KR20180093967A - 유전자 교정된 자가유래 각질세포를 사용한 열성 이영양성 수포성 표피박리증의 유전자 치료법 - Google Patents

유전자 교정된 자가유래 각질세포를 사용한 열성 이영양성 수포성 표피박리증의 유전자 치료법 Download PDF

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응온 티. 응웬
엠. 피터 마린코비치
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알프레드 티. 레인
폴 에이. 크하바리
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

요약
수포성 표피박리증 및 각막 짓무름을 치료하기 위한 콜라겐 VII의 세포-기반 전달 방법을 제공한다. 본 출원은 또한 각질세포 시트 또는 각막 세포 시트를 포함하는, 또는 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되는, 또는 추가로 이들로 구성되는 조성물 및 제약학적 조성물을 제공한다.

Description

유전자 교정된 자가유래 각질세포를 사용한 열성 이영양성 수포성 표피박리증의 유전자 치료법
연방 지원 연구 및 개발
본 발명은 미국 국립 보건원이 지급하는 계약 AR055914 하에 정부 보조로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 가진다.
관련 출원들에 대한 상호-참조
본 출원은 2016년 1월 4일에 출원된 미국 출원 제 62/274,700호, 및 2016년 10월 28일 출원된 미국 출원 제 62/414,533호에 대하여 35 U.S.C. 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 이들 각 출원의 내용 전문은 본 출원에 참고로 포함된다.
분야
본 출원은 일반적으로 수포성 표피박리증 (EB) 및 각막 짓무름을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
배경
열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)은 C7 기능의 손실을 초래하는 COL7A1 유전자 (콜라겐 VII, C7)에서의 돌연변이에 의해 유발되는, 유전적인 유전자 수포성 피부 질환이다. 이 질환에 걸린 환자들은 입인두, 결막, 식도, 뿐만 아니라 비뇨생식관 및 위장관의 원위면을 비롯한 피부 및 점막 조직의 광범위한 수포형성 및 짓무름으로 특징지어진다. 통증있는 수포형성 및 짓무름이 주요 장애이지만; 회복된 상처로부터의 흉터형성은 또한, 벙어리장갑형 손 기형 (유사합지증, pseudosyndactyly), 눈의 안검안구유착증, 식도 협착, 작은입증, 설소대단축증, 및 사지 협착을 비롯한 상당한 이병을 유발한다. 만성적인 상처와 흉터형성은 침습성 편평 세포 암종 침습의 병인이 될 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 RDEB에서 심각한 문제가 되므로, 침습성 편평 세포 암종은 최근 20년사이에 이 모집단에서 주된 사망 원인이다. 그러므로 이러한 질병을 위한 최적의 치료법은 조기에 실시되어 흉터생성을 방지하고, 뿐만 아니라 수포형성을 방지하는 것이 될 수 있을 것이다. 또한, 피부 및 점막 조직을 전신적으로 교정하는 능력은 RDEB 치료를 접근함에 있어서 매우 바람직할 것이다.
VII형 콜라겐 (C7)은 대형 호모트라이머 삼중 나선형 콜라겐 분자인데, 이 분자는 NC2 단부에서 역-평행 다이머를 형성한 후, 고정 원섬유로 명명되는 부착 구조로 초분자 조립되는데, 고정 원섬유는 기저막 구역 (BMZ)의 기저판을 유두진피에 연결시킨다. C7은 대형 NC1 도메인을 내포하는데, 이 도메인은 기저판 및 콜라겐 도메인에서 라미닌-332를 결합시키고, 유두진피의 간질 콜라겐 원섬유들 주변을 감싼다. 그러므로, RDEB에서 C7의 결핍은 유두진피와 기저판 사이에서 수포를 생성한다.
이 질병의 분자 수준의 진단에서 진전에도 불구하고, 현재 치료법은 완화수준의 진료에 제한되어 있다. C7을 대체하기 위한 몇 가지 접근법들이 제시되어 왔으나, 모두 나름의 한계를 가지고 있다. 국소 도포되는, rC7은 무손상 피부를 침투할 수 없으며 상처입은 부위들에 제한된다. RDEB 환자들을 위한 진피 내 rC7 단백질 주사는 또 다른 대안이지만; 전통적인 바늘 주사로 인한 제한된 확산은 rC7 미세바늘 배열 전달을 필요로 하는데, 이는 아직 임상용으로 사용될 수 없다.
치료 목적을 위해, 피부에 대한 C7의 국소 전달이 바람직하다. 본 발명은 이러한 문제점을 해결한다. C7의 전신 치료법은 전신 독성을 유발할 수 있다. (Hou 외 (2015), Journal of Investigative Dermatology 135, 3060-3067 참고.)
요약
인간 대상체에서 수포성 표피박리증 (EB)을 치료하기 위한 조성물 및 방법들이 제공된다. 본 발명의 방법들의 치료에서, 인간 각질세포 모집단은 야생형 인간 C7을 인코딩하는 유전자 작제물을 혼입시킴으로써 C7을 발현시키도록 유전자 조작된다. 일부 구체 예들에서 그 발현 수준은 정상적인 인간 각질세포 발현 수준보다 크다. 일부 구체 예에서, 발현 수준은 정상적인 인간 각질세포 발현 수준에 비해 작거나, 유사하거나 동일하다. 본 발명은 야생형 C7을 발현시키기 위한 본 발명의 방법들에 의해 유전자 조작된 단리된 각질세포 모집단을 포함하며, 이는 제약학적 단위 용량 조성물로 제공될 수 있다. 일부 구체 예들에서, 대상체는 수포성 표피박리증 (EB)을 유발하는, C7 유전자 결손에 걸린 인간이다. 이 구체 예들에서, 유전자 결손은 RDEB이다.
일부 구체 예들에서, 치료에 이용되는 각질세포는 자가유래 각질 세포이다. 생체 외 유전자 조작 방법은, 레트로바이러스 (예컨대, 감마레트로바이러스), AAV 바이러스, 및 렌티바이러스, 또는 무-바이러스 통합 방법들을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 바이러스-유도된 방법들로부터 제한없이 선택될 수 있으며, 이러한 방법들에는 비-바이러스 벡터들, 트랜스포존, 미니-서클 통합, CRISPR/Cas9 게놈 편집 시스템 등이 포함된다. 일부 구체 예들에서, 감마레트로바이러스는, 쥐과 백혈병 바이러스 (MLV 또는 MuLV), 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV), 및 이종친화 쥐과 백혈병 바이러스-관련 바이러스 (XMRV)를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 일부 구체 예들에서, 비-바이러스 벡터들은 게놈 편집 특징부 능력을 가지는 에피솜 벡터들 또는 통합 벡터들을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 일부 구체 예들에서, MLV LTR 제어하에, 기능적 COL7A1 cDNA를 내포하는 GMP-등급의 GalV-가성형(pseudotyped) LZRSE-COL7A1 바이러스가 C7 유전자를 각질세포에 통합시키기 위해 사용된다. 일부 구체 예들에서, 기능적 COL7A1 cDNA는 전장 야생형 인간 COL7A1 cDNA이다. 한 구체 예에서, 기능적 COL7A1 cDNA는 전장 야생형 인간 COL7A1 cDNA의 유전자 변형을 포함한다. 일부 구체 예들에서, 바이러스 형질도입은 세포 배양위에 바이러스 상청액을 오버레이(overlay)하여 실시된다. 일부 구체 예들에서, 이렇게 처리된 각질세포는 바이러스 형질도입율 (VTE) >50% 및 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN) ≤≤ 3의 박리 전 기준 (pre-release criteria)을 만족시킨다. 일부 구체 예들에서, PGCN는 3, 10, 20, 40, 또는 60 보다 크다. 일부 구체 예에서, PGCN은 2, 1.5, 1, 또는 0.5 보다 작다.
일부 구체 예에서, 내인성 돌연변이된, 기능이상, 또는 절두된 C7 유전자는 표적화 절단 후 유전자에 삽입되는 “공여자” 서열 (예컨대, 기능적 COL7A1 cDNA 또는 C7 유전자) 및 본 출원에 기재된 CRISPR/Cas 시스템 (또는 상기 CRIPSR/Cas 시스템을 인코딩하는 벡터)을 사용하여 대체된다.
본 발명의 일부 구체 예들에서, EB의 치료 방법이 제공되며, 이 방법은 EB에 걸린 대상체로부터 각질세포 모집단을 얻는 단계, 야생형 인간 C7을 발현시키기 위해 각질세포를 레트로바이러스 형질도입으로 변형시키는 단계, 및 이 각질세포를 개체에 재도입시키는 단계를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 추가로 구성된다. 일부 구체 예들에서, 각질세포는 피부 펀치 생검으로부터 얻으며, 혈청의 존재 또는 부재하는 각질세포 배지에서 생체내 배양된다. 일부 구체 예들에서, 각질세포는 세포 공급층이 존재 또는 부재하는 배지에서 배양된다. 표피는 진피층으로부터 분리되며 각질세포는 이러한 표피층으로부터 얻어진다. 유전적으로 교정된 세포들의 모집단을 제공하기 위한 형질도입에 최소한 약 106개 세포들, 최소한 약 2 x 106개, 및/또는 최소한 4 x 106개 세포들이 사용된다. 세포들을 배양하여 약 25 cm2 내지 약 100 cm2 의 이식용 시트를 만든다. 유전적으로 교정된 각질세포 시트들은 편평 세포 암종(SCC)의 임상 증거가 없었던 감염되지 않은, 진무른, 및/또는 흉터가 생긴 상처 부위 위에 배치된다. 상처 부위들은 약 50 cm2, 약 100 cm2, 및/또는 약 200 cm2 일 수 있다. 일부 구체 예들에서, 상처는 이식을 위해 생성된다. 이러한 일부 구체 예들에서, 상처는 교정되지 않은 남아있는 상처층 각질세포를 제거하기 위해 전기소작된다. 상처층을 만든 후 용해가능한 봉합사를 이용하여 이식편들을 상처층에 고정시킨다.
또 다른 구체 예에서, 본 출원은 EB의 증상들을 감소시킴에 유효한 용량의, 야생형 인간 C7을 발현시키기 위해 유전자적으로 교정된 각질세포 모집단, 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 추가로 구성되는 조성물을 제공한다. 본 출원의 한 양상에서, 조성물은 동결된다. 일부 구체 예들에서, 각질세포는 치료를 위해 선택된 개체에 대해 자가유래성이다.
또 다른 구체 예에서, 본 출원은 기능적 COL7A1 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물과 생체 외 통합된 피부 세포들을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 추가로 구성된 각질세포 시트를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 추가로 구성되는 제약학적 조성물을 제공한다. 일부 구체 예들에서, 각질세포 시트는 생체공학적 피부 균등물 위에 배치된다. 일부 구체 예들에서, 각질세포 시트는 무세포 기질, 콜라겐 기질, ECM 단백질 또는 화학물질층, 또는 생체적합성 메쉬위에 배치된다. 한 구체 예에서, 무세포 기질은 인간 및/또는 동물 진피로 만들어진다. 일부 구체 예들에서, 생체적합성 메쉬는 열가소성 수지, 폴리에틸렌, 초 고분자량 폴리에틸렌, 고분자량 폴리올레핀, 비코팅된 모노필라멘트 폴리프로필렌, 폴리에터 에터 케톤, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌, 나일론, 실리콘, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진다.
본 출원에서, 자가유래 RDEB 각질세포는 피부 생검으로부터 단리되고 기능적 (예컨대, 전장) 인간 COL7A1을 운반하는 레트로바이러스로 형질도입되었음을 보여준다. 각각의 대상체를 위한, 자가유래 표피 시트들 (~35 cm2)을 제작하고 만들어준 상처층에 이식하였다. 지표들은 기준선과 비교한 백분율로 상처 치유의 안전성, 효능, 그리고 이식 후 3 및 6 개월 후에 C7 발현의 증거를 포함하였다. 모든 이식편들이 모든 대상체들에게 내성이 우수하였으며, 심각한 유해 사례들 (전신 바이러스 감염, 자가-면역, 이식편들 내에서 피부 암 발생)은 보고되지 않았다. 3-6 개월에, 이식편들 대부분이 75% 치유를 보여주었다. 이식편 부위들로부터 얻은 생검들은 정상적인 고정 원섬유의 존재시 3 개월에 그리고 6개월에 진피-표피 연결부에서 강력한 C7 발현을 보였다. COL7A1 생체 외 유전자 전달은 유리한 안전성 프로파일을 가졌으며 유전된 RDEB를 가진 대상체에서 권장되는 효능을 보여주었다.
도 1. (A) RDEB 유전자 교정 흐름도. KC - 표피 각질세포, LEAES - LZRSE-COL7A1 유전자 조작된 자가유래 표피 시트 이식편들. ( B) LZRSE-COL7A1 바이러스 형질도입된 RDEB KC의 간접 면역형광법 (IIF). 항-VII형 콜라겐 다클론 항체 (오렌지색); Hoechst 33342 핵 (청색). 스케일 바, 100 μm. (C) 4명의 RDEB 대상체들의 교정된 KC에서 바이러스 형질도입율 (VTE)의 정량화. (D) 4명의 RDEB 대상체들의 교정된 KC에서 평균 프로바이러스 복제수(PGCN)의 정량화. (E) 이식편 이식 전과 후 REDB 표현형의 임상적 표현. 교정된 피부 이식 전 및 치료되지 않은 상처들에서의 수포들을, LEAES 이식 후 3 및 6개월 후에 비교하였음을 주목하라. (F) 피부 이식편들에서 VII형 콜라겐 발현의 IIF 분석. 항-VII형 콜라겐 NC2 Mab LH24 및 NC1 Pab FNC1 (녹색); Hoechst 33342 핵 (청색); 교정된 조직 이식편들의 진피-표피 연결부에서 VII형 콜라겐의 선형 녹색 염색을 주목하라. 스케일 바, 100 μμ. (G) 교정된 RDEB 피부 이식편들의 면역-EM 분석. 조직 단면들을 항-VII형 콜라겐 NC2 Mab LH24로, 그 다음 항-마우스 IgM-접합된 면역금 입자들 (흑색 점들, 화살표로 표시됨)로 일괄 표지하였다. 스케일 바, 200 nm.
도 2. I상 임상 시험에서 대상체 등록의 CONSORT 도표.
도 3. NC1 도메인에 특이적인 항 VII형 콜라겐 다클론 항체를 사용한, 배양된 KC 상청액의 웨스턴 블롯 분석. 임상 시험에 등록한 모든 대상체들에서 NC1 도메인을 내포하는 절두된 C7 단백질 발현을 주목하라.
도 4. 수집 전 성숙 LEAES, 조립된 그리고 최종 LEAES 이식편을 보여준다.
도 5. (A) 이식편 이식 전과 후 REDB 표현형의 임상적 표현. (B) 피부 이식편들에서 VII형 콜라겐 발현의 IIF 분석. 항-VII형 콜라겐 NC2 Mab LH24 (녹색); Hoechst 33342 핵 (청색); 케라틴 14 (항-K14 Pab, 오렌지색); 케라틴 1 (항-K1 Pab, 오렌지색) 및 로리크린 (항-로리크린 Pab, 오렌지색). 모든 시점들에서 교정된 조직 이식편들의 진피-표피 연결부에서 VII형 콜라겐의 선형 녹색 염색을 주목하라. 스케일 바, 100 μm.
도 6. 이식 전과 후 대상체 2의 상처들. (A) 이식편 이식 전과 후 REDB 표현형의 임상적 표현. (B) 피부 이식편들에서 VII형 콜라겐 발현의 IIF 분석. 항-VII형 콜라겐 NC2 Mab LH24 (녹색); Hoechst 33342 핵 (청색); 케라틴 14 (항-K14 Pab, 오렌지색); 케라틴 1 (항-K1 Pab, 오렌지색) 및 로리크린 (항-로리크린 Pab, 오렌지색). 3개월에 교정된 조직 이식편들의 진피-표피 연결부에서 VII형 콜라겐의 선형 녹색 염색을 주목하라. 스케일 바, 100 μm.
도 7. 이식 전과 후 대상체 3의 상처들. (A) 이식편 이식 전과 후 REDB 표현형의 임상적 표현. (B) 피부 이식편들에서 VII형 콜라겐 발현의 IIF 분석. 항-VII형 콜라겐 NC2 Mab LH24 (녹색); Hoechst 33342 핵 (청색); 케라틴 14 (항-K14 Pab, 오렌지색); 케라틴 1 (항-K1 Pab, 오렌지색) 및 로리크린 (항-로리크린 Pab, 오렌지색). 모든 시점들에서 교정된 조직 이식편들의 진피-표피 연결부에서 VII형 콜라겐의 선형 녹색 염색을 주목하라. 스케일 바, 100 μm.
도 8. 이식 전과 후 대상체 4의 상처들. (A) 이식편 이식 전과 후 REDB 표현형의 임상적 표현. (B) 피부 이식편들에서 VII형 콜라겐 발현의 IIF 분석. 항-VII형 콜라겐 NC2 Mab LH24 (녹색); Hoechst 33342 핵 (청색); 케라틴 14 (항-K14 Pab, 오렌지색); 케라틴 1 (항-K1 Pab, 오렌지색) 및 로리크린 (항-로리크린 Pab, 오렌지색). LH24 Mab으로 3개월에 그리고 NC1 Pab로 6 개월에 교정된 조직 이식편들의 진피-표피 연결부에서 VII형 콜라겐의 선형 녹색 염색을 주목하라. 스케일 바, 100 .
