颗粒静脉注射小鼠。小鼠每周进行成像来监测肿瘤发展/消退。当阴性对照(只给予盐水载体)的肿瘤超过108光度/秒/cm2时,每个组的群体死亡。通过免疫组织化学法的体外分析用于确定用新型PBM纳米颗粒处理的肿瘤中前列腺肿瘤细胞凋亡(半胱天冬酶-3和-9)的变化和分泌腔的(CK8和AR)、基本的(CK5)、神经内分泌的(突触素和嗜铬粒蛋白A)和增生(Ki67)表型的患病率。显微镜和形态测定分析确定了对前列腺肿瘤细胞凋亡以及分泌腔的、基础的、神经内分泌的和增生PCa细胞的频率或生存的变化的处理的显著性。此外,分离外周的、淋巴结和肿瘤相关淋巴细胞的数量和活性,纯化CD4+ T(CD3+)细胞的亲和力,并在细胞内和表面染色用于Th1(TNF-α、IFN-α、LT)、Th2(IL-4和IL-10)、Th17(IL-17A、IL-17-F、IL-22和TNF-α)和调节性T细胞(IL-10、TGF-β和/或FoxP3)的频率的流式细胞分析。用或不用FR4刺激(即在抗体包被板上孵育)CD3加CD28之后,测量纯化的T淋巴细胞的增殖以评价Th1/Th2细胞增殖。
CD4+ T淋巴细胞的分离
通过吸入二氧化碳处死小鼠。手术切除原发肿瘤和淋巴结。切除来自肝脏和肺的继发性肿瘤。用手术刀和注射针将样品切成碎片并释放到细胞悬液中机械地制备肿瘤细胞的单细胞悬液。用胶原酶(Ⅳ型)过夜消化未分解好或产生差的细胞悬液的纤维瘤。在RPMI中洗涤回收的细胞悬浮液。通过75-100%的不连续的Ficoll-Hypaque密度梯度(PharmaciaFine Chemicals,Uppsala,Sweden)离心从其他细胞类型分离出肿瘤细胞。简言之,将细胞(在5ml RPMI的细胞)的混合物放置在梯度的75%聚蔗糖-泛影葡胺的顶部,覆盖超过100%的聚蔗糖-泛影葡胺,并在室温下700×g离心25分钟。从75%和100%聚蔗糖-泛影葡胺的界面收集淋巴细胞并在补充有10%热灭活胎牛血清、50单位/ml盘尼西林、50pg/ml链霉素、50pg/ml庆大霉素、10mM HEPES缓冲液和2mM L-谷氨酰胺的RPMI(完全培养基)中洗涤。根据制造商的实验方案,使用我们的Miltenyi Biotec AutoMACS系统通过阴性选择分离CD4+ T淋巴细胞。
淋巴细胞的细胞内细胞因子和表面染色
荧光团-标记的大鼠抗小鼠CD4、CD25、FR4、IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-4、TGF-β1、IL-10和Foxp3(BD-PharMingen)用于免疫荧光染色。简言之,将从原发肿瘤和转移部位中分离的105淋巴细胞在FACS缓冲液(在PBS中的2%牛血清白蛋白)中洗涤。用每105的Fc BlockTM(BD-PharMingen)0.5μg在冰上孵育30分钟,用于阻断非特异性结合。通过用FACS缓冲液洗涤细胞以除去Fc Block,用荧光染料标记的大鼠抗小鼠CD4、CD25和/或FR4Abs在10μl初级Abs和90μl FACS缓冲液中将细胞沉淀在冰上孵育40分钟。通过将上述细胞在FACS缓冲液洗涤3次除去多余的Abs。对于细胞内染色,将这些细胞在皂素溶液中重新悬浮,在1X Perm/WashTM(Biolegend)溶液中洗涤,用于检测细胞内(例如细胞因子)和细胞核(例如FoxP3)标记。透化作用之后,用10μl初级Abs(大鼠抗小鼠[IFN-γ、TNF-α和LT]或[IL-17A、IL-17F和IL-22]或[IL-4、IL-5和IL-10]或[TGF-β1、IL-10和FOXP3])和90μl FACS缓冲液在冰上孵育细胞沉淀40分钟。通过将上述细胞在FACS缓冲液洗涤3次除去多余的染色。在70μl固定液(PBS中1%多聚甲醛)中重悬细胞,并用流式细胞仪分析。
使用Amnis ImageStream系统的通过图像分析的体外表型分析
FACS染色后,使用Amnis ImageStream系统分析CD4+T细胞群或PCa肿瘤细胞频率的变化,其允许流式细胞计数的图像采集和六通道分析(明亮背景和黑暗背景,以及用于不同荧光分析的四个通道)。使用图像数据探索和分析软件(IDEAS)分析采集的图像。这种方法证实,德克萨斯红阳性纳米颗粒与荧光素酶阳性PCa细胞及FR4 +Treg细胞凋亡有关。
动物(自然生物发光前列腺癌)
