JP2023036685A - Ｖｉｉ型コラーゲン欠損症の治療のための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】栄養障害型表皮水疱症などのＶＩＩ型コラーゲン欠損症の治療のための組成物及び方法を提供する。【解決手段】ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）欠損症に罹患している患者を治療する方法であって、前記Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞を取得するステップと、ＣＯＬ７Ａ１をコードするヌクレオチド配列又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と前記細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有する自家遺伝子改変細胞を形成するステップにおいて、前記レンチウイルスベクターが、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップと、前記自家遺伝子改変細胞を培養するステップと、有効量の前記遺伝子改変細胞を前記Ｃ７欠損症患者に投与するステップと、を含むことを特徴とする方法である。【選択図】図１４

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子データとして提出される配列表を含み、これは、その全体を参照により本明細書に組み込む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年３月９日に作成され、０１００－００１６ＰＲ１＿ＳＬ．ｔｘｔと称し、サイズは９２，９２４バイトである。
本発明は、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）をコードするヌクレオチド配列又はその機能性変異体を含む自家遺伝子改変細胞の投与を含む、栄養障害型表皮水疱症などのＶＩＩ型コラーゲン欠損症の治療のための組成物及び方法に関する。
ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）は、皮膚の層全体を保持する、真皮表皮接合部（ＤＥＪ）における係留線維の形成に重要なタンパク質である（Ｂｕｒｇｅｓｏｎ １９９３；Ｌｅｉｇｈ ｅｔ ａｌ．１９８８）。栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）は、Ｃ７の欠損が、表皮と下層の真皮との間に接着する係留線維の損傷を引き起こし、皮膚及び器官に影響を及ぼすことを特徴とする遺伝性疾患である。Ｃ７をコードするＣＯＬ７Ａ１遺伝子の突然変異が、Ｃ７欠損の原因となる。ＤＥＢに罹患している患者は、重篤な水疱形成に極めて罹患しやすい。優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）は、全身性水疱形成を特徴とする。一過性水疱症は、ＤＤＥＢの一形態であり、これは、小児期の間に自然に治癒する。劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）は、衰弱性皮膚水疱症である。ＲＤＥＢは、ＲＤＥＢの別の形態であり、この場合、水疱は、皮膚がこすれあう箇所で形成する。これらの線維がなければ、皮膚層は分離し、こする、又は引っ掻くといった普通の日常的な活動を含むあらゆる種類の摩擦に応答して、重篤な水疱形成、開放性創傷及び瘢痕化を引き起こす。
現在治療的処置がないために、患者は、主として創傷緩和医療に頼っている。いくつかの戦略を使用する前臨床試験は、ＲＤＥＢ皮膚のＣ７機能を回復することによって、疾患の作用が補正され得ることを示唆する心強い結果を明らかにしている。初期のアプローチは、脆弱な培養表皮組織の移植に依存するものであったため、置換しようとする皮膚組織の除去を必要とし、瘢痕化が起こる（Ｍａｖｉｌｉｏ ｅｔ ａｌ．２００６；Ｃｈｅｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００２；Ｓｉｐｒａｓｈｖｉｌｉ ２０１０）。他の方法は、直接ウイルスを用いた発現による補正用Ｃ７の送達及び組換えタンパク質の全身送達を含むものであった（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ２００９；Ｗｏｏｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２００３）。これらの処置候補は全て、費用及び生体安全性の懸念をはじめとするいくつかの問題をはらんでいる。
複製欠損、自己不活性型（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター（ＬＶ）の使用は、遺伝子療法に、下記の複数の利点をもたらす：１）分裂及び非分裂細胞の両方を導入する能力、２）高い形質導入効率、３）長期の持続的なトランスジーン発現、４）免疫応答をトリガーし得る、ウイルスタンパク質をコードする配列を分配する能力、５）転写的に不活性なＳＩＮ長末端反復配列（ＬＴＲ）による安全性プロフィールの向上、並びに６）大きなトランスジーンをパッケージする能力。遺伝子療法のためにＬＶベクターを使用する臨床試験からの安定性試験では、癌原遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子内若しくはその付近での優先的組込みが一切示されなかった。被験者当たり１００億個のＬＶベクター導入Ｔ細胞を投与され、平均４年間追跡された患者は、白血病又はその他の有害事象を呈示しなかった。異染性白質ジストロフィー、ウィスコット・オルドリッチ症候群（ＷＡＳ）及び副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）の適応に関する試験によって、それぞれ、最大２１ヵ月、３２ヵ月、及び３６ヵ月の追跡中に、異常なクローン増殖は認められないことが判明した（Ｂｉｆｆｉ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１３）。
自家遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞（ＧＭ－ＨＤＦ）による治療は、患者自身の線維芽細胞の遺伝的欠損をエクスビボで補正することに基づく、有望な代替方法を提供する（Ｏｒｔｉｚ－Ｕｒｄａ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｗｏｏｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２００３）。ＲＤＥＢ皮膚移植片を有するマウスの基底膜領域（ＢＭＺ）にＣ７を供給する上で、ｈＣＯＬ７Ａ１遺伝子補正線維芽細胞が、ケラチノサイトより優れていることが報告されている（Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００６）。さらに、線維芽細胞の注射は、ケラチノサイトの移植よりも容易に完了することができる。
本発明は、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）欠損症に罹患している患者を治療する方法に関し、これは、Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞、好ましくは線維芽細胞若しくはケラチノサイトを取得するステップ、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有するＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含む自家遺伝子改変細胞を形成するステップにおいて、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップ、前記自家遺伝子改変細胞を培養するステップ、並びに遺伝子改変細胞をＣ７欠損症患者に投与するステップを含む。投与は、注射、好ましくは皮内注射により実施してもよい。本発明の一態様では、Ｃ７欠損症は、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）又は優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）などの栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）である。ＲＤＥＢの亜型も、本発明により治療することが考慮され、そのようなものとして、アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型、非アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、異型ＲＤＥＢ、前脛骨性ＲＤＥＢ、末端性ＲＤＥＢ、及び求心型ＲＤＥＢが挙げられる。