도 9. 항-C7 LH24 단클론 항체 특성화. NC2 도메인을 내포하는 카르복실-말단 펩티드에 대한 LH24 Mab 교차-반응성을 보여주는, 효소적으로 분해된 C7의 웨스턴 블롯 분석. NC2 특이적 pAb (NC2-10) 5을 사용하여 확인된 펩신 분해된 C7 분획에서의 NC2 도메인 존재. FNC1 pAb 6을 사용하여 확인된 콜라겐분해효소 분해된 C7 분획에서의 NC1 도메인.
도 10. 대상체 4로부터 얻은 교정되지 않은 상처들의 임상적 표현. 치료되지 않은 상처들에서 특징적인 자발적 수포 발달.
도 11. VII형 콜라겐에 대한 대상체 4 혈청 반응성. (A) 이식편 이식 전과 후 (3개월) 전장 C7에 대한 대상체 4 혈청의 교차-반응성을 보여주는 웨스턴 블롯 분석. (B) 이식 전 및 이식 후 3개월에 얻은 대상체 4 혈청은 NC2 도메인을 내포하는 효소적으로 (펩신) 분해된 C7 단백질에 특이적이다. 대조군 (오른쪽 레인)은 NC2 특이적 Pab (NC2-10) 5를 사용하여 분해된 C7 분획에서의 NC2 도메인 존재를 확인시킨다.
도 12. 이식 전 및 후 12개월의 대상체 1 상처들. 기준선에서 그리고 이식 후 12개월에서 상처들의 임상적 표현. 피부 이식편들에서 VII형 콜라겐 발현의 IIF 분석. 항-VII형 콜라겐 NC1 Pab (녹색); Hoechst 33342 핵 (청색); 케라틴 14 (항-K14 Pab, 오렌지); 케라틴 1 (항-K1 Pab, 오렌지색) 및 로리크린 (항-로리크린 Pab, 오렌지색). 교정된 조직 이식편의 진피-표피 연결부에서 VII형 콜라겐의 선형 녹색 염색을 주목하라. 스케일 바, 100 μm.
도 13은 pLZRSE-COL7A1 레트로바이러스 플라스미드의 맵을 도시한다.
본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물종 또는 속, 및 시약들에 제한되지 않으며, 이에 따라 변화할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 구체 예들을 오직 설명하기 위한 것이며, 제한을 하고자 하는 것이 아니므로, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 또한 이해하여야 한다.
본 출원에서 사용되는, 단수형 “하나" 및 “그것”은 내용상 명확히 달리 언급이 없는 한, 복수형들을 포함한다. 그러므로, 예를 들면, "하나의 세포"에 대한 지칭은 복수의 이러한 세포들을 포함하며 "배양"에 대한 지칭은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 하나 또는 그 이상의 배양물들 및 이의 균등물들, 등에 대한 지칭을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 명확히 달리 언급이 없는 한 본 발명이 속하는 해당 분야의 숙련된 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 임의의 방법들, 장치들, 및 시스템들의 임의의 구체 예는 ―기재한 단계들 및/또는 특징들을-포함(comprise/include/contain/have)하기 보다는-이들로 구성되거나 본질적으로 구성될 수 있다. 그러므로, 임의의 청구항에서, 용어 “로 구성된” 또는 “본질적으로 ~로 구성된”은, 상기 언급된 임의의 개방형 연결 동사들을, 개방형 연결 동사를 사용하지 않았을 경우의 청구범위로부터 주어진 청구범위를 변화시키기 위하여, 개방형 연결 동사를 사용하여 치환할 수 있다.
본 명세서가 대안만을 그리고 “및/또는”을 지칭하는 정의를 뒷받침하지만, 청구범위에서 용어 “또는”의 사용은, 대안들만을 지칭하는 것으로, 또는 대안들이 서로 배타적인 것임을 명시적으로 언급하지 않는 한, “및/또는”을 의미하기 위하여 사용된다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 일정 수치가 해당 수치를 결정하기 위하여 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 유전자 조작된 각질세포를 이용한 치료에 관한 관심 조건들에는, 제한없이, 후천성 및 선천성 형태를 비롯한 수포성 표피박리증의 다양한 형태들이 포함되며, 선천성 형태는 열성 또는 우성일 수 있다.
최근의 분류 체계에 기초하여, 이영양성 수포성 표피박리증 (DEB)은 다음 세 가지 하위유형들을 포함한다: 열성 DEB, 중증 전신성 (RDEB-sev gen) (이전에는 Hallopeau-Siemens 유형 (RDEB-HS)으로 불림; 열성 DEB, 기타 전신성(RDEB-O) (이전에는 비-Hallopeau-Siemens 유형 (RDEB-비-HS)으로 불림; 및 우성 DEB (DDEB). RDEB-sev gen에서, 전신에 영향을 주는 수포들은 신생아기에 존재할 수 있다. 입에 관련되면 입의 수포형성, 혀의 입의 바닥으로의 융합, 및 구강 크기의 점진적 감소를 초래할 수 있다. 식도 짓무름은 심한 삼킴장애를 일으킬 수 있는 웹 (web) 및 협착을 초래할 수 있다. 결과적으로, 심각한 영양 결핍 및 이차적 문제들이 공통적이다. 각막 짓무름은 흉터형성 및 시각 소실을 초래할 수 있다. 손과 발의 수포형성 후 흉터형성은 손가락 발가락들을 “벙어리 장갑형” 손과 발로 융합시키는데, 이는 이 질환의 특징이다. 공격형 편평 세포 암종의 평생위험은 90% 이상이다. DDEB에서, 수포형성은 종종 가벼우며 손, 발, 무릎 및 팔꿈치에 한정되지만, 그럼에도 불구하고 흉터가 형성되면서 치유된다. 이영양성 손발톱, 특히, 발톱이 통상적이며 이는 유일한 DDEB의 소견일 수 있다.
이러한 소견들의 전통적인 치료는 상처 드레싱 및 영양 지원을 비롯하여, 주로 보조적인 것이다. 작업 치료법은 손 구축 (hand contractures) 예방에 도움을 줄 수 있다. 손가락들의 외과적 복구를 종종 반복할 필요가 있다.
야생형 C7을 발현시키기 위하여 유전자 조작된 각질세포는 이영양성 수포성 표피박리증을 위한 치료에서 용도를 찾을 수 있다.
선천성 EB 형태들 이외에도, 후천성 수포성 표피박리증 (EBA) 형태가 VII형 콜라겐의 병리에 관여하며 본 출원의 유전자 조작된 각질세포를 이용하여 치료될 수 있다. EBA 환자에서 순환하는 자가항체들은 VII형 콜라겐 분자들에서 에피토프들을 인식하고, VII형 콜라겐 cDNAs의 분자 클로닝은 VII형 콜라겐의 아미노-말단 NC-1 도메인 내에서 우세한 면역에피토프를 식별하기 위한 툴을 제공하였다. NC-1(VII) 도메인의 항원성은, 선천성 형태의 EB에 걸린 환자들의 피부에서 VII형 콜라겐을 맵핑하기 위해 임상적으로 사용되는 단클론 항체들, 가령, H3A 및 L3D 또한 이러한 단백질 부분에서 에피토프들을 식별한다는 사실에 의해, 더욱 강조된다. EBA에서 VII형 콜라겐 에피토프들을 인식하는 순환하는 자가항체들 이외에도, 전신 홍반 루푸스에 걸린 일부 환자들에서 물집이 생긴 병소들은 또한 항-VII형 콜라겐 항체들과 연관되어 왔다.
콜라겐. 본 출원에서 사용되는 용어 “콜라겐”은, 존재하는 단백질의 최소한 약 50%, 최소한 약 60%, 최소한 약 70%, 최소한 약 80%, 최소한 약 90%, 최소한 약 95%, 또는 그 이상이 삼중 나선 구조의 콜라겐인 조성물을 지칭한다. 개개 사슬들의 삼중-나선 입체형태로의 폴딩은 반복되는 Gly-X-Y 삼핵산 서열들을 비롯한, 특징적인 주요 서열에서 예상된다. 콜라겐은 척추동물 종들에서 광범위하게 발견되며 많은 상이한 종들에 대해 시퀀싱되어 있다. 인간 단백질이 바람직할 수 있지만, 종들 간 고도의 서열 유사성으로 인해 상이한 종들의 콜라겐이, 예컨대, 포유동물 종들 간에 생의학적 목적을 위해 사용될 수 있다.
FACIT 콜라겐들 (불연속된 삼중 나선을 가지는 원섬유-연관 콜라겐)은 IX, XII, XIV, XIX, XX, 및 XXI형을 포함한다. 후자 유형의 콜라겐들 중 몇가지는 보다 큰 콜라겐 섬유들과 관련되며 세포 외 기질의 조직화를 안정화시키는 분자 다리로서 기능한다. 콜라겐 VII, (COL7A1, 염색체 3, NC_000003.10 (48576510..48607689, 보체))은 특히 흥미롭다. VII형 콜라겐은 고정 원섬유의 주성분이다.
VII형 콜라겐은 비-콜라겐 서열들이 연접되어 있는 긴, 424 nm의, 삼중-나선 도메인이다. VII형 콜라겐 분자들은 비-콜라겐 NC-1 및 NC-2 도메인들이 연접되어 있는 중심이 되는 콜라겐 삼중-나선 단편을 포함한다. 간질 콜라겐들과 달리, 반복되는 Gly-X-Y 서열은 Gly-X-Y 반복 서열에서의 아미노산 삽입 또는 결실로 인한 19개 결함들에 의해 불연속된다. 가장 주목할 만한 것은, 삼중-나선 도메인의 중간에, 펩신을 이용한 단백질가수분해적 소화에 취약한 39개-아미노산 비-콜라겐 “힌지” 영역이 존재한다는 점이다. 대략 145 kDa 크기의, VII형의 아미노-말단 NC-1 도메인은, 공지된 접착 단백질들에 대한 상동성을 가지는 하위-모듈들을 포함하며, 이러한 모듈들에는 연골 기질 단백질 (CMP)에 대한 상동성을 가지는 단편들, 9개의 연속 피브로넥틴 III형-유사 (FN-III) 도메인들, 폰 빌리브란트 인자의 A 도메인에 대한 상동성을 가지는 단편, 및 짧은 시스테인 및 프롤린-농후 영역이 포함된다. 카르복시-말단 비-콜라겐 도메인인, NC-2는, ~30kDa으로 비교적 작으며, 이는 쿠니쯔 프로테아제 억제제 분자에 대한 상동성을 가지는 단편을 내포한다.
인간 VII형 콜라겐 유전자, COL7A1은 총 118개의 별도의 엑손들을 가지는 복합체 구조를 가진다. 그러나 이 유전자는 비교적 치밀하며, 인트론들 대부분이 비교적 작고; 결과적으로, 전체 인간 COL7A1 유전자의 크기는 고작 ~32 kb로, ~8.9 kb의 메신저 RNA를 인코딩한다. COL7A1은 인간 염색체 3의 짧은 팔인, 영역 3p21.1에 맵핑되었다. VII형 콜라겐 유전자 구조 및 인코딩된 단백질의 일차 서열은 잘 보존되는데, 예를 들면, 마우스 유전자는 84.7%의 뉴클레오티드 상동성을, 그리고 90.4%의 단백질 수준 동일성을 보인다.
VII형 콜라겐은 배양액 내 표피 각질세포 및 진피 섬유모세포 모두에 의해 합성된다. 완전한 프로-α1(VII) 폴리펩티드의 합성시, 3개의 폴리펩티드가 그 카르복시-말단 단부들을 통해 트라이머 분자에 결합하며, 이 분자에서 그 콜라겐 부분이 삼중-나선 형태로 폴드된다. 그 후 삼중-나선 분자들은 세포외 환경으로 분비되며 이러한 세포외 환경에서 두개 유형의 VII 콜라겐 분자들은 분자의 양쪽 단부들 모두에 아미노-말단 도메인들이 존재하는 역-평행 다이머로 정렬된다. 이러한 다이머 조립 후 두 가지 VII형 콜라겐 분자들 모두의 카르복시-말단 단부 부분의 단백질가수분해 제거 및 분자간 다이설파이드 결합 형성에 의한 안정화가 이어진다. 후속하여, 다수의 이러한 역-평행 다이머들은 측면으로 응집하여 고정 원섬유를 형성한다.
COL7A1의 삼중 나선 도메인에서 (특히 엑손 73, 74, 및 75에서) 글리신 치환 돌연변이들이 우성 이영양성 수포성 표피박리증 (DDEB)에서 두드러진다. 돌연변이 p.Gly2034Arg 및 p.Gly2043Arg은, 최대 US 코호트에서 보고된 우성 돌연변이들 중 50%를 구성하는 가장 통상적인 DDEB-유발 돌연변이들이다. 글리신 치환 뿐만 아니라 그 외 다른 아미노산 치환들 및 이 영역 밖의 스플라이스 접합부 돌연변이들 또한 우성 DEB에서 발견될 수 있다.
전체 유전자에 걸쳐 400개 이상의 열성 DEB-유발 돌연변이들이 모든 형태의 DEB에 대해 기재된 바 있다. 그러나 각각의 돌연변이는 총 돌연변이 수의 1% - 2% 이하를 차지한다. 글리신 치환들 및 그 외 다른 아미노산 치환들이 기재된 바 있으나, RDEB에서는 영 돌연변이(null 돌연변이s)가 우세하다. 보다 가벼운 형태의 RDEB는 종종 스플라이스 접합부 돌연변이 또는 그 외 다른 과오 돌연변이들에 의해 유발된다.
“고유 서열” 폴리펩티드는 천연에서 유래한 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드이다. 이러한 고유 서열 폴리펩티드는 본 출원에 제시된 방법들에 따른 재조합 수단들에 의해 제조될 수 있다. 그러므로 고유 서열 폴리펩티드는 예컨대, 자연 발생 인간 폴리펩티드, 쥐과 폴리펩티드, 또는 임의의 그 외 다른 포유동물 종들로부터 얻은 폴리펩티드, 등의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 용어 “고유 서열 콜라겐 VII 단백질”은 N-말단의 개시 메티오닌 (Met)을 가지거나 가지지 않는 고유 단백질들을 포함한다.
변이체” 폴리펩티드는 고유 서열 폴리펩티드와 100% 미만의 서열 동일성을 가지는 하기 정의되는 바와 같은 생물학적 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체들은, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 고유 서열의 N- 또는 C-말단에 또는 고유 서열 내부에 추가되어 있고; 약 1 내지 40개의 아미노산 잔기들이 결실되고, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들에 의해 치환되어 있는 폴리펩티드; 그리고, 아미노산 잔기가 공유적으로 변형되어 있어 생성된 생성물이 비-자연 발생 아미노산을 가지게 되는, 상기 폴리펩티드의 유도체들을 포함한다. 보통, 생물학적 활성 콜라겐 VII 변이체는 고유 서열 콜라겐 VII 폴리펩티드와 최소한 약 90%, 바람직하게는 최소한 약 95%, 더욱 바람직하게는 최소한 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가질 것이다.
고유 서열 콜라겐, VII 폴리펩티드의 “기능적 유도체”는 고유 서열 콜라겐 VII 폴리펩티드와 공통되는 정성적인 생물학적 성질을 가지는 화합물이다. “기능적 유도체”는, 이들이 해당 고유 서열 콜라겐 VII 폴리펩티드와 공통되는 생물학적 활성을 가짐을 조건으로, 고유 서열의 단편들 및 고유 서열 콜라겐 VII 폴리펩티드의 유도체들 및 이의 단편들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 “유도체”는 콜라겐 VII 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체들 및 이의 공유적 변형들 모두를 포함한다.
용어 “상처층”은 상처의 최상부의 눈에 보이는 층을 지칭한다. 한 구체 예에서, 상처층은 딱지 (slough) 또는 괴사딱지 (eschar)로 덮인다. 또 다른 구체 예에서, 상처층은 과립 조직 피브린 딱지, 괴사딱지, 골, 힘줄, 및/또는 그 외 다른 기저 구조들의 존재에 대해 평가될 수 있다.
용어 “바이러스 형질도입율 (VTE) 시험”은 형질도입 대상 총 세포들에 대한 바이러스 형질도입된 세포들의 수의 비율을 측정하기 위한 시험이다. 한 구체 예에서, VTE는 형질도입된 바이러스에서 발현되는 단백질을 표적하는 항체로 면역형광 염색함으로써 측정된다. 또 다른 구체 예에서, VTE는 실시간 PCR 또는 정량적 PCR에 의해 측정된다.
용어 “프로바이러스 게놈 복제 수”또는 "PGCN"은 바이러스 형질도입된 세포들에서 프로바이러스 DNA 복제 수를 지칭한다. 그러므로 PGCN 시험은 바이러스 형질도입 또는 감염 후 세포에서 프로바이러스 DNA의 복제 수를 측정한다. 한 구체 예에서, 복제 수는 실시간 PCR 또는 정량적 PCR에 의해 측정된다. 또 다른 구체 예에서, PGCN은 서던 블롯 또는 초고속법 (high-throughput method)에 의해 측정된다. 일부 구체 예에서, PGCN은 3, 2, 1, 0.5 보다 작다. 일부 구체 예에서, PGCN은 3, 10, 100, 또는 1,000 보다 크다.