为了生成具有Pten等位基因的有条件的失活和激活的荧光素酶报告基因和小窝蛋白-1基因活性的小鼠,ARR2PB启动子驱动的前列腺上皮细胞特异性Cre系PB-Cre4(B6.D2-TgPbsn-cre/4Prb品系;NCI-Frederick MMHCC),B6.129-GT(ROSA)26Sortm2(ACTB-Luc)Tyj小鼠(LSL-Luc小鼠,Jackson实验室),和/或PBcav1+小鼠首先孕育产生PBcre4+luc+和PBcre4+luc+ cav1+小鼠。然后将来自这些小鼠中的雌性后代的纯合子,首先用纯合子敲除PTEN(C.129S4-Ptentm1Hwu/J染色;Jackson实验室)的小鼠培育。携带PBcre4+ cPten-/-luc+和PBcre4+cPten-/- luc+ cav1+的雄性后代纯合子小鼠用于所建议的治疗方案。使用雄性PBcre4+cPten-/- luc+和PBcre4+cPten-/- luc+ cav1+后代的F2代,以上提到的Power分析表明,需要各组的10cPten-/-L小鼠有必要评估治疗反应的显著性。非重组的同窝仔,例如无Cre基因的Ptenfloxed/floxedL作为对照组。另一组小鼠是在16周阉割(当侵入性腺癌已形成时)用于分析对于雄激素停药的即时(<2周)和长期(~10周)的反应,以评价Pten无效PCa对于荷尔蒙切除的反应。
PCa肿瘤发展的分析
使用25×5/8”规格注射针通过腹腔注射8周,小鼠每周注射萤火虫荧光素150mg/kg(Xenogen)。尽管是纯合子PTEN基因缺失,单独的PBcre4+ cPten-/-luc+和PBcre4+cPten-/-luc+ cav1+小鼠将有活性荧光素酶(L)基因的不同拷贝。确定反式L蛋白基因的拷贝数,并通过多重聚合酶链反应扩增和Southern印迹分析证实,以确保负责荧光素酶的L基因的数目不会因实验改变而改变。PIN发病前对小鼠进行成像(即<6周龄),仅>105光度/秒/cm2的净增加将构成在PBcre4+cPten-/-luc+和PBcre4+cPten-/- luc+ cav1+小鼠中PCa的开始。随后,使用Living图像软件(Caliper/Xenogen)的Pearson积差相关分析用于检测光度表达的增加、肿瘤生长和转移之间的相互关系的显著性。
结果解读
最佳的(10mg/kg/周),但不是次优的(0.1mg/kg/周)治疗剂量的细胞毒性药物导致PBcre4+ cPten-/- luc+小鼠而不是PBcre4+cPten-/- luc+ cav1+小鼠的肿瘤消退,但也导致了显著的肝和肾毒性(即提高的AST和ALT、低钙血症和低血糖症)。阉割最初减缓肿瘤的发展,但是会“反复”,并继续以较慢的速度增长。无论小窝蛋白1在肿瘤中的表达水平,通过含多西他赛或奥沙利铂的XPclad纳米颗粒显著地抑制了雄激素敏感的和荷尔蒙非反应的PCa生长。在这个模型中,多西他赛和奥沙利铂(单独或封装)也导致更少的转移病灶。虽然CK8Pos ARPos腔肿瘤及CK5Pos基底细胞间隔的增生发生,PTEN基因的失活也导致神经内分泌分化(即突触素Pos嗜铬粒蛋白APOS渐增的ARNEG)的扩展。神经内分泌细胞是ARNEG,因此是雄激素非依赖性;因此,荷尔蒙非反应的PCa可能衍生自荷尔蒙切除治疗之前存在的雄激素非依赖性肿瘤细胞或阉割后由于后续的遗传变异和选择而获得雄激素非依赖性细胞的亚群。通过奥沙利铂或含奥沙利铂的PBM纳米颗粒降低了这种潜在的分化。作为一种养殖PBcre4+cPten-/-luc+和PBcre4+cPten-/-luc+cav1+小鼠的替代模式,由表达载体过表达小窝蛋白-1的PTEN-CaP2-luc的肿瘤细胞移植到B6小鼠中。
实施例7:在PTEN-CAP2-luc肿瘤发展中的系统和免疫毒性
阐明了归因于多西他赛、奥沙利铂和PBM纳米颗粒的在阉割与非阉割野生型和Xpc-/-小鼠中PTEN-CAP2-LUC肿瘤发展中的全身性和免疫毒性。给B6和B6.Xpc-/-小鼠在左胫骨注射PTEN-CAP2-Luc细胞,以模拟ERCC1基因变异个体中发展的(骨转移)PCa。肿瘤发展之后,使用Caliper/Xenogen IVIS-100成像系统在未阉割小鼠中非侵入性地成像。肿瘤发光>105光度/秒/cm2后,将一组小鼠阉割以模拟雄激素切除,而第二组不处理。随后,给小鼠静脉注射治疗,每周0或10mg/kg多西他赛或奥沙利铂,或含有0.1mg/kg有效剂量多西他赛或奥沙利铂加德克萨斯红或者没有药物加德克萨斯红的叶酸涂覆的PBM纳米颗粒。每周对小鼠进行成像来监测肿瘤发展/消退。当阴性对照(只给予盐水载体)中的肿瘤超过108光度/秒/cm2时,在每个组的群体都死亡。通过免疫组织化学法的体外分析用于确定用新型PBM纳米颗粒处理的肿瘤中前列腺肿瘤细胞凋亡(半胱天冬酶-3和-9)的变化和分泌腔的(CK8和AR)、基本的(CK5)、神经内分泌的(突触素和嗜铬粒蛋白A))和增生(Ki67)表型的患病率。如前所述,外周的、淋巴结和肿瘤相关淋巴细胞的数量和活性的分离和CD4+T细胞亲和纯化,并在细胞内和表面染色,用于TH1、TH2、Th17的流式细胞计数、细胞频率的分析。具体地说,如前所述,用或不用FR4刺激,CD3加CD28之后,测量纯化的T淋巴细胞的增殖以评价Th1/Th2细胞增殖。随着每周生物发光成像,监测血液化学和外周血白细胞亚群以评价其可能与XPC缺陷相关的肿瘤或药物相关的毒性。