本発明の一実施形態では、形質導入用レンチウイルスベクター粒子は、以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端反復（ここで、修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）、（ｂ）ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列、（ｄ）Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、及び（ｅ）修飾３’ＬＴＲ（修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）を含むトランスファーレンチウイルスベクターから構築され、ここで、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又は機能性変異体は、細胞に組み込まれて、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を有する遺伝子改変細胞を形成する。
一実施形態では、少なくとも２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントがある。別の実施形態では、ＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。好ましくは、形質導入用ベクターを構築するのに用いられるトランスファーレンチウイルスベクターは、ｐＳＭＰＵＷ及びｐＦＵＧＷからなる群から選択される。好ましくは、形質導入レンチウイルスベクター粒子は、ＩＮＸＮ－２００４又はＩＮＸＮ－２００２である。
Ｃ７欠損症患者への自家遺伝子改変線維芽細胞の投与は、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みをはじめとする、あらゆる好適な方法で実施してよい。
本発明の別の態様は、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、ＲＤＥＢ又はＤＤＥＢ患者などのＣ７欠損症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞に関し、ここで、レンチウイルスベクター粒子は、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有する。
別の実施形態は、以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端（ここで、修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）、（ｂ）ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメント、（ｄ）Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、及び（ｅ）修飾３’ＬＴＲ（修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）を含むトランスファーベクターから形成される自己不活性型レンチウイルスベクターに関する。一実施形態では、ベクターは、少なくとも２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントを含み、ＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。本発明のベクターとしては、ＩＮＸＮ－２００４と称し、ＩＧＥ３０８プラスミドの配列を含むベクター；又はＩＮＸＮ－２００２と称するベクターがある。
本発明の別の実施形態は、ＩＧＥ３０８プラスミドの配列を含む、ＩＮＸＮ－２００４と称するレンチウイルスベクターで形質導入された；又はＩＮＸＮ－２００２と称するレンチウイルスベクターで形質導入された、ＲＤＥＢ若しくはＤＤＥＢ患者から得られる線維芽細胞を含む医薬組成物に関する。
一実施形態では、本発明は、ＩＮＸＮ－２００２及びＩＮＸＮ－２００４などのベクターを用いて、インビトロ又はエクスビボで形質導入された細胞に関する。
一実施形態では、本発明は、ベクターＩＮＸＮ－２００２又はＩＮＸＮ－２００４を用いて形質導入された自家線維芽細胞に関し、これらは、米国特許第８，７２８，８１９号明細書及び国際特許出願に記載の方法に従って取得し、増殖させた。
「最小限に継代した線維芽細胞を培養する方法及びその使用」と題する国際公開第２００８／０２７９８４号パンフレット（これらは各々、参照により本明細書に組み込む）。
一実施形態では、本発明は、線維芽細胞及び／又はケラチノサイトなどのヒト自家皮膚細胞の形質導入のための濃縮レンチウイルスの使用に関する。
別の実施形態では、本発明は、レンチウイルスと一緒に遠心分離することによる、線維芽細胞及び／又はケラチノサイトなどのヒト自家皮膚細胞の形質導入に関する。
一実施形態では、本発明は、線維芽細胞及び／又はケラチノサイトなどのヒト自家皮膚細胞の形質導入のための濃縮レンチウイルス及び遠心分離の両方の使用に関する。
一実施形態では、本発明は、２つ以上の個別の形質導入工程で、レンチウイルスと接触させた、線維芽細胞及び／又はケラチノサイトなどのヒト自家皮膚細胞の使用に関する。
一実施形態では、本発明は、２つ以上の個別の形質導入工程で、レンチウイルスと接触させた、線維芽細胞及び／又はケラチノサイトなどのヒト自家皮膚細胞の使用に関し、ここで、第２又はいずれか後の形質導入工程の前に、細胞を１回、２回、又は３回培養及び継代する。
本発明はまた、偽合指症に罹患している患者の治療に関し、これは、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む。
本発明は、さらに、栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）の水疱形成を治療、阻害若しくは軽減する方法、又はＲＤＥＢ患者の病変を治療する方法に関し、これは、本発明の自家遺伝子改変細胞を投与するステップを含む。
本発明の別の態様は、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むベクター粒子を形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、ＤＤＥＢ又はＲＤＥＢなどのＣ７欠損症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団、並びにこれらの単離された集団を製造する方法に関する。
本発明はまた、遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトにおける細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数を増加する方法にも関し、これは、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体をコードするヌクレオチド配列を含む形質導入用レンチウイルスベクターを、Ｃ７欠損症患者から取得したヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと接触させて、形質導入組成物を形成するステップを含む。この形質導入組成物をスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）に付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するが、ここで、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数は、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物よりも多い。本発明はさらに、超形質導入ステップも含み、この場合、形質導入細胞を第２の形質導入レンチウイルスベクターとさらに接触させて、第２の形質導入組成物を形成し、任意選択で、この組成物をスピノキュレーションに付す。一態様では、形質導入レンチウイルスベクターは、ＩＮＸＮ－２００２又はＩＮＸＮ－２００４、好ましくはＩＮＸＮ－２００４である。形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトは、スピノキュレーション又は超形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも又は約１、２、５、１０、２０、２５、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、若しくは５０倍多い組込みトランスジーンコピー数を有する。別の実施形態では、本発明は、細胞当たり少なくとも０．０５、０．０９、０．４１、若しくは０．７４、又は約０．１～約５、０．１～約１、０．４～約１、若しくは０．４～約０．７５の範囲の組込みトランスジーンコピー数を有することに関する。発現は、本明細書に記載する遺伝子導入方法を用いて増大することが判明している。例えば、Ｃ７の発現は、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、１０、２５、５０、１００、１５０、又は２００倍増大したことが明らかにされている。