용어 “무균 시험”은 시료에서 생존 가능한 오염 미생물의 존재 또는 부재를 나타내기 위한 시험을 지칭하며, 거짓 양성 결과를 제거하기 위해 종종 사용된다. 한 구체 예에서, 거짓 양성 결과는 환경으로 인한 오염 또는 오차로 인해 생성된다.
용어 “내독소”는, 브루셀라, 나이세리아, 및 비브리오 종들을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 특정한 그람-음성 세균의 외부 막과 연관된 독소를 지칭한다. 한 구체 예에서, 내독소들은 분비되지 않지만 세포들이 파괴될 때에만 방출된다. 내독소는 겔화법 (gel-clot method), 비색법 (chromogenic method), 비탁법 (turbidimetric method), 또는 이의 조합에 의해 측정 또는 시험될 수 있다.
용어 “마이코플라즈마”는 그 세포막 주위에 세포벽이 없는 세균의 모집단을 지칭하는데, 그리하여 이러한 세균은 특정 유형의 항생제들에 의해 덜 영향을 받거나 영향을 받지 않는다. 마이코플라즈마 시험은, 한천-및-액체배지 절차, DNA 탐지, 효소 및 ELISA법, 및 PCR을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “그람 염색 무균 시험”은 시료내 세균 및/또는 진균을 탐지하기 위한 절차를 지칭한다. 한 구체 예에서, 그람 염색 무균 시험은 시료에서 세균 또는 진균 및/또는 이들의 일반형의 존재 또는 부재를 보여줄 수 있다.
용어 “생존력 시험”은 생존력을 유지 또는 회복시키는 기관, 세포 또는 조직의 능력을 측정하기 위한 시험을 지칭하며, 기관, 세포 또는 조직의 기계적 활성, 운동성, 수축성, 유사분열 활성이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 한 구체 예에서, LZRSE-COL7A1 유전자 조작된 자가유래 표피 시트 (LEAES) 생존력 시험은 생존력을 유지 또는 회복시키는 LEAES 상의 세포 또는 조직의 능력을 시험하는 것이다.
본 출원에서 용어 “복제 가능 레트로바이러스 (RCR)”는, 레트로바이러스 벡터들이 복제 결손이 되도록 설계되었다 하더라도, 복제가능한 레트로바이러스를 지칭한다. 한 구체 예에서, RCR은 생산 세포들에서 전달 벡터, 패키징 성분들 및 내인성 레트로바이러스 요소들 사이에 상동 또는 비-상동 재조합을 통하여 제작하는 과정에서 생성된다. RCR 시험은 시료 내 RCR을 탐지하기 위한 것이다.
용어 “세포독성 T 세포 분석법”은 세포-매개된 면역 기능을 평가하기 위한 분석법을 지칭한다.
본 출원에서 용어 “박리 후 (post-release) 시험”은, 표피 시트가 플레이트로부터 박리된 후 하나 또는 그 이상의 시험들을 지칭하며, 이러한 시험에는 무균 시험, RCR 시험, 마이코플라즈마 시험, 생존력 시험, 및 그람 염색 무균 시험이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “유전자 변형”은 유기체의 유전자를 변경시키거나 하나의 유기체로부터 그 외 다른 유기체로 유전자를 삽입하는 과정을 지칭한다. 한 구체 예에서, 유전자 변형은 삽입, 결실, 및/또는 돌연변이를 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나 또한 이들로 구성된다. 용어 “삽입”은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 염기 쌍들의 뉴클레오티드 서열로의 추가를 의미한다. 용어 “결실”은 제거 또는 결손된 염색체 또는 뉴클레오티드 서열의 일부를 지칭한다. 용어 “돌연변이”는 뉴클레오티드 서열 (예컨대, DNA 서열)의 변경이다. 돌연변이는, 하나의 염기쌍 (즉, 점 돌연변이), 여러 개의 염기 쌍들, 또는 최대 큰 염색체 단편을 비롯하여 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 다양한 크기로 발생할 수 있다.
용어 “보존적 유전자 변형”은 유전적으로 변형된 유전자에 의해 인코드되는 폴리펩티드의 동일하거나 유사한 생화학적 성질들을 유지시키는 유전자 변형을 지칭한다. 예를 들면, 아스파르트산 및 글루탐산 모두는 모두 작고, 음으로 하전된 잔기들이다. 일부 구체 예에서, 하나의 폴리펩티드에서의 아스파르트산의 글루탐산으로의 돌연변이는 보존적 유전자 변형이다.
프롤릴 4-수산화효소 (P4HA ; EC 1.14.11.2)는 콜라겐 합성에서 중심적인 역할을 한다. 이는 펩티드 결합에서 프롤린 잔기들을 수산화함으로써 콜라겐에서 4-하이드록시프롤린의 형성을 촉매화한다. 4-하이드록시프롤린 잔기들은 새로이 합성된 전구콜라겐 폴리펩티드 사슬의 삼중 나선 분자들로의 폴딩에 필수적이다. 활성 효소는, 약 240,000의 분자량을 가지는, 2 알파 및 2 베타 소단위들의 테트라머이다. 베타 소단위 (P4HB)는 효소 다이설파이드 이성화효소 (EC 5.3.4.1)와 동일하며 주요 세포 갑상선-결합 단백질이다. 알파 소단위는 효소의 촉매 부위의 주요부에 기여한다. 이 폴리펩티드는 517개의 아미노산 잔기들로 되어 있으며 17개 아미노산들의 신호 펩티드이다.
P4HA 유전자는 69 킬로베이스 이상에 이르며 16개 엑손들로 구성된다. 유전자의 RNA 전사체들의 상호 배타적인 선택적 스플라이싱 (mutually exclusive alternative splicing)에 관한 증거가 이전에 제시된 바 있다. 제시된 데이터는 mRNA에서 발견되는 상호 배타적 서열들이 2개의 연속적인, 상동 71-bp 엑손들, 9와 10에 의해 코드됨을 나타내었다. 이들 엑손은 이들의 첫 번째 5개 염기 쌍들에서 동일하며 이들 간 전체 동일성은 뉴클레오티드 수준에서 61%이고 코딩된 아미노산 수준에서 58%이다. 두 유형들의 mRNA 모두 연구하였던 모든 조직에서 발현됨이 밝혀졌으나, 일부 조직에서 엑손 9 또는 엑손 10 서열들에 대해 코딩하는 유형이 다른 하나의 유형보다 더 풍부하였다.
"핵산 작제물"은 자연에서 함께 발견되지 않는 하나 또는 그 이상의 기능적 단위들을 포함하도록 작제되어 있는 핵산 서열을 의미한다. 예들에는, 원형, 선형, 이중-가닥, 외부염색체 DNA 분자 (플라스미드), 코스미드 (람다 파지로부터의 COS 서열들을 내포하는 플라스미드), 비-고유 핵산 서열을 포함하는 바이러스 게놈, 등이 포함된다.
본 발명의 방법들에서, 콜라겐 VII은 통합용, 일반적으로 바이러스 발현 작제물 상의 세포 모집단 내부에 도입시킴에 의해 생성된다. 콜라겐 VII 폴리펩티드를 인코드하는 DNA는 다양한 공급원으로부터 준비된, 콜라겐 VII 폴리펩티드 mRNA를 발현시키는 조직으로부터 준비된 임의의 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 콜라겐 VII 폴리펩티드-인코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 얻을 수 있다. 인코딩 유전자를 단리시키기 위한 선택적 수단들은 PCR 방법론을 사용하는 것이다.
콜라겐 VII 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 (예컨대, cDNA 또는 게놈 DNA)은 발현에 필요한 요소들에 작동적으로 연결된, 발현을 위한 작제물에 삽입된다. 이러한 많은 작제물들을 이용가능하다. 성분들에는 일반적으로 다음 중 하나 또는 그 이상이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 코딩 서열, 하나 또는 그 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
“벡터”는 세포들을 표적하기 위한 핵산 서열들을 전달할 수 있다. 예를 들면, 벡터는 표적 세포에서 발현될 수 있는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, “벡터 작제물”, “발현 벡터” 및 “유전자 전달 벡터”는 일반적으로 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 지칭하며, 이는 관심 유전자를 표적 세포들로 전달함에 유용하다. 그러므로, 이 용어는 클로닝 및 발현 운반체, 뿐만 아니라 통합 벡터들을 포함한다.
“발현 카세트”는 관심 유전자/코딩 서열을 포함하는 임의의 RNA 전사체 뿐만 아니라 비-번역된 RNA, 가령, shRNA, 마이크로RNA, siRNA, 안티-센스 RNA, 등의 발현을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 포함한다. 이러한 카세트들은 발현 카세트를 표적 세포들로 전달하기 위하여 “벡터”, “벡터 작제물”, “발현 벡터”, 또는 “유전자 전달 벡터"로 작제될 수 있다. 그러므로 이 용어는 클로닝 및 발현 운반체, 뿐만 아니라 바이러스 벡터들을 포함한다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동적으로 연결된다". 예를 들면, 하나의 서열에 대한 DNA는 이 DNA가 해당 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현될 경우 해당 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되며; 프로모터 또는 인핸서는 해당 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되며; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하기 위하여 배치되는 경우 코등 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, “작동적으로 연결된”은 연결되는 DNA 서열들이 인접하며, 분비 리더 (secretory leader)의 경우, 인접한적인 판독 상태(reading phase)임을 의미한다. 그러나, 인핸서들은 반드시 인접하여야 하는 것은 아니다. 연결은 용이한 제한 부위에서 결찰에 의해 이루어진다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 종래의 관행에 따라 사용된다.
발현 벡터들은 mRNA의 발현을 위한 숙주 세포, 또는 자가유래 백혈구에 의해 인식되는 프로모터를 내포할 것이며 콜라겐 VII 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 프로모터들은 구조 유전자의 개시 코돈에 대해 상류 (5')에 위치된 번역되지 않은 서열들로 (일반적으로 약 100 bp 내지 1000 bp 이내), 이들이 작동적으로 연결되는 특정 핵산 서열의 전사 및 번역을 조절한다. 이러한 프로모터들은 전형적으로 두 개의 분류, 유도성 및 항시성에 속한다. 유도성 프로모터들은 배양 조건에서의 일부 변화, 예컨대, 영양성분의 존재 또는 부재 또는 온도 변화하에서 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 시작하게 하는 프로모터들이다. 다양한 잠재적인 숙주 세포들에 의해 인식되는 수많은 프로모터들은 널리 공지되어 있다. 이종 프로모터는 일반적으로 보다 많은 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하므로 바람직하다.
포유동물 숙주 세포들에서 벡터들로부터의 전사는, 프로모터들이 숙주 세포 시스템과 상용가능한 한, 예를 들면, 바이러스들, 가령, 폴리오마바이러스, 폴폭스 바이러스, 아데노바이러스 (가령, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육아종 바이러스, 거대세포바이러스, 레트로바이러스, 간염-B, 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터들, 예컨대, 액틴 프로모터, PGK (포스포글리세레이트 키나아제), 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터들로부터 얻은 프로모터들에 의해 조절될 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터들은 SV40 바이러스 복제 원점을 또한 내포하는 SV40 제한효소 단편으로서 용이하게 얻어진다. 인간 거대세포바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한효소 단편으로서 용이하게 얻어진다.
고등 진핵생물에 의한 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 일반적으로 약 10 bp 내지 300 bp인, DNA의 시스-작용 요소들이며, 프로모터의 전사를 증가시키기 위하여 프로모터에 대해 작용한다. 인핸서들은 비교적 배향 및 위치 독립적이며, 인트론 안에서, 뿐만 아니라 코딩 서열 자체 안에서 전사 단위에 대해 5' 및 3' 에서 발견되었다. 포유동물 유전자로부터 얻은 많은 인핸서 서열들이 현재 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린). 그러나 전형적으로 진핵세포 바이러스로부터 얻은 인핸서를 사용하게 될 것이다. 예들에는, 복제 원점의 후기부 상의 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후기부 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 내부에 스플라이싱될 수 있으나, 바람직하게는 프로모터의 5' 부위에 배치된다.
진핵생물 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터들은 또한 전사의 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열들을 내포할 것이다. 이러한 서열들은 통상적으로 5' 및, 때때로 3'의 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비번역 영역들로부터 이용가능하다. 이들 영역은 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편들로 전사된 뉴클레오티드 단편들을 내포한다.
발현 카세트를 세포 내에 통합시키기 위한 벡터 및 시스템들은 해당 분야에 공지이며, 제한없이, 레트로바이러스 벡터들을 포함할 수 있다. 외인성 유전자를 표적 포유동물 세포들로 전달함에 유용한 많은 벡터들을 이용할 수 있다. 레트로바이러스-기반 벡터들이 특히 유용한 것으로 나타났다. 레트로바이러스들과 적절한 패키징 라인의 조합들이 사용될 수 있는데, 여기서 캡시드 단백질들이 표적 세포들을 감염시킴에 기능적일 것이다. 보통, 세포들과 바이러스는 배양 배지에서 최소한 약 24 시간 동안 배양된다. 그 후 세포들을 일부 적용에 있어서 짧은 기간 동안, 예컨대, 24-73 시간, 또는 최소한 2주 동안 배양 배지에서 성장시켰으며 분석 전 5주 또는 그 이상 동안 성장시킬 수도 있다. 통상적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터들은 “결함이 있다”, 즉, 생산 감염에 필요한 바이러스 단백질들을 생산할 수 없다. 벡터의 복제는 패키징 세포주에서의 성장을 필요로 한다.
레트로바이러스의 숙주 세포 특이성은 외피 단백질, env (p120)에 의해 결정된다. 외피 단백질은 패키징 세포주에 의해 제공된다. 최소한 세 가지 유형들, 동종숙주역, 양친화성, 및 이종친화성의 외피 단백질들이 있다. 양친화성 외피 단백질, 예컨대, 4070A (Danos 외, supra.)를 보유하는 레트로바이러스는, 인간, 개, 및 마우스를 비롯한 대부분의 포유동물 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 양친화성 패키징 세포주에는 PA12 (Miller 외 (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431B437); PA317 (Miller 외 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895B2902); GRIP (Danos 외 (1988) PNAS 85:6460B6464)가 포함된다. 이종친화 외피 단백질, 예컨대, AKR 외피 (AKR env)로 패키징된 레트로바이러스는, 쥐과 세포들을 제외한, 대부분의 포유동물 세포 유형들을 감염시킬 수 있다. 레트로바이러스의 5' 및 3' 말단의 서열들은 긴 말단 반복부들이다 (LTR). MMLV-LTR; HIV-LTR; AKR-LTR; FIV-LTR; ALV-LTR; 등을 비롯한 수많은 LTR 서열들이 해당 분야에 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 5' LTR은 강한 프로모터로서 작용하여, 표적 세포 게놈으로의 통합 후 도입된 유전자들이 전사되게 한다.
각질세포. 새로이 수집된 일차 각질세포를 수집하고 피부 펀치 생검으로부터 단리하고, 일정 기간의 배양 후 형질도입시켜, 진피 세포로부터 각질세포를 단리할 수 있다. 시험관내-증식된 상피 각질세포는 시트를 형성할 수 있다. 일부 구체 예들에서, 형질도입된 세포들을 형질도입시켰던 시간으로부터 약 1 내지 100일, 1 내지 50일, 1 내지 20일, 1 내지 10일, 1 내지 5일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 또는 1일 이내 환자에게 투여한다.
숙련된 기술자에게 공지된 바와 같이 본 발명의 방법들에서 임의의 다양한 배양 배지가 사용될 수 있다 (예컨대, Current Protocols in Cell Culture, 2000-2009 by John Wiley & Sons, Inc. 참고). 예시 배지는 또한 각질세포 배지를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 각질세포 배지는 무-혈청일 수 있고, 적절한 각질세포 보충물을 내포할 수 있다.
본 출원은 대상체에서 수포성 표피박리증 (EB)의 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 대상체의 피부 세포들 모집단을 얻는 단계; 기능적 (예컨대, 전장 야생형) 인간 콜라겐 VII (COL7A1) 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물을 통합시킴으로써 피부 세포들을 생체 외 교정하는 단계; 유전자 교정된 세포들을 배양하여 각질세포 시트를 형성하는 단계; 및 각질세포 시트의 이식편을 피부 상처층에 이식하는 단계를 포함하거나, 선택적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 추가로 이들로 구성된다. 본 출원은 또한 대상체에서 수포성 표피박리증 (EB)을 치료하기 위한 피부 세포들의 모집단의 용도에 관한 것이며, 여기서 피부 세포들의 모집단은 전장 야생형 인간 콜라겐 VII (COL7A1) 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물을 포함하는 바이러스로 형질도입함으로써 교정되어, 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN)를 가지는 형질도입된 피부 세포들의 모집단을 얻으며, 여기서 형질도입된 피부 세포들의 모집단의 PGCN은 3 이하이다. 일부 구체 예들에서, 유전자 교정된 세포들은 둘베코 변형 이글 배지 (둘베코 Modified Eagle Medium) 및 F12 배지를 포함하는, 선택적으로 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 또한 이들로 추가로 구성되는 DFF31 배지에서 배양된다. 한 구체 예에서, 피부 세포들은 발현 작제물을 포함하는, 선택적으로 이들로 본질적으로 구성되는, 또는 또한 이들로 추가로 구성되는 바이러스로 형질도입함으로써 교정되는데, 여기서 상기 바이러스는 레트로바이러스, AAV (아데노-연관 바이러스), 또는 렌티바이러스를 포함, 선택적으로 이들로 본질적으로 구성, 또는 이들로 추가로 구성된다. 또 다른 구체 예에서, 레트로바이러스는 LZRSE-바이러스이다. 한 구체 예에서, 레트로바이러스는 GalV-가성형이다. 또 다른 구체 예에서, 이렇게 형질도입된 각질세포는 박리전 기준인 바이러스 형질도입율 (VTE) >50% 및 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN) ≤3을 만족시킨다. 일부 구체 예들에서, PGCN은 2.5, 2, 1.5, 또는 1보다 작다. 또 다른 구체 예에서, PGCN은 3-20, 20-40, 40-60, 60-80, 또는 80-100 이다. 또 다른 구체 예에서, PGCN은 100보다 크다. 일부 구체 예들에서, 각질세포 시트는 크기가 다르다. 해당 분야의 통상의 기술자는 각질세포 시트의 크기를 결정할 수 있다.
