CN114699558B - 使用经遗传矫正的自体角质形成细胞进行的隐性营养不良型大疱性表皮松解症的基因疗法 - Google Patents

Abstract

提供了用于胶原蛋白VII的基于细胞的递送以治疗大疱性表皮松解症和角膜糜烂的方法。本公开还提供了包含角质形成细胞片层或角膜细胞片层，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成的组合物和药物组合物。

Description

使用经遗传矫正的自体角质形成细胞进行的隐性营养不良型 大疱性表皮松解症的基因疗法

分案说明

本申请是2018年6月27日向国家知识产权局提交的申请号为201780005233.2的中国专利申请“使用经遗传矫正的自体角质形成细胞进行的隐性营养不良型大疱性表皮松解症的基因疗法”的分案申请。

联邦政府资助的研究和开发

本发明是在由美国国家卫生研究院颁发的合同AR055914下借助政府资助进行的。政府对本发明享有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.119(e)要求2016年1月4日提交的美国序列第62/274,700号和2016年10月28日提交的美国序列第62/414,533号的优先权，所述专利的每一个的内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开总体上涉及治疗大疱性表皮松解症(EB)和角膜糜烂的方法和组合物。

背景技术

隐性营养不良型大疱性表皮松解症(RDEB)是由COL7A1基因(胶原蛋白VII，C7)中的突变(导致C7功能的缺乏)引起的遗传性基因起疱性皮肤病。患有此病症的患者的特征在于皮肤和粘膜组织(包括口咽、结膜、食管以及泌尿生殖道和胃肠道的远端方面)的广泛起疱和糜烂。疼痛的起疱和糜烂是重大残疾；然而，愈合伤口的结瘢也会引起显著的发病率，包括并指畸形(假性并趾)、眼的睑球粘连、食管狭窄、小口畸形、舌系带过短和四肢狭窄。已知，慢性创伤和结瘢诱发浸润性鳞状细胞癌侵袭，这是RDEB中的严重问题，从第二个十年开始，浸润性鳞状细胞癌是该群体的主要死亡原因。因此，对于该疾病的最佳疗法可以是应该尽早实施以防止致残结瘢发生，并防止起疱。此外，在RDEB治疗方法中，全身性地矫正皮肤和粘膜组织的能力将是非常需要的。

VII型胶原蛋白(C7)是大的同源三聚体三螺旋胶原蛋白分子，其在其NC2末端经历反平行二聚体形成，然后超分子装配成称为锚定原纤维的附着结构，其将基底膜区(BMZ)的致密层连接至乳突状真皮。C7含有大的NC1结构域(其结合致密层中的层粘连蛋白-332)和胶原蛋白结构域(collagenous domain)(其包裹乳突状真皮中的间质胶原蛋白原纤维)。因此，RDEB中缺乏C7会在乳突状真皮与致密层之间产生起疱。

尽管该疾病的分子诊断有所进展，但目前的疗法仅限于姑息治疗。虽然已经提出了替代C7的几种方法，但全都有其局限性。局部应用时，rC7不能穿透完整的皮肤，从而局限于受伤区域。用于RDEB患者的皮内rC7蛋白注射是另一种选择；然而，来自常规针头注射的有限扩散需要rC7微针阵列递送，这尚不能用于临床使用。

为了治疗目的，需要将C7局部递送至皮肤。本发明解决了这个问题。C7的全身性疗法可导致全身性毒性。(参见Hou等(2015),Journal of Investigative Dermatology135,3060–3067)。

发明内容

提供了用于治疗人受试者中的大疱性表皮松解症(EB)的组合物和方法。在本发明的治疗方法中，通过整合编码野生型人C7的基因构建体，将人角质形成细胞群工程化以表达C7。在一些实施方案中，表达水平高于正常人角质形成细胞的表达水平。在一些实施方案中，表达水平低于正常人角质形成细胞的表达水平，与正常人角质形成细胞的表达水平类似或相同。本发明包括通过本发明的方法工程化以表达野生型C7的分离的角质形成细胞群，可将其在药物单位剂量组合物中提供。在一些实施方案中，所述受试者是患有引起大疱性表皮松解症(EB)的C7的遗传缺陷的人。在实施方案中，遗传缺陷是RDEB。

在一些实施方案中，用于治疗的角质形成细胞是自体角质形成细胞。离体工程改造的方法可选自但不限于病毒驱动的方法(包括但不限于逆转录病毒(例如γ逆转录病毒)、AAV病毒和慢病毒)，或无病毒集成方法(virus-free integrative method)，其包括非病毒载体、转座子、小环整合、CRISPR/Cas9基因组编辑系统等。在一些实施方案中，γ逆转录病毒包括以下病毒或基本上由其组成或更进一步由其组成：鼠白血病病毒(MLV或MuLV)、猫白血病病毒(FeLV)、长臂猿猿白血病病毒(GALV)和异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)。在一些实施方案中，非病毒载体包括附加型载体或具有基因组编辑特征的能力的整合载体，基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在一些实施方案中，使用含有在MLVLTR控制下的功能性COL7A1 cDNA的GMP级GalV-假型化LZRSE-COL7A1病毒，将C7基因整合至角质形成细胞中。在一些实施方案中，功能性COL7A1 cDNA是全长野生型人COL7A1 cDNA。在一个实施方案中，功能性COL7A1cDNA包括来自全长野生型人COL7A1 cDNA的遗传修饰。在一些实施方案中，通过在细胞培养物上覆盖病毒上清液来进行病毒转导。在一些实施方案中，如此处理的角质形成细胞符合病毒转导效率(VTE)>50％且前病毒基因组拷贝数(PGCN)≤3的预释放标准。在一些实施方案中，PGCN大于3、10、20、40或60。在一些实施方案中，PGCN小于2、1.5、1或0.5。

在一些实施方案中，使用如本文所述的CRISPR/Cas系统(或编码所述CRIPSR/Cas系统的载体)和在靶向裂解后被插入基因的“供体”序列(例如，功能性COL7A1 cDNA或C7基因)替代内源突变的、功能失调的或截短的C7基因。

在本发明的一些实施方案中，提供了治疗EB的方法，所述方法包括以下步骤，基本上由以下步骤组成或更进一步由以下步骤组成：从患有EB的受试者获得角质形成细胞群，通过逆转录病毒转导修饰角质形成细胞以表达野生型人C7，并将角质形成细胞重新引入个体。在一些实施方案中，角质形成细胞获自皮肤穿刺活检物，将其在具有或不具有血清的角质形成细胞培养基中体外培养。在一些实施方案中，将角质形成细胞在具有或不具有饲养层细胞的培养基中培养。将表皮与真皮层分离并从表皮层获得角质形成细胞。将至少约10⁶个细胞，至少约2x10⁶个和/或至少4x10⁶个细胞用于转导以提供遗传矫正的细胞群。培养细胞以产生约25cm²至约100cm²的片层用于移植。将遗传矫正的角质形成细胞片层置于缺乏鳞状细胞癌(SCC)的临床证据的未感染的、糜烂性和/或瘢痕性伤口部位。伤口部位可以为约50cm²、约100cm²和/或约200cm²。在一些实施例中，为了移植而产生伤口。在一些此类实施方案中，将伤口电灼以消除残留的未矫正的创面床角质形成细胞。在创面床准备后，通过可溶缝线将移植物固定在创面床上。

在另一个实施方案中，本公开内容提供了组合物，所述组合物以有效减轻EB症状的剂量包含经遗传矫正以表达野生型人C7的角质形成细胞群和药学上可接受的载体，基本上由其组成，或更进一步由其组成。在本公开的一个方面，将组合物冷冻。在一些实施方案中，角质形成细胞相对于被选择进行治疗的个体是自体的。

在另一个实施方案中，本公开提供了药物组合物，所述组合物包含角质形成细胞片层，基本上由其组成，或更进一步由其组成，所述角质形成细胞片层包含利用编码功能性COL7A1蛋白的基因构建体离体整合的皮肤细胞，基本上由其组成，或更进一步由其组成。在一些实施方案中，将角质形成细胞片层置于经生物工程化的皮肤等效物上。在一些实施方案中，将角质形成细胞片层置于无细胞基质、胶原蛋白基质、ECM蛋白质或化学层或生物相容性网片上。在一个实施方案中，无细胞基质由人和/或动物真皮制成。在一些实施方案中，生物相容性网片由热塑性树脂、聚乙烯、超高分子量聚乙烯、高分子量聚烯烃、未涂覆的单丝聚丙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、尼龙、硅或其任何组合制成。

本文显示，从皮肤活检物分离自体RDEB角质形成细胞，并用携带功能性(例如全长)人COL7A1的逆转录病毒转导。对于每个受试者，制备自体表皮片层(～35cm²)并将其移植至制备好的创面床上。终点包括安全性、与基线相比的伤口愈合百分比的功效，以及移植后3个月和6个月时的C7表达的证据。所有移植物均被所有受试者良好耐受，未报告有严重不良事件(全身性病毒感染、自身免疫、移植物内发生皮肤癌)。在3-6个月时，大部分移植物显示75％的愈合。来自移植物部位的活检显示在3个月时在真皮-表皮交界处有强烈的C7表达，并且在6个月时存在正常的锚定原纤维。COL7A1离体基因转移具有良好的安全性特征，并且在患有遗传性RDEB的受试者中显示出令人鼓舞的功效。

附图说明

图1.(A)RDEB遗传矫正流程图。KC-表皮角质形成细胞，经LEAES-LZRSE-COL7A1工程化的自体表皮片层移植物。(B)LZRSE-COL7A1病毒转导的RDEB KC的间接免疫荧光(IIF)。抗VII型胶原蛋白多克隆抗体(橙色)；Hoechst 33342细胞核(蓝色)。比例尺，100μm。(C)在4名RDEB受试者的矫正的KC中定量病毒转导效率(VTE)。(D)4个RDEB受试者的矫正的KC中平均前病毒拷贝数(PGCN)的定量。(E)移植物移植前后RDEB表型的临床表现。注意与LEAES移植后3和6个月相比在矫正的皮肤移植之前和未经处理的伤口中的水疱。(F)皮肤移植物中VII型胶原蛋白表达的IIF分析。抗VII型胶原蛋白NC2 Mab LH24和NC1 Pab FNC1(绿色)；Hoechst 33342细胞核(蓝色)；注意矫正的组织移植物的真皮-表皮交界处的VII型胶原蛋白的线性绿色染色。比例尺，100μm。(G)矫正的RDEB皮肤移植物的免疫-EM分析。用抗VII型胶原蛋白NC2 Mab LH24整体标记组织切片，然后用抗-小鼠IgM缀合的免疫金颗粒(黑点，由箭头指示)标记。比例尺，200nm。

图2.I期试验中受试者招募的符合关系图(CONSORT diagram)。

图3.使用对NC1结构域有特异性的抗VII型胶原蛋白多克隆抗体对培养的KC上清液进行的蛋白质印迹分析。注意试验中招募的所有受试者中含有NC1结构域的截短的C7蛋白表达。

图4.显示收获前成熟的LEAES、装配和最终的LEAES移植。

图5.(A)移植前后RDEB表型的临床表现。(B)皮肤移植物中VII型胶原蛋白表达的IIF分析。抗VII型胶原蛋白NC2 Mab LH24(绿色)；Hoechst 33342细胞核(蓝色)；角蛋白14(抗K14 Pab，橙色)；角蛋白1(抗K1 Pab，橙色)和兜甲蛋白(抗兜甲蛋白Pab，橙色)。注意所有时间点的矫正的组织移植物的真皮-表皮交界处的VII型胶原蛋白的线性绿色染色。比例尺，100μm。

图6.移植前后受试者2的伤口。(A)移植物移植前后RDEB表型的临床表现。(B)皮肤移植物中VII型胶原蛋白表达的IIF分析。抗VII型胶原蛋白NC2 Mab LH24(绿色)；Hoechst33342细胞核(蓝色)；角蛋白14(抗K14 Pab，橙色)；角蛋白1(抗K1 Pab，橙色)和兜甲蛋白(抗兜甲蛋白Pab，橙色)。注意在3个月的矫正的组织移植物的真皮-表皮交界处的VII型胶原蛋白的线性绿色染色。比例尺，100μm。

图7.移植前后受试者3的伤口。(A)移植物移植前后RDEB表型的临床表现。(B)皮肤移植物中VII型胶原蛋白表达的IIF分析。抗VII型胶原蛋白NC2 Mab LH24(绿色)；Hoechst33342细胞核(蓝色)；角蛋白14(抗K14 Pab，橙色)；角蛋白1(抗K1 Pab，橙色)和兜甲蛋白(抗兜甲蛋白Pab，橙色)。注意所有时间点的矫正的组织移植物的真皮-表皮交界处的VII型胶原蛋白的线性绿色染色。比例尺，100μm。

图8.移植前后受试者4的伤口。(A)移植物移植前后RDEB表型的临床表现。(B)皮肤移植物中VII型胶原蛋白表达的IIF分析。抗VII型胶原蛋白NC2 Mab LH24(绿色)；Hoechst33342细胞核(蓝色)；角蛋白14(抗K14 Pab，橙色)；角蛋白1(抗K1 Pab，橙色)和兜甲蛋白(抗兜甲蛋白Pab，橙色)。注意3个月时(对于LH24单抗)和6个月时(对于NC1 Pab)的矫正的组织移植物的真皮-表皮交界处的VII型胶原蛋白的线性绿色染色。比例尺，100μm。

图9.抗C7 LH24单克隆抗体表征。酶促消化的C7的蛋白质印迹分析显示LH24Mab与包含NC2结构域的羧基末端肽的交叉反应性。用NC2特异性pAb(NC2-10)5确认胃蛋白酶消化的C7级分中存在NC2结构域。使用FNC1 pAb6鉴定胶原蛋白酶消化的C7级分中的NC1结构域。

图10.来自受试者4的未矫正的伤口的临床表现。未经处理的伤口中的特征性自发性水疱发展。

图11.受试者4血清对VII型胶原蛋白的反应性。(A)蛋白质印迹分析显示受试者4的血清与移植物移植之前和之后(3个月)的全长C7的交叉反应性。(B)移植前获得的和移植后3个月获得的受试者4的血清对酶促(胃蛋白酶)消化的含有NC2结构域的C7蛋白有特异性。对照(右侧泳道)使用NC2特异性Pab(NC2-10)5确认消化的C7级分中存在NC2结构域。

图12.移植前和移植12个月后受试者1的伤口。基线和移植后12个月时的伤口临床表现。皮肤移植物中VII型胶原蛋白表达的IIF分析。抗VII型胶原蛋白NC1 Pab(绿色)；Hoechst 33342细胞核(蓝色)；角蛋白14(抗K14 Pab，橙色)；角蛋白1(抗K1 Pab，橙色)和兜甲蛋白(抗兜甲蛋白Pab，橙色)。注意矫正的组织移植物的真皮-表皮交界处的VII型胶原蛋白的线性绿色染色。比例尺，100μm。