添付の図面を参照することにより、以下の詳細な説明と共に考慮されれば、本発明のより十全な理解が得られるであろう。図面に示す実施形態は、本発明を例証することを意図するに過ぎず、例示した実施形態に本発明を制限するものとして解釈すべきではない。
図１Ａは、係留線維を形成するＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）三量体を描く。ＣＯＬ７Ａ１遺伝子は、２９０ｋＤａα鎖をコードし、３つの鎖が三重ヘリックス（三量体）を形成する。Ｂｒｕｃｋｎｅｒ－Ｔｕｄｅｒｍａｎ Ｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１７：６－７からのイメージ。 図１Ｂは、正常及びＲＤＥＢ皮膚の全体的構造を描く。Ｃ７係留線維は、他のコラーゲン、細胞外マトリックスタンパク質、及びＬａｍ３３２に結合して、真皮と表皮の結合を媒介する。係留線維が存在しなければ、水疱形成を招き得る。 図２は、本発明の一態様に従うｃＧＭＰ規模のＧＭ－ＨＤＦ製造工程を説明する。Ｃ７発現カセットを自己不活性型レンチウイルスバックボーンにクローン化した。約９×１０６ＩＵ／ｍＬの力価を有するＣＯＬ７Ａ１遺伝子（ＬＶ－ＣＯＬ７）を含む、レンチウイルスベクター（ＩＮＸＮ－２００２）のパイロット規模製造は、ｃＧＭＰ規模製造工程に使用するために実施した。線維芽細胞をＲＤＥＢ患者の生検から単離し、増殖させた後、モック、高用量、及び低用量ＬＶ－ＣＯＬ７形質導入のための３つのアームに分割した。各アームの線維芽細胞を２×ＣＳ１０規模まで増殖させた後、凍結保存した（原薬）。患者の治療のために、原薬バイアルを解凍し、製剤化した（製剤）後、細胞が由来する患者の創傷治癒部位注射のために臨床現場に送り返した。 図３Ａは、細胞当たりのＬＶ－ＣＯＬ７（ＩＮＸＮ－２００２用）コピー数を記載する。原薬バイアルを解凍し、ｑＰＣＲを用いて、細胞当たりのＬＶ－ＣＯＬ７ ＤＮＡコピーについてアッセイした。プライマーは、ＬＶシャトルベクターに特異的であった。結果は、用量依存的レベルの細胞当たりコピー数を実証するものであり、高用量及び低用量アームからの平均は、それぞれ０．３８及び０．１８コピーであった。 図３Ｂは、ＬＶ－ＣＯＬ７で形質導入したＲＤＥＢ患者線維芽細胞により生成されたＣ７発現レベルを記載する：原薬バイアルを解凍し、３日間培養した。馴らし細胞培養上清を収集して、ＥＬＩＳＡによりＣ７レベルについてアッセイした。結果は、ＬＶ－ＣＯＬ７形質導入細胞において６０～１２０ｎｇ／ｍＬ（Ｃ７）の範囲のウイルス用量依存的タンパク質発現を示す。 図３Ｃは、ＬＶ－ＣＯＬ７で形質導入したＲＤＥＢ患者線維芽細胞により産生されたＣ７の三量体形態を示す：免疫沈降アッセイでも、馴らし細胞培養上清を使用した。免疫沈降Ｃ７を非変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離して、ウエスタンブロットにより視覚化した。ＲＤＥＢ線維芽細胞により産生されたＣ７は、主に三量体であり、モック形質導入細胞（アームＣ）よりも多くのＣＯＬ７を発現するＬＶ－ＣＯＬ７形質導入細胞を含んだ。免疫反応性を示すいくつかの低分子量種も観察された。 図４Ａは、Ｌａｍ３３２に対する精製済ＣＯＬ７の結合を表示する。ＣＯＬ７は、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞に発現され、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した後、ＢＳＡと比較してＬａｍ３３２に対する優先的結合についてアッセイすることにより、アッセイを確立した（ＯＤ４５０の増加は、ＣＯＬ７とＬａｍ３３２の結合増大と一致する）。 図４Ｂは、ＬＶ－ＣＯＬ７形質導入線維芽細胞（ＩＮＸＮ－２００２ベクターにより形質導入されている）におけるＣＯＬ７とＬａｍ３３２の結合を表示する。原薬バイアルを解凍し、３日間培養した。馴らし細胞培養上清を収集し、ＢＳＡ対照と比較してＬａｍ３３２との結合についてアッセイした。結果は、Ｌａｍ３３２に対するウイルス用量依存的結合を示す。 図５は、１×１０６ＧＭ－ＨＤＦ（ＩＮＸＮ－２００２ベクターにより形質導入されている）を内皮注射した後、ヒトＣＯＬ７特異的抗体を用いた免疫蛍光染色により分析したＳＣＩＤマウスの背面上の複合ＲＤＥＢ皮膚移植片を表す。代表的な画像が示される。１×１０６ＧＭ－ＨＤＦの内皮注射後１０日目のＲＤＥＢケラチノサイトで作製された複合移植片（ｎ＝４）にＣＯＬ７の局在化が観察された。正常ケラチノサイト及び線維芽細胞から作製された陽性対照移植片は、強度のＣＯＬ７染色を示し、陰性対照移植片は、ベースライン測定でＣＯＬ７染色を示さなかった（陰性ベースライン比較のためのＤＥＪ地点の矢印）。 図６は、ｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現プラスミドベクターの概略図を提供する。 図７は、第３世代レンチウイルス発現ベクターに対してｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現ベクターの特徴を比較する。 図８は、ｐＦＵＧＷレンチウイルス発現プラスミドベクターの概略図を提供する。 図９は、ＨＩＶ－１ウイルス粒子の電子顕微鏡写真を示す。 図１０は、Ｃ７三量体の形成を検出するＴＲ８ ＧＭ－ＨＤＦの免疫沈降結果を記載する。 図１１Ａは、Ｃ７三量体の形成を検出するＴＲ１０及びＥＲ１ ＧＭ－ＨＤＦの免疫沈降結果を記載する。 図１１Ｂは、Ｃ７三量体の形成を検出するＴＲ９の免疫沈降結果を記載する。 図１２は、ＧＭ－ＨＤＦによって発現されたＣ７によるＬａｍ３３２結合の結果を示す。 図１３は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をコードするレンチウイルスベクタープラスミド構築物の概略図を提供する。 図１４は、ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクターのプロウイルスＲＮＡゲノム構造の概略図を提供する。 図１５は、ＩＮＸＮ－２００２ウイルス粒子の詳細を描く概略図を示す。 図１６は、ＩＮＸＮ－２００２の挿入遺伝毒性の可能性を評価するためのインビトロ不死化アッセイの概略図を提供する。 図１７は、培養中のＦＸＣ－００７の典型的な細胞形態及び構造を示す。 図１８は、ＴＲ８ ＧＭ－ＨＤＦの特定の用量についてＥＬＩＳＡにより決定されるＣ７発現レベルのグラフを提供する。 図１９は、ＦＣＸ－００７ ＧＭ－ＨＤＦにより産生される、ＮＣ１特異的抗体に対するＣ７三量体の免疫沈降を示すウエスタンブロットを記載する。 図２０は、Ｃ７とラミニン３３２又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コートウェルとの相互作用を検出するための結合アッセイについてのアッセイ読み出し（４５０ｎｍの光学密度（ＯＤ４５０））を示す。結合したＣ７は、Ｃ７ ＮＣ１特異的抗体及びＨＲＰ共役二次抗体を用いて検出した。 図２１Ａは、正常線維芽細胞及びＬＶ－ＣＯＬ７で形質導入した患者線維芽細胞の経時的な細胞遊走量をグラフとして示す。 図２１Ｂは、正常線維芽細胞及びＬＶ－ＣＯＬ７で形質導入した患者線維芽細胞の経時的な細胞遊走の画像を提供する。 図２２は、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のクローニングの概略図を提供する。 図２３は、ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクタートランスファープラスミド、ＩＧＥ２３０を作製するためのｐＳＭＰＵＷ発現ベクターへのＣＯＬ７Ａ１遺伝子のクローニングの概略図を提供する。 図２４は、ＩＮＸＮ－２００４レンチウイルスベクタートランスファープラスミド（ＩＧＥ３０８）の構築の概略図を提供する。 図２５Ａは、ＩＧＥ３０８プラスミドの遺伝子エレメントを概略的に描く。 図２５Ｂは、ＩＧＥ３０８プラスミドの遺伝子エレメントを概略的に描く。 図２６は、ＧＭ－ＨＤＦを注射した複合移植片の免疫蛍光分析を示す。 図２７は、対照細胞に対するその倍率変化の値によって測定されるＬＶ－ＣＯＬ７転写物レベルを示すグラフを提供する。 図２８は、ＩＮＸＮ－２００２及びＬＶ－ＨＡ－ＣＯＬ７形質導入ＲＤＥＢ線維芽細胞のＣ７染色の代表的な画像を提供する。 図２９は、ＴＲ８、ＴＲ９、Ｔ１０及びＥＲ１により形質導入されたＧＭ－ＨＤＦの細胞上清中で測定されるＣ７タンパク質レベルを示すグラフを提供する。 図３０は、ＴＲ８、ＴＲ９、Ｔ１０及びＥＲ１について、経時的なＧＭ－ＨＤＦの運動過剰の補正をグラフとして示す。 図３１は、２つの倍率、２０×及び５×で、Ｃ７に特異的な抗体を用いてＧＭ－ＨＤＦ細胞によるＣ７タンパク質発現を調べるための、代表的な間接的免疫蛍光（ＩＦ）画像を示す。（ＴＲ１２．１及びＴＲ１３については、アームＡのみ試験した。前の工程との比較のためにＴＲ８のアームＡのみを示す）。 図３２は、ＴＲ１１、ＴＲ１２．１及びＴＲ１３の各トレーニングランアームについて、ＧＭ－ＨＤＦのＣ７陽性（Ｃ７＋）細胞のパーセンテージを記載する。 図３３は、ＴＲ８、ＴＲ１１、ＴＲ１２．１、及び１３について発現されたＣ７タンパク質レベルの量を示すグラフを提供する。エラーバーは、標準偏差を示す；ｎ＝３。ＴＲ８、ＴＲ１２．１、及びＴＲ１３については、アームＡの結果のみを示す。 図３４は、Ｃ７三量体（ａ）ＴＲ１１、（ｂ）ＴＲ１２．１及びＴＲ１３ ＧＭ－ＨＤＦの検出のためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ／免疫ブロットを提供する。 図３５は、ＴＲ１１、ＴＲ１２．１及びＴＲ１３についてラミニン３３２（Ｌａｍ３３２）に結合するＧＭ－ＨＤＦにより発現されたＣ７のグラフを示す。 図３６は、ＴＲ１１、ＴＲ１２．１及びＴＲ１３について、ＧＭ－ＨＤＦの経時的な運動過剰（％遊走）の補正を示す細胞遊走アッセイの結果を提供する。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及び劣性栄養障害型表皮水疱症由来の対照線維芽細胞の運動過剰が示される。