일부 구체 예에서, 내인성의 돌연변이된, 기능이상의, 또는 절두된 C7 유전자는 표적화 절단 후 유전자에 삽입되는 “공여자” 서열 (예컨대, 기능적 COL7A1 cDNA 또는 C7 유전자 또는 전장 야생형 COL7A1 cDNA 또는 유전자) 및 본 출원에 기재된 CRISPR/Cas 시스템 (또는 상기CRIPSR/Cas 시스템을 인코딩하는 벡터)을 사용하여 대체된다. CRISPR/Cas 시스템들은 세균의 40% 및 고세균의 90%에서 발견되며 이들 시스템들의 복잡성은 상이하다. 예컨대, 본 출원에 그 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 8,697,359를 참고하라. CRISPR 좌위 (일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열)은 유기체의 게놈 내부의 영역이며 여기서 외부 DNA의 짧은 단편들이 짧은 회문 반복 서열들 사이에 통합된다. 이러한 좌위들이 전사되고 RNA 전사체들 (“예비-crRNA”은 짧은 CRISPR RNA들 (crRNAs)로 가공된다. 3가지 유형의 CRISPR/Cas 시스템들이 존재하는데 이들 모두 “Cas”단백질들 (CRISPR 관련하여)로 공지된 이러한 RNA 및 단백질들을 포함한다. I 및 III형 모두 예비-crRNAs를 가공하는 Cas 엔도뉴클레아제를 가지는데, 이는, 예비-crRNAs가 crRNAs로 완전히 가공되었을 때, crRNA에 상보적인 핵산을 절단할 수 있는 다중-Cas 단백질 복합체를 조립한다. CRISPR/Cas 시스템은 게놈의 내인성 유전자 (예컨대, 내인성 또는 피난항 (safe harbor) 유전자, 또는 조절 유전자 또는 이의 DNA 표적)에서의 관심 영역 내 표적 부위에 결합하는데, 여기서 CRISPR/Cas 시스템은 표적 유전자 및 기능적 도메인 (예컨대, 전사 조절 도메인 및/또는 뉴클레아제 도메인)을 인식하는, 하나 또는 그 이상의 유전자 조작된 단일 가이드 RNAs를 포함한다. 일부 구체 예에서, 본 출원에 기재된 CRISPR/Cas 시스템은 유전자 내부 또는 이에 인접한 코딩 또는 비-코딩 영역, 가령, 예를 들면, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류인 비-전사 영역 내의 관심 영역 (예컨대, EB 조직의 내인성 C7 유전자)에 결합하거나 및/또는 관심 영역을 절단할 수 있다. 특정 구체 예들에서, CRISPR/Cas는 유전자, 예컨대, 돌연변이된, 기능이상의, 또는 절두된 C7 유전자에 결합하거나 및/또는 이를 절단한다.
한 양상에서, 상처는 비-교정된 상처층 각질세포가 없다. 한 구체 예에서, 상처는 비-교정된 상처층 각질세포를 제거하기 위하여 처리된다. 또 다른 양상에서, 대상체는 열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)을 앓고 있다. 다른 양상에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 구체 예에서, 각질세포 시트는 VTE 시험, PGCN 시험, 무균 시험, 내독소 시험, 마이코플라즈마 시험, 그람 염색 무균 시험, LEAES 생존력 시험, 박리 후 시험, RCR 시험, 세포독성 T 세포 분석법, 항-C7 LH24 mAb 특성화, 전자 현미경 검사, 면역-전자 현미경 검사, 면역형광 염색법, C7 발현, 및 AF 분석법으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 또는 그 이상의 시험을 거친다. 한 양상에서, 면역형광 염색법은 직접 또는 간접 면역형광 염색법을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다.
일부 구체 예들에서, 각질세포 시트는 무세포 기질, 콜라겐 기질, 또는 생체적합성 메쉬 위에 배치된다. 한 구체 예에서, 생체적합성 메쉬는 열가소성 수지, 폴리에틸렌, 초 고분자량 폴리에틸렌, 고분자량 폴리올레핀, 비코팅 모노필라멘트 폴리프로필렌, 폴리에터 에터 케톤, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌, 나일론, 실리콘, 또는 이의 임의의 조합으로 제조된다.
일부 구체 예들에서, 피부 세포들은 각질세포를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 한 구체 예에서, 피부 세포들은 줄기세포들을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 또 다른 구체 예에서, 상기 방법은 줄기세포들을 각질세포로 분화시키는 단계를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 한 양상에서, 줄기세포들은 형질도입 전, 후 또는 중에 분화된다. 일부 구체 예들에서, 줄기세포들은 형질도입 전에 분화된다 (예컨대, 각질세포 또는 각막 상피 세포들로). 일부 구체 예들에서, 줄기세포들은 형질도입 후 분화된다. 추가 구체 예에서, 줄기세포들은 형질도입 중에 분화된다.
RDEB 환자들은 통증이 있는 각막을 약화시키는 짓무름을 자주 일으킬 수 있다. 그리하여, 본 출원은 또한 대상체의 각막 짓무름 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 각막 세포들이 모집단을 얻는 단계; 기능적 (예컨대, 전장 야생형) 인간 콜라겐 VII (COL7A1) 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물을 통합시킴으로써 각막 세포들을 생체 외 교정하는 단계; 유전자 교정된 세포들을 배양하여 각막 세포 시트를 형성하는 단계; 및 각막 세포 시트의 이식편을 각막 표면에 이식하는 단계를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 일부 양상에서, 각막 세포들은 각막 상피 세포들을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 또 다른 양상에서, 각막 세포들은 줄기세포들을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 일부 구체 예에서, 상기 방법은 줄기세포들을 각막 상피 세포로 분화시키는 단계를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다.
일부 양상에서, 각막 세포들은 유전자 작제물을 포함하는 바이러스로 형질도입함으로써 교정되며, 여기서 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 AAV를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 한 구체 예에서, 레트로바이러스는 LZRSE-바이러스이다. 일부 구체 예들에서, 레트로바이러스는 GalV-가성형이다. 일부 구체 예들에서, 이렇게 형질도입된 각막세포는 바이러스 형질도입율 (VTE) >50% 및 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN) ≤≤ 3의 박리전 기준 (pre-release criteria)을 만족시킨다. 일부 구체 예들에서, PGCN은 2.5, 2, 1.5, 또는 1 보다 작다. 또 다른 구체 예에서, PGCN은 3-20, 20-40, 40-60, 60-80, 또는 80-100 이다. 또 다른 구체 예에서, PGCN은 100 보다 크다. 일부 양상에서, 대상체는 열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)을 앓고 있다. 다른 양상에서, 대상체는 인간이다.
한 양상에서, 각막 세포 시트는 VTE 시험, PGCN 시험, 무균 시험, 내독소 시험, 마이코플라즈마 시험, 그람 염색 무균 시험, LEAES 생존력 시험, 박리 후 시험, RCR 시험, 세포독성 T 세포 분석법, 항-C7 LH24 mAb 특성화, 전자 현미경 검사, 면역-전자 현미경 검사, 면역형광 염색법, C7 발현, 및 AF 분석법으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 또는 그 이상의 시험을 거친다. 한 구체 예에서, 면역형광 염색법은 직접 또는 간접 면역형광 염색법을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 일부 구체 예들에서, 각막 세포 시트는 무세포 기질, 콜라겐 기질, 또는 생체적합성 메쉬 위에 배치된다.
한 양상에서, 생체적합성 메쉬는 생체적합성 금속, 가령, 티타늄 합금, 스테인리스 스틸, 코발트-크롬 합금, 및 니켈-티타늄 합금을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 비-재흡수성 재료들로부터 제조될 수 있다. 또 다른 양상에서, 생체적합성 메쉬층은 열가소성 수지, 폴리에틸렌, 초 고분자량 폴리에틸렌, 고분자량 폴리올레핀, 비코팅 모노필라멘트 폴리프로필렌, 폴리에테르 에테르 케톤, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌, 나일론, 임의의 폴리머 또는 하나 또는 그 이상의 이중 결합들을 내포하는 지방족 탄화수소, 임의의 그 외 다른 적절한 다공성 재료들, 또는 구부리거나 그 외 다른 방식으로 일정 형상으로 형성될 수 있는 임의의 그 외 다른 적절한 다공성 재료를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 비-재흡수성 폴리머 재료들로부터 제조될 수 있다.
또 다른 양상에서, 생체적합성 메쉬는, 폴리글리콜릭 애시드, 폴리-L-락틱 애시드 (PLLA), 폴리-D,L-락틱 애시드 (PDLA), 트라이메틸렌 카보네이트 (TMC), 폴리-￡카프로락톤, 폴리-P-다이옥산온, 락타이드와 글리콜라이드의 코폴리머 (PLGA), 폴리하이드록시-3-부티레이트, 콜라겐, 히알루로닉 애시드, 실크, 바이오셀룰로오스, 그 외 다른 단백질-기반 폴리머들, 다당류, 폴리(DTE 카보네이트), 폴리아크릴레이트, TMC와 PLLA, PLDA, 또는 PLGA의 블렌드 및 이러한 폴리머들의 그 외 다른 조합들을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 합성 또는 생물학적 재흡수성 폴리머 재료로 구성될 수 있다.
한 구체 예에서, 생체적합성 메쉬는 열가소성 수지, 폴리에틸렌, 초 고분자량 폴리에틸렌, 고분자량 폴리올레핀, 비코팅 모노필라멘트 폴리프로필렌, 폴리에터 에터 케톤, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌, 나일론, 실리콘, 또는 이의 임의의 조합으로 제조된다.
또한 본 출원은 각질세포 시트를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된 조성물을 제공하며, 여기서 각질세포 시트는 다음 단계들을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성되는 공정에 의해 제조된다: 대상체로부터 ?부 세포들의 모집단을 얻는 단계; 기능적 (예컨대, 전장 야생형) 인간 콜라겐 VII (COL7A1) 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물을 통합시킴으로써 피부 세포들을 생체 외 교정하는 단계; 유전자 교정된 세포들을 배양하여 각질세포 시트를 형성하는 단계. 일부 구체 예들에서, 피부 세포들은 각질세포를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 한 구체 예에서, 피부 세포들은 줄기세포들을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 또 다른 구체 예에서, 줄기세포들은 각질세포로 분화된다. 일부 구체 예들에서, 줄기세포들은 형질도입 전, 후 또는 중에 분화된다.
추가로 각질세포 시트를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성되는 제약학적 조성물을 제공하며, 상기 각질세포 시트는 기능적 COL7A1 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물을 생체 외 통합시킨 피부 세포들을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 한 양상에서, 피부 세포들은 대상체로부터 얻는다. 일부 구체 예들에서, 대상체는 인간이다. 일부 구체 예들에서, 피부 세포들은 기능적 COL7A1 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물이 생체 외 통합된 줄기세포들로부터 분화된다. 한 구체 예에서, 대상체는 RDEB를 앓고 있다. 일부 구체 예에서, 피부 세포들 또는 줄기세포들은 유전자 작제물을 포함하는 바이러스로 형질도입되며, 여기서 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 AAV를 포함한다.
한 구체 예에서, 기능적 COL7A1 단백질은 전장 야생형 인간 COL7A1 단백질이다. 한 양상에서, 기능적 COL7A1 단백질은 전장 야생형 인간 COL7A1 단백질의 유전자 변형을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 또 다른 양상에서, 기능적 COL7A1 단백질은 전장 야생형 인간 COL7A1 단백질의 유전자 변형을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성되며, 여기서 유전자 변형은 보존적이다. 한 추가 양상에서, 유전자 변형은 삽입, 결실, 및/또는 돌연변이를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다.
또한, 본 출원은 각막 세포 시트를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된 제약학적 조성물을 제공하며, 상기 각막 세포는 기능적 COL7A1 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물이 생체 외 통합된 각막 세포들을 포함한다. 일부 구체 예들에서, 각막 세포들은 기능적 COL7A1 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물이 생체 외 통합된 줄기세포들로부터 분화된다. 또 다른 구체 예에서, 각막 세포들은 대상체로부터 얻는다. 한 구체 예에서, 대상체는 RDEB를 앓고 있다. 일부 구체 예들에서, 대상체는 인간이다. 일부 구체 예들에서, 각막 세포들 또는 줄기세포들은 유전자 작제물을 포함하는 바이러스로 형질도입되며, 여기서 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 AAV를 포함한다. 한 구체 예에서, 레트로바이러스는 LZRSE-바이러스이다. 일부 구체 예에서, 레트로바이러스는 GalV-가성형이다. 또 다른 구체 예에서, 이렇게 형질도입된 세포는 박리전 기준인 바이러스 형질도입율 (VTE) >50% 및 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN) ≤≤ 3을 만족시킨다.
한 양상에서, 기능적 COL7A1 단백질은 전장 야생형 인간 COL7A1 단백질이다.
특정 구체 예들에서, 세포들은 1-21 일 동안 배양된다. 추가 구체 예들에서, 세포들은 7, 14, 21 일 또는 그 이상 배양된다. 그러므로, 세포들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29일, 또는 그 이상 동안 적절한 조건하에서 배양될 수 있다. 해당 분야에 공지된 기법들을 이용하여 필요에 따라 세포들을 재도말하고, 배지 및 보충물들을 추가 또는 바꿀 수 있다.
특정 구체 예들에서, 유전자 변형된 각질세포는 세포들 중 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 C7 전이유전자를 발현시키기에 충분한 시기 동안 그리고 조건하에 배양될 수 있다.
한 구체 예에서, 본 출원의 세포 조성물들은 EB 치료에 유효한 양의 고유 인간 C7 단백질을 발현시키는, 유전자 변형된 자가유래 각질세포 모집단을 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된다. 대상체에 생착시키기 위해, 표적 세포 모집단들을 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합한 시트에서 성장시킨다. 이러한 조성물들은 완충액, 가령, 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 가령, 글루코오스, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질들; 폴리펩티드 또는 아미노산, 가령, 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 가령, EDTA 또는 글루타티온; 보강제 (예컨대, 알루미늄 하이드록사이드); 및 보존제를 포함할 수 있다.
본 출원의 세포 조성물은 EB 치료에 적절한 방식으로 투여된다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 병태, 및 환자 질병의 유형 및 중증도와 같은 요인들에 의해 결정될 것이나, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
상기 세포들은 해당 분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지된 방법으로, 전형적으로 피부 이식편 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. 의사는, 부분적으로, 질병의 유형 및 위치에 기초하여 특정 대상체에 적합한 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다. 형질감염된 세포들은 상처 부위에 국소적으로 투여될 수 있다.
대상체에 투여하기 위한 유전자 조작된 세포들의 제약학적 제재들이 본 발명에서 고려된다. 해당 분야의 숙련된 기술자는 대상체에 세포를 투여하는 기법들을 잘 알고 있을 것이다. 더욱이, 해당 분야의 숙련된 기술자는 대상체에 투여하기 전 이들 세포 시트들을 준비하는데 필요한 기법들 및 제약학적 시약들을 잘 알고 있을 것이다.
본 발명의 특정 구체 예들에서, 제약학적 제재는 C7을 과-발현하도록 변형되어 있는 유전자 조작된 세포들 및 선택적으로 프롤릴-4-수산화효소를 포함하거나, 선택적으로 본질적으로 이들로 구성되거나, 또한 추가로 이들로 구성된 수성 조성물이다. 특정 구체 예들에서, 형질도입된 세포는 대상체로부터 얻은 세포들 (즉, 자가유래 세포들)을 사용하여 준비된다.
본 발명의 제약학적 조성물은 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 배지에서 유효량의 형질감염된 세포 용액을 포함한다. 본 출원에서 사용되는, “제약학적 제재” 또는 “제약학적 조성물”은 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 등을 포함한다. 제약학적 활성 물질들을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 해당 분야에 널리 공지이다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 세포와 상용불가능한 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충용 활성 성분들 또한 상기 조성물에 혼입될 수 있다. 인간 투여를 위해, 제재들은 생물학에 관해 FDA 센터가 요구하는 무균성, 발열원성, 일반적인 안전성, 및 순도 기준을 만족시켜야 한다.