对结果的解释
最佳的(10mg/kg/周),但不是次优的(0.1mg/kg/周)治疗剂量的细胞毒性药物导致在B6和B6.Xpc-/-小鼠中PTEN-CAP2-luc肿瘤消退。该肿瘤生长的减弱也与在B6.Xpc-/-小鼠中比在B6小鼠中显著更高的毒性(即提高的AST和ALT、低钙血症和低血糖症)一致。在B6和B6.Xpc-/-小鼠中,阉割减缓并可能使PTEN-CAP2-Luc肿瘤的发展暂停,但随后是持续地增长。XPC缺陷不会对PBM纳米颗粒(含多西他赛或奥沙利铂)介导的雄激素-敏感性或荷尔蒙非反应的PCa的生长减弱产生有害影响。重要的是,在B6和B6.Xpc-/-小鼠中,在不存在毒性的情况下,PBM纳米颗粒均介导肿瘤缩小。这些发现与比接受癌药物溶液的组具有更高的通过PBM纳米颗粒递送的多西他赛和奥沙利铂的生物药效率或定位一致。在一种PTEN-CAP2-luc肿瘤移植的替代模式中,使用PC3-luc的异种移植模型建立NIH-III Xpc-/-小鼠以开展这些实验。
实施例8:姜黄素负载的PBM纳米颗粒介导的肿瘤消退
PBM纳米颗粒制剂、NHS-活化的叶酸的合成、DSC-活化的PEG和叶酸-结合的PEG的生成
如图15所示,在含有吸热氧化锆磨球的研磨罐中形成姜黄素负载的PBM纳米颗粒。球磨罐绕其自身的轴线以及围绕所述腔室轮的公共轴线的相反方向旋转。这产生行星球的转动和对含淀粉、聚乙二醇、德克萨斯红和姜黄素的微颗粒的碾磨。
最小有效剂量(MED)、最佳给药方案(ODS)和PBM纳米颗粒的安全性
在无胸腺雄性NIH-Ⅲ小鼠中以骨内注射PC3-Luc细胞评价所述MED测定和最优方案(图16)。原发肿瘤(非侵入性的成像测量)建立>105光度/秒/cm2净增后启动给药。对于MED,以每只小鼠10μg、20μg、50μg、100μg、200μg和400μg姜黄素负载的PBM纳米颗粒的剂量、不处理、和只有纳米颗粒(无姜黄素)给予尾巴静脉注射每周三次持续28天来处理小鼠。对于最佳给药方案,评价三个额外的方案,每周三次与对照比较;每日(每周5天)、每四天、和每周一次地持续28天。对所有小鼠称重,每周三次测量肿瘤以评价PBM纳米颗粒的毒性、疗效和安全性。
体内药物代谢动力学研究
荧光素酶表达人雄激素非反应性(PC3-LUC;ARNEG)细胞系骨内注射六组(n=10)体重25~30g的雄性裸鼠中。直接注射肿瘤细胞进入骨髓已被开发作为自发转移的一种替代用于前列腺癌和骨细胞之间的相互作用的研究以模仿发展的骨转移。第1组给予20mg/鼠姜黄素混悬液;第2组给予200μg或最佳MED的与叶酸结合的姜黄素负载的纳米颗粒。第3组给予200μg未结合叶酸的姜黄素负载的纳米颗粒。第4组给予200μg与得克萨斯红(在体外跟踪颗粒的细胞内定位)+叶酸结合的姜黄素负载的纳米颗粒。第5组给予200μg未结合得克萨斯红+叶酸的姜黄素负载的纳米颗粒。第6组仅给予PBS作为阴性对照。在轻度乙醚麻醉下从眼眶后淋巴管收集血液样品(0.5ml)到肝素化的微量离心管中。每个采样之后,施加1ml葡萄糖生理盐水以防止在中央室体积和电解质改变。在4℃下通过在4000rcf离心血样10分钟分离血浆。将25μl的2.8%乙酸加入到25μl血浆中,(对姜黄素的稳定性)和添加50μl内标(IS)17-β雌二醇乙酸酯并涡旋20秒。以10,000rcf离心10分钟后,分离有机层,其中包含姜黄素和IS。留下的残余物重新溶解在125μl甲醇中并用HPLC分析。
PCa肿瘤发展和毒性的分析
使用25规格×5/8”注射针通过腹腔注射每周给小鼠注射150mg/kg的荧光素(Caliper)。使用IVIS Caliper成像系统通过小鼠非侵入性成像评价肿瘤生长和转移。使用Living图像软件(Caliper)的Pearson积差相关分析用于检测光度表达的增加、肿瘤生长和转移之间的相互关系的显著性。在死亡者中收集血清,并使用血液化学分析仪(BoehringerMannheim/Hitachi 911)测量尿素N2、肌酸、磷、钙、钠、钾、氯、碳酸氢盐、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、胆固醇、总胆红素、总蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白比、葡萄糖和淀粉酶。