图13.描绘了pLZRSE-COL7A1逆转录病毒质粒的图谱。

具体实施方式

应该理解的是，本发明不限于所述的具体方法学、方案、细胞系、动物物种或属以及试剂，因此可以变化。还应该理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。

如本文中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“该培养物”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种培养物及其等效物，等等。除非另外明确指出，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

任何本发明的方法、装置和系统的任何实施方案可由所述步骤和/或特征组成，或者基本上由所述步骤和/或特征组成，而不是包含/包括/含有/具有所述步骤和/或特征。因此，在任何权利要求中，术语“由...组成”或“基本上由......组成”可以代替上述任何开放式连接动词，以便改变给定权利要求的范围，所述权利要求可以以其它方式使用开放式连接动词。

除非明确指出仅指代替代方案，或者替代方案是相互排斥的，否则在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，尽管本公开支持仅指代替代方案的定义和“和/或”。

贯穿本申请，术语“约”用于表示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。

用本发明的利用经工程化的角质形成细胞的治疗的目标条件包括但不限于各种形式的大疱性表皮松解症，包括获得性和先天性形式，后者可以是隐性或显性的。

基于最新的分类系统，营养不良型大疱性表皮松解症(DEB)包括三种亚型：隐性DEB，严重的全身性(RDEB-sev gen)(以前称为Hallopeau-Siemens型(RDEB-HS)；隐性DEB，全身性的其它(RDEB O)(以前称为非Hallopeau-Siemens型(RDEB-non-HS)；以及显性DEB(DDEB)；在RDEB-sev gen中，影响全身的水疱可存在于新生儿期。口部受累可导致口起疱、舌与口底的融合、口腔尺寸的逐渐缩小。食管糜烂可导致可引起严重吞咽困难的蹼(webs)和狭窄。因此严重的营养缺乏和继发性问题是常见的。角膜糜烂可导致结瘢和视力丧失。手和足起疱后结瘢将指(趾)融合成“并指(趾)”手和足”，这是这种疾病的标志。侵袭性鳞状细胞癌的终生危险超过90％。在DDEB中，起疱通常是轻微的，并且仅限于手、足、膝盖和肘，但仍然会愈合并且结瘢。营养不良的指(趾)甲，尤其是脚趾甲是常见的，可能是DDEB的唯一表现。

表现的常规治疗主要是支持性的，包括伤口敷料和营养支持。职业疗法可有助于预防手部挛缩。手指的手术松解通常需要重复。

经工程化以表达野生型C7的角质形成细胞可用于治疗营养不良型大疱性表皮松解症。

除了EB的遗传形式以外，大疱性表皮松解症的获得性形式(EBA)涉及VII型胶原蛋白的病理学并且可用本公开的经工程化的角质形成细胞治疗。EBA患者的循环自身抗体识别VII型胶原蛋白分子中的表位，并且VII型胶原蛋白cDNA的分子克隆已提供了鉴定VII型胶原蛋白的氨基末端NC-1结构域中的主要免疫表位的工具。以下事实进一步突显了NC-1(VII)结构域的抗原特性：单克隆抗体(诸如H3A和L3D)(其在临床上用于在具有遗传形式的EB的患者的皮肤中绘制VII型胶原蛋白的图谱)也鉴定蛋白质的该部分中的表位。除了识别EBA中的VII型胶原蛋白表位的循环自身抗体以外，一些系统性红斑狼疮患者的大疱病变也与抗VII型胶原蛋白抗体相关。

胶原蛋白。如本文中所用，术语“胶原蛋白”是指其中至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多的存在的蛋白质是呈三螺旋构型的胶原蛋白。将单个α-链折叠成三螺旋构象是基于特征性一级序列(包括重复的Gly-X-Y三联体序列)预测的。胶原蛋白广泛存在于脊椎动物物种中，并且已对许多不同物种的胶原蛋白进行了测序。由于物种之间的高度序列相似性，来自不同物种的胶原蛋白可用于生物医学目的，例如在哺乳动物物种之间，尽管人蛋白质可以是优选的。

FACIT胶原蛋白(具有中断的三螺旋的原纤维缔合胶原蛋白)包括IX型、XII型、XIV型、XIX型、XX型和XXI型。后面类型的胶原蛋白中的几种与更大的胶原蛋白纤维缔合，并作为分子桥，稳定细胞外基质的组织。胶原蛋白VII(COL7A1，第3号染色体，NC_000003.10(48576510..48607689，补充材料))是特别吸引人的。VII型胶原蛋白是锚定原纤维的主要组分。

VII型胶原蛋白是具有侧翼非胶原蛋白序列的424nm长的三螺旋结构域。VII型胶原蛋白分子包括中央胶原蛋白三螺旋片段，其侧翼为非胶原蛋白NC-1和NC-2结构域。与间质胶原蛋白不同，重复的Gly-X-Y序列由于Gly-X-Y重复序列中氨基酸的插入或缺失而被19个缺陷中断。最值得注意的是，在三螺旋结构域的中间，存在39个氨基酸的非胶原蛋白“铰链”区域，其对利用胃蛋白酶的蛋白水解消化敏感。大小约为145kDa的VII型的氨基末端NC-1结构域，包括与已知粘附蛋白具有同源性的子模块，包括与软骨基质蛋白(CMP)具有同源性的区段、九个连续的III型纤连蛋白(FN-III)结构域、与von Willebrand因子的A结构域具有同源性的区段以及短的富含半胱氨酸和脯氨酸的区域。羧基末端非胶原蛋白结构域NC-2相对较小，～30kDa，并且其含有与Kunitz蛋白酶抑制剂分子具有同源性的区段。

人VII型胶原蛋白基因COL7A1具有总共118个分开的外显子的复杂结构。然而，该基因相对紧凑，大部分内含子相对较小；因此，整个人COL7A1基因的大小仅为～32kb，编码～8.9kb的信使RNA。COL7A1已被映射到人第3号染色体的短臂区3p21.1。VII型胶原蛋白基因结构和编码的蛋白质的一级序列是很保守的，例如，该小鼠基因在核苷酸上显示84.7％的同源性，在蛋白质水平上显示90.4％的同一性。

VII型胶原蛋白由培养中的表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞合成。合成完整的前-α1(VII)多肽后，三个多肽通过其羧基末端缔合成三聚体分子，所述三聚体分子在其胶原蛋白部分折叠成三螺旋形式。然后将三螺旋分子分泌到细胞外环境，在所述细胞外环境中两种类型的VII型胶原蛋白分子排列成反向平行二聚体，其中分子的两个末端上均存在氨基末端结构域。该二聚体装配伴随着蛋白水解去除两种VII型胶原蛋白分子的羧基末端的一部分以及通过分子间二硫键形成而稳定化。随后，这些反向平行二聚体中的大量二聚体横向聚集形成锚定原纤维。

在显性营养不良型大疱性表皮松解症(DDEB)中，COL7A1的三螺旋结构域(尤其是外显子73、74和75)中的甘氨酸取代突变占优势。突变p.Gly2034Arg和p.Gly2043Arg是最常见的引起DDEB的突变，占最大美国队列中报道的显性突变的50％。在该区域外的甘氨酸取代以及其它氨基酸取代和剪接点突变也可见于显性DEB中。

对于所有形式的DEB，已经描述了超过400个跨越整个基因的引起隐性DEB的突变。然而，每个突变不超过突变总数的1％-2％。无效突变在RDEB中占优势，尽管已经描述了甘氨酸取代和其它氨基酸取代。更温和的RDEB形式通常是由剪接点突变或其它错义突变引起的。

“天然序列”多肽是与天然来源的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列多肽可以根据本文所述的方法通过重组手段产生。因此，天然序列多肽可具有例如天然存在的人多肽、鼠多肽或来自任何其它哺乳动物物种的多肽等的氨基酸序列。术语“天然序列胶原蛋白VII”包括具有或不具有起始N末端甲硫氨酸(Met)的天然蛋白质。

“变体”多肽意指如下定义的生物活性多肽，其与天然序列多肽具有小于100％的序列同一性。此类变体包括其中一个或多个氨基酸残基被添加在天然序列的N端或C端或其内部；约1至40个氨基酸残基被缺失，和任选地被一个或多个氨基酸残基取代的多肽；以及上述多肽的衍生物，其中氨基酸残基已被共价修饰，使得所得产物具有非天然存在的氨基酸。通常，生物活性胶原蛋白VII变体将具有与天然序列胶原蛋白VII多肽有至少约90％，优选至少约95％，更优选至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

天然序列胶原蛋白VII多肽的“功能性衍生物”是具有与天然序列VII型胶原蛋白多肽共同的定性生物学特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列胶原蛋白VII多肽的衍生物及其片段，条件是它们具有与相应的天然序列胶原蛋白VII多肽共同的生物学活性。术语“衍生物”涵盖胶原蛋白VII多肽的氨基酸序列变体及其共价修饰。

术语“创面床”是指伤口的最上面的有活力的层。在一个实施方案中，创面床由蜕落物或焦痂覆盖。在另一个实施方案中，可评估创面床中肉芽组织纤维蛋白脱落物、焦痂、骨、肌腱和/或其它下层结构的存在。

术语“病毒转导效率(VTE)测试”是测量病毒转导的细胞数量对经受转导的总细胞数量的比率的测试。在一个实施方案中，通过用靶向转导病毒上表达的蛋白质的抗体进行免疫荧光染色来测量VTE。在另一个实施方案中，通过实时PCR或定量PCR测量VTE。

术语“前病毒基因组拷贝数”或“PGCN”是指病毒转导的细胞中前病毒DNA拷贝的数量。因此，PGCN测试测量病毒转导或感染后细胞中前病毒DNA的拷贝数。在一个实施方案中，拷贝数通过实时PCR或定量PCR测量。在另一个实施方案中，PGCN通过DNA印迹或高通量方法测量。在一些实施方案中，PGCN小于3、2、1、0.5。在一些实施方案中，PGCN大于3、10、100或1,000。

术语“无菌测试”是指试图揭示样品中存在或不存在活的污染微生物的测试，并且经常用于消除假阳性结果。在一个实施方案中，假阳性结果因来自环境的污染或错误而生成。

术语“内毒素”是指与某些革兰阴性细菌的外膜缔合的毒素，所述革兰阴性细菌包括但不限于布鲁氏菌属(Brucella)、奈瑟球菌属(Neisseria)和弧菌属(Vibrio)物种。在一个实施方案中，内毒素不分泌，但仅在细胞被破坏时释放。内毒素可以通过凝胶-凝块法、显色法、比浊法或其组合来测量或测试。

术语“支原体(mycoplasma)”是指在其细胞膜周围缺乏细胞壁，使得细菌不太受或不受某些类型的抗生素影响的细菌群体。支原体测试包括但不限于琼脂-和肉汤法、DNA检测、酶和ELISA方法以及PCR。

术语“革兰氏染色无菌测试”是指用于检测样品中的细菌和/或真菌的方法。在一个实施方案中，革兰氏染色无菌测试可显示样品中细菌或真菌的存在或不存在，和/或其一般类型。

术语“活力测试”是指确定器官、细胞或组织维持或恢复活力的能力的测试，所述活力包括但不限于器官、细胞或组织的机械活动、运动、收缩、有丝分裂活性。在一个实施方案中，LZRSE-COL7A1工程化的自体表皮片层(LEAES)活力测试是测试LEAES上的细胞或组织维持或恢复存活力的能力。

在本公开中，术语“有复制能力的逆转录病毒(RCR)”是指即使逆转录病毒载体被设计为复制缺陷型也能够复制的逆转录病毒。在一个实施方案中，RCR通过生产细胞中转移载体、包装组分与内源性逆转录病毒元件之间的同源或非同源重组在生产过程中生成。RCR测试是检测样品中的RCR。

术语“细胞毒性T细胞测定”是指用于评估细胞介导的免疫功能的测定。

术语“释放后测试”在本公开中指的是表皮片层从板上释放之后的一个或多个测试，包括，但不限于，无菌测试、RCR测试、支原体测试、活力测试和革兰氏染色无菌测试。

术语“遗传修饰”是指改变生物体的基因或将来自一个生物体的基因插入另一生物体的过程。在一个实施方案中，遗传修饰包括插入、缺失和/或突变，基本由其组成，或由其组成。术语“插入”是指将一个或多个核苷酸碱基对添加到核苷酸序列中。术语“缺失”是指被去除或丢失的染色体或核苷酸序列的一部分。术语“突变”是核苷酸序列(例如，DNA序列)的改变。突变可以以各种大小发生，包括但不限于单个碱基对(即，点突变)、数个碱基对，或直至大的染色体区段。

术语“保守性遗传修饰”是指保持由经遗传修饰的基因编码的多肽的相同或相似生物化学性质的遗传修饰。例如，天冬氨酸和谷氨酸都是小的带负电荷的残基。在一些实施方案中，它是通过将多肽中的天冬氨酸突变为谷氨酸进行的保守性遗传修饰。

脯氨酰4-羟化酶(P4HA；EC 1.14.11.2)在胶原蛋白合成中发挥重要作用。它通过羟基化肽键联中的脯氨酸残基来催化胶原蛋白中4-羟基脯氨酸的形成。4-羟脯氨酸残基对于将新合成的前胶原蛋白多肽链折叠成三螺旋分子是必需的。活性酶是2个α和2个β亚基的四聚体，分子量约为240,000。β亚基(P4HB)与酶二硫键异构酶(EC 5.3.4.1)和主要的细胞甲状腺结合蛋白相同。α亚基贡献了该酶的催化部位的主要部分。该多肽是517个氨基酸残基和17个氨基酸的信号肽。

P4HA基因涵盖超过69千碱基，由16个外显子组成。先前已经提出了该基因的RNA转录物的互斥选择性剪接的证据。目前的数据表明，mRNA中发现的互斥序列由2个连续的同源71-bp外显子9和10编码。这些外显子在它们的前5个碱基对中是相同的，并且它们之间的总体同一性是61％(在核苷酸水平上)和58％(在编码的氨基酸水平上)。发现两种类型的mRNA都在所有研究的组织中表达，但在一些组织中，编码外显子9或外显子10序列的类型比其它类型更丰富。

“核酸构建体”是指经构建来包含在自然界中不一起存在的一个或多个功能单元的核酸序列。实例包括环状、线性、双链、染色体外DNA分子(质粒)、粘粒(含有来自λ噬菌体的COS序列的质粒)、包含非天然核酸序列的病毒基因组等。