해당 분야의 통상의 기술자는 임의의 그 외 다른 경로로 사용하기 위한 무균 용액을 생성하는 기법들을 잘 알고 있을 것이다. 세포 이식편의 크기 및 이식편 상의 세포들의 수는 해당 분야의 숙련된 기술자가 결정할 것이다. 특정 양상들에서, 수일, 수주, 수개월 또는 수년의 기간에 걸쳐 다회 용량들이 투여될 수 있다. 대상체는, 동일한 영역 또는 상이한 영역에 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이식편들을 제공받을 수 있다. 한 구체 예에서, 대상체는 동일한 영역 또는 상이한 영역에 재이식받을 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 대상체의 생물학적 시료 (예컨대, 각질세포 또는 각막 세포)는 적절한 조건하에 보관된다. 일단 생물학적 시료가 보관되면, 대상체가 새로운 이식편을 필요로 하는 경우 펀치 생검은 전혀 필요하지 않다. 보관된 생물학적 시료들은 대상체가 필요로 하는 이식편을 결정함에 충분한 또는 보충적인 정보를 제공할 수 있다.
“유효량” 또는 “치료량”이 기재되는 경우, 투여될 본 출원 조성물의 정확한 양은 환자 (대상체)의 연령, 체중, 및 상태의 개별적인 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로 본 출원에 기재된 세포들을 포함하는 세포 조성물은 1-100, 1-103, 1-104, 1-105, 1-106, 1-107, 또는 107 개 이상의 세포양으로 투여될 수 있는 것으로 설명될 수 있으며, 이 양에는 상기 범위에 속하는 모든 정수 값들이 포함된다. 세포 조성물들은 또한 이러한 용량들로 다회 투여될 수 있다. 세포들은 면역치료법에서 일반적으로 공지된 주입 기법들을 사용하여 투여될 수 있다 (예컨대, Rosenberg 외, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988 참고). 특정 환자에 대한 최적 용량 및 치료 섭생법은 질병의 징후들에 관해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료를 조정함으로써 의약 분야의 숙련된 기술자가 용이하게 결정할 수 있다.
본 출원의 특정 구체 예들에서, 본 출원에 기재된 방법들, 또는 해당 분야에 공지된 그 외 다른 방법들을 사용하여 유전자 조작된 각질세포는 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께 (예컨대, 이전, 동시 또는 이후) 환자에게 투여된다.
실시예
다음의 실시예들은 본 발명을 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 완전한 개시 및 설명을 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자들이 자신의 발명이라고 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니며 또한 다음의 실험들이 실시되는 모든 실험들임을 또는 단 하나의 실험임을 나타내고자 하는 것도 아니다. 사용되는 값들 (예컨대, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위하여 노력을 하였으나, 일부 실험 오차 및 편차를 고려하여야 한다. 달리 언급이 없는 한, 부분은 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 그리고 압력은 대기압 또는 대기압 근방이다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌들 및 특허 출원들은 각 개개의 문헌 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고문헌으로 포함되는 것으로 기재된 것과 같이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명을 실시하기 위한 바람직한 방식들을 포함하기 위해 본 발명의 발명자가 발명하고 제시한 특정 구체 예들과 관련하여 본 발명을 기재하였다. 해당 분야의 숙련된 기술자는, 본 출원에 기재된 내용에 비추어, 본 발명이 의도한 범위에서 벗어나지 않고 예시된 특정 구체 예들에 있어서 수많은 변형 및 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 단백질 서열에 영향을 주지 않고 코돈 중복성으로 인한 변화들이 기본 DNA 서열에서 이루어질 수 있다. 더욱이, 생물학적인 기능적 균등성을 고려함으로 인해, 종류 또는 양에 있어서 생물학적 작용에 영향을 주지 않고 단백질 구조에 변화를 줄 수 있다. 이러한 모든 변형들은 첨부된 청구범위에 포함되는 것으로 한다.
실시예 1
열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)을 위한 치료로서 자가유래 세포들의 세포 재프로그래밍.
열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)은 VII형 콜라겐 (C7)을 코딩하는 유전자인 COL7A1의 기능 돌연변이의 소실에 의해 유발되는 심각한 수포형성 피부 질병이다. C7은 표피 기저막 구역 (BMZ)을 진피에 대해 안정화시키는 고정 원섬유 (AF)의 주 성분이다. C7은 BMZ 리간드에 결합하는 아미노 말단 비-콜라겐 NC1 도메인, 삼중 나선으로 조립되는 중심 콜라겐 도메인, 및 C7 조립체를 AF로 촉매화하는 NC2 도메인을 비롯한 복수의 도메인들을 사용함을 통해 이러한 기능을 수행한다. RDEB에서 이러한 기능적 C7 도메인들의 소실은 심각한 BMZ 분리를 가져온다. 이는 광범위하고 통증이 있는 수포형성, 짓무름, 및 흉터를 생성하고, 순차적으로 공격형 그리고 종종 20 및 30년안에 나타나는 치사 형태의 SCC를 초래할 수 있다. 이 질병의 분자 수준의 진단에 있어서의 진전에도 불구하고, 현재 치료법은 완화수준의 진료에 제한되어 있다. 동종이형 섬유모세포 (Venugopal 외, J. Am. Acad . Dermatol. 2013;69(6):898-908), 골수 이식 (Wagner 외, N. Engl . J. Med . 2010;363(7):629-639), 골수-유래 중간엽 간질 세포들의 진피 내 및 정맥 내 전달 (Conget 외, Cytotherapy 2010;12(3):429-431; Petrof 외, J Investig . Dermatol. 2015;135 (9):2319-2321; Gorell 외, Pediatr. Dermatol. 2015;32 (2):220-225) 및 피부 치환 (Falabella 외, Arch Dermatol . 2000;136(10):1225-342)에 관한 임상 시험들이 가변율의 효능 및 안전성으로 수행된 바 있다. 임상전 연구들은 정맥 내 및 국소 C7, 유도 만능 줄기세포들, 및 아미노글리코시드를 비롯한 가능한 치료 양식들을 조사하였다.
유전자 치료법은 단일유전자 질병, 가령, RDEB의 치료를 위한 가능성있는 강력한 도구이다. 그러나 환자에게 유전자 전달 후 면역결핍증 및 비스코트-올드리치 증후군의 심각한 합병증과 관련하여 심각한 안정성 문제가 제기되었다. 삽입 돌연변이유발이 여전히 잠재적인 문제로 남아있지만, 피부 유전자 치료법의 이점은 이식된 조직의 표면 배치로 인해 보다 용이하게 신생물을 임상적으로 평가하는 능력이다. 더욱이, 유전자 변형된 피부 이식편들은, 장기간 교정하면서 부정적인 유해 효과 없이 연접부 EB 환자를 치료함에 성공적으로 사용되었다. 재생되는 인간 표피에서 장기 C7 발현을 위한 플랫폼은 면역결핍 마우스에 이식되어 만들어졌다 (Siprashvili 외, Hum. Gene Ther ., 2010, 21(10):1299-1310). 이 문헌은 중증 RDEB 대상체들에 이식된, LZRSE-COL7A1 유전자 조작된 자가유래 표피 시트들 (LEAES)의 생체 외 유전자 전달에 관한 I상 임상 시험의 결과를 새로이 제공한다.
임상 결과
대상체 및 치료. 선별된 38명의 대상체들 중, 8명이 본 연구에 동의하였으며 4명의 대상체들이 등록되고 이식편을 제공받았다(도 2). 대상체는 절두된 C7 (NC1 도메인)을 발현시키는 다양한 이형접합 COL7A1 돌연변이 화합물을 운반하였으며, 이는 웨스턴 블롯(도 3)에 의해 각질세포 배지에서 탐지되었으나, IIF에 의한 조직에서는 탐지되지 않았다(도 1F, 도 5B, 6B, 7B, 8B, 12). 모든 대상체들은 남성이었으며, 평균 연령이 23세(범위: 18-32세)였고, 영향을 받은 관련 전체 신체표면은 4%-30%이었다. 각각은 빈혈, 식도 협착, 및 유사 합지증의 병력을 비롯한 피부 외 소견을 가진 심각한 질병에 걸렸다(표 1).
일차 RDEB 각질세포를 상처입지 않은 피부에서 단리하여, 세포 당 평균 70% 효율 및 0.8의 프로바이러스 게놈 복제수를 가지는 LZRSE-COL7A1 레트로바이러스 벡터로 형질도입하였다(도 1B-D). 5개의 흉터진 및/또는 진무른 상처들 및 하나의 유도된 상처가 각 환자에 이식되었다. 이식된 만성 상처 대다수는 >5년 동안 존재하였었다(표 3). 모두 24개의 이식편들을 순차적으로 상처 치유, 감염, 통증 및 가려움 백분율에 대해 모니터하였다.
효능. 모든 대상체들은 이식편 부위들에서 개선된 상처 치유 및 피부 강도, 뿐만 아니라 감소된 통증 및 가려움을 보고하였다. 이식편들은 기준선과 비교하여 감소된 수포형성을 보여주었는데; 각 대상체의 대표적인 사진들이 도시되어 있다 (도 1E, 도 5A, 6A, 7A, 8A, 12). 대조적으로, 치료되지 않은 상처들은 지속적인 수포 형성을 나타내었다(도 10).
이식 후 1개월에, 20/24개의 상처들 (83%)은 ₃75% 치유를 보였으나 단 4개의 상처들은 50%-74% 치유를 보였다(표 3). 3개월에, 21/24개(87%) 상처들은 ₃75% 치유되었으나, 3/24개(13%)는 50%-74% 치유되었다(표 3). 6개월에, 16/24개(67%)는 ₃75% 치유되었으며, 5/24개(21%)는 50%-75% 치유되었고, 그리고 3/24개 (13%) 이식된 부위들은 수포를 나타냈으며 이식편 이식 실패로 간주되었다(0%-49% 치유됨).
LEAES 이식편들의 분자 분석은 3개월시 9/10개(90%) 시료에서 6개월시 8/12개(66%) 시료에서 강력한 C7 발현을 나타내었다. LEAES의 IIF 분석법은 교정되지 않은 피부 대조군에 비해 표피-진피 연접부에서 적절한 C7 국소화(도 1F, 도 5B, 6B, 7B, 8B, 12)를 보여주었다. LEAES 이식편들은 표피 표지자들인 케라틴 14, 케라틴 1, 및 로리크린 유사 정상 피부에 대해 양성이었던 가시 및 과립층들과 함께 완전히 분화된 표피를 보여주었다(도 1F, 도 5B, 6B, 7B, 8B, 12). 음성 시료들 중에서, C7은 6개월시 대상체 2로부터 얻은 분석 생검들에서 탐지할 수 없었으나; 병렬 생검에서 고정 원섬유(AF)가 존재하였다. 6개월 시, C7은 NC1 도메인에 특이적인 항체들을 사용한 대상체 4에서 확인되었다(도 1F).
교정된 시료들에서 BMZ의 분자 구조를 평가하기 위하여, LEAES 이식편들로부터 얻은 생검들을 또한 투과 전자 현미경검사 (법)으로 분석하였다. 3개월 시, 5/7개 시료들(71%)은 NC2 반응성 AF의 형태학적으로 정상인 모양 및 빈도를 나타내었다(도 1G). 6개월 시 AF들이 4/12개(33%) 생검에서 탐지되었으며, 대상체 4에서 얻은 생검들에서는 AF가 전혀 탐지되지 않았다(도 1G).
안전성. 심각한 유해 사례들은 보고되지 않았다. 이식편 부위 가려움(n=3)에 이어 이식편 부위 배농 증가(n=2)가 가장 통상적인 유해 사례들이었으며(등급 1 또는 2) 악성 임상 징후는 전혀 발견되지 않았다. RCR 및 세포독성 T 세포 분석법들은 모든 시점들에서 음성이었다(표 2).
상처 배농 증가가 2/24 상처들에서 보였으나, 해당 부위들에서 홍반, 부종, 통증, 또는 압통이 없음을 비롯하여 감염 징후는 없었다. 6개월 시, 대상체 3에서 부위 Z는 상처 집락을 가졌으며(등급 2) 이식 실패로 간주되었다(표 3). 가려움이 3/24개 이식편 부위들 및 2개 이식편 주위 영역들에서 나타났다(등급 1).
연구 전반에 걸쳐 C7 면역 반응들을 면밀히 모니터하였다. 이식된 영역들 밖에서 전신 자가면역 증상들 또는 증가된 수포형성을 보인 대상체들은 없었다. 대상체 1에서, 순환하는 또는 조직 결합된 항체들은 IIF 또는 DIF에 의해 전혀 관찰되지 않았다(표 2). 3개월 시 대상체 2는 2개 상처들 (A 및 E)의 DIF 분석시 보체가 없는 1+ (가벼운) 선형 IgG, IgM, IgA를 보여주었다. 이들 면역반응체들은 이식 후 6개월시에는 관찰되지 않았다. 대상체 3은 IIF 분석시 3개월시에 선형 혈청 IgA의 일시적 상승 (1:320)을 보여주었으며 DIF 분석시 6개월시에 오직 1+까지의 미량의 IgM 및 IgA의 선형 조직 염색을 보여주었다. 대조적으로, 대상체 4는 IIF 분석시 1개월 및 3개월시에 순환하는 선형 IgG 항체들의 1:160 적정량(titer)을 나타내었으며, 이와 함께 DIF로 분석시 3개월시에 3개 이식편들에서 1 내지 2+ IgG, IgA, C3, 및 IgM 염색이 탐지되었다(표 2). 그러나 이식편들 밖에서 전신 자가면역 증상들 또는 수포형성 증가는 전혀 나타나지 않았으며 C7-특이적 세포독성 T 세포 분석 결과들은 음성이었다. 6개월 시에, 혈청 항체 IgG 및 C3 수준이 감소되었으며 (1:40) 이식편들에서 탐지된 조직 결합된 면역 복합체들은 없었다 (표 2). 대상체 4에서 표피하의 선형 면역 침착물을 발견한 후, 우리는 대상체 4의 기준선 혈장 항-C7 항체 수준을 정제된 C7 단백질의 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 재평가하였다. 음성 기준선 IIF 데이터와 대조적으로, 웨스턴 블롯 분석법은 기준선 (1:300) 및 이식 후 3개월시 혈청 (1:1000) 모두가 정제된 C7에 대해 반응성이었음을 보여주었으며, 이는 대상체 4가 이식편 배치 이전에 외인성 C7에 감작하였음을 나타낸다(도 11A). 사전에 특징지어진 카르복실-말단 C7 펩신 단편 내에서 대상체 4의 혈청 항체 반응성을, 이식편 배치 전 및 후 모두에서 확인하였다(도 11B).
논의. RDEB의 유전자 교정은 >9kb COL7A1 cDNA를 아우르는 대형 전이유전자의 효율적인 전달을 필요로 하므로 상당한 과제를 가지고 있다. 이에, 본 출원은 4명의 RDEB 대상체들에서 고무적인 효능 및 허용가능한 안전성을 가지는 유전자 교정된 자가유래 표피 각질세포 이식에 관한 인간에서의 연구를 제공한다. 유전자 교정된 표피 세포들은, 하나의 대상체에 대해 최대 1년까지 탐지가능한 C7을 이식 후 6개월 시에 시험된 이식편 부위들 중 67% 이상에서 기능적, 자가-재생 표피를 재생하였다(도 12). 18주 시에 만성 상처들 중, 단 2/9개(22%)만이 치유되었던 동종이형 각질세포 이식편들 이상으로 주목할 만한 개선이었다. LEAES 이식편들은 또한 동종이형 섬유모세포 주사와 비교시 보다 우수한 상처 치유 결과를 생성하였는데, 이는 BM-MSC의 진피내 또는 정맥내 주사 또는 위약과 비교시 상처 치유에 있어서는 일부 초기 개선을 보였으나 장기간 차이는 없었다. 유사한 방법론을 사용한, 연접부 수포성 표피박리증에 관한 유전자 치료법의 사례 보고서는, 최대 6년 동안의 교정을 나타내었으며, 이는 장기간의 치료 효과에 우선하는 것이다. 우리가 우리의 LEAES 이식편들에서 본 6개월간 지속된 C7 발현은 6회의 표피 전환 주기 (epidermal turnover cycles) 기간에 걸쳐 이어졌으며, 이는 우리가 우리의 유전자 전달 기법으로 줄기세포들을 성공적으로 표적하였음을 의미하는 것이다.
우리의 연구에서, 개선된 상처 치유 및 증가된 피부 내구성은 BMZ에서의 탐지가능한 전장 C7 생성 및 AF 형성과 직접적으로 연관되어 있었다. 이식 전에는 없었으나, 각 연구 시점에서, 비록 다음과 같은 가변 효율로 탐지되었지만 두 가지 모두 존재하였다: 66-90%의 C7 발현 및 33-71%의 AF 형성. 생검 시료채취 변이성은 교정된 표피 세포들의 비균질 모집단 또는 부분적 이식편 흡수의 원인이 될 수 있다. 일부 구체 예들에서, 이식 영역은 대상체가 대상체의 삶의 질에 유익할 것이라고 느끼는 영역이 될 수 있다. 그러나 이식편 배치 후 중요한 첫 수일 동안, 이 영역들 중 일부는 움직이지 못하게 하거나 물리적 마찰에 대해 보호하기 어렵다(예컨대, 대상체 2의 하부 등 부위 E, 왼쪽 어깨 부위 B, 표 3, 뒤어깨 부위 D, 도 6A). 더욱이, 관찰된 바와 같이 이식 후 고정화 시간이 짧을수록 이식편 흡수에 부정적인 영향을 줄 수 있는데, 이는 대상체 2가 그 외 다른 연구 참여자들과 비교하여 이식 후 가장 짧은 이식 후 고정시간을 가졌을 때 대상체 2에 대해 6개월시에 시료화된 생검들에서 IF 분석시 탐지가능한 C7의 부재 및 전반적으로 감소된 상처 치유가 나타났기 때문이다(표 1). 더욱이, 유도된 상처들은 우수한 치유 능력을 보여주었음에도, 가장 적은 C7 발현을 보여주었다. 파손적인 방법, 가령, 전기소작법을 사용하지 않고, 나머지 비-교정된 상처층 각질세포는 상부에 놓인 LEAES 이식편들을 생성하지 않도록 할 수 있었음이 가능하다. 이러한 관찰내용은 보다 효율적으로 상처층 각질세포를 제거하는 개선된 상처층 생성 기법들은 이식편 흡수를 개선시킬 수 있음을 암시한다.