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語並びにあらゆる略語は、本発明の技術分野の通常の技術者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似若しくは同等のあらゆる組成物、方法、キット及び情報連絡手段を用いて、本発明を実施することができるが、好ましい組成物、方法、キット及び情報連絡手段は本明細書に記載される。
本明細書で引用する全ての参照文献は、法律の及ぶ限り、参照により本明細書に組み込む。こうした参照文献についての論述は、その著者によって為された主張を要約することを意図するに過ぎない。いずれかの参照文献（又はいずれかの参照文献の１部分）が、関連する先行技術であるという承認は一切していない。本出願人は、引用したあらゆる参照文献の正確さ及び適切性に異議を唱える権利を留保する。
本発明をより分かりやすくするために、いくつかの用語を本明細書に定義する。更なる定義を詳細な説明の全体を通して記載する。
特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む」と一緒に用いられるとき、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ又は複数の」、「少なくとも１つの」、及び「１つ以上」の意味とも一致する。
本出願全体を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用される装置、方法に固有の誤差の変動、又は試験対象の間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。典型的には、この用語は、状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％未満の変動性を含むことを意味する。
特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、二者択一のみを指すことが明示されているか、又は二者択一が互いに排他的ではない限り、「及び／又は」を意味するために用いられるが、本開示は、二者択一のみ、並びに「及び／又は」を指す定義を支持する。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される通り、「含んでいる」（並びに「含む」及び「含む」などを含むあらゆる形態）、「有している」（並びに「有する」及び「有する」などを含むあらゆる形態）、「包含している」（並びに「包含する」及び「包含する」などを含むあらゆる形態）、又は「含有している」（並びに「含有する」及び「含有する」などを含むあらゆる形態）という語は、包括的であるか、又は制限がなく、従って、追加的な、記載されていない要素若しくは方法ステップを除外しない。本明細書で論じるあらゆる実施形態は、本発明の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、その逆も然りである。さらにまた、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することができる。
核酸及び／又は核酸配列は、それらが、共通の祖先核酸又は核酸配列から、天然若しくは人工的に得られる場合、「相同的」である。タンパク質及び／又はタンパク質配列は、そのコードＤＮＡが、共通の祖先核酸又は核酸配列から、天然若しくは人工的に得られる場合、相同的である。相同的分子は、ホモログと呼ぶことができる。例えば、本明細書に記載するように、任意の天然に存在するタンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発方法によって修飾することができる。発現されると、この突然変異誘発核酸は、元の核酸によりコードされたタンパク質と相同的であるポリペプチドをコードする。相同性は、一般に、２つ以上の核酸若しくはタンパク質（又はそれらの配列）同士の配列同一性から推定される。相同性を確立する上で有用な配列同士の同一性の正確なパーセンテージは、該当する核酸及びタンパク質によって変動するが、相同性を確立するために、少なくとも２５％の配列同一性が通常使用される。さらに、相同性を確立するために、より高レベルの配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上を用いることもできる。配列同一性パーセンテージを決定するための方法（例えば、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）が、本明細書に記載され、一般に利用可能である。
ポリペプチドの２つの核酸配列又はアミノ酸配列に関して、用語「同一」又は「配列同一性」は、指定の比較ウィンドウにわたる最大一致についてアラインメントしたとき、２つの配列内で同じである残基を指す。本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０、通常、約５０～約２００、より一般的には約１００～約１５０の連続した位置のセグメントを指し、ここで、２つの配列を最適にアラインメントした後、１つの配列を同じ数の連続位置の参照配列と比較することができる。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムにより；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のアラインメントアルゴリズムにより；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索方法により；これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（限定されないが、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ Ｃａｌｉｆ．，によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＢＬＡＳＴ，ＦＡＳＴＡ，ＴＦＡＳＴＡなど）により実施することができ；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７－２４４ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－１０８９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８：１５５－１６５；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：３０７－３３１によって十分に記載されている。また、アライメントは検査及びマニュアルアライメントによっても実施されることが多い。
１クラスの実施形態では、例えば、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰ（又はＣＬＵＳＴＡＬ、若しくはいずれか他の利用可能なアライメントソフトウエア）により測定して、本明細書のポリペプチドは、参照ポリペプチド、又はその断片と少なくとも７０％、一般的には少なくとも７５％、任意選択で少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％若しくは９９％以上同一である。同様に、核酸は、出発核酸に関して表すこともでき、例えば、これらは、例えば、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮ（若しくはＣＬＵＳＴＡＬ、又はいずれか他の利用可能なアライメントソフトウエア）により測定して、参照核酸又はその断片と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％以上同一であってよい。１分子が、より大きな分子と特定のパーセンテージの配列同一性を有するというとき、これは、２つの分子を最適にアラインメントしたとき、小さい方の前記パーセンテージの残基が、２つの分子が最適にアライメントされる順序に従って、大きい方の分子に一致する残基が見出されることを意味する。