在本发明的方法中，胶原蛋白VII通过向细胞群中引入整合的(通常是)病毒表达构建体而产生。编码胶原蛋白VII多肽的DNA可获自从各种来源制备的任何cDNA文库(从表达胶原蛋白VII多肽mRNA的组织制备的)。编码胶原蛋白VII多肽的基因也可获自基因组文库或通过寡核苷酸合成获得。分离编码基因的替代方法是使用PCR方法。

将编码胶原蛋白VII多肽的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入用于表达的构建体中，将其可操作地连接至表达所需的元件。许多此类构造是可用的。组件通常包括但不限于以下的一种或多种：编码序列、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

“载体”能够将核酸序列转移至靶细胞。例如，载体可包含能够在靶细胞中表达的编码序列。为了本发明的目的，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”通常指能够指导目标基因表达并且可用于将目标基因转移至靶细胞中的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆性和表达载体，以及整合载体。

“表达盒”包含能够指导任何RNA转录物(包括目标基因/编码序列)以及非翻译RNA(诸如shRNA、微RNA、siRNA、反义RNA等)的表达的任何核酸构建体。此类盒可被构建成“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”，以便将表达盒转移到靶细胞中。因此，该术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。

当置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果信号序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位置被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并处于阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行连接来完成。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

表达载体将含有被自体白细胞或用于mRNA表达的宿主细胞识别，并且可操作地连接至胶原蛋白VII编码序列的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')(通常在约100bp到1000bp内)的非翻译序列，其控制它们可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。此类启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件中的一些变化(例如，营养物的存在或不存在或温度的变化)而启动升高水平的从其控制下的DNA的转录的启动子。许多被多种替在的宿主细胞识别的启动子是公知的。异源启动子是优选的，因为它们通常允许更高的转录和更高的产量。

哺乳动物宿主细胞中从载体的转录可以例如受启动子控制，所述启动子获自病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40))的基因组，获自异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子，获自热激启动子，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为也含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子可方便地作为HindIII E限制性片段获得。

高等真核生物的转录常常通过将增强子序列插入载体而增加。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10bp到300bp，其作用于启动子以增加其转录。增强子的取向和位置是相对独立的，已被发现位于转录单位的5'和3'、内含子内以及编码序列本身内。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点晚期侧上的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。可将增强子在编码序列的5'或3'位置剪接至表达载体中，但优选位于启动子5'的位点。

在真核宿主细胞中使用的表达载体也将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔地3'非翻译区获得。这些区域含有转录为mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。

用于将表达盒整合入细胞的载体和系统是本领域已知的，并且可包括但不限于逆转录病毒载体。可用于将外源基因转移至靶哺乳动物细胞中的许多载体是可用的。已显示基于逆转录病毒的载体特别有用。可以使用逆转录病毒和合适的包装系的组合，其中衣壳蛋白可用于感染靶细胞。通常，将细胞和病毒在培养基中孵育至少约24小时。然后在一些应用中使细胞在培养基中短时间生长，例如24-73小时或至少两周内，并且可使其生长5周或更长时间，然后进行分析。常用的逆转录病毒载体是“有缺陷的”，即不能产生生产性感染所需的病毒蛋白。载体的复制需要在包装细胞系中的生长。

逆转录病毒的宿主细胞特异性由包膜蛋白env(p120)决定。包膜蛋白由包装细胞系提供。包膜蛋白至少有三种类型：嗜亲性、兼嗜性和异嗜性。携带兼嗜性包膜蛋白例如4070A(Danos等，同上)的逆转录病毒能够感染大多数哺乳动物细胞类型，包括人、狗和小鼠。兼嗜性包装细胞系包括PA12(Miller等，(1985)Mol.Cell.Biol.5:431B437)；PA317(Miller等(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895B2902)；GRIP(Danos等(1988)PNAS 85:6460B6464)。用异嗜性包膜蛋白例如AKR env包装的逆转录病毒能够感染除鼠细胞外的大多数哺乳动物细胞类型。逆转录病毒5'和3'末端的序列是长末端重复序列(LTR)。许多LTR序列在本领域中是已知的并且可以使用，包括MMLV-LTR、HIV-LTR、AKR-LTR、FIV-LTR、ALV-LTR等。5'LTR充当强启动子，在整合至靶细胞基因组中后驱动引入的基因转录。

角质形成细胞。可从皮肤穿刺活检物中收集、分离新收集的原代角质形成细胞，并在培养一段时间后进行转导以从真皮细胞中分离角质形成细胞。体外扩增的上皮角质形成细胞可以形成片层。在一些实施方案中，可从细胞被转导的时间开始在约1至100天内、1至50天内、1至20天内、1至10天内、1至5天内、1至3天内、1至2天内或1天内向患者施用转导的细胞。

正如本领域技术人员已知的，可在本发明的方法中使用多种培养基中的任何一种(参见例如，John Wiley&Sons,Inc.的Current Protocols in Cell Culture,2000-2009)。说明性的培养基还包括但不限于角质形成细胞培养基，其可以是无血清的，并且可以含有适当的角质形成细胞补充剂。

本公开提供了用于治疗受试者中的大疱性表皮松解症(EB)的方法，所述方法包括以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者更进一步由以下步骤组成：获得受试者的皮肤细胞群；通过整合编码功能性(例如，全长野生型)人胶原蛋白VII(COL7A1)蛋白质的基因构建体离体地矫正皮肤细胞群；培养经遗传学矫正的细胞以形成角质形成细胞片层；以及将角质形成细胞片层的移植物移植到皮肤创面床上。本公开还涉及皮肤细胞群用于治疗受试者中的大疱性表皮松解症(EB)的用途，其中通过利用包含编码全长野生型人胶原蛋白VII(COL7A1)蛋白质的基因构建体的病毒转导以获得具有前病毒基因组拷贝数(PGCN)的转导的皮肤细胞群来矫正所述皮肤细胞群，并且其中转导的皮肤细胞群的PGCN不超过3。在一些实施方案中，将经遗传矫正的细胞在DFF31培养基中进行培养，所述培养基包含达尔伯克氏改良伊格尔培养基和F12培养基，或者基本上由其组成或者更进一步由其组成。在一个实施方案中，皮肤细胞通过利用病毒的转导来矫正，所述病毒包含表达构建体，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成，其中所述病毒包括逆转录病毒、AAV(腺伴随病毒)或慢病毒，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在另一个实施方案中，逆转录病毒是LZRSE-病毒。在一个实施方案中，逆转录病毒被GalV-假型化。在另外的实施方案中，如此转导的角质形成细胞符合病毒转导效率(VTE)>50％且前病毒基因组拷贝数(PGCN)≤3的预释放标准。在一些实施方案中，PGCN小于2.5、2、1.5或1。在另一个实施方案中，PGCN为3-20、20-40、40-60、60-80或80-100。在另一个实施方案中，PGCN大于100。在一些实施方案中，角质形成细胞片层的尺寸不同。本领域普通技术人员可测定角质形成细胞片层的尺寸。

在一些实施方案中，使用如本文所述的CRISPR/Cas系统(或编码所述CRIPSR/Cas系统的载体)和在靶向裂解后被插入基因的“供体”序列(例如，功能性COL7A1 cDNA或C7基因或全长野生型COL7A1 cDNA或基因)替代内源性突变的、功能失调的或截短的C7基因。在40％的细菌和90％的古细菌中发现CRISPR/Cas系统，并且它们相异在于系统的复杂性。参见，例如，美国专利第8,697,359号，其通过引用整体并入本文。CRISPR基因座(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是生物体基因组内的区域，其中外来DNA的短区段整合在短重复回文序列之间。这些基因座被转录并且RNA转录物(“前-crRNA”)被加工成短的CRISPR RNA(crRNA)。存在三种类型的CRISPR/Cas系统，其均并入这些RNA和被称为“Cas”蛋白的蛋白质(CRISPR相关的)。I型和III型均具有加工pre-crRNA的Cas内切核酸酶，所述pre-crRNA当被完全加工成crRNA时，装配能够切割与crRNA互补的核酸的多Cas蛋白复合物。CRISPR/Cas系统结合于基因组中的内源基因(例如，内源或安全港基因，或调控基因或其DNA靶标)中的目标区域中的靶位点，其中所述CRISPR/Cas系统包含识别靶基因和功能结构域(例如，转录调控结构域和/或核酸酶结构域)的一种或多种经工程化的单一引导RNA。在一些实施方案中，如本文所述的CRISPR/Cas系统可结合于和/或切割基因内或其附近的编码或非编码区域中的目标区域(例如，来自EB组织的内源性C7基因)(诸如，例如前导序列、尾随序列或内含子)，或处于编码区的上游或下游的非转录区内的目标区域。在某些实施方案中，CRISPR/Cas结合于和/或切割基因，例如突变的、功能失调的或截短的C7基因。

在一个方面，伤口没有未矫正的创面床角质形成细胞。在一个实施方案中，治疗伤口以消除未矫正的创面床角质形成细胞。在另一方面，受试者患有隐性营养不良型大疱性表皮松解症(RDEB)。在不同的方面，受试者是人。

在另一个实施方案中，使角质形成细胞片层经历选自由以下组成的组的一个或多个测试：VTE测试、PGCN测试、无菌测试、内毒素测试、支原体测试、革兰氏染色无菌测试、LEAES活力测试、释放后测试、RCR测试、细胞毒性T细胞测定、抗C7 LH24mAb表征、电子显微镜术、免疫电子显微镜术、免疫荧光染色、C7表达和AF分析。在一个方面，免疫荧光染色包括直接或间接免疫荧光染色，或者基本上由其组成或者更进一步由其组成。

在一些实施方案中，将角质形成细胞片层置于无细胞基质、胶原蛋白基质或生物相容性网片上。在一个实施方案中，生物相容性网片由热塑性树脂、聚乙烯、超高分子量聚乙烯、高分子量聚烯烃、未涂覆的单丝聚丙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、尼龙、硅或其任何组合制成。

在一些实施方案中，皮肤细胞包括角质形成细胞，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在一个实施方案中，皮肤细胞包括干细胞，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在另一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤，或者基本由所述步骤组成，或者更进一步由所述步骤组成：将干细胞分化成角质形成细胞。在一个方面，在转导之前、之后或转导期间将干细胞分化。在一些方面，在转导之前将干细胞分化(例如，分化成角质形成细胞或角膜上皮细胞)。在一些实施方案中，在转导之后将干细胞分化。在另外的实施方案中，在转导期间将干细胞分化。

RDEB患者可频繁地发展衰弱性疼痛角膜糜烂。因此，本公开还提供了用于治疗受试者的角膜糜烂的方法，所述方法包括以下步骤，或者基本上由所述步骤组成，或者更进一步由所述步骤组成：从受试者获得角膜细胞群；通过整合编码功能性(例如，全长野生型)人胶原蛋白VII(COL7A1)蛋白质的基因构建体来离体矫正角膜细胞；培养经遗传矫正的细胞以形成角膜细胞片层；以及将角膜细胞片层的移植物移植到角膜表面。在一些方面，角膜细胞包括角膜上皮细胞，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在另一个方面，角膜细胞包括干细胞，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤，或者基本上由所述步骤组成，或者更进一步由所述步骤组成：将干细胞分化成角膜上皮细胞。

在一些方面，角膜细胞通过利用包含基因构建体的病毒的转导来矫正，其中所述病毒包括逆转录病毒、慢病毒或AAV，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在一个实施方案中，逆转录病毒是LZRSE病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒被GalV-假型化。在一些实施方案中，如此转导的角膜细胞符合病毒转导效率(VTE)>50％且前病毒基因组拷贝数(PGCN)≤3的预释放标准。在一些实施方案中，PGCN小于2.5、2、1.5或1。在另一个实施方案中，PGCN为3-20、20-40、40-60、60-80或80-100。在另一个实施方案中，PGCN大于100。在一些方面，受试者患有隐性营养不良型大疱性表皮松解症(RDEB)。在不同的方面，受试者是人。

在一方面，将角膜细胞片层经历选自由以下组成的组的一个或多个测试：VTE测试、PGCN测试、无菌测试、内毒素测试、支原体测试、革兰氏染色无菌测试、LEAES活力测试、释放后测试、RCR测试、细胞毒性T细胞测定、抗C7 LH24 mAb表征、电子显微镜术、免疫电子显微镜术、免疫荧光染色、C7表达和AF分析。在一个实施方案中，免疫荧光染色包括直接或间接免疫荧光染色，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在一些实施方案中，将角膜细胞片层置于无细胞基质、胶原蛋白基质或生物相容性网片上。

在一个方面，生物相容性网片可由不可吸收材料制成，包括但不限于生物相容性金属，诸如钛合金、不锈钢、钴铬合金和镍钛合金。在另一方面，生物相容性网片的层可由不可吸收聚合物材料制成，包括但不限于热塑性树脂、聚乙烯、超高分子量聚乙烯、高分子量聚烯烃、未涂覆的单丝聚丙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、尼龙、含有一个或多个双键的任何聚合物或脂肪族烃、任何其它适当的多孔材料或可以弯曲或以其它方式形成形状的任何其它合适的多孔材料。

另一方面，生物相容性网片可由合成或生物可吸收聚合物材料组成，包括但不限于聚乙醇酸、聚-L-乳酸(PLLA)、聚-D,L-乳酸(PDLA)、三亚甲基碳酸酯(TMC)、聚-￡-己内酯，聚对二氧杂环己酮、丙交酯和乙交酯的共聚物(PLGA)、聚羟基-3-丁酸酯、胶原蛋白、透明质酸、丝、生物纤维素、其它基于蛋白质的聚合物、多糖、聚(DTE碳酸酯)、多芳基化合物、PLLA、PLDA或PLGA与TMC的混合物以及这些聚合物的其它组合。

在一个实施方案中，生物相容性网片由热塑性树脂、聚乙烯、超高分子量聚乙烯、高分子量聚烯烃、未涂覆的单丝聚丙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、尼龙、硅或其任何组合制成。

本公开还提供了组合物，所述组合物包含解质形成细胞片层，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成，其中所述角质形成细胞片层通过包括以下步骤，或者基本上由以下步骤组成，或者更进一步由以下步骤组成的方法制备：从受试者获得皮肤细胞群；通过整合编码功能性(例如，全长野生型)人胶原蛋白VII(COL7A1)蛋白质的基因构建体来离体矫正皮肤细胞；培养经遗传矫正的细胞以形成角质形成细胞片层。在一些实施方案中，皮肤细胞包括角形成细胞，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在一个实施方案中，皮肤细胞包括干细胞，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在另一个实施方案中，将干细胞分化成角质形成细胞。在一些实施方案中，在转导之前、之后或转导期间将干细胞分化。