안전성과 관련하여, 유해 사례들은 거의 보고되지 않았으며 나타났던 유해 사례들은 모두 가벼운 것이었다. 임의의 시점의 이식편들에서 혈중 RCR, 또는 편평 세포 암종의 증거를 나타낸 대상체들은 없었으나, 잠재적인 유해 사례에 대한 장기간 모니터링은 계속 진행중이다. 유전자 전달을 비롯한 모든 분자 치환 접근법들은, 특히, 영 돌연변이들을 가진 대상체들에서 치료 생성물에 대한 원치않는 면역 반응들의 위험을 제기한다. 본 연구에서 모든 대상체들은 NC1 도메인을 내포하는 절두된 C7 분자를 발현시켰으며, 이러한 분자는 단백질의 항원 부분이 되는 것으로 생각되므로, 잠재적인 면역 반응의 위험을 최소화시켰다. 연구하는 동안 모든 대상체들의 임의의 시점에서 C7 연관 세포독성 T 세포 활성의 증거는 전혀 보이지 않았다. 그러나 대상체 4에서의 IIF 및 DIF 연구들은 이식 후 1 및 3개월시에 BMZ 반응성 IgG, 3개월시에 보체 C3 고정화, 6개월 시에 보다 낮은 혈청 IgG 적정량을 나타내었다(표 2). 비록 NC1 도메인이 가장 항원성을 띠는 C7의 부분으로 보고된 바 있으나, 카르복시 말단 NC2 도메인 또한 RDEB 환자들에서 항-C7 자가항체들의 존재 및 소수의 항원 에피토프들을 내포한다. 대상체 4가 이식 전 탐지가능한 항-C7 항체들을 가졌었다는 웨스턴 블롯 분석법을 사용한 발견은 CLIA-인증된 IIF 분석법으로 선별하는 과정 동안에는 확인되지 않았는데, 이는 장래의 치료 연구들에서 보다 감응성인 표준화된 방법들이 기준선 면역 교차-반응성을 평가하기 위하여 개발되어야 함을 암시한다.
결론적으로, 유전자 교정된 자가유래 표피 피부 이식편들은, 그 외 다른 특정 치료 선택안이 없는 환자 모집단인, 중증 RDEB 환자에서 C7 침착 증가 및 수포형성 감소를 보여주었다. 본 접근법의 장기간 효능 및 안전성을 평가하기 위해 더 젊은 RDEB 대상체들이 관여하는 더 큰 연구들이 계획된다.
표 1. 이식된 RDEB 유전자 치료법 대상체들의 기본 특성
Figure pct00001
1 BSA는 추정된 상처입은 체표면적을 나타내고, SCC는 편평 세포 암종을 나타내며, IF는 피부 생검의 면역형광법을 나타내고, EM은 피부 생검의 전자 현미경 검사를 나타내며, AF는 고정 원섬유를 나타내고, LD는 기저판을 나타내고, 그리고 C7은 VII형 콜라겐을 나타냄
2 NC1은 LH7.2로 그리고 NC2는 LH24로 평가하였음
3 피부 생검 시료는 FNC1 항체를 사용하여 평가하였음
4 원숭이 식도에 대한 혈청 간접 면역형광법으로 결정되었음
5 기준선에서의 웨스턴 블롯에서 나타난 순환하는 자가-항체들; 이식 후 면역 반응 증거가 나타난 후 조사됨
표 2. 유전자 치료법 이식 및 전신 안전성에 대한 지표
Figure pct00002
1 원숭이 식도에서 혈청 시료로부터 간접 면역형광법에 의함, 자가항체들이 기저막 구역에 국소분포됨.
2 혈액 중 존재하는 RCR 복제 가능 레트로바이러스
3 이식 부위들에서 편평 세포 암종 또는 그 외 다른 신생물의 임상 증거
4 피부 생검에 대해 실시된 직접 면역형광법에 의함, 자가항체들이 기저막 구역에 국소분포됨
5 ND는 실시되지 않음을 나타냄
표 3. 이식 부위 기본 특성들, 임상 반응 및 피부 생검 추적조사 결과1
Figure pct00003
Figure pct00004
1 조사자에 의한 임상 및 사진 평가에 기초하여, 회색은 ≥75% 치유를 나타내고, Lt 수평선은 50-74% 치유를 나타내고, 검은색은 <49% 치유를 나타냄
2 ± 3 주
방법
연구 설계. 이는 I상, 개방 임상 시험이다 (NCT01263379). 주된 연구의 목적은 전장 COL7A1 코딩 서열을 내포하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 유전자 조작된 자가유래 각질세포를 이식받은 RDEB 대상체들에서 안전성 및 효능 데이터를 얻는 것이었다 (도 1A). 2013년 10월과 2015년 2월 사이에, 4명의 성인 RDEB 대상체들에게 LEAES를 이식하였다. 모든 대상체들에 대해 최소한 6개월의 추적조사 데이터를 수집한다. 본 연구는 식품의약국 (IND # 13708) 및 스탠포드 IRB (프로토콜 #14563)의 승인을 받았다.
대상체. 대상체들은 18세 또는 그 이상이었으며 임상적으로 RDEB 진단을 받았으며, LEAES 이식에 적합한 100 cm2 내지 200 cm2 의 개방 짓무름 면적을 가졌다. 대상체들은 또한 전신 마취 가능하였으며 유전자 시험을 통해 RDEB를 확인하였던 선별 프로토콜에 기초하여 선택되었다(GeneDx, Gaithersburg, MD). C7의 NC1 도메인의 존재를 배양된 각질세포 (KC) 상청액의 웨스턴 블롯에 의해 그리고 피부 생검 시료들의 간접 면역형광 현미경검사(IIF)에 의해 평가하였다. 생검 시료들에서 전장 C7 및 성숙 AFs의 부재를, C7의 카르복실-말단 NC2 도메인에 특이적인 LH24 항체를 사용하는 IIF 및 면역-전자 현미경검사 (IEM)으로 확인하였다(도 9). 순환하는 그리고 조직-결합된 IgG, IgA, IgM, 및 C3는 각각 영장류의 식도에서 혈청을 사용한 IIF 그리고 대상체 생검 단면들의 직접 면역형광법(DIF)을 통해 분석되었다. HIV, 간염, 전신 감염, 또는 심장 이상을 비롯한 중요한 비-RDEB 의학 합병증들을 보유한 대상체들은 제외되었다. 임상적으로 중요한 빈혈은 이식 전 치료되었다.
연구 처치. 상처나지 않은, 흉터없는 피부 영역들로부터 LEAES를 제조하기 위해 2개의 8 mm 펀치 생검들을 얻었다. CBC, 완전 대사 패널 (CMP), 뿐만 아니라 복제 가능 레트로바이러스 (RCR) 및 C7-감응성 세포독성 T 세포 분석을 위해 기준선 혈액 시료들을 얻었다. 자가유래 각질세포에서 유래한 피부 생검에 LZRSE-COL7A1을 형질도입시키고 8개의 LEAES 이식편들을 제조하기 위해 사용하였다(도 4). 6개의 이식편들을 SCC의 임상 증거가 없는, 감염되지 않은 짓무른 및/또는 흉터입은 상처 부위에 처리하였다. 6개의 이식된 상처 부위들 (A, B, C, D, E, Z, 표 3) 중, 수술시 각 대상체에서 물리적 마찰에 의해 1개의 상처가 생겼다(“부위 Z” 전신 마취 상태에서, 표피 줄기세포들의 보유 가능성을 최소화하기 위해 상처층들을 소작했다. 상처층 준비 후 용해가능한 봉합사를 이용하여 LEAES 이식편들을 상처층들에 고정시켰다. 대상체 3 및 4는 추적조사 이식편 확인에 도움을 주기 위해 각 이식편의 모서리에 작은 인도 잉크 문신을 하는 것에 동의하였다. 이식편들을 표준 상처 드레싱 및 국소 무피로신으로 커버하였으며, 이식 후 5-7 일에 이들을 제거하였다.
지표 및 평가. 이식 후 1, 3, 6 및 12개월시에 대상체들이 방문하였다. 각 연구 방문시, C7-감응성 세포독성 T 세포 분석, CBC, 및 CMP를 위하여 순환하는 자가항체들에 대해 IIF로 혈청 시료들을 평가하였다. 혈청 내 RCR의 존재를 3 및 6개월시에 평가하였다. 각 방문시, 조직 결합된 면역글로불린 및 보체를 DIF로, C7 발현을 IIF로, 그리고 고정 원섬유의 존재를 IEM으로 평가하기 위해 대표적인 이식편들을 생검하였다. 상처들을 임상적으로 평가하였으며 다음과 같은 등급으로 나누었다: 디지털 사진촬영 및/또는 Canfield Vectra 카메라를 사용하여 기준선과 비교시, 100%-75% 치유 (상당한 상처 치유로 정의됨), 74%-50% 치유, 49%-25% 치유, 25% 미만 치유.
재료 및 시약
LEAES 제작에 사용된 모든 재료들 및 시약들은 제조업체가 제공한 분석 증명서에 근거하여 우발적인 바이러스들이 없었다. 소에서 유래한 시약들을 포함하는 각각의 로트 조직 배양 배지는 시중 9CFR 혈구흡착 시험을 통해 우발적인 바이러스에 대해 시험되었으며 (American BioResearch, Pullman, WA) 음성으로 나타났다.
RDEB 각질세포 단리 및 증식. 피부 시료들을 2개의 8mm 펀치 생검으로서 얻었으며, 30 μμg/mL 아미카신 (HIkma Pharmaceuticals, 런던, 영국), 20 μg/mL 반코마이신 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 및 0.5 μg/mL 암포테리신 B (USBiological, Salem, MA)를 보유한 35 mL 생검 수집 배지 50/50A (인간 각질세포 성장 보충제를 보유한 50% 각질세포 배지 154 (Life Technologies, Carlsbad, CA) 및 보충제를 보유한 50% 정의된 각질세포 무혈청 배지 (Life Technologies, Carlsbad, CA))에 옮겼다. 표피를 진피로부터 분리하기 위하여, 피부 시료를 25 카제인용해 효소단위/디스파제의 mL를 내포하는 5℃의 디스파제 용액 (Life Technologies, Carlsbad, CA)에 16-20 시간 동안 두었다. 다음날, 표피를 진피에서 조심스럽게 벗겨내고 37℃의 TrypLE Select 10X(Life Technologies, Carlsbad, CA) 용액에 20-30분 동안 두었다. 이 용액을 1200 rpm에서 원심분리하여 각질세포 펠릿을 얻었다. 세포들을 인산염 완충 식염수 (PBS, Life Technologies, Carlsbad, CA)로 한번 세척하고 각질세포를 50/50A 배지에서 PureCoat Collagen I Mimetic Cultureware (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA) 상에 도말하였다. 각질세포가 60-70% 밀집도 (confluence)에 도달한 후, 세포들을 TrypLE Select 10X로 처리하고 바이러스 형질도입을 위해 도말하였다. 형질도입 과정을 시작함에 최소한 4x106 개의 세포들이 필요하였다.
각질세포 교정. MLV LTR의 통제하에 있는 전장 COL7A1 cDNA를 내포하는 cGMP 등급 GalV-가성형 LZRSE-COL7A1 바이러스는 2010년 Siprashvili 외의 문헌에 기재된 바와 같이 현재의 Good Manufacturing Practices를 사용하여 인디애나 대학 벡터 제조 설비에 의해 제조되었다. pLZRSE-COL7A1 플라스미드의 지도가 도 13에 도시되어 있으며, 이의 전체 서열은 서열 번호: 1로 나타나있다. 각 플레이트에 대해 12 mL 바이러스 상청액을 오버레이하고 세포들을 1250 rpm에서 그리고 32℃에서 1 시간 동안 원심분리하여 바이러스 형질도입을 실시하였다. 원심분리 후, 바이러스 상청액을 PBS로 세척하여 제거하고 교정된 각질세포 증식을 위해 50/50V 배지를 사용하였다. 교정된 KC가 바이러스 형질도입율 (VTE) >50% 및 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN) ≤≤ 3의 박리전 기준을 계속 만족시키는 한, 필요에 따라 형질도입을 반복하였다.
박리 전 시험 . VTE 시험. 항-VII형 콜라겐 단클론 항체 NP32, NP185 또는 항-VII형 콜라겐 다클론 항체 FNC1으로 IF 기법을 사용하여 VTE 시험을 실시하였다. 세포들을 메탄올/아세톤 혼합물 용액에서 고정시키고, 세제에서 투과화시키고 항-C7 일차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 대규모 세척 후, Alexa Fluor 555 염료에 접합시킨 이차 항체를 추가하고 1시간 추가 배양하였다. 세포핵을 Hoechst 33342로 10분간 표지하고, 세척하고, Prolong 금 안티페이드 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 추가하였다. VTE는 청색 핵 대 C7 양성 세포들의 비율을 계수하여 결정되었다. 박리 전 기준을 만족시키기 위하여, 최소한 50%의 세포들이 C7 발현에 대해 양성이었다.
PGCN 시험. 레트로바이러스 형질도입 후 교정된 RDEB KC로부터 단리된 게놈 DNA의 qPCR 분석을 통해 PGCN 시험을 실시하였다. 3x106 교정된 세포들로부터 Qiagen DNeasy Blood & Tissue 키트 (Qiagen, 독일)를 사용하여 게놈 DNA를 정제하였다. 표준 분광기법을 사용하여 DNA를 정량하고 qPCR 분석을 위해 사용하였다. 주형의 임계 주기 (Ct) 및 플라스미드 DNA 대조군의 양으로부터 Ct 의존성인 표준 곡선을 사용하여 프로바이러스 용량을 결정하였다. 평균 PGCN을 다음과 같이 계산하였다: PGCN = (TPCN x 6.16pg) / (C주형. x 103pg), 여기서, TPCN = 총 프로바이러스 복제수. 6.16pg = 체세포에서 게놈 DNA의 양 C주형. =PCR에서 사용된 주형의 양 (나노그램). 박리 전 기준을 만족시키기 위하여, 모든 각질세포 게놈에 대한 평균에 대해 3 이하의 프로바이러스 게놈 복제수들이 제공되었다.
무균 시험. 배양 배지에 존재하는 항생제들로부터 잠재적인 거짓 음성을 제거하기 위해 설계된 Millipore Steritest 시스템을 사용하여 막 여과함으로써 배양 상청액 시료를 무균성에 대해 시험하였다 (Pacific BioLabs, Hercules, CA). 여과 및 세척 후, 시료를 소화 배지 및 액상 싸이오글리콜레이트 배지 (Digest Medium and Fluid Thioglycollate Medium)에서 대두 케이스 (Soybean Case)에 넣고 14 일 동안 배양하였다. 미생물 오염 증거에 관해 시료들을 매일 관찰하였다.
내독소 시험. 제조업체의 권장사항에 따라 배양된 상청액의 시료를 리물루스 아메바세포 용해물 (Limulus Amebocyte Lysate, LAL) QCL-1000 분석법 (Lonza, Basel, 스위스)을 통해 평가하였다. 생성물의 박리 요건을 만족시키기 위한 이 시험의 결과는 < 1.0 EU/mL이었다.
마이코플라즈마 시험. 제조업체의 요구에 따라 세포 배양 상청액을 MycoAlert 마이코플라즈마 탐지 키트 (Lonza, Basel, 스위스)를 사용하여 마이코플라즈마에 대해 시험하였다. 생성물의 박리 요건을 만족시키기 위한 이 시험의 결과는 < 0.9였다.
EAES 개시 및 가공. 교정된 각질세포가 100% 밀집도에 도달하였을 때, LEAES 개시 가공을 시작하였고 성장 배지를 50/50V에서 표피 시트 생성 배지 DFF31로 교체하였으며, 이 배지는 둘베코 변형 이글 배지 (Life Technologies, Carlsbad, CA) 및, 10% 소 태아 혈청 (Lonza, Basel, 스위스), 36 ng/mL 하이드로코르티손 (Spectrum, New Brunswick, NJ), 25 μμg/mL 아데닌 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 5 μμg/mL 재조합 인간 인슐린 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 2 ng/mL 리오티로닌 (Spectrum, New Brunswick, NJ), 5 μμg/mL 소 트랜스페린 (Millipore, Billerica, MA), 10 ng/mL 재조합 표피 성장 인자 (R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 30 μμg/mL 아미카신 (Hikma Pharmaceuticals, 런던, 영국) 그리고 20 μμg/mL 반코마이신 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)을 내포하는 F12 배지 (Lonza, Basel, 스위스)로 구성된다.