核酸又はアミノ酸配列に適用される用語「実質的に同一の」は、核酸又はアミノ酸配列が、標準パラメータを用いた前述のプログラム（好ましくは、ＢＬＡＳＴ）を用い、参照配列と比較して、少なくとも９０％の配列同一性若しくはそれ以上、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは９８％及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、１１の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合には、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２）参照）を使用する。配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアライメントした配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アライメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、両配列中に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を取得し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割った後、その商に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出する。好ましくは、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０残基の配列の領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、少なくとも約１５０残基にわたり実質的に同一である。最も好ましい実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
本明細書に開示するタンパク質の「機能性変異体」は、例えば、少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０の保存的アミノ酸置換を含む参照タンパク質のアミノ酸配列を含んでもよい。フレーズ「保存的アミノ酸置換」又は「保存的突然変異」は、共通の特性を有する別のアミノ酸による１アミノ酸の置換を指す。個々のアミノ酸同士の共通の特性を決定する機能的方法は、同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）生物の対応するタンパク質同士のアミノ酸変化の標準化頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９））。こうした分析に従って、１群内のアミノ酸が優先的に互いと交換し、従って、タンパク質構造全体に対するその影響が互いに最も類似する、アミノ酸の群を定義することができる（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．前掲）。保存的突然変異の例として、前述の亜群内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、陽電荷が維持されるようにリシンによるアルギニン、及びその逆の置換；陰電荷が維持され得るようなグルタミン酸によるアスパラギン酸の、及びその逆の置換；遊離－ＯＨが維持され得るようにセリンによるトレオニンの置換；並びに遊離－ＮＨ２が維持され得るように、グルタミンによるアスパラギンの置換を含む。本発明の一実施形態では、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子は、変異体が、表皮と真皮の間の原線維を係留することができるという条件で、Ｃ７タンパク質又はその機能性変異体をコードする。
あるいは、又は追加的に、機能性変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を含む参照タンパク質のアミノ酸配列を含んでもよい。「非保存的突然変異」は、異なる群同士のアミノ酸置換、例えば、リシンによるトリプトファン、又はフェニルアラニンによるセリンの置換などを含む。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能性変異体を妨害しないか、又はその生物活性を阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能性変異体の生物活性が参照配列と比較して増加するように、機能性変異体の生物活性を増強し得る。
本明細書に開示するタンパク質（その機能性部分及び機能性変異体を含む）は、１つ又は複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含んでもよい。こうした合成アミノ酸は当技術分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３及びトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリン β－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リシン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リシン、６－ヒドロキシリシン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。
本発明は、ベクターＩＮＸＮ－２００２；及び本明細書でＩＮＸＮ－２００４とも呼ばれるＩＧＥ３０８、さらには、それらと実質的に同一及び／又は相同のベクター並びにそれらの機能性変異体を含む。
用語「患者」又は「被験者」は、ヒト及び動物をはじめとする哺乳動物を指す。
用語「治療すること」は、ＲＤＥＢ及び／又はＤＤＥＢをはじめとするＤＥＢの症状を軽減若しくは改善する、並びに／又はその再発及び／若しくは進行を阻止することを意味する。
用語「自家細胞」は、同じ個体から得られ、後に同じ個体に戻される細胞を指す。特に、細胞は、ＤＥＢ患者の身体から採取したものであってよく、続いて、これらの細胞を遺伝子改変し、培養して増殖させた後、それらが初めに採取された患者の身体に戻すことができる。
用語「形質導入」は、トランスフェクションではなく、ウイルス感染による、ウイルス若しくはレトロウイルスベクターを用いた遺伝子の送達を指す。
用語「形質導入用レンチウイルスベクター」又は「形質導入レンチウイルスベクター粒子」は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルス発現／トランスファープラスミドベクター、パッケージングベクター、及びエンベロープベクターを用いたパッケージング細胞株の同時トランスフェクトから形成される感染性レンチウイルスベクター粒子を指す。形質導入用レンチウイルスベクターは、トランスフェクション後のプロデューサ細胞培養物の上清から採取される。好適なパッケージング細胞株は、当技術分野で公知であり、例えば、２９３Ｔ細胞株がある。
用語「レンチウイルスベクター」は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲ外部の構造及び機能遺伝子エレメントを含有するベクターを指す。
用語「自己不活性型ベクター」（ＳＩＮ）は、Ｕ３領域として知られる３’ＬＴＲエンハンサー－プロモータ領域が、最初のウイルス複製ラウンド後のウイルス転写を阻止するように修飾されている（例えば、欠失又は置換により）ベクターを指す。その結果、ベクターは、宿主ゲノムに１回だけ感染して、これに組み込まれることができ、それ以上継代することはできない。ＳＩＮベクターは、３’ＬＴＲ Ｕ３領域が、第１複製ラウンド後のウイルス転写を阻止するように修飾されており、ウイルスが継代する能力を排除することから、不要な複製可能ウイルスを生成するリスクを大幅に低減する。
用語「薬学的に許容される担体」は、健全な医学的判断の範囲内で、自家遺伝子改変細胞の活性に影響を及ぼすことなく、また、ヒト及び動物の組織に対して毒性であることなく、又は刺激、アレルギー反応、若しくはその他の合併症を引き起こすことなく、自家遺伝子改変細胞との接触に使用に適しており、妥当なベネフィット／リスク比に相応する溶液を指すために本発明にて使用される。有用な薬学的に許容される担体は、自家遺伝子改変細胞と生体適合性であり、それらの活性を低減しないか、又はそれらの細胞死を引き起こさない注射液であってもよい。