还提供了药物组合物，所述药物组合物包含角质形成细胞片层，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成，所述角质形成细胞片层包含利用编码功能性COL7A1蛋白的基因构建体离体整合的皮肤细胞，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在一个方面，皮肤细胞获自受试者。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，皮肤细胞从利用编码功能性COL7A1蛋白的基因构建体离体整合的干细胞分化而来。在一个实施方案中，受试者患有RDEB。在一些实施方案中，利用包含基因构建体的病毒转导皮肤细胞或干细胞，其中病毒包括逆转录病毒、慢病毒或AAV。

在一个实施方案中，功能性COL7A1蛋白是全长野生型人COL7A1蛋白。在一个方面，功能性COL7A1蛋白包括来自全长野生型人COL7A1蛋白的遗传修饰，或者基本由其组成，或者更进一步由其组成。在另一方面，功能性COL7A1蛋白包括来自全长野生型人COL7A1蛋白的遗传修饰，或基本由其组成，或者更进一步由其组成，其中遗传修饰是保守的。在另外的方面，遗传修饰包括插入、缺失和/或突变，或者基本上由所述插入、缺失和/或突变组成，或者更进一步由所述插入、缺失和/或突变组成。

本公开中还提供了药物组合物，所述药物组合物包含角膜细胞片层，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成，所述角膜细胞包括利用编码功能性COL7A1蛋白的基因构建体离体整合的角膜细胞。在一些实施方案中，角膜细胞从利用编码功能性COL7A1蛋白的基因构建体离体整合的干细胞分化而来。在另一个实施方案中，角膜细胞获自受试者。在一个实施例中，受试者患有RDEB。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，利用包含基因构建体的病毒转导角膜细胞或干细胞，其中所述病毒包括逆转录病毒、慢病毒或AAV。在一个实施方案中，逆转录病毒是LZRSE病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒被GalV-假型化。在另外的实施方案中，转导的细胞符合病毒转导效率(VTE)>50％且前病毒基因组拷贝数(PGCN)≤3的预释放标准。

在一个方面，功能性COL7A1蛋白质是全长野生型人COL7A1蛋白。

在某些实施方案中，将细胞培养1-21天。在另外的实施方案中，将细胞培养7天、14天、21天或更长时间。因此，可将细胞在适当的条件下培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或更多天。将细胞被重新铺板，并且可以根据需要使用本领域已知的技术添加或改变培养基和补充剂。

在某些实施方案中，可将经遗传改变的角质形成细胞在一定条件下培养且培养足够的时间段，使得至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表达C7转基因。

在一个实施方案中，本公开的细胞组合物包含经遗传改变的自体角质形成细胞群，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成，以有效治疗EB的量表达天然人C7蛋白。将靶细胞群与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合，在用于移植至受试者的片层中生长。此类组合物可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。

以适合于EB治疗的方式施用本公开的细胞组合物。尽管可通过临床试验确定合适的剂量，但施用的量和频率将根据诸如患者状况和患者疾病的类型和严重程度等因素来决定。

可通过本领域技术人员公知的方法通常以皮肤移植物的形式向受试者施用所述细胞。从业医生将能够部分地基于疾病的类型和位置来确定用于特定受试者的合适施用途径。可将转染的细胞局部施用于伤口部位。

本发明考虑了用于向受试者施用的经工程化的细胞的药物制剂。本领域普通技术人员将熟悉向受试者施用细胞的技术。此外，本领域普通技术人员将熟悉在向受试者施用之前制备这些细胞片层所必需的技术和药物试剂。

在本发明的某些实施方案中，所述药物制剂是含水组合物，所述含水组合物包含已被修饰以过表达C7和任选的脯氨酰-4-羟化酶的经工程化的细胞，或者基本上由其组成，或者更进一步由其组成。在某些实施方案中，使用已经从受试者获得的细胞(即自体细胞)制备转导的细胞。

本发明的药物组合物包含有效量的药学上可接受的载体或含水介质中的经转染的细胞的溶液。如本文中所用，“药物制剂”或“药物组合物”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除了任何常规介质或试剂与细胞不相容之外，还考虑了其在治疗性组合物中的用途。还可将补充活性成分掺入组合物中。对于人施用，制剂应满足FDA生物制剂中心所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。

本领域普通技术人员将熟悉用于通过任何其它途径生成用于应用的无菌溶液的技术。本领域技术人员将确定细胞移植物的尺寸和移植物上的细胞数量。在某些方面，可以在数天、数周、数月或数年的时间段内施用多个剂量。受试者可在同一区域或不同区域中接受例如1片、2片、3片、4片、5片、6片、7片、8片、9片、10片、11片、12片、13片、14片、15片、16片、17片、18片、19片或20片移植物。在一个实施方案中，可在同一区域或不同区域内对受试者进行重新移植。在另一个实施方案中，将受试者的生物样品(例如，角质形成细胞或角膜细胞)在适当的条件下储存。一旦存储了生物样品，如果受试者需要新的移植物，则不需要穿刺活检。存储的生物样品可提供足够或补充的信息来确定受试者所需的移植物。

当指示“有效量”或“治疗量”时，待施用的本公开的组合物的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重和病症的个体差异来确定。可概括地说明，可以以1-100个、1-10³个、1-10⁴个、1-10⁵个、1-10⁶个、1-10⁷个或多于10⁷个细胞(包括这些范围内的所有整数值)的量施用包含本文所述细胞的细胞组合物。还可以以这些剂量施用细胞组合物多次。可通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术(参见例如Rosenberg等，New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)来施用细胞。用于特定患者的最佳剂量和治疗方案可容易地由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗来确定。

在本公开的某些实施方案中，将使用本文所述的方法或本领域已知的其它方法遗传工程改造的角质形成细胞与任何数量的相关治疗方式结合(例如，在之前、同时或之后)施用于患者。

工作实施例

提供下列实施例为本领域普通技术人员提供如何产生和使用本发明的完整公开内容和说明，并且无意限制本发明者视为它们的发明的范围，它们也无意表示下面的实验是全部实验或所实施的唯一实验。已努力确保关于使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应当解释一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏度数表示，压力是大气压或接近大气压。

在本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，就如同特定地及个别地表明各个出版物或专利通过引用并入。

已经根据本发明人发现或提出的包括用于实施本发明的优选模式的特定实施例描述了本发明。本领域技术人员将认识到，根据本公开，在不脱离本发明的预期范围的情况下，可以在示例性特定实施方案中做出许多修改和改变。例如，由于密码子冗余性，可以在基础DNA序列中进行改变而不影响蛋白质序列。此外，由于生物功能等效性的考虑，可对蛋白质结构进行改变而不会在种类或数量方面影响生物作用。所有这些修改旨在被包括在所附权利要求的范围内。

实施例1

作为用于隐性营养不良型大疱性表皮松解症(RDEB)的治疗的自体细胞的细胞重编程。

隐性营养不良型大疱性表皮松解症(RDEB)是由COL7A1(编码VII型胶原蛋白(C7)的基因)的功能丧失突变引起的严重起疱皮肤病。C7是锚定原纤维(AF)的主要成分，其稳定表皮基底膜区(BMZ)至真皮。C7通过使用多个结构域执行此功能，所述结构域包括结合BMZ配体的氨基末端非胶原蛋白NC1结构域、装配成三螺旋的中央胶原蛋白结构域和催化C7装配成AF的NC2结构域。RDEB中这些功能性C7结构域的丧失导致严重的BMZ分离。这会产生广泛而痛苦的起疱、糜烂和结瘢，进而导致在第二和第三个十年中出现的SCC的侵袭性和通常致命的形式。尽管在这种疾病的分子诊断方面取得了进展，但目前的疗法仅限于姑息疗法。同种异体成纤维细胞的临床试验(Venugopal等，J.Am.Acad.Dermatol.2013；69(6):898–908)、骨髓移植(Wagner等，N.Engl.J.Med.2010；363(7):629–639)、骨髓来源的间充质基质细胞的真皮内和静脉内递送(Conget等，Cytotherapy 2010；12(3):429-431；Petrof等，JInvestig.Dermatol.2015；135(9):2319-2321；Gorell等，Pediatr.Dermatol.2015；32(2):220–225)和皮肤替代物(Falabella等，Arch Dermatol.2000；136(10):1225–342)已经以不同等级的效率和安全性进行。临床前研究已经探索了潜在的治疗方式，包括静脉和局部C7、诱导多能干细胞和氨基糖苷类。

基因疗法是治疗单基因疾病(诸如RDEB)的潜在强大工具。然而，在严重的联合免疫缺陷和Wiskott-Aldrich综合征患者的基因转移后出现严重的安全问题。尽管插入诱变仍然是一个潜在的问题，但皮肤基因疗法的有利方面是由于移植的组织的表面放置而更容易地临床评估肿瘤的能力。此外，经遗传修饰的皮肤移植物已被成功地用于治疗一位交界型EB患者，长期矫正并且无不良副作用。建立用于在再生的人表皮中长期表达C7的平台以移植到免疫缺陷型小鼠上(Siprashvili等，Hum.Gene Ther.,2010,21(10):1299–1310)。本公开现在提供移植到具有严重RDEB的受试者上的LZRSE-COL7A1工程化自体表皮片层(LEAES)的离体基因转移的I期临床试验结果。

临床结果

受试者和治疗。在筛选的38名受试者中，8名同意进行研究，招募4名受试者并接受移植物(图2)。受试者携带各种复合杂合的COL7A1突变，导致表达截短的C7(NC1结构域)，其通过蛋白质印迹法在角质形成细胞培养基中检测到(图3)，但通过IIF在组织中未检测到(图1F、图5B、6B、7B、8B、12)。所有受试者均为男性，平均年龄为23岁(范围：18-32岁)，受影响的全身表面受累为4％-30％。每例都有严重的具有皮肤外表现的疾病，包括贫血史、食管狭窄和假性并指畸形(表1)。

从未受损皮肤分离原代RDEB角质形成细胞，并用LZRSE-COL7A1逆转录病毒载体转导，平均效率为70％且每细胞的前病毒基因组拷贝数为0.8(图1B-D)。对每位患者移植5个瘢痕性和/或糜烂性伤口和1个诱导伤口。大部分移植的慢性伤口已经存在了>5年(表3)。连续监测所有24个移植物的百分比伤口愈合、感染、疼痛和瘙痒。

功效。所有受试者均报道了改善的伤口愈合和皮肤强度以及移植部位的疼痛和瘙痒减轻。与基线相比，移植物显示减少的起疱；显示了来自每个受试者的代表性照片(图1E、图5A、6A、7A、8A、12)。相反，未治疗的伤口显示持续的水疱形成(图10)。

在移植后1个月，20/24的伤口(83％)显示≥75％的愈合，而仅有4个伤口显示50％-74％的愈合(表3)。在3个月时，21/24(87％)的伤口愈合≥75％，而3/24(13％)愈合50％-74％(表3)。在6个月时，16/24(67％)愈合≥75％，5/24(21％)愈合50％-75％，仅有3/24(13％)的移植部位出现水疱并被认为是移植失败(愈合0％-49％)。

LEAES移植物的分子分析揭示了在3个月时C7在9/10(90％)的样品中强烈表达，以及在6个月时在8/12(66％)的样品中强烈表达。LEAES的IIF分析显示C7在表皮-真皮交界处的适当定位(图1F、图5B、6B、7B、8B、12)，与未矫正的皮肤对照相反。LEAES移植物显示完全分化的表皮，其具有对表皮标志物角蛋白14、角蛋白1和类似正常皮肤的兜甲蛋白呈阳性的棘层及颗粒层(图1F、图5B、6B、7B、8B、12)。在阴性样品当中，在从6个月时的受试者2获得的分析活检物中检测不到C7；然而，锚定原纤维(AF)存在于并行的活检物中。在6个月时，使用对NC1结构域有特异性的抗体在受试者4中鉴定出C7(图1F)。

为了评估矫正样品中的BMZ的分子结构，还通过透射电子显微镜术(方法)分析了从LEAES移植物获得的活检物。在3个月时，5/7的样品(71％)显示形态正常的外观和NC2反应性AF的频率(图1G)。在6个月时，在4/12(33％)的活检物中检测到AF，在从受试者4获得的活检物中未检测到AF(图1G)。

安全性。没有报告严重的不良事件。移植部位瘙痒(n＝3)，随后移植部位引流增加(n＝2)是最常见的不良事件(1级或2级)，未发现恶性肿瘤的临床体征。RCR和细胞毒性T细胞测定在所有时间点均为阴性(表2)。

在2/24伤口中观察到增加的伤口引流，但在所述部位未见感染体征，包括红斑、水肿、疼痛或压痛的不存在。在6个月时，受试者3的部位Z具有伤口定植(2级)并被认为是移植失败(表3)。在3/24移植部位和2个移植物周围区域注意到瘙痒(1级)。

在整个研究过程中密切监测C7免疫响应。受试者均没有全身性自身免疫症状或增加的移植区域外部起疱。在受试者1中，通过IIF或DIF没有观察到循环抗体或组织结合的抗体(表2)。受试者2在3个月时在2个伤口(A和E)的DIF分析中显示1+(轻度)线性IgG、IgM、IgA而没有补体。在移植后6个月未观察到这些免疫反应物。受试者3在第3个月在IIF时显示出线性血清IgA(1:320)的短暂升高，仅在第6个月在DIF时显示痕量至1+的IgM和IgA的线性组织染色。相反地，受试者4在第1和3个月在IIF时显示1:160滴度的循环线性IgG抗体以及在第3个月通过DIF在3个移植物中检测到的1至2+的IgG、IgA、C3和IgM染色(表2)。然而，未观察到全身性自身免疫症状或增加的移植物外部起泡，并且C7特异性细胞毒性T细胞测定结果为阴性。在第6个月时，血清抗体IgG和C3水平降低(1:40)，在移植物中未检测到组织结合的免疫复合物(表2)。在于受试者4中发现表皮下线性免疫沉积物后，我们使用纯化的C7蛋白的蛋白质印迹分析重新评估受试者4的基线血浆抗-C7抗体水平。与阴性基线IIF数据相比，蛋白质印迹分析显示基线(1:300)和移植血清后3个月(1:1000)均对纯化的C7具有反应性，表明受体4在移植物放置前对外源性C7敏感(图11A)。在移植物放置之前和之后，在先前表征的羧基末端C7胃蛋白酶片段内确认了受试者4的血清抗体反应性，(图11B)。

讨论。RDEB的遗传矫正施加了实质性挑战，因为它需要高效递送大的转基因(包括>9kb的COL7A1 cDNA)。在此，本公开提供了在具有RDEB的受试者4中具有令人鼓舞的功效和可接受的安全性的经遗传矫正的自体表皮角质形成细胞移植的人体内研究。经遗传矫正的表皮细胞在超过67％的在移植后6个月测试的移植部位中再生了功能性自我更新的表皮，其中对于一个受试者在长达一年中可检测到C7(图12)。与同种异体角质形成细胞移植物相比，这是显著的改善，其中仅有2/9(22％)的慢性伤口在18周时愈合。与同种异体成纤维细胞注射相比，LEAES移植物也产生了更好的伤口愈合结果，所述同种异体成纤维细胞注射与安慰剂或BM-MSC的真皮内或静脉内注射相比，在伤口愈合方面表现出一些初步改善，但没有长期差异。使用类似方法治疗交界型大疱性表皮松解症的基因疗法的病例报告显示长达6年的矫正，为长期治疗效果提供优越性。我们在LEAES移植物中看到的持续6个月的C7表达跨越6个表皮周转周期的持续时间，这意味着我们已经用我们的基因转移技术成功地靶向干细胞。