颗粒尺寸、分布和ζ电位验证
使用纳米ZS(Malvern)取五次测量的平均值通过动态光散射测定颗粒的尺寸,在电场下基于电泳迁移率以30次测量的平均值估计ζ电位。通过附Nikon遮光TE 2000-S显微镜的原子力显微镜(AFM)(Veeco Bioscope II)使用纳秒示波器软件分析纳米颗粒的表面形态。在移液管头的帮助下将纳米颗粒悬浮液置于硅片上,并使其在空气中干燥。该显微镜是振动阻尼,使用市售金字塔形Si3N4端(Veeco)进行测量。悬臂以0.1N/m的标称力常数用于扫描。通过显示悬臂在跟踪方向的振幅信号和在回扫方向的高度信号以获得图像,同时记录这两种信号。
PBM姜黄素纳米颗粒在体外的释放动力学
将姜黄素包裹的PBM纳米颗粒(100mg)分散在10ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,pH为7.4,并分装于20微量离心管中。将管保持在设定为室温的热稳定水浴中。游离姜黄素是完全不溶于水;因此,在预定的时间间隔,以3000rpm将溶液离心10分钟以从纳米颗粒中分离释放(沉淀)的姜黄素。所释放的姜黄素溶解在1ml乙醇中利用分光光度法测定450nm的吸光度。使用姜黄素在乙醇中的标准曲线和方程计算释放的姜黄素的浓度:释放(%)=[姜黄素]rel/[姜黄素]tot×100,其中,[姜黄素]rel是在时间t收集的释放的姜黄素的浓度,[姜黄素]tot是包埋在纳米颗粒的姜黄素总量。
血清和肝酶水平的分析提供信息:如果任何所选择的剂量是有毒的,这样的剂量在进一步的研究中剔除。在以下实施例中使用最高耐受剂量用于功效研究。
实施例9:姜黄素负载的PBM纳米颗粒针对PCa和细胞死亡的机制的体内药效
如图16所示,肿瘤植入是通过心内(骨转移,主要表现出成骨细胞特征)的、荧光素酶表达人雄激素非依赖性(PC3-luc;ARNEG PTENNeg)PCa细胞系的注射进入雄性无胸腺NIH-III小鼠的左心室。原发肿瘤(通过非侵入性的成像测量)的建立净增长>105光度/秒/cm2之后,每周用PBS单独地或20mg/鼠姜黄素悬液单独地给阳性和阴性对照小鼠静脉内注射。
利用通过免疫组织化学的体外分析确定在前列腺肿瘤中细胞凋亡的变化(半胱天冬酶-3和-9)和以新型PBM纳米颗粒处理过的肿瘤中的增生(Ki67)表型。
细胞系和细胞培养
从Caliper/Xenogen获得PC3-luc细胞。在含2mM L-谷氨酰胺的Ham F12K,并调整为包含含有10%胎牛血清(FBS)的1.5g/L碳酸氢钠(ATCC),(Sigma,St Louis,MO)培养基中在37℃下以5%的二氧化碳培养PC3-luc细胞。
动物和处理
NIH-III雄性小鼠从Jackson实验室购买。动物被收容并保持在莫尔豪斯学院的医学动物设施的常规圈养条件下的微生物隔离笼子内。原发肿瘤(通过非侵入性的成像测量)的建立净增长>105光度/秒/cm2之后,每周用PBS单独地或20mg/鼠姜黄素单独地给阳性和阴性对照小鼠静脉内注射。实验组每周用在100μl PBS中的200μg叶酸-结合的或未结合的姜黄素负载的纳米颗粒、含0.4%w/w磺基罗丹明101酰氯(德克萨斯红荧光染料;TxRed)的纳米颗粒单独、叶酸结合的TxRed(0.4%w/w)+姜黄素(4%w/w)或TxRed(0.4%w/w)+姜黄素(4%w/w)静脉内给药。当用PBM纳米颗粒递送时,小鼠接受100倍以下的姜黄素(即200μg,而不是每只小鼠20mg)。随后,使用Living图像软件(Caliper Life Sciences)的Pearson积差相关分析用于检测光度表达、肿瘤生长和转移之间的相互关系的显著性。
免疫组织化学染色、显微镜检查和分析
将石蜡包埋的来自小鼠切除的肿瘤组织、肾脏、胰脏和肝脏切片(6μm厚)。使用标准实验方案处理载玻片,半胱天冬酶-3(Cedarlane实验室)-半胱天冬酶-9的(SantaCruz),-FR2和-FR4(Santa Cruz)和/或-Ki67(Novocastra实验室)染色。通过ScanScope GL系统(Aperio Technologies)使用40X物镜扫描所有的横截面,接着是在相同解剖区域中的无损压缩和评价。在Spectrum Plus软件(Aperio Technologies)的帮助下进行切片的形态测定分析。使用Spectrum Plus运算进行自动化的图像分析i)正面像素数和颜色重叠合法;ii)免疫组织化学膜;iii)免疫组织化学核;以及iv)钠钙偏磷酸盐聚合物MICROMET。