本発明は、Ｃ７欠損症患者のための自家遺伝子改変細胞治療法に関する。「Ｃ７欠損症患者」は、真皮表皮接合部（ＤＥＪ）における係留線維の形成に重要なＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）が不足しているか、又はその生成が実質的に低下しているかのいずれかであるために、栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）を引き起こす。本発明は、線維芽細胞又はケラチノサイトなどのＤＥＢ患者細胞を採取すること、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を挿入するために、採取した細胞を遺伝子改変すること、遺伝子改変細胞を拡大すること、並びに遺伝子改変細胞の集団のＤＥＢ患者に投与して戻すことに関する。
細胞は、ＤＥＢに罹患している患者から採取する。線維芽細胞又はケラチノサイトが好ましい。細胞は、公知の方法で取得したものでよく、例えば、患者の皮膚サンプル、掻爬片、生検が挙げられる。一実施形態では、細胞は、ＤＥＢ患者の非水疱形成皮膚から取得する。別の実施形態では、細胞は、ＤＥＢ患者の水疱形成皮膚から取得する。ＤＥＢ患者から採取された細胞は、突然変異した非機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を有するか、又はその遺伝子が欠失しているかのいずれかである。これらの細胞は、標準的細胞培養技術を用いて培養する。採取された患者の細胞は、続いて、機能性ＶＩＩ型コラーゲン遺伝子（Ｃ７）又はその機能性変異体をコードする遺伝子材料を用いてエクスビボで処理する。
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子は、２９０ｋＤａα鎖をコードする核酸、配列番号１を有し、ここで、３つの鎖は、図１Ａに描くように、三重ヘリックス（三量体）を形成する。Ｃ７は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、真皮表皮接合部（ＤＥＪ）における係留線維の形成に重要なタンパク質である。Ｃ７遺伝子の突然変異は、表皮と真皮の結合を維持する係留線維を作り上げるＣ７の非存在又は低減を引き起こす。Ｃ７係留線維は、図１Ｂに示すように、他のコラーゲン、細胞外マトリックスタンパク質、並びに真皮と表皮との結合を媒介するＬａｍ３３２に結合する。係留線維が存在しないと、皮膚の水疱形成を引き起こす。本発明はまた、ＣＯＬ７Ａ１及びＣ７と実質的に同一の核酸及びポリペプチドを含むベクターの使用にも関する。別の実施形態では、本発明は、変異体が、表皮と真皮との間で線維を係留することができれば、ＣＯＬ７Ａ１又はＣ７タンパク質の機能性変異体をコードする核酸を含むベクターを包含する。本発明の別の態様は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子のオープンリーディングフレームのみの使用を含み、これは、Ｃ７タンパク質又はその機能性変異をコードする。一部の実施形態では、ＣＯＬ７Ａ１核酸は、当技術分野で周知のように、形質導入細胞におけるＣ７の発現増大のためにコドン最適化される。
本発明によれば、ＣＯＬ７Ａ１は、複製欠損及び自己不活性型である形質導入レンチウイルスベクターを用いて、採取されたＤＥＢ細胞に形質導入することができる。自己不活性型レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）に由来し、ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質ではなく異種ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を含む偽型である。これまでに報告されているように、４００ｂｐ欠失をＬＴＲのＵ３領域に導入することにより、自己不活性型（ＳＩＮ）ベクターが得られる（Ｚｕｆｆｅｒｙ １９９８）。本発明のベクターは、第２及び第３世代ＳＩＮベクターとは区別される。特に、本発明のベクターは、安全性を高めると共に、本明細書でさらに説明する通り、クローニング能力を増大するように修飾されている。
本発明の形質導入レンチウイルスベクターを構築するために用いられるベクターは、トランスフェクション又は感染により、パッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ベクターゲノムを含有する形質導入レンチウイルスベクター粒子を産生する。パッケージング細胞株に対するパッケージングベクター、トランスファーベクター、及びエンベロープベクターの同時トランスフェクションの後、培地から組換えウイルスを回収して、当業者により使用される標準的な方法により滴定する。このように、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションにより、一般に、優性選択マーカ（カナマイシン、ネオマイシン、ＤＨＦＲ、若しくはグルタミンシンテターゼなど）と一緒に、パッケージング構築物をヒト細胞株に導入することができ、続いて、適切な薬物の存在下での選択、及びクローンの単離を実施する。選択マーカ遺伝子は、構築物中のパッケージング遺伝子と物理的に連結させることができる。
パッケージング機能が、好適なパッケージング細胞により発現されるように構築された安定な細胞株は公知である。例えば、パッケージング細胞について記載する米国特許第５，６８６，２７９号明細書；及びＯｒｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）を参照されたい。レンチウイルスベクターが中に組み込まれたパッケージング細胞は、プロデューサ細胞を形成する。従って、プロデューサ細胞は、目的の治療遺伝子を担持するパッケージングされた感染ウイルス粒子を産生又は放出することができる細胞若しくは細胞株である。好適なレンチウイルスベクターパッケージング細胞株の例として、２９３細胞がある。
本発明の一実施形態では、形質導入レンチウイルスベクターは、以下：（ａ）修飾５’側の長末端反復配列（ＬＴＲ）を含むレンチウイルス発現プラスミドベクター（ここで、修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）（ｂ）ＣＯＬ７Ａ１遺伝子、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメント、及び（ｄ）修飾３’ＬＴＲ（ここで、修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含むと共に、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）の欠失を含む）から構築される。
本発明の別の態様では、欠失したＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）は、ウッドチャック転写後調節エレメントＰＲＥ（ＷＰＲＥ）である。
本発明の別の態様では、レンチウイルス発現プラスミドベクターは、２つ以上のレンチウイルス中央ポリプリン配列（ｃＰＰＴ）エレメントを含む。ｃＰＰＴエレメントの組込みは、遺伝子発現レベルを高めることが判明している。
本発明の別の態様では、３’ＬＴＲは、一般に用いられる標準的な第３世代ＳＩＮ ＬＶベクターの１３３ｂｐ欠失ではなく、４００ｂｐ断片（Ｚｕｆｆｅｒｙ １９９８により開示の通り）を欠失するように修飾してもよい。４００ｂｐの欠失は、読み通し転写を阻止することにより安全性を高め、さらには、ベクター転写物はパッケージング細胞中でより安定していることから、ウイルス力価を増加すると考えられる。
本発明のまた別の態様では、レンチウイルス発現プラスミドに、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）（好ましくは、ウッドチャック転写後調節エレメントＰＲＥ（ＷＰＲＥ）である）を組み込んでもよい。ＷＰＲＥは、ベクターのウイルス力価を高めることが判明している。
ｃＰＰＴの添加、及び修飾３’ＬＴＲ欠失は、本発明のＣＯＬ７Ａ１遺伝子を含むレンチウイルスベクターの機能を改善して、遺伝子発現レベル、ウイルス力価、及び安全性を高めることがわかっている。
本発明は、さらに、第３世代レンチウイルス発現ベクターに共通する特定のエレメントが欠失しているレンチウイルス輸送ベクターの使用を含む。特に、ヒトヒンジにおけるレンチウイルスベクターの使用についての安全性の懸念は、第３世代レンチウイルスベクターの分断ゲノム同士の再組換えから生じ得る複製可能レンチウイルスを作製する不安に関するものである（Ｔａｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。他のヘルパープラスミドとの配列相同性を低減し、これによってヒトに対する安定性を高めるために、ｇａｇ配列及び／又はｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）をウイルスベクターから欠失させてもよい。従って、本発明の一実施形態では、ｇａｇ配列はベクターに存在しない。本発明の別の実施形態では、ｇａｇ配列及びＲＲＥの両方がベクターに存在しない。