在我们的研究中，改善的伤口愈合和增加的皮肤耐久性与BMZ处可检测的全长C7产生和AF形成直接相关。尽管在移植之前不存在，但两者均存在于每个研究时间点，虽然以可变效率(对于C7表达为66-90％，以及对于AF形成为33-71％)检测到。活检取样变化性可归因于矫正的表皮细胞的异质群体或部分移植物摄取。在一些实施方案中，移植物区域可以是其中受试者感觉对其生活质量有益的区域。然而，在移植物放置的关键的最初几天中，一些区域难以固定或防止机械摩擦(例如，受试者2的腰部部位E，左肩部位B，表3，后肩部部位D，图6A)。此外，如所观察到的移植后较短的固定时间可负面影响移植物摄取，如对于受试者2在6个月时总体下降的伤口愈合和在取样的活检物中通过IF检测不到C7所指示的，因为受试者相较于另外的研究参与者具有最短的移植后固定(表1)。此外，虽然诱导伤口显示出良好的愈合能力，但他们表现出最少的C7表达。有可能的是，如果没有诸如电灼的破坏性方法，残留的非矫正创面床角质形成细胞可能已经中断了覆盖性LEAES移植物的建立。这些发现表明更高效地消除创面床角质形成细胞的改进的创面床制备技术可改善移植物摄取。

关于安全性，报道了很少的不良事件，并且看到的那些都是轻度的。受试者在任何时间点在血液或移植物中的鳞状细胞癌均未显示RCR的证据，然而对潜在不良事件的长期监测正在进行中。包括基因转移在内的所有分子置换方法均对治疗性产品造成不想要的免疫响应风险，特别是在具有无效突变的受试者中。在这项研究中，所有受试者均表达了含有NC1结构域的截短的C7分子，该分子被认为是蛋白质的抗原性部分，因此使潜在的免疫反应的风险降至最低。在研究期间，在所有受试者中在任何时间点没有看到与C7相关的细胞毒性T细胞活性的证据。然而，受试者4中的IIF和DIF研究在1个月和3个月时显示BMZ反应性IgG，在3个月时显示补体C3固定，在移植后6个月时血清IgG滴度较低(表2)。尽管NC1结构域已被报道为C7的抗原性最强的部分，但羧基末端NC2结构域也包含次要抗原表位，并且RDEB患者中存在抗C7自身抗体在之前的工作中已有广泛报道。受试者4在移植前具有可使用免疫印迹分析检测到的抗C7抗体(其在使用CLIA认证的IIF测定的筛选过程中未被鉴定)的发现，表明应当开发更灵敏的标准化方法来在将来的治疗性研究中评估基线免疫交叉反应性。

总之，经遗传矫正的自体表皮皮肤移植物在具有严重RDEB的患者(具有很少的其它特定治疗选择的患者群体)中表现出增加的C7沉积和减少的起疱。计划包括更年轻的RDEB受试者的更大规模的研究来估此方法的长期有效性和安全性。

表1.移植的RDEB基因疗法受试者的基线特征

¹BSA表示估计的受伤体表面积，SCC表示鳞状细胞癌，IF表示皮肤活检物的免疫荧光，EM表示皮肤活检物的电子显微镜观察，AF表示锚定原纤维，LD表示致密层，C7表示VII型胶原蛋白

²通过LH7.2(对于NC1)和LH24(对于NC2)评估的

³使用FNC1抗体评估皮肤活检样品

⁴通过猴食管上的血清间接免疫荧光测定的

⁵基线时在蛋白质印迹中看到的循环自身抗体；根据移植后免疫响应的证据检查的

表2.基因疗法移植物和全身性安全性的终点

¹通过猴食管上的血清样品的间接免疫荧光，定位于基底膜区的自身抗体

²血液中的具有RCR复制能力的逆转录病毒

³移植部位上的鳞状细胞癌或其它肿瘤的临床证据

⁴通过对皮肤活检物进行直接免疫荧光，定位于基底膜区的自身抗体

⁵ND表示未完成

表3.移植部位基线特征、临床响应和皮肤活检随访结果¹

¹基于研究者的临床和照片评估，灰色表示移植物≥75％的愈合，Lt水平表示50-74％的愈合，黑色表示<49％的愈合

²±3周

方法

研究设计。这是I期公开标记临床试验(NCT01263379)。主要研究目标是获得用含有全长COL7A1编码序列的逆转录病毒载体转导的经遗传工程化的自体角质形成细胞移植的RDEB受试者的安全性和效率数据(图1A)。在2013年10月与2015年2月期间，4名成年RDEB受试者移植了LEAES。收集所有受试者的数据，并进行至少6个月的随访。该研究已经由食品和药物管理局(IND#13708)和斯坦福IRB(方案#14563)批准。

受试者。受试者年龄在18岁或更大年龄，并且临床诊断为RDEB，具有适合于LEAES移植的100cm2至200cm²的开放性糜烂区域。受试者也能够进行全身麻醉并基于其中通过基因测试(GeneDx,Gaithersburg,MD)确认RDEB的筛选方案进行选择。通过培养的角质形成细胞(KC)上清液的蛋白质印迹和皮肤活检样品的间接免疫荧光显微镜检查(IIF)评估C7的NC1结构域的存在。使用对C7的羧基末端NC2结构域有特异性的LH24抗体，通过IIF和免疫-电子显微镜术(IEM)证实了活检样品中不存在全长C7和成熟AF(图9)。通过对灵长类动物食管使用血清的IIF和受试者活检切片的直接免疫荧光(DIF)分别分析循环和组织结合的IgG、IgA、IgM和C3。排除具有显著的非RDEB医学并发症(包括HIV、肝炎、全身感染或心脏异常)的受试者。移植前治疗临床上显著的贫血。

研究性治疗。从未受伤的无瘢痕的皮肤区域获得两个8mm的穿刺活检物用于LEAES制备。获得基线血液样品以用于CBC、完整代谢组(CMP)以及有复制能力的逆转录病毒(RCR)和C7敏感性细胞毒性T细胞测定。将皮肤活检物来源的自体角质形成细胞用LZRSE-COL7A1转导并用于产生8个LEAES移植物(图4)。将6个移植物应用于缺乏SCC临床证据的未感染的糜烂性和/或瘢痕性伤口部位。在6个移植的伤口部位(A、B、C、D、E、Z，表3)中，在手术时通过机械摩擦(“部位Z”)在每个受试者中创建一个伤口。在全身麻醉下，对创面床进行烧灼处理，以尽可能地减少保留的表皮干细胞的机会。在创面床制备后通过可溶缝线将LEAES移植物固定至创面床。受试者3和4同意在每个移植物的角落放置小的印度墨水纹身以帮助进行后续移植物鉴定。移植物用标准伤口敷料和局部莫匹罗星覆盖，移植后5-7天除去所述伤口敷料和莫匹罗星。

终点和评估。在移植后1、3、6和12个月随访受试者。在每次研究访问中，通过IIF(用于C7敏感性细胞毒性T细胞测定)、CBC和CMP评估血清样品的循环自身抗体。在3和6个月时评估血清中RCR的存在。在每次访问时，对代表性移植物进行活检以评估组织结合的免疫球蛋白和补体(通过DIF)、C7表达(通过IIF)和锚定原纤维的存在(通过IEM)。使用数字照相术和/或Canfield Vectra相机临床评估伤口并将其评级为：与基线相比，100％-75％愈合(定义为显著的伤口愈合)、74％-50％愈合、49％-25％愈合，少于25％愈合。

材料和试剂

根据制造商提供的分析认证，在LEAES生产过程中使用的所有材料和试剂都没有外来病毒。通过针对外来病毒的商业9CFR血细胞吸附试验(American BioResearch,Pullman,WA)测试包括牛源试剂的每批组织培养基，发现其为阴性。

RDEB角质形成细胞的分离和扩增。将皮肤样品获取为两个8mm的穿刺活检物并转移到35mL的含有30μg/mL阿米卡星(HIkma Pharmaceuticals,London,United Kingdom)、20μg/mL万古霉素(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)和0.5μg/mL两性霉素B(USBiological,Salem,MA)的活检收集培养基50/50A(含人角质形成细胞生长补充剂(Life Technologies,Carlsbad,CA)的50％角质形成细胞培养基154和含有补充剂(Life Technologies,Carlsbad,CA)的50％确定的角质形成细胞无血清培养基)中。为了使表皮与真皮分离，将皮肤样品在5℃下置于含有25个酪蛋白分解单位/mL的分散酶(Life Technologies,Carlsbad,CA)的分散酶溶液中16-20小时。第二天，将表皮小心地从真皮上剥离下来并在37℃下置于TrypLE Select 10X(Life Technologies,Carlsbad,CA)溶液中20-30分钟。将溶液以1200rpm离心得到角质形成细胞团块。用磷酸盐缓冲盐水(PBS,Life Technologies,Carlsbad,CA)将细胞洗涤一次，并将角质形成细胞在50/50A培养基中铺板在PureCoatCollagen I Mimetic Cultureware(Corning Life Sciences,Tewksbury,MA)上。在角质形成细胞达到60-70％汇合后，将细胞用TrypLE Select 10X处理并铺板以用于病毒转导。需要至少4x10⁶个细胞来启动转导过程。

角质形成细胞矫正。由印第安纳大学载体生产实验室(Indiana UniversityVector Production Facility)利用如由Siprashvili等2010所述的现行良好生产规范生产含有在MLV LTR控制下的全长COL7A1 cDNA的cGMP级GalV-假型化LZRSE-COL7A1病毒。pLZRSE-COL7A1质粒的图谱描绘于图13中，其全序列示于SEQ ID NO:1中。对于各板通过覆盖12mL病毒上清液并以1250rpm和32℃离心1小时来进行病毒转导。离心后，通过用PBS洗涤除去病毒上清液，并将50/50V培养基用于矫正的角质形成细胞扩增。只要矫正的KC继续满足病毒转导效率(VTE)>50％且前病毒基因组拷贝数(PGCN)≤3的预释放标准，则根据需要重复转导。

预释放测试。VTE测试。使用IF技术，利用抗VII型胶原蛋白单克隆抗体NP32、NP185或抗VII型胶原蛋白多克隆抗体FNC1进行VTE测试。将细胞固定在甲醇/丙酮混合物溶液中，在去污剂中进行透化，并在室温下与抗C7一抗一起孵育1小时。充分洗涤后，加入缀合有Alexa Fluor 555染料的二抗并再孵育1小时。用Hoechst 33342标记细胞核10分钟，洗涤并用Prolong gold抗褪色剂(Life Technologies,Carlsbad,CA)进行封片。通过计算蓝色核与C7阳性细胞的比率来测定VTE。为达到预释放标准，至少有50％的细胞对C7表达呈阳性。

PGCN测试。通过对从逆转录病毒转导后矫正的RDEB KC分离的基因组DNA进行qPCR分析来进行PGCN测试。使用QiagenDNeasy Blood&Tissue试剂盒(Qiagen,Germany)从3x106个矫正的细胞中纯化基因组DNA。使用标准分光光度计测量技术定量DNA并将其用于qPCR分析。使用模板的阈值循环(Ct)和来自质粒DNA对照的量的Ct依赖性标准曲线测定前病毒剂量。平均PGCN由下式计算：PGCN＝(TPCN x6.16pg)/(Ctempl.x 103pg)，其中TPCN＝总前病毒拷贝数。6.16pg＝体细胞中基因组DNA的量。Ctempl.＝PCR中使用的模板量，以纳克计。为了符合预释放标准，对于每个角质形成细胞基因组平均不超过3个前病毒基因组拷贝数。

无菌测试。使用Millipore Steritest系统通过膜过滤测试培养物上清液样品的无菌性，所述Millipore Steritest系统经设计来消除来自存在于培养基(PacificBioLabs,Hercules,CA)中的抗生素的潜在假阴性。过滤并洗涤后，将样品置于大豆酪蛋白消化培养基(Soybean Case in Digest Medium)和巯基乙酸盐培养基中并孵育14天。每天观察样品的微生物污染的证据。

内毒素测试。根据制造商的推荐，通过鲎变形细胞溶解物(Limulus AmebocyteLysate)(LAL)QCL-1000测定(Lonza,Basel,Switzerland)评估培养上清液的样品。为了满足产物释放要求，该测试的结果<1.0EU/mL。

支原体测试。根据制造商的要求，使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)测试细胞培养物上清液的支原体。为了满足产物释放要求，该测试的结果<0.9。

LEAES起始和处理。一旦矫正的角质形成细胞达到100％汇合，就开始LEAES起始过程并将生长培养基从50/50V变换为表皮片层生产培养基DFF31，其由达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Life Technologies,Carlsbad,CA)和含有以下成分的F12培养基(Lonza,Basel,Switzerland)组成：10％胎牛血清(Lonza,Basel,Switzerland)、36ng/mL氢化可的松(Spectrum,New Brunswick,NJ)、25μg/mL腺嘌呤(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)、5μg/mL重组人胰岛素(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)、2ng/mL碘塞罗宁(Spectrum,New Brunswick,NJ)、5μg/mL牛转铁蛋白(Millipore,Billerica,MA)、10ng/mL重组表皮生长因子(R&DSystems,Minneapolis,MN)和30μg/mL阿米卡星(Hikma Pharmaceuticals,London,UnitedKingdom)以及20μg/mL万古霉素(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。

LEAES装配和运输。在移植当天开始LEAES装配。通过在37℃下用分散酶(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)酶促消化20-30分钟来从板表面释放表皮片层。为了去除残余量的培养基和分散酶，用50/50VC洗涤表皮片层至少5次。用外科止血夹将其固定至匹配尺寸的石油纱布上，并用用无菌黑色缝线标记基面。将装配的LEAES浸没在50/50VC运输介质中并用透气无菌膜密封。然后将LEAES表皮移植物运输至手术室进行移植。

释放测试。革兰氏染色无菌测试。在LEAES释放当天，将培养基的样品送到斯坦福医院临床实验室(Stanford Hospital Clinical Laboratory)进行快速革兰氏染色测试。将该测试的阴性结果用作LEAES批次释放标准。