根据其抑制肿瘤生长的能力,确定PBM纳米颗粒和游离姜黄素的疗效。接受叶酸涂覆的含姜黄素的PBM纳米颗粒的小鼠会导致在无肝或肾毒性的小鼠中的肿瘤消退以及在心室内挑战模型中较少的转移性病变。游离姜黄素(未封装)具有低内在活性,吸收不良,和/或迅速排出,来自身体的间隙将产生差的生物利用度。PBM纳米颗粒的涂布叶酸的靶向递送增强姜黄素的疗效和生物利用度。
实施例10:通过姜黄素纳米颗粒的细胞死亡的分子机制的表征
姜黄素降低增殖潜能,并增加前列腺癌细胞的体外凋亡的潜力,主要是通过调节细胞凋亡抑制蛋白,和通过生长因子受体的信号转导途径(例如由EGF受体)介入。它也显著改变了在PC-3和LNCaP人前列腺癌细胞的微丝组织和体外细胞运动性。这项研究表明,姜黄素纳米颗粒在前列腺癌细胞中对于肌动蛋白细胞骨架具有显著影响,包括改变微丝组织和功能。这可能表示一种重要的机制,其中姜黄素用作化学预防药剂,以及作为血管生成和转移的抑制剂。
PBM纳米颗粒对前列腺癌细胞系的作用机制,比较PBM纳米颗粒影响的功能途径与之前报道的游离姜黄素的影响。归因于该潜在的转录因子的抑制姜黄素的许多多效性效应,姜黄素在肿瘤细胞中的主要细胞靶标是被激活核因子κB(NF-κB)。电泳迁移率改变(“凝胶移位”)测定法用于评估NF-κB对DNA的结合能力。还测定PBM纳米颗粒在外周血单核细胞(PBMC)中抑制促炎细胞因子的能力。许多这些细胞因子(IL-6、IL-8和TNFα)与致癌过程(包括血管形成的诱导)有密切联系。用游离和PBM纳米颗粒两者激发的PBMC的孵育并且测量IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA水平,与DMSO和无效的纳米颗粒处理的细胞相比为证据,从而测试通过这两种药剂的IL-6的剂量依赖性降低。另外,体外方法用于确定姜黄素纳米粒是否诱导半胱天天冬酶依赖的或非依赖的细胞凋亡信号介导的前列腺癌细胞死亡。简而言之,雄激素反应性(LNCaP)和雄激素非反应性PCa细胞(PC3)是在单独存在姜黄素(10μM)以及叶酸包衣和未包衣的姜黄素负载(10nM)的纳米颗粒存在下有或无TNF和Fas抑制的情况下生长24、48和72小时。由TUNEL法和流式细胞仪测量细胞凋亡和/或坏死。还进行RT-PCR和蛋白质印迹分析以确定促凋亡和促生存分子的表达,例如CD95、FasL、TNF、TNF-R1、NF-κB、Bax、Bcl-2、Bcl XL、细胞色素C以及胱门蛋白酶-9和-3。
细胞增殖测定
用不同浓度的姜黄素纳米颗粒和游离姜黄素进行细胞增殖测定。使用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物)细胞增殖试剂盒(Boehringer Mannheim)用生产商的实验方案测定细胞增殖。
细胞凋亡检测
根据制造商的操作说明,通过膜联蛋白V表面染色的处理的细胞使用细胞凋亡检测试剂盒3(Alexa Fluor 488膜联蛋白V/碘化丙锭(Invitrogen)进行细胞凋亡测定。
蛋白质印迹分析
简而言之,将细胞在PBS中洗涤两次并在RIPA裂解缓冲液中溶解。通过Bradford法测定总蛋白。加载等量的蛋白并在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上解析,将该蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用5%无脂奶粉将该膜封闭,分别探测第一和第二抗体。用BCIP/NBT底物(Promega,美国)进行最终检测。分析这些群组,并使用Image J软件(NIH)对其量化,以β肌动蛋白使其标准化。控制的密度取1,处理结果将被表示为相对于对照的相对单位(RU)。用游离姜黄素或PBM纳米颗粒处理后,在PCa细胞系中进行了肌动蛋白聚合和伪足形成以使用图像流分析检测细胞运动及其在肿瘤转移中的作用。
姜黄素在PBM纳米颗粒中的封装增加了姜黄素的生物利用度,相对于1μM游离姜黄素,10nM的姜黄素负载的PBM纳米颗粒导致荷尔蒙非反应性(PC3)PCa细胞系凋亡、NF-κB的封闭以及促炎细胞因子(IL-6、IL-8和TNFα)在体外的下调。此外,由于姜黄素使雄激素反应性TRAIL抗性癌细胞增敏,PBM纳米颗粒的靶向递送增加姜黄素的生物利用度,进一步提高姜黄素的功效且具有更高的细胞活力(肌动蛋白聚合和伪足形成),因此含有姜黄素的纳米颗粒对抗LNCaP更有效。
实施例11:用结合肽的、含药物的纳米颗粒靶向前列腺癌细胞