本発明のレンチウイルスベクターを作製するための出発材料は、好ましくは、大きなＣＯＬ７Ａ１遺伝子（８．８９ｋｂｐ）又はその機能性変異体の挿入に適応し得るｃＰＰＴ及びＰＲＥを含むレンチウイルス発現プラスミドベクターである。好ましくは、本発明の形質導入用レンチウイルスベクターを構築するための出発材料は、レンチウイルス発現プラスミドベクター、ｐＳＭＰＵＷ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びｐＦＵＧＷ（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から選択される。
本発明の一態様では、形質導入用レンチウイルスベクターの構築のためにｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現プラスミドベクターを選択する。図６は、ｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現プラスミドベクターにおける遺伝子エレメントの概略図を示す。ｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現ベクターの特徴は、図７に描かれるように、遺伝子発現レベル及び安全性を高めるために、第３世代レンチウイルス発現ベクターから修飾されている。特に、ｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現ベクターは、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）、続いてウッドチャック肝炎ウイルス（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をコードする。残ったｇａｇ（Δｇａｇ）及びＲＲＥエレメントは、ｐＳＭＰＵＷベクター構築物から除去した。さらに、ｐＳＭＰＵＷベクター構築物は、標準的な第３世代ＳＩＮ ＬＶベクターにおいて一般に使用される１３３ｂｐ欠失ではなく、３’ＬＴＲ Ｕ３領域において、より大きな４００ｂｐ欠失を使用した。野生型ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をｐＳＭＰＵＷベクターに組み込んだ。
本発明の別の態様では、形質導入レンチウイルスベクターの構築のためにｐＦＵＧＷレンチウイルス発現プラスミドが選択される。図８は、このプラスミドベクターにおける遺伝子エレメントの概略図を示す。ｐＦＵＧＷベクターの特徴は、ＲＲＥ、２つのｃＰＰＴエレメント、及びＷＰＲＥエレメントを含み、これらは、レンチウイルス産生及びトランスジーン発現を改善し得る。
本発明の別の態様では、ＷＰＲＥエレメントは、レンチウイルスベクターから欠失されている。
本発明の一実施形態では、本発明の形質導入用レンチウイルスベクター粒子は、ＩＮＸＮ－２００２（ベクタートランスファープラスミド－ＩＧＥ２３０）又はＩＮＸＮ－２００４（ベクタートランスファープラスミド－ＩＧＥ３０８）と称されるか、あるいは、その機能性変異体を含む実質的に同一のベクターである。
ＤＥＢ患者から採取した細胞を機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子で形質転換する。本発明の一態様では、細胞は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を有するレンチウイルスベクターで形質導入する。本発明の別の態様では、レンチウイルスベクターは、自己不活性ベクターである。組み込まれたトランスジーンのコピー数は、いずれか公知の方法を用いて評価することができる。例えば、定量ＰＣＲ、多重連結依存性プローブ増幅、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイによるコピー数スクリーニング、及び通常の核型分析によって、コピー数を決定してもよい。各細胞に組み込まれたトランスジーンのコピー数は、製造中に細胞に投与するウイルス用量によってモジュレートしてもよい。ＣＯＬ７Ａ１含有ベクターで形質導入されたＲＤＥＢ採取細胞における細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数は、用量依存的である。
ＤＥＢ患者から採取して、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子で形質転換した細胞は、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を有し、正常細胞の形態を呈するであろう。これらの細胞は、標準的な培養技術を用いて、培地中で増殖又は拡大させてもよい。
本発明の範囲内のＣＯＬ７Ａ１形質導入用ベクターで形質導入した、採取線維芽細胞において、正常線維芽細胞の形態学的特徴が観察される。例えば、正常線維芽細胞形態は、細い延長部を含む縦長の紡錘形又はスピンドルの外観を呈示する細胞を含む。正常な形態は、さらに、より大型の平板な星細胞を含み、これらは、細胞質最先端を有していてもよい。図９は、ＣＯＬ７Ａ１形質導入用ベクターで形質導入した線維芽細胞の正常細胞形態の一例を示す。
ＣＯＬ７Ａ１形質導入用ベクターで形質導入した、採取ＤＥＢ患者細胞により産生されるＣ７の生産も観察されている。特に、Ｃ７三量体の形成は、係留線維のアセンブリーにおいて重要である。ＣＯＬ７Ａ１形質導入用ベクターで形質導入したＤＥＢ患者細胞は、正しい構造、サイズ及び機能を有するＣ７三量体を形成することができることが判明している。
本発明の一態様では、ＣＯＬ７Ａ１形質導入用ベクターで形質導入した線維芽細胞により発現されたＣ７は、抗Ｃ７特異的抗体との免疫沈降を用いて、係留線維を形成できることを確認することが可能である。例えば、抗Ｃ７特異的抗体、ｆＮＣ１は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／免疫ブロットによる検出のための培養上清からのＣ７の選択性捕捉及び濃縮のために使用してもよい。例えば、図９及び１０は、ＣＯＬ７Ａ１形質導入用ベクターで形質導入した線維芽細胞により産生されるＣ７が、主に三量体であったことを明らかにする。
本発明の別の態様では、Ｃ７の機能は、ラミニン結合アッセイ又は細胞遊走アッセイの使用などの公知の方法を用いて評価することができる。Ｃ７は、フィブロネクチン、ラミニン３３２（Ｌａｍ３３２）、ＣＯＬ１、及びＣＯＬ４をはじめとする固定化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分と結合することがわかっている（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２ａ）。Ｃ７とＬａｍ３３２同士の相互作用は、Ｃ７のＮＨ２－末端ＮＣ１ドメインによって起こり、これは、Ｌａｍ３３２及びＣ７ ＮＣ１両方のネイティブ立体構造に依存する（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｃ７とＬａｍ３３２同士の結合は、真皮表皮接合部における正しいＬａｍ３３２構造を確立する上で重要である。こうした組織化は、細胞外リガンド及び表面受容体との相互作用にとって、さらにはシグナル伝達にとって重要である（Ｗａｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００７）。本発明の一態様では、精製済Ｌａｍ３３２とＣ７の結合を検出するために、Ｃ７ ＮＣ１ドメインに対する抗体を用いるＥＬＩＳＡが開発されている。Ｃ７／Ｌａｍ３３２と結合するＥＬＩＳＡは、文献（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２ａ）に記載されているが、本発明者らの知る限り、形質導入細胞の上清中に存在するＣ７を試験するために使用されたことは一度もなかった。図１２の結果は、トレーニング（Ｔｒａｉｎｉｎｇ）及びエンジニアリング（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ランからのＧＭ－ＨＤＦによって発現されるＣ７のＬａｍ３３２に対する用量依存性結合を示している。
さらに、細胞遊走アッセイを用いて、機能性Ｃ７活性を評価することができる。これまでの試験によって、ＲＤＥＢ線維芽細胞及びケラチノサイトが、それらの正常対応物と比較して運動性増大を示すこと、並びに、Ｃ７の発現により正常な運動性が回復され得ることが判明した（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２ｂ；Ｃｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｂａｌｄｅｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。好適なアッセイとしては、線維芽細胞及びケラチノサイトの遊走を測定するためのコロイド状金塩遊走アッセイ、又はケラチノサイトの遊走を測定するための創傷治癒アッセイが挙げられる。機能性Ｃ７活性を有する細胞は、こうしたアッセイにおいて、ＲＤＥＢ細胞よりも低い運動性を呈示するであろう。