LEAES活力测试。进行活力测试，其中将LEAES样品与含有Hoechst 33342和SYTOX绿色染剂的细胞核染料混合物一起孵育20分钟。计算SYTOX绿色染色与Hoechst 33342染色的比率，比率≥70％时释放产物。

释放后测试。将培养基和LEAES移植物的样品交付用于发送测试(send-outtesting)，预期由于测试过程持续时间长而在移植物移植后获得测试结果。如果这些“释放后”测试结果超出规范范围，则安全计划到位。释放后标准包括额外的无菌测试(参见预释放测试中的无菌测试)、RCR测试(印第安纳大学载体生产实验室)和支原体测试(BioniqueTesting Laboratories,Saranac Lake,NY)。

RCR测试。将LEAES和LEAES培养上清液的样品在印第安纳大学载体生产实验室，按照他们的推荐经历扩展的PG-4S+L-细胞空斑测定，测试结果“无RCR的证据”用作释放标准。在基线、3个月和6个月时，由印第安纳大学载体生产实验室使用定量聚合酶链式反应(Q-PCR)测定存在的GALV包膜(GALV-E)序列的水平来分析血液样品。通过针对人载脂蛋白B基因序列的第二探针和引物组评估血液样品量的充足性。使用每0.12μg基因组DNA含有105个、104个、103个、102个和10个拷贝的GALV-E序列的基因组12/22/15 8DNA的标准曲线作为阳性对照。阴性对照包括未转导的人基因组DNA和水。

细胞毒性T细胞测定。在基线、1个月、3个月和6个月时收集15mL全血用于细胞毒性T细胞测定。使用Ficoll-Paque(GE Healthcare)密度梯度离心从血沉棕黄层或全血中分离外周血单核细胞。然后在培养皿中孵育2小时后，回收贴壁单核细胞。使用MACS磁性细胞分选试剂盒(Miltenyi Biotech)，通过将非贴壁细胞与缀合于顺磁性微珠的抗CD4和抗CD8抗体一起孵育来将CD4+和CD8+T淋巴细胞一起纯化。用针对IFN-γ(BD Pharmingen)或IL-4(BD Pharmingen)的单克隆抗体涂覆96孔PVDF-滤板(Millipore)，使用含有5％人AB血清的RPMI培养基封闭所述板，然后用无血清RPMI洗涤板。在20UI/ml IL-2存在的情况下，在37℃下于加湿的5％CO²的空气培养箱中将CD4+和CD8+T淋巴细胞(2x10⁵个细胞/孔)和经γ-辐照的单核细胞(2.5x10⁴个细胞/孔)在板上共孵育40小时。培养基含有10μg/ml重组VII型胶原蛋白或3μg/ml伴刀豆球蛋白A(Sigma)以刺激淋巴细胞。洗涤板，通过将各孔与1μg/ml的生物素化的抗IFN-γ或抗IL-4单克隆抗体(BD Pharmingen)，然后与缀合有链霉抗生物素蛋白的碱性磷酸酶(Roche)的1:1000稀释物连续反应来原位检测单个细胞分泌的IFN-γ或IL-4。使用BCIP/NBT显色底物(Promega)进行检测。通过用水洗涤停止反应，并使用CTLELISPOT读数器计数斑点。在无抗原的情况下使用T细胞并行地运行阴性对照，并从未知抗原中减去相应的评分。

抗-C7 LH24 mAb表征。LH24 mAb先前被鉴定为与表皮基膜2反应。在我们的研究中，其在C7无效RDEB患者皮肤中的特异性不存在表明其识别C7上的表位。为了进一步定位C7分子上的LH24反应性，通过蛋白质印迹测试LH24对含有NC1和NC2结构域的C7的酶促消化物的反应性。如先前所述，用高度纯化的细菌胶原蛋白酶(Worthington)消化纯化的C7产生含有C7片段的NC1结构域。如先前所述，在胃蛋白酶消化纯化的C7后产生含有C7片段的3NC2 12/22/15 9。

电子显微镜术。通过在含有0.05％单宁酸的达尔伯克氏无血清培养基(SFM)中的1.5％戊二醛/1.5％多聚甲醛中浸泡最少1小时，随后在SFM中进行充分漂洗，然后在1％OsO4中后固定60分钟来制备用于电子显微镜术的3mm皮肤穿刺活检物。将样品在SFM中洗涤，然后在梯度系列乙醇中脱水至100％，在环氧丙烷中漂洗并且经2小时的总时间于Spurr环氧树脂中进行渗透，通过微波能加速。将样品在70℃聚合18小时。

免疫电子显微镜术。通过以下步骤制备用于免疫电子显微镜术的3mm皮肤穿刺活检样品：在SFM中充分漂洗，然后在4℃下浸入于SFM中以1:5稀释的对胶原蛋白VII的NC2区域有特异性的小鼠IgM LH24抗体中过夜，在SFM中充分漂洗，然后在4℃下在于SFM中以1:3稀释的山羊抗-小鼠IgM超小胶体金缀合物(Aurion)中孵育过夜。在SFM中进行充分漂洗后，将样品在冰上暴露于金增强溶液(Nanoprobes)15分钟，然后快速升温至25℃并再孵育5分钟。然后用冰冷的SFM漂洗样品，然后如上进行固定和包埋。间接免疫荧光(IIF)：将人血清铺于猴食管上并用针对人IgA、IgM、IgG和C3的抗体染色。在1:40和更高的抗体稀释度下检测到的信号被认为高于背景。

直接免疫荧光(DIF)。将12/22/15 10组织切成5微米，并用缀合有荧光团的针对人IgA、IgM、IgG、C3和纤维蛋白原的抗体染色。并行地运行正常对照。C7表达和AF分析：将3mm皮肤穿刺活检样品切成8微米，并使用抗VII型胶原蛋白多克隆抗体FNC1(针对C7的NC1结构域产生的)或单克隆抗体LH24(C7的NC2结构域)通过IIF进行分析。简言之，将切片在甲醇/丙酮混合物的溶液中固定，在去污剂中透化，并在室温(25℃)下与抗C7一抗一起孵育1小时。充分洗涤后，加入缀合于Alexa Fluor 555或488染料的二抗并孵育1小时。用Hoechst33342标记细胞核10分钟，洗涤并用Prolong gold抗褪色剂(Life Technologies,Carlsbad,CA)封片。从Covance(Emeryville，CA)获得针对表皮标志物角蛋白1、角蛋白14和兜甲蛋白的抗体。如果检测到在真皮-表皮交界处的VII型胶原蛋白的连续线性染色，则将活检物评分为对C7表达呈阳性。如果在具有AF的特征性质(包括密度、厚度、曲率、成拱度和成环性)的超结构中检测到代表NC2结构域特异性LH24抗体的金缀合物颗粒，则将活检物评分为对锚定原纤维(AF)呈阳性。

照相术。对于受试者2-4，使用Canfield Vectra 3D照相机从多个角度拍摄每个移植部位的～5幅图像。然后将这些图像拼接在一起以创建综合3D图像。使用Mirror软件(Canfield,Fairfield,NJ)，选择标志(landmark)并加以编号以标识每个图像上的相应位置，然后融合成单个图像。为了准确地追踪移植物边缘，将来自随访的融合图像与基线图像进行比较，从第0天开始覆盖移植物轮廓。再次标识解剖标志(例如，纹身点)以正确放置轮廓。用数码照相机(Canon Powershot)根据需要获得受试者2-4的另外照片和受试者1的所有图像。

等效物

应该理解，虽然已经结合上述实施方案描述了本公开，但前面的描述和实施例旨在说明而不是限制本公开的范围。本公开范围内的其它方面、有利方面和修改对于本公开所属领域的技术人员将是显而易见的。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提供的所有核苷酸序列以5'至3'方向呈现。

可适当地在本文中未具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制不存在的情况下实施本文中说明性描述的实施方案。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广义地理解并且没有限制。另外，本文中采用的术语和表达已被用作描述而不是限制的术语，并且不意图使用此类术语和表达来排除所显示和描述的特征的任何等效物或其部分，但是应承认在本公开的范围内各种修改是可能的。

因此，应该理解的是，尽管已通过具体实施方案和任选的特性明确地公开了本公开，但本领域技术人员可采用本文中公开的实施方案的修改、改进和变化，并且此类修改、改进和变化被认为是在本公开的范围内。此处提供的材料、方法和实施例是特定实施方案的代表，是示例性的，并且不旨在限制本公开的范围。

本文已经广泛地和一般性地描述了本公开的范围。落入类别公开中的更窄的种类和子类分组的每一个也构成本公开的一部分。这包括具有从类别中移除任何主题的附带条件或负面限制的一般性描述，而不管所摘取的材料是否在本文中被具体引述。

另外，在按照Markush组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将意识到，还按照Markush组的任何单独成员或成员的亚组来由此描述本公开的实施方案。

本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体明确地并入，其程度如同每个出版物、专利申请、专利和其它参考文献被单独地通过引用并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

序列表

<110> 小利兰·斯坦福大学托管委员会

退伍军人事务部代表的美国政府

Siprashvili, Zurab

Nguyen, Ngon T.

Marinkovich, M. Peter

Tang, Jean

Lane, Alfred T.

Khavari, Paul A.

<120> 使用经遗传矫正的自体角质形成细胞进行的隐性营养不良型大疱性表皮松解症的基因疗法

<130> STAN-1295WO

<150> 62/274,700

<151> 2016-01-04

<150> 62/414,533

<151> 2016-10-28

<160> 1

<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版

<210> 1

<211> 20326

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

cccgaaaagt gccaccagct ttgctcttag gagtttccta atacatccca aactcaaata 60

tataaagcat ttgacttgtt ctatgcccta gggggcgggg ggaagctaag ccagcttttt 120

ttaacattta aaatgttaat tccattttaa atgcacagat gtttttattt cataagggtt 180

tcaatgtgca tgaatgctgc aatattcctg ttaccaaagc tagtataaat aaaaatagat 240

aaacgtggaa attacttaga gtttctgtca ttaacgtttc cttcctcagt tgacaacata 300

aatgcgctgc tgagaagcca gtttgcatct gtcaggatca atttcccatt atgccagtca 360

tattaattac tagtcaatta gttgattttt atttttgaca tatacatgtg aaagacccca 420

cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaaatacat 480

aactgagaat agaaaagttc agatcaaggt caggaacaga tggaacagct gaatatgggc 540

caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggaa 600

cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc 660

caagaacaga tggtccccag atgcggtcca gccctcagca gtttctagag aaccatcaga 720

tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc 780

agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagcccac 840

aacccctcac tcggcgcgcc agtcctccga ttgactgagt cgcccgggta cccgtgtatc 900

caataaaccc tcttgcagtt gcatccgact tgtggtctcg ctgttccttg ggagggtctc 960

ctctgagtga ttgactaccc gtcagcgggg gtctttcatt tgggggctcg tccgggatcg 1020

ggagacccct gcccagggac caccgaccca ccaccgggag gtaagctggc cagcaactta 1080

tctgtgtctg tccgattgtc tagtgtctat gactgatttt atgcgcctgc gtcggtacta 1140

gttagctaac tagctctgta tctggcggac ccgtggtgga actgacgagt tcggaacacc 1200

cggccgcaac cctgggagac gtcccaggga cttcgggggc cgtttttgtg gcccgacctg 1260

agtccaaaaa tcccgatcgt tttggactct ttggtgcacc ccccttagag gagggatatg 1320

tggttctggt aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt 1380

cggtttggga ccgaagccgc gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcatcgtt ctgtgttgtc 1440

tctgtctgac tgtgtttctg tatttgtctg aaaatttggg cccgggccag actgttacca 1500

ctcccttaag tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga gcggatcgct cacaaccagt 1560