用上述方法制备顺铂(Cispt)和TexasRed(TR)封装的、结合癌细胞的肽(I、II、II和IV)-或叶酸偶联的聚己内酯包覆的纳米微粒。所述肽的氨基酸序列如下所示:
肽I-HTIRYDWHFTAR(SEQ ID NO:1)
肽II-FRPNRAQDYNTN(SEQ ID NO:2,参见EP1531159和Zitzmann等,临床癌症研究,2005,11:139-146)。
肽III-TIHYDFWHTRRA(SEQ ID NO:3)。
肽IV-NFTRPNNYRDAQ(SEQ ID NO:4)。
前列腺肿瘤特异性PBM纳米颗粒的粒度分布。采用Malver Zetasizer NS装置用0.1mg/L浓度(5%质量,假定密度为1g/cm3)的纳米颗粒来测定颗粒的粒度分布。图17显示前列腺肿瘤特异性PBM纳米颗粒的粒度分布。
前列腺肿瘤特异性PBM纳米颗粒的ζ电位。使用Malvern Zetasizer NS用0.1mg/L浓度(5%质量,假定密度为1g/cm3)的纳米颗粒测量顺铂(Cispt)和TexasRed(TR)封装的、结合癌细胞的肽(I、II、II和IV)-或叶酸偶联的聚己内酯包覆的纳米微粒的ζ电势分布。图18示出了前列腺肿瘤特异性PBM纳米颗粒的ζ电位。
PBM纳米颗粒处理过的癌细胞的TUNEL和DRAQ5染色。以2μM的铂溶液单独地、含顺铂和癌细胞结合肽(I、II、III和IV)-或叶酸偶联的聚己内酯包覆的PBM纳米颗粒、或无涂层的纳米颗粒,对PC3细胞进行处理。PBM颗粒粘附1小时,并用PBS洗涤5次除去未粘附的颗粒。作为阳性对照,用顺铂溶液(20μM)处理细胞。接着,在37℃下以5%CO2孵育细胞48小时。随后,将细胞固定并染色用于以Avidine-FITC和DRAQ5的Amnis ImageStream分析。图19示出了PBM纳米颗粒处理过的癌细胞的TUNEL和DRAQ5染色。通过核形态测量法鉴定细胞凋亡。TUNEL(FITC)强度绘制在Y轴上和核DRAQ5强度绘制在X轴上。非凋亡事件的阴影为暗红色,真正的凋亡事件为亮绿色,与细胞凋亡的核碎片相关的形态正常的细胞为深绿色。
PBM纳米颗粒介导的癌细胞与正常细胞的凋亡。用顺铂溶液或含有顺铂和含癌细胞结合肽(I、II、III和IV)-或叶酸偶联的聚己内酯包覆的PBM纳米颗粒,或无涂层的纳米颗粒,处理DU145(前列腺癌细胞系)和PrEC(原发性前列腺上皮细胞)。用不同的肽和叶酸的顺铂溶液浓度(20uM)和纳米颗粒浓度(2uM)处理细胞,处理后细胞孵育1小时,然后用PBS洗涤5次,并在37℃以5%CO2再次孵育细胞48小时,固定并用亲和素-FITC和荧光DNA结合染料DRAQ5染色细胞,在Image stream系统上成像。
图20显示PBM纳米颗粒介导的癌细胞与正常细胞的凋亡。使用来自IDEAS套装软件的两个标准的基于图像特征确定凋亡细胞:区域(Area)和斑点小计(Spot Small Total)。与活细胞相比,浓缩凋亡细胞核具有较低的面积值。碎片凋亡细胞核的图像表现出小而亮的区域具有比正常细胞核均匀的图像更高的Spot Small Total值。而顺铂溶液导致DU145和PREC细胞的凋亡,靶向PBM的纳米颗粒顺铂配方只会导致DU145细胞凋亡。
PBM纳米颗粒移位到细胞核和TUNEL染色。用顺铂溶液或含有顺铂-和德克萨斯红-和肿瘤细胞结合肽(I、II、III和IV)-或叶酸偶联的聚己内酯包覆的PBM纳米颗粒,或无涂层的纳米颗粒处理DU145(前列腺癌细胞系)细胞。用不同的肽和叶酸的顺铂溶液浓度(20uM)和纳米颗粒浓度(2uM)处理细胞,处理后细胞孵育1小时,然后用PBS洗涤5次,并在37℃以5%CO2再次孵育细胞48小时,固定并用TUNEL-FITC和荧光DNA结合染料DRAQ5染色细胞,在Image stream系统上成像。图21显示PBM纳米颗粒移位到细胞核和TUNEL染色。德克萨斯红和TUNEL-FITC之间的Amnis ImageStream相似明亮详细分析显示叶酸-、肽I-、肽II-、肽III-和肽IV涂覆的PBM纳米颗粒共定位到核,这在未涂覆的颗粒中没有观察到。
以上描述是用于教导本领域普通技术人员如何实践本发明的目的,它并不试图详细列出它所有明显的修改和变化,对于本领域技术人员来说,在阅读本发明的描述后,其将变得显而易见。然而,其试图将所有这些显而易见的改进和变化包括在由以下的实施方式限定的本发明范围之内。具体实施方式旨在涵盖对于达到目的有效的任何次序的成分和步骤,除非上下文明确有相反指示。
序列表
<110> 吉安特科技股份有限公司(JYANT TECHNOLOGIES, INC.)