LEAES 조립 및 운반. LEAES 조립은 이식일에 개시되었다. 표피 시트들을 디스파제 (Life Technologies, Carlsbad, CA)로 37℃에서 20-30분 동안 효소 분해함으로써 플레이트 표면으로부터 유리시켰다. 잔여량의 배지 및 디스파제를 제거하기 위하여, 표피 시트들을 50/50VC로 최소한 5회 세척하였다. 표피 시트를 딱 맞는 크기의 석유 거즈에 수술용 헤모클립을 사용하여 고정시켰으며 바닥면을 무균 검은색 봉합사로 표시하였다. 조립된 LEAES를 50/50VC 운반 배지에 침지시키고 기체 투과성 무균 필름으로 밀봉하였다. 그 후 LEAES 표피 이식편들을 이식을 위해 수술실로 운반하였다.
박리 시험. 그람 염색 무균 시험. LEAES 박리일에, 신속한 그람 염색 시험을 위해 배양 배지의 시료를 스탠포드 병원 임상 실험실로 보냈다. 이 시험에 대한 음성 결과가 LEAES 로트 박리 기준으로서 사용되었다.
LEAES 생존력 시험. 생존력 시험을 실시하였으며, 이 시험에서 LEAES 시료는 Hoechst 33342 및 SYTOX 그린 염료를 내포하는 핵 염료 혼합물과 함께 20분 동안 배양되었다. 생성물을 박리하기 위한 SYTOX 그린 염료 대 Hoechst 33342 염료의 비율은 ≥70%에서 계산되었다.
박리 후 시험. 발송(send-out) 시험을 위해 배양 배지의 시료 및 LEAES 이식편을 제출하였으며, 시험 결과는 장기간의 시험 과정으로 인해 이식편 이식 후 얻어질 것으로 예상되었다. 이러한 “박리 후” 시험 결과들이 규격에서 벗어났을 경우 안전성 계획을 준비하였다. 박리 후 기준은 추가 무균 시험 (박리 전 시험에서 무균 시험을 참고), RCR 시험 (인디애나 대학 벡터 제조 설비) 및 마이코플라즈마 시험 (Bionique Testing Laboratories, Saranac Lake, NY)을 포함하였다.
RCR 시험. 권고사항에 따라 LEAES 및 LEAES 배양된 상청액의 시료는 인디애나 대학 벡터 제조 설비에서 확장된 PG-4 S+L- 세포 플라크 분석을 거쳤으며 "RCR 증거 없음"의 시험 결과를 박리 기준으로서 사용하였다. 기준선, 3개월, 및 6개월 시에서, 혈액 시료들을 인디애나 대학 벡터 제조 설비로 분석하여 정량적 중합효소 연쇄 반응(Q-PCR)을 사용하여 제공된 GALV 외피(GALV-E) 서열들의 수준을 결정하였다. 혈액 시료의 양의 적절성은 인간 아포지질단백질 B 유전자 서열들에 대한 제 2 프로브 및 프라이머 세트에 의해 평가되었다. 게놈 DNA 0.12 μμg 당 105, 104, 103, 102, 및 10 복제수의 GALV-E 서열을 내포하는 게놈 12/22/15 8 DNA를 사용하는 표준 곡선이 양성 대조군으로 사용되었다. 음성 대조군들은 형질도입되지 않은 인간 게놈 DNA 및 물을 포함하였다.
세포독성 T 세포 분석. 세포독성 T 세포 분석을 위해 15mL의 전혈을 기준선, 1 개월, 3개월 및 6개월시에 수집하였다. 말초 혈액 단핵 세포들을 백혈구 연층 또는 전혈로부터 Ficoll-Paque (GE Healthcare) 밀도-기울기 원심분리를 사용하여 단리하였다. 이후 페트리 접시에서 2시간 배양 후 부착된 단핵구들을 회수하였다. CD4+ 및 CD8+ T 림프구들은 MACS 자기 세포 분류 키트 (Miltenyi Biotech)를 사용하여, 비부착 세포들을 상자성 마이크로비드에 접합된 항-CD4 및 항-CD8 항체들과 함께 배양함으로써 함께 정제되었다. 96-웰 PVDF-필터 플레이트 (Millipore)를 IFN-γ (BD Pharmingen) 또는 IL-4 (BD Pharmingen)에 대한 단클론 항체로 코팅하고, 5% 인간 AB 혈청을 보유한 RPMI 배지를 사용하여 차폐시키고, 무혈청 RPMI로 세척하였다. CD4+ 및 CD8+ T 림프구 (2x105 개 세포/웰), 및 방사선 조사된 단핵구들 (2.5x104 개 세포/웰)을 공기 중 5% CO2 의 가습된 배양장치내, 20 UI/ml IL-2가 존재하는 플레이트에서 37℃에서 40시간 동안 공배양하였다. 림프구를 자극하기 위해 배지는 10 μg/ml의 재조합 VII형 콜라겐 또는 3 μg/ml의 콘카나발린 A (Sigma)을 내포하였다. 이 플레이트들을 세척하였으며 각각의 세포들에 의해 분비된 IFN-γ 또는 IL-4는 각 웰을 1 μg/ml의 비오티닐화 항-IFN-γ 또는 항-IL-4 단클론 항체 (BD Pharmingen), 이후 스트렙타비딘-접합된 알칼리성 포스파타아제 (Roche)의 1:1000 희석액과 연속하여 반응시킴으로써 그 자리에서 (in situ) 탐지되었다. 탐지는 BCIP/NBT 발색 기질 (Promega)을 사용하여 실시되었다. 물로 세척하여 반응을 중단시키고 CTL ELISPOT 판독기를 사용하여 점들을 계수하였다. 항원없이 T 세포들을 사용하여 음성 대조군 시험을 병행하였으며, 해당 점수를 알려지지 않은 점수로부터 감산하였다.
항-C7 LH24 mAb 특성화. 표피 기저막 2와 반응시키기 위하여 LH24 mAb를 사전에 확인하였다. 본 연구에서 C7 없는 RDEB 환자 피부에서 LH24 mAb의 특징적 부재는 LH24 mAb가 C7상의 에피토프를 인식하였음을 나타낸다. C7 분자에 대한 LH24 반응성을 더욱 국한시키기 위하여, NC1 및 NC2 도메인을 내포하는 C7의 효소 분해에 대한 LH24 반응성을 웨스턴 블롯으로 시험하였다. NC1 도메인 내포 C7 단편은 앞서 설명한 바와 같이 고도로 정제된 세균 콜라겐분해효소 (Worthington)로 정제된 C7을 분해하여 생성되었다. 앞서 설명한 바와 같이 정제된 C7을 펩신 분해한 후 3개의 NC2 12/22/15 9 내포 C7 단편이 생성되었다.
전자 현미경 검사. 전자 현미경 검사를 위해, 3 mm 피부 펀치 생검을 0.05% 탄닌산을 내포하는 둘베코 무혈청 배지 (SFM)에서 1.5% 글루타르알데하이드/1.5% 파라포름알데하이드에 최소 1시간 동안 침지시킨 다음, SFM에서 대규모 헹굼 후, 1% OsO4에서 60분 동안 사후-고정 (post-fixation)시킴으로써 준비하였다. 시료들을 SFM으로 세척 후, 등급이 나뉜 일련의 에탄올 내지 100% 에탄올에서 탈수시키고, 프로필렌 옥사이드에서 헹구고 Spurr의 에폭시에 총 2시간에 걸쳐 침윤시켰으며, 반응을 마이크로파 에너지로 가속화시켰다. 시료들을 70 ℃에서 18시간에 걸쳐 중합하였다.
면역-전자 현미경검사. 면역-전자 현미경 검사를 위해 3 mm 피부 펀치 생검 시료를, SFM에서 대규모 헹굼 후, SFM에서 1:5로 희석시킨, 콜라겐 VII의 NC2 영역에 특이적인 마우스 IgM LH24 항체에 4 ℃에서 하룻밤 동안 침지시키고, SFM에서 대규모 헹굼 후, SFM에서 1:3으로 희석시킨, 염소 항-마우스 IgM 초소형 콜로이드 금 접합체 (Aurion)에서 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양시켜 준비하였다. SFM에서 대규모 헹굼 후 시료들을 얼음에서 15분 금 강화 용액 (Nanoprobes)에 노박리킨 다음, 신속하게 25 ℃로 데우고 5분 더 배양하였다. 그 후 시료들을 얼음같이 차가운 SFM으로 헹군 다음, 상기와 같이 고정시키고 포매시켰다. 간접 면역-형광법 (IIF): 인간 혈청을 원숭이 식도 위에 놓고 인간 IgA, IgM, IgG, 및 C3에 대하여 지시되는 항체들로 염색하였다. 신호는 바탕 이상으로 고려되는 1:40 및 그 이상의 항체 희석액에서 탐지되었다.
직접 면역- 형광법 ( DIF ). 12/22/15 10 조직을 5 마이크로미터로 자르고 인간 IgA, IgM, IgG, C3, 및 피브리노겐에 대한 형광체-접합된 항체들로 염색하였다. 정상 대조군들에 대한 시험을 병행하여 수행하였다. C7 발현 및 AF 분석: 3 mm 피부 펀치 생검 시료를 8 마이크로미터로 자르고 항-VII형 콜라겐 다클론 항체 FNC1 (C7의 NC1 도메인에 대해 제시됨) 또는 단클론 항체 LH24(C7의 NC2 도메인)를 사용하여 IIF로 분석하였다. 요약하면, 단면들을 메탄올/아세톤 혼합물 용액에서 고정시키고, 세제에서 투과화시키고 항-C7 일차 항체와 함께 실온(25℃)에서 1시간 동안 배양하였다. 대규모 세척 후, Alexa Fluor 555 또는 488 염료에 접합된 이차 항체를 추가하고 1시간 동안 배양하였다. 세포핵을 Hoechst 33342로 10분간 표지하고, 세척하고, Prolong 금 안티페이드 시약 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 추가하였다. 표피 표지자로 케라틴 1, 케라틴 14 및 로리크린 항체들을 Covance (Emeryville, CA)사로부터 얻었다. 생검들은, 진피-표피 연접부에서 VII 형 콜라겐의 연속적인 선형 염색이 탐지되는 경우 C7 발현에 대해 양성의 점수를 받았다. 밀도, 두께, 만곡, 아치형성 (arching), 및 루프형성 (looping)을 비롯한 고정 원섬유 (AF)의 특징적인 특성을 가진 초미세구조에서 NC2 도메인 특이적 LH24 항체들을 나타내는 금 접합체 입자들이 탐지되는 경우 생검들은 AF에 대해 양성의 점수를 받았다.
사진촬영. 대상체 2-4에 대해, Canfield Vectra 3D 카메라를 사용하여 각 이식 부위를 다양한 각도로 ~5장의 이미지를 찍었다. 그 후 이들 이미지를 함께 묶어서 종합적인 3D 이미지를 만들었다. Mirror 소프트웨어 (Canfield, Fairfield, NJ)를 사용하여 각 이미지에 대한 기준점(landmark)들을 선택하고 해당 위치들을 식별하기 위한 번호를 붙인 다음, 하나의 이미지로 혼합하였다. 이식편 경계를 정확하게 추적하기 위하여, 추적조사 방문시 얻은 혼합된 이미지들을 0일의 이식편 윤곽을 오버레이한 기준 이미지와 비교하였다. 윤곽을 정확하게 표시하기 위해 해부학적 기준점들 (예컨대, 타투 점들)을 다시 확인하였다. 필요에 따라 디지털 사진촬영으로 대상체 2-4에 대해 추가 사진들 및 대상체 1에 대해 모든 이미지들을 얻었다 (Canon Powershot).
균등예
본 출원을 상기 구체 예들과 관련하여 설명하였으나, 전술한 상세한 설명 및 실시예들은 본 출원 발명을 설명하고자 하는 것이며 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 할 것이다. 본 출원 발명이 속하는 분야의 숙련된 기술자들은 본 출원의 범위에 속하는 다른 양상들, 이점들 및 변형예들을 잘 알고 있을 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본 출원에서 제공되는 모든 뉴클레오티드 서열들은 5'에서 3' 방향으로 제공된다.
본 출원에 설명적으로 기재된 구체 예들은 본 출원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이 적절하게 실시될 수 있다. 그러므로 예를 들면, 용어 “포함하는”, “비롯한”, "내포하는” 등은 제한없이 광범위하게 이해되어야 한다. 또한, 본 출원에서 사용되는 용어들 및 표현들은 제한이 아닌 설명을 위해 사용되었으며, 나타낸 그리고 기재된 특징들의 임의의 균등예 및 이의 일부를 제외하고자 이러한 용어 및 표현을 사용한 것이 아니라, 본 출원 발명의 범위에 속하는 다양한 변형예들이 가능한 것으로 이해된다.
그러므로 비록 본 출원을 특정 구체 예들 및 선택적 특징들로 상세히 설명하였으나, 본 출원에 개시된 구체 예들의 변형 예, 개 선예 및 변화 예는 해당 분야의 숙련된 기술자들에 의해 재분류될 수 있으며, 이러한 변형 예, 개선 예 및 변화 예들은 본 출원 발명의 범위에 속하는 것으로 간주됨을 이해하여야 한다. 본 출원에 제공된 재료들, 방법들, 및 예들은 특정 구체 예들의 대표 예이며, 예시이며, 본 출원발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 출원 발명의 범위는 본 출원에서 가장 광범위하게 그리고 일반적으로 기재되었다. 일반적인 개시 내용에 속하는 보다 협소한 종들 및 아속 분류 각각도 본 출원의 일부를 형성한다. 여기에는 제외된 재료가 구체적으로 본 출원에서 언급되었는지 여부에 관계없이, 속으로부터 임의의 대상 물질을 제외시키는 부정적 제한 또는 조건이 있는 일반적 설명이 포함된다.
또한, 본 출원의 특징들 또는 양상들이 마쿠쉬 그룹의 형식으로 기재되어 있는 부분에서, 해당 분야에 속하는 숙련된 기술자들은 본 출원의 구체 예들이 마쿠쉬 그룹의 임의의 개개 구성원 또는 구성원들의 하위그룹 형식으로 기재될 수 있음을 이해할 것이다.
본 출원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원들, 특허들, 및 그 외 다른 참고문헌들은 마치 각각이 개별적으로 참고문헌으로 포함되어 있는 것과 동일한 정도로, 그 전문이 명확하게 본 출원에 참고로 포함된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 비롯하여 본 발명의 명세서의 내용이 우선한다.