cggtagttgt caagaagaga cgttgggtta ccttctgctc tgcagaatgg ccaaccttta 1620

acgtcggatg gccgcgagac ggcaccttta accgagacct catcacccag gttaagatca 1680

aggtcttttc acctggcccg catggacacc cagaccaggt cccctacatc gtgacctggg 1740

aagccttggc ttttgacccc cctccctggg tcaagccctt tgtacaccct aagcctccgc 1800

ctcctcttcc tccatccgcc ccgtctctcc cccttgaacc tcctcgttcg accccgcctc 1860

gatcctccct ttatccagcc ctcactcctt ctctaggcgc ccccatatgg ccatatgaga 1920

tcttatatgg ggcacccccg ccccttgtaa acttccctga ccctgacttg acaagagtta 1980

ctaacagccc ctctctccaa gctcacttac aggctctcta cttagtccag cacgaagtct 2040

ggagacctct ggcggcagcc taccaagaac aactggaccg accggtggta cctcaccctt 2100

accgagtcgg cgacacagtg tgggtccgcc gacaccagac taagaaccta gaacctcgct 2160

ggaaaggacc ttacacagtc ctgctgacca cccccaccgc cctcaaagta gacggcatcg 2220

cagcttggat acacgccgcc cacgtgaagg ctgccgaccc cgggggtgga ccatcctcta 2280

gactgccgga tcccagtgtg gtggtacggg aattcaagct taggatgacg ctgcggcttc 2340

tggtggccgc gctctgcgcc gggatcctgg cagaggcgcc ccgagtgcga gcccagcaca 2400

gggagagagt gacctgcacg cgcctttacg ccgctgacat tgtgttctta ctggatggct 2460

cctcatccat tggccgcagc aatttccgcg aggtccgcag ctttctcgaa gggctggtgc 2520

tgcctttctc tggagcagcc agtgcacagg gtgtgcgctt tgccacagtg cagtacagcg 2580

atgacccacg gacagagttc ggcctggatg cacttggctc tgggggtgat gtgatccgcg 2640

ccatccgtga gcttagctac aaggggggca acactcgcac aggggctgca attctccatg 2700

tggctgacca tgtcttcctg ccccagctgg cccgacctgg tgtccccaag gtctgcatcc 2760

tgatcacaga cgggaagtcc caggacctgg tggacacagc tgcccaaagg ctgaaggggc 2820

agggggtcaa gctatttgct gtggggatca agaatgctga ccctgaggag ctgaagcgag 2880

ttgcctcaca gcccaccagt gacttcttct tcttcgtcaa tgacttcagc atcttgagga 2940

cactactgcc cctcgtttcc cggagagtgt gcacgactgc tggtggcgtg cctgtgaccc 3000

gacctccgga tgactcgacc tctgctccac gagacctggt gctgtctgag ccaagcagcc 3060

aatccttgag agtacagtgg acagcggcca gtggccctgt gactggctac aaggtccagt 3120

acactcctct gacggggctg ggacagccac tgccgagtga gcggcaggag gtgaacgtcc 3180

cagctggtga gaccagtgtg cggctgcggg gtctccggcc actgaccgag taccaagtga 3240

ctgtgattgc cctctacgcc aacagcatcg gggaggctgt gagcgggaca gctcggacca 3300

ctgccctaga agggccggaa ctgaccatcc agaataccac agcccacagc ctcctggtgg 3360

cctggcggag tgtgccaggt gccactggct accgtgtgac atggcgggtc ctcagtggtg 3420

ggcccacaca gcagcaggag ctgggccctg ggcagggttc agtgttgctg cgtgacttgg 3480

agcctggcac ggactatgag gtgaccgtga gcaccctatt tggccgcagt gtggggcccg 3540

ccacttccct gatggctcgc actgacgctt ctgttgagca gaccctgcgc ccggtcatcc 3600

tgggccccac atccatcctc ctttcctgga acttggtgcc tgaggcccgt ggctaccggt 3660

tggaatggcg gcgtgagact ggcttggagc caccgcagaa ggtggtactg ccctctgatg 3720

tgacccgcta ccagttggat gggctgcagc cgggcactga gtaccgcctc acactctaca 3780

ctctgctgga gggccacgag gtggccaccc ctgcaaccgt ggttcccact ggaccagagc 3840

tgcctgtgag ccctgtaaca gacctgcaag ccaccgagct gcccgggcag cgggtgcgag 3900

tgtcctggag cccagtccct ggtgccaccc agtaccgcat cattgtgcgc agcacccagg 3960

gggtggagcg gaccctggtg cttcctggga gtcagacagc attcgacttg gatgacgttc 4020

aggctgggct tagctacact gtgcgggtgt ctgctcgagt gggtccccgt gagggcagtg 4080

ccagtgtcct cactgtccgc cgggagccgg aaactccact tgctgttcca gggctgcggg 4140

ttgtggtgtc agatgcaacg cgagtgaggg tggcctgggg acccgtccct ggagccagtg 4200

gatttcggat tagctggagc acaggcagtg gtccggagtc cagccagaca ctgcccccag 4260

actctactgc cacagacatc acagggctgc agcctggaac cacctaccag gtggctgtgt 4320

cggtactgcg aggcagagag gagggccctg ctgcagtcat cgtggctcga acggacccac 4380

tgggcccagt gaggacggtc catgtgactc aggccagcag ctcatctgtc accattacct 4440

ggaccagggt tcctggcgcc acaggataca gggtttcctg gcactcagcc cacggcccag 4500

agaaatccca gttggtttct ggggaggcca cggtggctga gctggatgga ctggagccag 4560

atactgagta tacggtgcat gtgagggccc atgtggctgg cgtggatggg ccccctgcct 4620

ctgtggttgt gaggactgcc cctgagcctg tgggtcgtgt gtcgaggctg cagatcctca 4680

atgcttccag cgacgttcta cggatcacct gggtaggggt cactggagcc acagcttaca 4740

gactggcctg gggccggagt gaaggcggcc ccatgaggca ccagatactc ccaggaaaca 4800

cagactctgc agagatccgg ggtctcgaag gtggagtcag ctactcagtg cgagtgactg 4860

cacttgtcgg ggaccgcgag ggcacacctg tctccattgt tgtcactacg ccgcctgagg 4920

ctccgccagc cctggggacg cttcacgtgg tgcagcgcgg ggagcactcg ctgaggctgc 4980

gctgggagcc ggtgcccaga gcgcagggct tccttctgca ctggcaacct gagggtggcc 5040

aggaacagtc ccgggtcctg gggcccgagc tcagcagcta tcacctggac gggctggagc 5100

cagcgacaca gtaccgcgtg aggctgagtg tcctagggcc ggctggagaa gggccctctg 5160

cagaggtgac tgcgcgcact gagtcacctc gtgttccaag cattgaacta cgtgtggtgg 5220

acacctcgat cgactcggtg actttggcct ggactccagt gtccagggca tccagctaca 5280

tcctatcctg gcggccactc agaggccctg gccaggaagt gcctgggtcc ccgcagacac 5340

ttccagggat ctcaagctcc cagcgggtga cagggctaga gcctggcgtc tcttacatct 5400

tctccctgac gcctgtcctg gatggtgtgc ggggtcctga ggcatctgtc acacagacgc 5460

cagtgtgccc ccgtggcctg gcggatgtgg tgttcctacc acatgccact caagacaatg 5520

ctcaccgtgc ggaggctacg aggagggtcc tggagcgtct ggtgttggca cttgggcctc 5580

ttgggccaca ggcagttcag gttggcctgc tgtcttacag tcatcggccc tccccactgt 5640

tcccactgaa tggctcccat gaccttggca ttatcttgca aaggatccgt gacatgccct 5700

acatggaccc aagtgggaac aacctgggca cagccgtggt cacagctcac agatacatgt 5760

tggcaccaga tgctcctggg cgccgccagc acgtaccagg ggtgatggtt ctgctagtgg 5820

atgaaccctt gagaggtgac atattcagcc ccatccgtga ggcccaggct tctgggctta 5880

atgtggtgat gttgggaatg gctggagcgg acccagagca gctgcgtcgc ttggcgccgg 5940

gtatggactc tgtccagacc ttcttcgccg tggatgatgg gccaagcctg gaccaggcag 6000

tcagtggtct ggccacagcc ctgtgtcagg catccttcac tactcagccc cggccagagc 6060

cctgcccagt gtattgtcca aagggccaga agggggaacc tggagagatg ggcctgagag 6120

gacaagttgg gcctcctggc gaccctggcc tcccgggcag gaccggtgct cccggccccc 6180

aggggccccc tggaagtgcc actgccaagg gcgagagggg cttccctgga gcagatgggc 6240

gtccaggcag ccctggccgc gccgggaatc ctgggacccc tggagcccct ggcctaaagg 6300

gctctccagg gttgcctggc cctcgtgggg acccgggaga gcgaggacct cgaggcccaa 6360

agggggagcc gggggctccc ggacaagtca tcggaggtga aggacctggg cttcctgggc 6420

ggaaagggga ccctggacca tcgggccccc ctggacctcg tggaccactg ggggacccag 6480

gaccccgtgg ccccccaggg cttcctggaa cagccatgaa gggtgacaaa ggcgatcgtg 6540

gggagcgggg tccccctgga ccaggtgaag gtggcattgc tcctggggag cctgggctgc 6600

cgggtcttcc cggaagccct ggaccccaag gccccgttgg cccccctgga aagaaaggag 6660

aaaaaggtga ctctgaggat ggagctccag gcctcccagg acaacctggg tctccgggtg 6720

agcagggccc acggggacct cctggagcta ttggccccaa aggtgaccgg ggctttccag 6780

ggcccctggg tgaggctgga gagaagggcg aacgtggacc cccaggccca gcgggatccc 6840

gggggctgcc aggggttgct ggacgtcctg gagccaaggg tcctgaaggg ccaccaggac 6900

ccactggccg ccaaggagag aagggggagc ctggtcgccc tggggaccct gcagtggtgg 6960

gacctgctgt tgctggaccc aaaggagaaa agggagatgt ggggcccgct gggcccagag 7020

gagctaccgg agtccaaggg gaacggggcc cacccggctt ggttcttcct ggagaccctg 7080

gccccaaggg agaccctgga gaccggggtc ccattggcct tactggcaga gcaggacccc 7140

caggtgactc agggcctcct ggagagaagg gagaccctgg gcggcctggc cccccaggac 7200

ctgttggccc ccgaggacga gatggtgaag ttggagagaa aggtgacgag ggtcctccgg 7260

gtgacccggg tttgcctgga aaagcaggcg agcgtggcct tcggggggca cctggagttc 7320

gggggcctgt gggtgaaaag ggagaccagg gagatcctgg agaggatgga cgaaatggca 7380

gccctggatc atctggaccc aagggtgacc gtggggagcc gggtccccca ggacccccgg 7440

gacggctggt agacacagga cctggagcca gagagaaggg agagcctggg gaccgcggac 7500

aagagggtcc tcgagggccc aagggtgatc ctggcctccc tggagcccct ggggaaaggg 7560

gcattgaagg gtttcgggga cccccaggcc cacaggggga cccaggtgtc cgaggcccag 7620

caggagaaaa gggtgaccgg ggtccccctg ggctggatgg ccggagcgga ctggatggga 7680

aaccaggagc cgctgggccc tctgggccga atggtgctgc aggcaaagct ggggacccag 7740

ggagagacgg gcttccaggc ctccgtggag aacagggcct ccctggcccc tctggtcccc 7800

ctggattacc gggaaagcca ggcgaggatg gcaaacctgg cctgaatgga aaaaacggag 7860

aacctgggga ccctggagaa gacgggagga agggagagaa aggagattca ggcgcctctg 7920

ggagagaagg tcgtgatggc cccaagggtg agcgtggagc tcctggtatc cttggacccc 7980

aggggcctcc aggcctccca gggccagtgg gccctcctgg ccagggtttt cctggtgtcc 8040

caggaggcac gggccccaag ggtgaccgtg gggagactgg atccaaaggg gagcagggcc 8100

tccctggaga gcgtggcctg cgaggagagc ctggaagtgt gccgaatgtg gatcggttgc 8160

tggaaactgc tggcatcaag gcatctgccc tgcgggagat cgtggagacc tgggatgaga 8220

gctctggtag cttcctgcct gtgcccgaac ggcgtcgagg ccccaagggg gactcaggcg 8280

aacagggccc cccaggcaag gagggcccca tcggctttcc tggagaacgc gggctgaagg 8340

gcgaccgtgg agaccctggc cctcaggggc cacctggtct ggcccttggg gagaggggcc 8400

cccccgggcc ttccggcctt gccggggagc ctggaaagcc tggtattccc gggctcccag 8460

gcagggctgg gggtgtggga gaggcaggaa ggccaggaga gaggggagaa cggggagaga 8520

aaggagaacg tggagaacag ggcagagatg gccctcctgg actccctgga acccctgggc 8580

cccccggacc ccctggcccc aaggtgtctg tggatgagcc aggtcctgga ctctctggag 8640

aacagggacc ccctggactc aagggtgcta agggggagcc gggcagcaat ggtgaccaag 8700

gtcccaaagg agacaggggt gtgccaggca tcaaaggaga ccggggagag cctggaccga 8760

ggggtcagga cggcaacccg ggtctaccag gagagcgtgg tatggctggg cctgaaggga 8820

agccgggtct gcagggtcca agaggccccc ctggcccagt gggtggtcat ggagaccctg 8880

gaccacctgg tgccccgggt cttgctggcc ctgcaggacc ccaaggacct tctggcctga 8940

agggggagcc tggagagaca ggacctccag gacggggcct gactggacct actggagctg 9000

tgggacttcc tggacccccc ggcccttcag gccttgtggg tccacagggg tctccaggtt 9060

tgcctggaca agtgggggag acagggaagc cgggagcccc aggtcgagat ggtgccagtg 9120

gaaaagatgg agacagaggg agccctggtg tgccagggtc accaggtctg cctggccctg 9180

tcggacctaa aggagaacct ggccccacgg gggcccctgg acaggctgtg gtcgggctcc 9240

ctggagcaaa gggagagaag ggagcccctg gaggccttgc tggagacctg gtgggtgagc 9300

cgggagccaa aggtgaccga ggactgccag ggccgcgagg cgagaagggt gaagctggcc 9360

gtgcagggga gcccggagac cctggggaag atggtcagaa aggggctcca ggacccaaag 9420

gtttcaaggg tgacccagga gtcggggtcc cgggctcccc tgggcctcct ggccctccag 9480

gtgtgaaggg agatctgggc ctccctggcc tgcccggtgc tcctggtgtt gttgggttcc 9540

cgggtcagac aggccctcga ggagagatgg gtcagccagg ccctagtgga gagcggggtc 9600

tggcaggccc cccagggaga gaaggaatcc caggacccct ggggccacct ggaccaccgg 9660

ggtcagtggg accacctggg gcctctggac tcaaaggaga caagggagac cctggagtag 9720

ggctgcctgg gccccgaggc gagcgtgggg agccaggcat ccggggtgaa gatggccgcc 9780

ccggccagga gggaccccga ggactcacgg ggccccctgg cagcagggga gagcgtgggg 9840

agaagggtga tgttgggagt gcaggactaa agggtgacaa gggagactca gctgtgatcc 9900

tggggcctcc aggcccacgg ggtgccaagg gggacatggg tgaacgaggg cctcggggct 9960

tggatggtga caaaggacct cggggagaca atggggaccc tggtgacaag ggcagcaagg 10020

gagagcctgg tgacaagggc tcagccgggt tgccaggact gcgtggactc ctgggacccc 10080

agggtcaacc tggtgcagca gggatccctg gtgacccggg atccccagga aaggatggag 10140

tgcctggtat ccgaggagaa aaaggagatg ttggcttcat gggtccccgg ggcctcaagg 10200

gtgaacgggg agtgaaggga gcctgtggcc ttgatggaga gaagggagac aagggagaag 10260

ctggtccccc aggccgcccc gggctggcag gacacaaagg agagatgggg gagcctggtg 10320

tgccgggcca gtcgggggcc cctggcaagg agggcctgat cggtcccaag ggtgaccgag 10380

gctttgacgg gcagccaggc cccaagggtg accagggcga gaaaggggag cggggaaccc 10440

caggaattgg gggcttccca ggccccagtg gaaatgatgg ctctgctggt cccccagggc 10500

cacctggcag tgttggtccc agaggccccg aaggacttca gggccagaag ggtgagcgag 10560

gtccccccgg agagagagtg gtgggggctc ctggggtccc tggagctcct ggcgagagag 10620

gggagcaggg gcggccaggg cctgccggtc ctcgaggcga gaagggagaa gctgcactga 10680

cggaggatga catccggggc tttgtgcgcc aagagatgag tcagcactgt gcctgccagg 10740

gccagttcat cgcatctgga tcacgacccc tccctagtta tgctgcagac actgccggct 10800

cccagctcca tgctgtgcct gtgctccgcg tctctcatgc agaggaggaa gagcgggtac 10860

cccctgagga tgatgagtac tctgaatact ccgagtattc tgtggaggag taccaggacc 10920

ctgaagctcc ttgggatagt gatgacccct gttccctgcc actggatgag ggctcctgca 10980

ctgcctacac cctgcgctgg taccatcggg ctgtgacagg cagcacagag gcctgtcacc 11040

cttttgtcta tggtggctgt ggagggaatg ccaaccgttt tgggacccgt gaggcctgcg 11100

agcgccgctg cccaccccgg gtggtccaga gccaggggac aggtactgcc caggactgag 11160

aattcgcggc cgccagcaca gtggtcgacg ataaaataaa agattttatt tagtctccag 11220

aaaaaggggg gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaacgcca 11280

ttttgcaagg catggaaaaa tacataactg agaatagaga agttcagatc aaggtcagga 11340

acagatggaa cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc 11400

ggctcagggc caagaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 11460

agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtccagccct 11520

cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc 11580

tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct 11640

ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc ctcactcggg gcgccagtcc tccgattgac 11700