<120> 特异性靶向癌细胞的输送系统及其使用方法
<130> 1013-150 PCT
<150> 61/523,626
<151> 2011-08-15
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
His Thr Ile Arg Tyr Asp Trp His Phe Thr Ala Arg
1 5 10
<210> 2
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Asn Phe Thr Arg Pro Asn Asn Tyr Arg Asp Ala Gln
1 5 10
Claims (16)
1.一种用于特异性靶向癌细胞的药物组合物,包括:包含姜黄素的行星球磨(PBM)纳米颗粒,
其中,所述PBM纳米颗粒包含被包封在基质芯内的姜黄素,所述基质芯包含纤维素,胶原蛋白和/或淀粉,
其中,所述基质芯进一步包覆有与叶酸结合的聚己内酯(PCL)-聚乙二醇(PEG)共聚物,
其中,所述PBM纳米颗粒具有20至200nm的尺寸范围,
其中,通过向赋形剂/生物聚合物水溶液加入姜黄素以形成姜黄素和赋形剂/生物聚合物的混合物来制备PBM纳米颗粒,混合物被干燥,然后通过行星球磨研磨,
其中,所述赋形剂/生物聚合物水溶液大于1%赋形剂/生物聚合物(w/v)并小于10%赋形剂/生物聚合物(w/v),以及
其中,所述赋形剂/生物聚合物选自纤维素、胶原蛋白、淀粉及其组合。
2.如权利要求1所述的药物组合物,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包括选自化学治疗剂、放射性偶联物、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及细胞毒性剂中的一种或多种附加的治疗剂。
3.如权利要求1所述的药物组合物,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包含选自以下的一种或多种化学治疗剂:基于铂的药物;选自小豆蔻、姜黄素、高良姜、生姜、内亚胡椒、姜黄的天然酚;植物生物碱;紫杉烷类;烷化剂;肿瘤抗生素;蒽环类;拓扑异构酶抑制剂;选自5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、腺苷脱氨酶抑制剂、卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤、奈拉滨、喷司他丁有丝分裂抑制剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂的抗代谢物、和热休克蛋白拮抗剂。
4.如权利要求1所述的药物组合物,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包括选自结合一种或多种肿瘤相关抗原的肽或抗体的靶向配体。
5.如权利要求1所述的药物组合物,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包括包含选自212Bi、131I、131In、90Y、188Tu和186Re的放射性同位素的放射性偶联物。
6.如权利要求1所述的药物组合物,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包括选自白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链,蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素以及它们的片段中的一种或多种细胞毒性剂。
7.有效量的药物组合物的用途,包括:
向受试者施用有效量的药物组合物,该药物组合物包括:
包含姜黄素的行星式球磨(PBM)纳米颗粒,其中,所述PBM纳米颗粒涂覆有叶酸、腺苷、嘌呤、激素、高亲和力肿瘤受体的肽配体或抗肿瘤抗原的抗体或它们的混合物。
8.如权利要求7所述的用途,其中,所述癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤,以及胚细胞瘤。
9.如权利要求7所述的用途,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包括选自化学治疗剂、放射性偶联物、抗体、siRNA、反义寡核苷酸、三链形成寡核苷酸以及细胞毒性剂中的一种或多种附加的细胞毒性剂。
10.如权利要求7所述的用途,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包括选自卡铂、顺铂、多西他赛和奥沙利铂中一种或多种化学治疗剂。
11.如权利要求7所述的用途,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包括放射性偶联物,所述放射性偶联物包含选自212Bi、131I、131In、90Y、188Tu和186Re的放射性同位素。
12.如权利要求7所述的用途,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包括选自白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链,蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单孢霉烯族毒素以及它们的片段中的一种或多种细胞毒性剂。
13.如权利要求7所述的用途,其中,所述PBM纳米颗粒包含基质芯,其含有选自藻酸盐、纤维素、胶原蛋白、淀粉和PEG中的一种或多种可生物降解的聚合物。
14.如权利要求7所述的用途,其中,所述PBM纳米颗粒包含基质芯,其含有PEG和选自藻酸盐、纤维素、胶原蛋白和淀粉的其它可生物降解的聚合物。
15.如权利要求7所述的用途,其中,所述PBM纳米颗粒进一步包括包含PEG、PCL或它们的混合物的释放控制涂层。
16.如权利要求7所述的用途,其中,所述叶酸或叶酸衍生物与所述释放控制涂层结合。
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CA3073631A1 (en) * | 2017-09-27 | 2019-04-04 | Targimmune Therapeutics Ag | Castration resistant prostate cancer |
EP3737415A4 (en) * | 2018-01-12 | 2021-06-30 | President and Fellows of Harvard College | COMPOSITIONS AND PROCEDURES RELATED TO MACROPHAGE AND / OR MONOCYTE WITH ATTACHED PARTICLES |
US10912843B2 (en) | 2018-04-04 | 2021-02-09 | National Cheng Kung University | Endoplasmic reticulum-targeting nanovehicles and methods for use thereof |
CN109350610B (zh) * | 2018-12-12 | 2021-06-01 | 湖南湘源美东医药科技有限公司 | 一种姜黄素复合纳米颗粒及其制备方法 |
CN112237638B (zh) * | 2020-10-28 | 2022-11-29 | 西安华牧生物科技有限责任公司 | 降低放射性核素肾浓聚的组合探针及其制备方法 |