SEQUENCE LISTING <110> Siprashvili, Zurab Nguyen, Ngon T. Marinkovich, M. Peter Tang, Jean Lane, Alfred T. Khavari, Paul A. <120> GENE THERAPY FOR RECESSIVE DYSTROPHIC EPIDERMOLYSIS BULLOSA USING GENETICALLY CORRECTED AUTOLOGOUS KERATINOCYTES <130> STAN-1295WO <150> 62/274,700 <151> 2016-01-04 <150> 62/414,533 <151> 2016-10-28 <160> 1 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20326 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cccgaaaagt gccaccagct ttgctcttag gagtttccta atacatccca aactcaaata 60 tataaagcat ttgacttgtt ctatgcccta gggggcgggg ggaagctaag ccagcttttt 120 ttaacattta aaatgttaat tccattttaa atgcacagat gtttttattt cataagggtt 180 tcaatgtgca tgaatgctgc aatattcctg ttaccaaagc tagtataaat aaaaatagat 240 aaacgtggaa attacttaga gtttctgtca ttaacgtttc cttcctcagt tgacaacata 300 aatgcgctgc tgagaagcca gtttgcatct gtcaggatca atttcccatt atgccagtca 360 tattaattac tagtcaatta gttgattttt atttttgaca tatacatgtg aaagacccca 420 cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaaatacat 480 aactgagaat agaaaagttc agatcaaggt caggaacaga tggaacagct gaatatgggc 540 caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc 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ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 12360 tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 12420 aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 12480 ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 12540 cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 12600 accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 12660 ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 12720 ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 12780 gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt tgcggccgaa ttagatccag 12840 acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 12900 gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 12960 aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg 13020 aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat ggctgattat gatcctctag 13080 agtcggtggg cctcgggggc gggtgcgggg tcggcggggc cgcccgggtc ggcttcggtc 13140 ggagccatgg ggtcgtgcgc tcctttcggt cgggcgctgc gggtcgtggg gcgggcgtca 13200 ggcaccgggc ttgcgggtca tgcaccaggt cgcgcggtcc ttcgggcact cgacgtcggc 13260 ggtgacggtg aagccgagcc gctcgtagaa ggggaggttg cggggcgcgg aggtctccag 13320 gaaggcgggc accccggcgc gctcggccgc ctccactccg gggagcacga cggcgctgcc 13380 cagacccttg ccctggtggt cgggcgagac gccgacggtg gccaggaacc acgcgggctc 13440 cttgggccgg tgcggcgcca ggaggccttc catctgttgc tgcgcggcca gccgggaacc 13500 gctcaactcg gccatgcgcg ggccgatctc ggcgaacacc gcccccgctt cgacgctctc 13560 cggcgtggtc cagaccgcca ccgcggcgcc gtcgtccgcg acccacacct tgccgatgtc 13620 gagcccgacg cgcgtgagga agagttcttg cagctcggtg acccgctcga tgtggcggtc 13680 cgggtcgacg gtgtggcgcg tggcggggta gtcggcgaac gcggcggcga gggtgcgtac 13740 ggcccggggg acgtcgtcgc gggtggcgag gcgcaccgtg ggcttgtact cggtcatgga 13800 aggtcgtctc cttgtgaggg gtcaggggcg tgggtcaggg gatggtggcg gcaccggtcg 13860 tggcggccga cctgcaggtc gaaaggcccg gagatgagga agaggagaac agcgcggcag 13920 acgtgcgctt ttgaagcgtg cagaatgccg ggcctccgga ggaccttcgg gcgcccgccc 13980 cgcccctgag cccgcccctg agcccgcccc cggacccacc ccttcccagc ctctgagccc 14040 agaaagcgaa ggagcaaagc tgctattggc cgctgcccca aaggcctacc cgcttccatt 14100 gctcagcggt gctgtccatc tgcacgagac tagtgagacg tgctacttcc atttgtcacg 14160 tcctgcacga cgcgagctgc ggggcggggg ggaacttcct gactagggga ggagtagaag 14220 gtggcgcgaa ggggccacca aagaacggag ccggttggcg cctaccggtg gatgtggaat 14280 gtgtgcgagg ccagaggcca cttgtgtagc gccaagtgcc cagcggggct gctaaagcgc 14340 atgctccaga ctgccttggg aaaagcgcct cccctacccg gtagaattaa ttctcatgtt 14400 tgacagctta tcatcgatag atcctcacag gccgcaccca gcttttcttc cgttgcccca 14460 gtagcatctc tgtctggtga ccttgaagag gaagaggagg ggtcccgaga atccccatcc 14520 ctaccgtcca gcaaaaaggg ggacgaggaa tttgaggcct ggcttgaggc tcaggacgca 14580 aatcttgagg atgttcagcg ggagttttcc gggctgcgag taattggtga tgaggacgag 14640 gatggttcgg aggatgggga attttcagac ctggatctgt ctgacagcga ccatgaaggg 14700 gatgagggtg ggggggctgt tggagggggc aggagtctgc actccctgta ttcactgagc 14760 gtcgtctaat aaagatgtct attgatctct tttagtgtga atcatgtctg 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gtccattgtc tgttatttca tggtcttttt 16500 acaaactcat atatttgctg aggttttgaa ggatgcgatt aaggaccttg ttatgacaaa 16560 gcccgctcct acctgcaata tcagggtgac tgtgtgcagc tttgacgatg gagtagattt 16620 gcctccctgg tttccaccta tggtggaagg ggctgccgcg gagggtgatg acggagatga 16680 cggagatgaa ggaggtgatg gagatgaggg tgaggaaggg caggagtgat gtaacttgtt 16740 aggagacgcc ctcaatcgta ttaaaagccg tgtattcccc cgcactaaag aataaatccc 16800 cagtagacat catgcgtgct gttggtgtat ttctggccat ctgtcttgtc accattttcg 16860 tcctcccaac atggggcaat tgggcatacc catgttgtca cgtcactcag ctccgcgctc 16920 aacaccttct cgcgttggaa aacattagcg acatttacct ggtgagcaat cagacatgcg 16980 acggctttag cctggcctcc ttaaattcac ctaagaatgg gagcaaccag caggaaaagg 17040 acaagcagcg aaaattcacg cccccttggg aggtggcggc atatgcaaag gatagcactc 17100 ccactctact actgggtatc atatgctgac tgtatatgca tgaggatagc atatgctacc 17160 cggatacaga ttaggatagc atatactacc cagatataga ttaggatagc atatgctacc 17220 cagatataga ttaggatagc ctatgctacc cagatataaa ttaggatagc atatactacc 17280 cagatataga ttaggatagc 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ctgtcggcgt ccactctctt tccccttgtt acaaatagag tgtaacaaca 18180 tggttcacct gtcttggtcc ctgcctggga cacatcttaa taaccccagt atcatattgc 18240 actaggatta tgtgttgccc atagccataa attcgtgtga gatggacatc cagtctttac 18300 ggcttgtccc caccccatgg atttctattg ttaaagatat tcagaatgtt tcattcctac 18360 actagtattt attgcccaag gggtttgtga gggttatatt ggtgtcatag cacaatgcca 18420 ccactgaacc ccccgtccaa attttattct gggggcgtca cctgaaacct tgttttcgag 18480 cacctcacat acaccttact gttcacaact cagcagttat tctattagct aaacgaagga 18540 gaatgaagaa gcaggcgaag attcaggaga gttcactgcc cgctccttga tcttcagcca 18600 ctgcccttgt gactaaaatg gttcactacc ctcgtggaat cctgacccca tgtaaataaa 18660 accgtgacag ctcatggggt gggagatatc gctgttcctt aggacccttt tactaaccct 18720 aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg gttagtctgg 18780 atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttaac aagggggcct 18840 tataaacact attgctaatg ccctcttgag ggtccgctta tcggtagcta cacaggcccc 18900 tctgattgac gttggtgtag cctcccgtag tcttcctggg cccctgggag gtacatgtcc 18960 cccagcattg gtgtaagagc ttcagccaag agttacacat aaaggcaatg ttgtgttgca 19020 gtccacagac tgcaaagtct gctccaggat gaaagccact cagtgttggc aaatgtgcac 19080 atccatttat aaggatgtca actacagtca gagaacccct ttgtgtttgg tccccccccg 19140 tgtcacatgt ggaacagggc ccagttggca agttgtacca accaactgaa gggattacat 19200 gcactgcccg tgaccaatac aaaacaaaag cgctcctcgt accagcgaag aaggggcaga 19260 gatgccgtag tcaggtttag ttcgtccggc ggcgggggat ctggccgctt taaatcaatc 19320 taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 19380 atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 19440 actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 19500 cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 19560 agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 19620 gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg 19680 gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 19740 gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 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Claims (67)

  1. 다음 단계를 포함하는, 대상체에서의 수포성 표피박리증 (EB) 치료방법:
    대상체로부터 피부 세포들의 모집단을 얻는 단계;
    전장 야생형 인간 콜라겐 VII (COL7A1) 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물을 통합시켜 피부 세포들을 생체 외 교정하는 단계;
    유전자 교정된 세포들을 배양하여 각질세포 시트를 형성하는 단계; 및
    각질세포 시트의 이식편을 피부 상처층에 이식하는 단계;
    여기서 상기 피부 세포들은 유전자 작제물을 포함하는 바이러스를 형질도입함으로써 교정되고; 여기서 형질도입된 피부 세포의 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN)는 3 이하, 그리고 선택적으로 2, 1.5, 1, 또는 0.5 미만임.
  2. 대상체에서 수포성 표피박리증 (EB)을 치료하기 위한 피부 세포들의 모집단의 용도로서, 여기서 피부 세포들의 모집단은 전장 야생형 인간 콜라겐 VII (COL7A1) 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물을 포함하는 바이러스를 형질도입함으로써 교정되어, 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN)를 가지는 형질도입된 피부 세포들의 모집단을 얻으며, 여기서 형질도입된 피부 세포들의 모집단의 PGCN은 3 이하, 그리고 선택적으로 2, 1.5, 1, 또는 0.5 미만인, 용도.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스, AAV (아데노-연관 바이러스), 또는 렌티바이러스를 포함함을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  4. 청구항 3에 있어서, 레트로바이러스는 LZRSE-바이러스임을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  5. 청구항 3에 있어서, 레트로바이러스는 GalV-가성형임을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  6. 청구항 1 - 5 중 어느 한 항에 있어서, 이렇게 형질도입된 피부 세포들은 바이러스 형질도입율 (VTE) >50%의 박리 전 기준을 만족시킴을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  7. 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 상처는 비-교정된 상처층 각질세포가 없음을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  8. 청구항 1-7 중 어느 한 항에 있어서, 상처는 비-교정된 상처층 각질세포를 제거하기 위하여 치료됨을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  9. 청구항 1-8 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)을 앓고 있음을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  10. 청구항 1-8 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간임을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  11. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서, 각질세포 시트는 VTE 시험, PGCN 시험, 무균 시험, 내독소 시험, 마이코플라즈마 시험, 그람 염색 무균 시험, LEAES 생존력 시험, 박리 후 시험, RCR 시험, 세포독성 T 세포 분석법, 항-C7 LH24 mAb 특성화, 전자 현미경검사, 면역-전자 현미경검사, 면역형광 염색법, C7 발현, 및 AF 분석법으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 또는 그 이상의 시험을 거침을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  12. 청구항 11에 있어서, 면역형광 염색법은 직접 또는 간접 면역형광 염색을 포함함을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  13. 청구항 1-12 중 어느 한 항에 있어서, 각질세포 시트는 무세포 기질, 콜라겐 기질, 또는 생체적합성 메쉬 위에 배치됨을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  14. 청구항 13에 있어서, 생체적합성 메쉬는 열가소성 수지, 폴리에틸렌, 초 고분자량 폴리에틸렌, 고분자량 폴리올레핀, 비코팅 모노필라멘트 폴리프로필렌, 폴리에터 에터 케톤, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌, 나일론, 실리콘, 또는 이의 임의의 조합으로 제조됨을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  15. 청구항 1-14 중 어느 한 항에 있어서, 피부 세포들은 각질세포를 포함함을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  16. 청구항 1-15 중 어느 한 항에 있어서, 피부 세포들은 줄기세포들을 포함함을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  17. 청구항 1-16 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포들을 각질세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  18. 다음 단계를 포함하는, 대상체에서의 각막 짓무름 치료방법:
    대상체로부터 각막 세포들의 모집단을 얻는 단계;
    전장 야생형 인간 콜라겐 VII (COL7A1) 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물을 통합시켜 각막 세포들을 생체 외 교정하는 단계;
    유전자 교정된 세포들을 배양하여 각막 세포 시트를 형성하는 단계; 및
    각막 세포 시트의 이식편을 각막 표면에 이식하는 단계.
  19. 청구항 18에 있어서, 각막 세포는 각막 상피 세포를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서, 각막 세포는 줄기세포를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 18-20 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포들을 각막 상피 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 18-21 중 어느 한 항에 있어서, 각막 세포들은 유전자 작제물을 포함하는 바이러스를 형질도입하여 교정되며, 여기서 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 AAV를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 레트로바이러스는 LZRSE-바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 22에 있어서, 레트로바이러스는 GalV-가성형임을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 18-24 중 어느 한 항에 있어서, 이렇게 형질도입된 각막 세포는 바이러스 형질도입율 (VTE) >50% 및 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN)≤ 3, 그리고 선택적으로 2, 1.5, 1, 또는 0.5 미만의 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN)의 박리-전 기준을 만족시킴을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 18-25 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)을 앓고 있음을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 18-26 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간임을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 18-27 중 어느 한 항에 있어서, 각막 세포 시트는 VTE 시험, PGCN 시험, 무균 시험, 내독소 시험, 마이코플라즈마 시험, 그람 염색 무균 시험, LEAES 생존력 시험, 박리 후 시험, RCR 시험, 세포독성 T 세포 분석법, 항-C7 LH24 mAb 특성화, 전자 현미경검사, 면역-전자 현미경검사, 면역형광 염색법, C7 발현, 및 AF 분석법으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 또는 그 이상의 시험을 거침을 특징으로 하는 방법 또는 용도.
  29. 청구항 28에 있어서, 면역형광 염색법은 직접 또는 간접 면역형광 염색을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 18-29 중 어느 한 항에 있어서, 각막 세포 시트는 무세포 기질, 콜라겐 기질, 또는 생체적합성 메쉬 위에 배치됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 생체적합성 메쉬는 열가소성 수지, 폴리에틸렌, 초 고분자량 폴리에틸렌, 고분자량 폴리올레핀, 비코팅 모노필라멘트 폴리프로필렌, 폴리에터 에터 케톤, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌, 나일론, 실리콘, 또는 이의 임의의 조합으로 제조됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된 각질세포 시트를 포함하는 조성물:
    대상체로부터 피부 세포들의 모집단을 얻는 단계;
    전장 야생형 인간 콜라겐 VII (COL7A1) 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물을 통합시켜 피부 세포들을 생체 외 교정하는 단계; 및
    유전자 교정된 세포들을 배양하여 각질세포 시트를 형성하는 단계;
    여기서 피부 세포들은 유전자 작제물을 포함하는 바이러스를 형질도입함으로써 교정되고; 여기서 형질도입된 피부 세포의 PGCN은 3 이하임.
  33. 청구항 32에 있어서, 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 AAV를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  34. 청구항 33에 있어서, 레트로바이러스는 LZRSE-바이러스임을 특징으로 하는 조성물.
  35. 청구항 33-34 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스는 GalV-가성형임을 특징으로 하는 조성물.
  36. 청구항 32-35 중 어느 한 항에 있어서, 이렇게 형질도입된 피부 세포들은 바이러스 형질도입율 (VTE) >50%의 박리 전 기준을 만족시킴을 특징으로 하는 조성물.
  37. 청구항 32-36 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 열성 이영양성 수포성 표피박리증 (RDEB)을 앓고 있음을 특징으로 하는 조성물.
  38. 청구항 32-37 중 어느 한 항에 있어서, 각질세포 시트는 VTE 시험, PGCN 시험, 무균 시험, 내독소 시험, 마이코플라즈마 시험, 그람 염색 무균 시험, LEAES 생존력 시험, 박리 후 시험, RCR 시험, 세포독성 T 세포 분석법, 항-C7 LH24 mAb 특성화, 전자 현미경검사, 면역-전자 현미경검사, 면역형광 염색법, C7 발현, 및 AF 분석법으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 또는 그 이상의 시험을 거침을 특징으로 하는 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서, 면역형광 염색법은 직접 또는 간접 면역형광 염색을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  40. 청구항 32-39 중 어느 한 항에 있어서, 피부 세포들은 각질세포를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  41. 청구항 32-40 중 어느 한 항에 있어서, 피부 세포들은 줄기세포들을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  42. 청구항 41에 있어서, 줄기세포는 각질세포로 분화됨을 특징으로 하는 조성물.
  43. 각질세포 시트를 포함하는 제약학적 조성물로서, 상기 각질세포 시트는 기능적 COL7A1 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물이 생체 외 통합된 피부 세포들을 포함하는 제약학적 조성물.
  44. 청구항 43에 있어서, 피부 세포들은 기능적 COL7A1 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물이 생체 외 통합된 줄기세포들로부터 분화됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  45. 청구항 43-44 중 어느 한 항에 있어서, 피부 세포들은 대상체로부터 얻음을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  46. 청구항 43-44 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 RDEB를 앓고 있음을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  47. 청구항 43-46 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  48. 청구항 43-47 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 COL7A1 단백질은 전장 야생형 인간 COL7A1 단백질임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  49. 청구항 43-48 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 COL7A1 단백질은 전장 야생형 인간 COL7A1 단백질로부터의 유전자 변형을 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  50. 청구항 49에 있어서, 유전자 변형은 삽입, 결실, 및/또는 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  51. 청구항 43-50 중 어느 한 항에 있어서, 피부 세포들 또는 줄기세포들은 유전자 작제물을 포함하는 바이러스로 형질도입되며, 여기서 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 AAV를 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  52. 청구항 51에 있어서, 레트로바이러스는 LZRSE-바이러스임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  53. 청구항 51에 있어서, 레트로바이러스는 GalV-가성형임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  54. 청구항 51에 있어서, 이렇게 형질도입된 피부 세포는 바이러스 형질도입율 (VTE) >50% 및 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN) ≤ 3의 박리 전 기준을 만족시킴을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  55. 청구항 43-54 중 어느 한 항에 있어서, 각질세포 시트는 VTE 시험, PGCN 시험, 무균 시험, 내독소 시험, 마이코플라즈마 시험, 그람 염색 무균 시험, LEAES 생존력 시험, 박리 후 시험, RCR 시험, 세포독성 T 세포 분석법, 항-C7 LH24 mAb 특성화, 전자 현미경검사, 면역-전자 현미경검사, 면역형광 염색법, C7 발현, 및 AF 분석법으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 또는 그 이상의 시험을 거침을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  56. 청구항 55에 있어서, 면역형광 염색법은 직접 또는 간접 면역형광 염색을 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  57. 각막 세포 시트를 포함하는 제약학적 조성물로서, 상기 각막 세포는 기능적 COL7A1 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물로 생체 외 통합된 각막 세포를 포함하는 제약학적 조성물.
  58. 청구항 57에 있어서, 각막 세포들은 기능적 COL7A1 단백질을 인코딩하는 유전자 작제물이 생체 외 통합된 줄기세포들로부터 분화됨을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  59. 청구항 57 또는 58에 있어서, 각막 세포들은 대상체로부터 얻음을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  60. 청구항 59에 있어서, 대상체는 RDEB를 앓고 있음을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  61. 청구항 59에 있어서, 대상체는 인간임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  62. 청구항 57-61 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 COL7A1 단백질은 전장 야생형 인간 COL7A1 단백질임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  63. 청구항 57-62 중 어느 한 항에 있어서, 각막 세포들 또는 줄기세포들은 유전자 작제물을 포함하는 바이러스로 형질도입되며, 여기서 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 AAV를 포함함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  64. 청구항 63에 있어서, 레트로바이러스는 LZRSE-바이러스임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  65. 청구항 63에 있어서, 레트로바이러스는 GalV-가성형임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  66. 청구항 63에 있어서, 이렇게 형질도입된 세포는 바이러스 형질도입율 (VTE) >50% 및 프로바이러스 게놈 복제수 (PGCN) ≤ 3의 박리 전 기준을 만족시킴을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  67. 청구항 66에 있어서, PGCN는 2 미만임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
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