tgagtcgccc gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg 11760

tctcgctgtt ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt 11820

tcacatgcag catgtatcaa aattaatttg gttttttttc ttaagtattt acattaaatg 11880

gccatagttg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattggcgc 11940

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 12000

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 12060

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 12120

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 12180

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 12240

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 12300

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 12360

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 12420

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 12480

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 12540

cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 12600

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 12660

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 12720

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 12780

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt tgcggccgaa ttagatccag 12840

acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 12900

gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 12960

aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg 13020

aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat ggctgattat gatcctctag 13080

agtcggtggg cctcgggggc gggtgcgggg tcggcggggc cgcccgggtc ggcttcggtc 13140

ggagccatgg ggtcgtgcgc tcctttcggt cgggcgctgc gggtcgtggg gcgggcgtca 13200

ggcaccgggc ttgcgggtca tgcaccaggt cgcgcggtcc ttcgggcact cgacgtcggc 13260

ggtgacggtg aagccgagcc gctcgtagaa ggggaggttg cggggcgcgg aggtctccag 13320

gaaggcgggc accccggcgc gctcggccgc ctccactccg gggagcacga cggcgctgcc 13380

cagacccttg ccctggtggt cgggcgagac gccgacggtg gccaggaacc acgcgggctc 13440

cttgggccgg tgcggcgcca ggaggccttc catctgttgc tgcgcggcca gccgggaacc 13500

gctcaactcg gccatgcgcg ggccgatctc ggcgaacacc gcccccgctt cgacgctctc 13560

cggcgtggtc cagaccgcca ccgcggcgcc gtcgtccgcg acccacacct tgccgatgtc 13620

gagcccgacg cgcgtgagga agagttcttg cagctcggtg acccgctcga tgtggcggtc 13680

cgggtcgacg gtgtggcgcg tggcggggta gtcggcgaac gcggcggcga gggtgcgtac 13740

ggcccggggg acgtcgtcgc gggtggcgag gcgcaccgtg ggcttgtact cggtcatgga 13800

aggtcgtctc cttgtgaggg gtcaggggcg tgggtcaggg gatggtggcg gcaccggtcg 13860

tggcggccga cctgcaggtc gaaaggcccg gagatgagga agaggagaac agcgcggcag 13920

acgtgcgctt ttgaagcgtg cagaatgccg ggcctccgga ggaccttcgg gcgcccgccc 13980

cgcccctgag cccgcccctg agcccgcccc cggacccacc ccttcccagc ctctgagccc 14040

agaaagcgaa ggagcaaagc tgctattggc cgctgcccca aaggcctacc cgcttccatt 14100

gctcagcggt gctgtccatc tgcacgagac tagtgagacg tgctacttcc atttgtcacg 14160

tcctgcacga cgcgagctgc ggggcggggg ggaacttcct gactagggga ggagtagaag 14220

gtggcgcgaa ggggccacca aagaacggag ccggttggcg cctaccggtg gatgtggaat 14280

gtgtgcgagg ccagaggcca cttgtgtagc gccaagtgcc cagcggggct gctaaagcgc 14340

atgctccaga ctgccttggg aaaagcgcct cccctacccg gtagaattaa ttctcatgtt 14400

tgacagctta tcatcgatag atcctcacag gccgcaccca gcttttcttc cgttgcccca 14460

gtagcatctc tgtctggtga ccttgaagag gaagaggagg ggtcccgaga atccccatcc 14520

ctaccgtcca gcaaaaaggg ggacgaggaa tttgaggcct ggcttgaggc tcaggacgca 14580

aatcttgagg atgttcagcg ggagttttcc gggctgcgag taattggtga tgaggacgag 14640

gatggttcgg aggatgggga attttcagac ctggatctgt ctgacagcga ccatgaaggg 14700

gatgagggtg ggggggctgt tggagggggc aggagtctgc actccctgta ttcactgagc 14760

gtcgtctaat aaagatgtct attgatctct tttagtgtga atcatgtctg acgaggggcc 14820

aggtacagga cctggaaatg gcctaggaga gaagggagac acatctggac cagaaggctc 14880

cggcggcagt ggacctcaaa gaagaggggg tgataaccat ggacgaggac ggggaagagg 14940

acgaggacga ggaggcggaa gaccaggagc cccgggcggc tcaggatcag ggccaagaca 15000

tagagatggt gtccggagag gggaaaaacg tccaagttgc attggctgca aagggaccca 15060

cggtggaaca ggagcaggag caggagcggg aggggcagga gcaggagggg caggagcagg 15120

aggaggggca ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga ggggcaggag gggcaggagc 15180

aggaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg 15240

aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggagca ggaggagggg caggaggggc 15300

aggaggggca ggagcaggag gaggggcagg agcaggagga ggggcaggag gggcaggagc 15360

aggaggaggg gcaggagggg caggaggggc aggagcagga ggaggggcag gagcaggagg 15420

ggcaggaggg gcaggagggg caggagcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg 15480

ggcaggaggg gcaggagcag gaggggcagg agcaggaggg gcaggagcag gaggggcagg 15540

agcaggaggg gcaggagggg caggagcagg aggggcagga ggggcaggag caggaggggc 15600

aggaggggca ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg 15660

ggcaggagca ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg gcaggagggg caggagcagg 15720

aggggcagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca ggaggggcag gagcaggagg 15780

tggaggccgg ggtcgaggag gcagtggagg ccggggtcga ggaggtagtg gaggccgggg 15840

tcgaggaggt agtggaggcc gccggggtag aggacgtgaa agagccaggg ggggaagtcg 15900

tgaaagagcc agggggagag gtcgtggacg tggagaaaag aggcccagga gtcccagtag 15960

tcagtcatca tcatccgggt ctccaccgcg caggccccct ccaggtagaa ggccattttt 16020

ccaccctgta ggggaagccg attattttga ataccaccaa gaaggtggcc cagatggtga 16080

gcctgacgtg cccccgggag cgatagagca gggccccgca gatgacccag gagaaggccc 16140

aagcactgga ccccggggtc agggtgatgg aggcaggcgc aaaaaaggag ggtggtttgg 16200

aaagcatcgt ggtcaaggag gttccaaccc gaaatttgag aacattgcag aaggtttaag 16260

agctctcctg gctaggagtc acgtagaaag gactaccgac gaaggaactt gggtcgccgg 16320

tgtgttcgta tatggaggta gtaagacctc cctttacaac ctaaggcgag gaactgccct 16380

tgctattcca caatgtcgtc ttacaccatt gagtcgtctc ccctttggaa tggcccctgg 16440

acccggccca caacctggcc cgctaaggga gtccattgtc tgttatttca tggtcttttt 16500

acaaactcat atatttgctg aggttttgaa ggatgcgatt aaggaccttg ttatgacaaa 16560

gcccgctcct acctgcaata tcagggtgac tgtgtgcagc tttgacgatg gagtagattt 16620

gcctccctgg tttccaccta tggtggaagg ggctgccgcg gagggtgatg acggagatga 16680

cggagatgaa ggaggtgatg gagatgaggg tgaggaaggg caggagtgat gtaacttgtt 16740

aggagacgcc ctcaatcgta ttaaaagccg tgtattcccc cgcactaaag aataaatccc 16800

cagtagacat catgcgtgct gttggtgtat ttctggccat ctgtcttgtc accattttcg 16860

tcctcccaac atggggcaat tgggcatacc catgttgtca cgtcactcag ctccgcgctc 16920

aacaccttct cgcgttggaa aacattagcg acatttacct ggtgagcaat cagacatgcg 16980

acggctttag cctggcctcc ttaaattcac ctaagaatgg gagcaaccag caggaaaagg 17040

acaagcagcg aaaattcacg cccccttggg aggtggcggc atatgcaaag gatagcactc 17100

ccactctact actgggtatc atatgctgac tgtatatgca tgaggatagc atatgctacc 17160

cggatacaga ttaggatagc atatactacc cagatataga ttaggatagc atatgctacc 17220

cagatataga ttaggatagc ctatgctacc cagatataaa ttaggatagc atatactacc 17280

cagatataga ttaggatagc atatgctacc cagatataga ttaggatagc ctatgctacc 17340

cagatataga ttaggatagc atatgctacc cagatataga ttaggatagc atatgctatc 17400

cagatatttg ggtagtatat gctacccaga tataaattag gatagcatat actaccctaa 17460

tctctattag gatagcatat gctacccgga tacagattag gatagcatat actacccaga 17520

tatagattag gatagcatat gctacccaga tatagattag gatagcctat gctacccaga 17580

tataaattag gatagcatat actacccaga tatagattag gatagcatat gctacccaga 17640

tatagattag gatagcctat gctacccaga tatagattag gatagcatat gctatccaga 17700

tatttgggta gtatatgcta cccatggcaa cattagccca ccgtgctctc agcgacctcg 17760

tgaatatgag gaccaacaac cctgtgcttg gcgctcaggc gcaagtgtgt gtaatttgtc 17820

ctccagatcg cagcaatcgc gcccctatct tggcccgccc acctacttat gcaggtattc 17880

cccggggtgc cattagtggt tttgtgggca agtggtttga ccgcagtggt tagcggggtt 17940

acaatcagcc aagttattac acccttattt tacagtccaa aaccgcaggg cggcgtgtgg 18000

gggctgacgc gtgcccccac tccacaattt caaaaaaaag agtggccact tgtctttgtt 18060

tatgggcccc attggcgtgg agccccgttt aattttcggg ggtgttagag acaaccagtg 18120

gagtccgctg ctgtcggcgt ccactctctt tccccttgtt acaaatagag tgtaacaaca 18180

tggttcacct gtcttggtcc ctgcctggga cacatcttaa taaccccagt atcatattgc 18240

actaggatta tgtgttgccc atagccataa attcgtgtga gatggacatc cagtctttac 18300

ggcttgtccc caccccatgg atttctattg ttaaagatat tcagaatgtt tcattcctac 18360

actagtattt attgcccaag gggtttgtga gggttatatt ggtgtcatag cacaatgcca 18420

ccactgaacc ccccgtccaa attttattct gggggcgtca cctgaaacct tgttttcgag 18480

cacctcacat acaccttact gttcacaact cagcagttat tctattagct aaacgaagga 18540

gaatgaagaa gcaggcgaag attcaggaga gttcactgcc cgctccttga tcttcagcca 18600

ctgcccttgt gactaaaatg gttcactacc ctcgtggaat cctgacccca tgtaaataaa 18660

accgtgacag ctcatggggt gggagatatc gctgttcctt aggacccttt tactaaccct 18720

aattcgatag catatgcttc ccgttgggta acatatgcta ttgaattagg gttagtctgg 18780

atagtatata ctactacccg ggaagcatat gctacccgtt tagggttaac aagggggcct 18840

tataaacact attgctaatg ccctcttgag ggtccgctta tcggtagcta cacaggcccc 18900

tctgattgac gttggtgtag cctcccgtag tcttcctggg cccctgggag gtacatgtcc 18960

cccagcattg gtgtaagagc ttcagccaag agttacacat aaaggcaatg ttgtgttgca 19020

gtccacagac tgcaaagtct gctccaggat gaaagccact cagtgttggc aaatgtgcac 19080

atccatttat aaggatgtca actacagtca gagaacccct ttgtgtttgg tccccccccg 19140

tgtcacatgt ggaacagggc ccagttggca agttgtacca accaactgaa gggattacat 19200

gcactgcccg tgaccaatac aaaacaaaag cgctcctcgt accagcgaag aaggggcaga 19260

gatgccgtag tcaggtttag ttcgtccggc ggcgggggat ctggccgctt taaatcaatc 19320

taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 19380

atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 19440

actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 19500

cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 19560

agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 19620

gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg 19680

gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 19740

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 19800

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 19860

cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 19920

ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat 19980

accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 20040

aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 20100

aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 20160

caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 20220

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 20280

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttc 20326

Claims (20)

1.用包含编码全长野生型人胶原蛋白VII(COL7A1)蛋白质的基因构建体的病毒转导的角膜上皮细胞片层在制备用于治疗患有隐性营养不良型大疱性表皮松解症(RDEB)的受试者角膜糜烂的药物组合物中的用途，其中通过用包含所述基因构建体的病毒进行转导来矫正所述角膜上皮细胞；并且其中所述转导的角膜上皮细胞中的每一个具有不超过3的前病毒基因组拷贝数(PGCN)。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述病毒包括逆转录病毒、AAV(腺伴随病毒)或慢病毒。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述逆转录病毒是LZRSE-病毒。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述逆转录病毒被GalV-假型化。

5.根据权利要求1所述的用途，其中如此转导的所述角膜上皮细胞符合病毒转导效率(VTE)>50％的预释放标准。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。

7.根据权利要求1所述的用途，其中将所述角膜上皮细胞片层经历选自以下中的一个或多个测试：VTE测试、PGCN测试、无菌测试、内毒素测试、支原体测试、革兰氏染色无菌测试、LEAES活力测试、释放后测试、RCR测试、细胞毒性T细胞测定、抗C7 LH24 mAb表征、电子显微镜术、免疫电子显微镜术、免疫荧光染色、C7表达或AF分析。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述免疫荧光染色包括直接或间接免疫荧光染色。

9.根据权利要求1所述的用途，其中将所述角膜上皮细胞片层置于无细胞基质、胶原蛋白基质或生物相容性网片上。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述生物相容性网片由热塑性树脂、聚乙烯、超高分子量聚乙烯、高分子量聚烯烃、未涂覆的单丝聚丙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、尼龙、硅或其任何组合制成。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述角膜上皮细胞包括干细胞。

12.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述前病毒基因组拷贝数(PGCN)小于2。

13.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述前病毒基因组拷贝数(PGCN)小于1.5。

14.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述前病毒基因组拷贝数(PGCN)小于1。

15.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述前病毒基因组拷贝数(PGCN)小于0.5。

16.制备权利要求1所述的角膜上皮细胞片层的方法，包括：

(a)从所述受试者中获得角膜上皮细胞群；

(b)通过利用包含编码全长野生型人胶原蛋白VII(COL7A1)蛋白质的基因构建体的病毒来转导所述角膜上皮细胞以离体矫正所述角膜上皮细胞；

(c)培养经遗传学矫正的所述角膜上皮细胞以形成角膜上皮细胞片层；

其中所述经矫正的角膜上皮细胞中的每一个具有不超过3的前病毒基因组拷贝数(PGCN)。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述前病毒基因组拷贝数(PGCN)小于2。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述前病毒基因组拷贝数(PGCN)小于1.5。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述前病毒基因组拷贝数(PGCN)小于1。

20.根据权利要求16所述的方法，其中所述前病毒基因组拷贝数(PGCN)小于0.5。