WO2023172674A2 (en) * | 2022-03-09 | 2023-09-14 | The Regents Of The University Of California | One-step supramolecular multifunctional coating on plant virus nanoparticles for bioimaging and therapeutic applications |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070224280A1 (en) * | 2006-03-21 | 2007-09-27 | Lillard James W | Novel nanoparticles for delivery of active agents |
CN101563105A (zh) * | 2006-07-10 | 2009-10-21 | 拜奥根Idec马萨诸塞公司 | 用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法 |
CN103169973A (zh) * | 2007-11-12 | 2013-06-26 | 彼帕科学公司 | 使用4-碘-3-硝基苯甲酰胺化合物与抗肿瘤剂组合治疗乳腺癌 |
CN104066425A (zh) * | 2011-08-15 | 2014-09-24 | 詹姆斯·W·利拉德 | 特异性靶向癌细胞的输送系统及其使用方法 |
CN106580877A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-04-26 | 中国药科大学 | 一种水飞蓟宾纳米混悬剂及其制备方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US5817343A (en) * | 1996-05-14 | 1998-10-06 | Alkermes, Inc. | Method for fabricating polymer-based controlled-release devices |
ATE306497T1 (de) | 2003-11-11 | 2005-10-15 | Deutsches Krebsforsch | Peptid für die diagnose und therapie von tumoren |
US20080089941A1 (en) * | 2006-06-01 | 2008-04-17 | Mower Thomas E | Fucoidan compositions and methods |
US20100290982A1 (en) * | 2007-04-13 | 2010-11-18 | University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth | Solid in oil/water emulsion-diffusion-evaporation formulation for preparing curcumin-loaded plga nanoparticles |
US20090170195A1 (en) * | 2007-12-28 | 2009-07-02 | Kent State University | Curcumin-hyaluronan compounds |
US8685538B2 (en) * | 2009-03-25 | 2014-04-01 | Northeastern University | Stable polyelectrolyte coated nanoparticles |
-
2012
- 2012-08-08 CN CN201910155058.6A patent/CN110075316A/zh active Pending
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-
2015
- 2015-03-21 HK HK15102888.4A patent/HK1202796A1/zh unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070224280A1 (en) * | 2006-03-21 | 2007-09-27 | Lillard James W | Novel nanoparticles for delivery of active agents |
CN101563105A (zh) * | 2006-07-10 | 2009-10-21 | 拜奥根Idec马萨诸塞公司 | 用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法 |
CN103169973A (zh) * | 2007-11-12 | 2013-06-26 | 彼帕科学公司 | 使用4-碘-3-硝基苯甲酰胺化合物与抗肿瘤剂组合治疗乳腺癌 |
CN104066425A (zh) * | 2011-08-15 | 2014-09-24 | 詹姆斯·W·利拉德 | 特异性靶向癌细胞的输送系统及其使用方法 |
CN106580877A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-04-26 | 中国药科大学 | 一种水飞蓟宾纳米混悬剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
GARCIA-BENNETT ALFONSO等: "In search of the Holy Grail: Folate-targeted nanoparticles for cancer therapy", 《BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY》 * |
KIM T H等: "Preparation and characterization of water-soluble albumin-bound curcumin nanoparticles with improved antitumor activity", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS》 * |
RAJESH SINGH等: "Nanoparticle-based targeted drug delivery", 《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR PATHOLOGY》 * |
THANGAPAZHAM RAJESH L等: "Evaluation of a nanotechnology-based carrier for delivery of curcumin in prostate cancer cells", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY》 * |
张强,等: "《药剂学》", 31 January 2005, 北京大学医学出版社 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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