本発明は、一態様では、ＤＥＢ患者由来の自家遺伝子改変細胞を含む医薬製剤に関する。これらの細胞は、細胞を初めに採取した患者への送達に好適な任意の量で存在してよい。例えば、上記の細胞は、１．０～５．０×１０７細胞／ｍＬ、１．０～４．０×１０７細胞／ｍＬ、１．０～３．０×１０７細胞／ｍＬ、又は１．０～２．０×１０７細胞／ｍＬの細胞濃度で存在してよい。細胞は、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの細胞の生存能を持続する上で好適な懸濁液中に存在する。特に、製剤中の細胞の生存率は、≧６０％、７０％、７５％又は８０％の量で存在する。好適な賦形剤は、自家遺伝子改変細胞を含有する解凍バイアルから細胞を洗浄するのに用いることができるリン酸緩衝食塩水などの製剤中に存在してもよい。
本発明の自家遺伝子改変細胞は、少なくとも又は約０．０５、０．０９、０．４１若しくは０．７４、又は約０．１～約６．０、約０．１～約５．５、約０．１～約５．０、約０．１～約４．５、約０．１～約４．０、約０．１～約３．５、約０．１～約３．０、約０．１～約１、約０．４～約１、若しくは約０．４～約０．７５の範囲の形質導入用ベクターコピー数を有する。好ましくは、形質導入用ベクターコピー数は、約０．１～約５．０の範囲である。形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトは、スピノキュレーション又は超形質導入に付していない形質導入組成物と比較して、細胞当たり少なくとも又は約１、２、５、１０、２０、２５、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、若しくは５０倍多い組込みトランスジーンコピー数を有する。さらに、本発明のＦＣＸ－００７細胞のＣ７タンパク質発現値は、≧３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は６００ｎｇ／日／Ｅ６細胞である。好ましくは、本発明の自家遺伝子改変細胞のＣ７タンパク質発現値は、≧５００ｎｇ／日／Ｅ６細胞である。本発明は、Ｃ７の発現が、スピノキュレーション又は超形質導入に付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比較して、１０、２５、１００、１５０、又は２００倍増大することも見出した。
感染多重度（ＭＯＩ）は、形質導入に用いた細胞当たりのベクター粒子の数を指す。本発明によれば、以下の実施例に示すように、ＭＯＩが低下しても、所望の形質導入用ベクターコピー数が達成された。例えば、本発明は、≦１５、≦１４、≦１３、≦１２、≦１１、又は≦１０のＭＯＩに関する。好ましくは、ＭＯＩは、約１～１０である。
本発明の製剤を用いて、ＶＩＩ型欠損を患う患者の様々な疾患を治療することができる。特に、本発明の製剤は、ＤＤＥＢ又はＲＤＥＢをはじめとするＤＥＢを治療するのに好適である。本発明の一実施形態では、ＲＤＥＢの亜型を治療することも可能であり、そうした亜型として、限定されないが、アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型、非アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、異型ＲＤＥＢ、前脛骨性ＲＤＥＢ、末端性ＲＤＥＢ、及び求心型ＲＤＥＢが挙げられる。
本発明は、さらに、Ｃ７欠損に起因する様々な症状の治療、軽減、予防、及び／又は阻害に関する。例えば、ＤＥＢは、水疱形成後に瘢痕化を招くと知られており、これが、拘縮変形、嚥下障害（口腔及び食道が罹患している場合）、指及び足指の合着、並びに運動制限の原因となり得る。従って、本発明の一態様では、ミトンハンド症候群としても知られる偽合指症の治療、軽減、阻害、及び／又は予防を考察する。別の態様では、本発明は、例えば、新生児稗粒腫、関節拘縮、全身性軟部組織線維症、臓器線維症、角膜病変、瘢痕性プラーク、瘢痕性脱毛症、爪ジストロフィー、舌癒着、及び虫歯の頻度増加を引き起こし得るＲＤＥＢ及び／又はＤＤＥＢに関連する深部線維症及び／又は瘢痕化の治療、軽減、阻害、及び／又は予防に関する。別の態様では、本発明は、ＲＤＥＢに関連する口腔粘膜病変及び胃腸病変の治療、軽減、予防、及び／又は阻害に関する。別の実施形態は、ＤＥＢ患者に関連する水疱の治療、予防、軽減、及び／又は阻害に関する。
自家遺伝子改変細胞の投与は、当業者が、患者の必要に基づいて決定することができる任意の適切な時間に実施してよい。例えば、投与は、１回、１日１回、月１回、３ヵ月に１回、又は年１～２回実施してよい。
自家遺伝子改変細胞を含有する本発明の製剤は、限定されないが、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みを含む、いずれか公知の方法によって、患者に投与してよい。注射は、例えば、腸管外、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、動脈内、眼内及び腹腔内、又は例えば、前立腺若しくは肝臓などの特定の器官／組織への直接注射であってよい。局所投与の場合、製剤は、病変の部位などの患部に直接投与してもよい。製剤を当該部位に直接適用する前に、患部組織の創傷清拭を実施することができる。あるいは、製剤を好適なポリマーカプセルなどの好適な送達系に封入するか、又は生体適合性マトリックス若しくは移植片、例えば、コラーゲンマトリックス、ハイドロゲル、皮膚移植片、若しくはメッシュに埋め込んでもよい。
本発明の自家遺伝子改変細胞は、単独で、又はＤＥＢ患者のための他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。ＤＥＢを治療するために用いられる治療薬の例として、Ｚｏｒｂｌｉｓａなどの局所治療薬、皮膚移植片、抗炎症薬、抗体、他の有望な遺伝子又は細胞ベースの治療薬が挙げられる。別の実施形態では、本発明の修飾細胞は、骨髄移植療法（又は間葉系幹細胞などの他の系統細胞療法）が十分な治療を提供しなかった皮膚又は粘膜領域に対して投与してもよい。他の治療薬との併用によって自家遺伝子改変細胞のＣ７発現能力が損なわれないことが好ましい。
本発明は、さらに、Ｃ７欠損症患者から得られ、本発明に従って形質導入された、遺伝子改変細胞中の細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数を増大又は増加する方法に関する。特に、形質導入中の特定のステップが、これらの細胞中のトランスジーンのコピー数を実質的に増大したことが判明している。本発明の一態様では、Ｃ７欠損症患者から得た細胞を本発明のレンチウイルスベクターと接触させて、その組成物をスピノキュレーション（スピン形質導入としても知られる）に付す。この方法では、レンチウイルスベクターを標的細胞上で旋回させる。スピノキュレーションの追加は、スピノキュレーション又は形質導入なしの形質導入と比較して≧２倍のレベルで、遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞における細胞当たりのコピー数を予想外に増加した。しかし、コピー数を増加する別の方法を見出すために、標的細胞をスピノキュレーションによる第１の形質導入を介して継代し、続いて、任意選択でスピノキュレーションによる第２の形質導入により継代させる、第２の形質導入ステップ（又は超形質導入）が思いがけなく判明した。このようにして、スピノキュレーションを用いたこの超形質導入が、スピノキュレーション又は超形質導入を含まない本来の伝統的形質導入方法と比べ、コピー数をさらに２倍増加することが判明した。
別の実施形態では、ＩＮＸＮ－２００２からＩＮＸＮ－２００４にレンチウイルスベクターを変えることによって、スピノキュレーション又は超形質導入なしの伝統的形質導入と比べ、遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞におけるトランスジーンコピー数を４倍増加することが判明した。
組込みトランスジーンコピー数を広範囲に評価することによって、スピノキュレーションの追加、スピノキュレーションによる超形質導入の追加、及びＩＮＸＮ－２００２からＩＮＸＮ－２００４への変更という累加変更が、スピノキュレーション又は超形質導入を含まない本来の伝統的形質導入方法と比べ、予想外にも、コピー数を＞２７倍増加することが判明している（実施例９を参照：本来の試験でのＴＲ８（スピノキュレーション又は超形質導入を含まなかった）とＴＲ１２．１及びＴＲ３を比較）。従って、本発明は、Ｃ７欠損症患者からの形質導入細胞のコピー数の増加に関する。
本発明をさらに説明するために、以下の非限定的例を記載する。
ＦＣＸ－００７は、レンチウイルスベクター（ＩＮＸＮ－２００２）（実施例１に示す通り）又はレンチウイルスベクター（ＩＮＸＮ－２００４）（実施例２に示す通り）のいずれかを用いて、ヒト７型コラーゲンタンパク質を発現するように、遺伝子改変された、生存自家ヒト皮膚線維芽細胞の懸濁液である。
実施例１
Ａ．レンチウイルスベクターＩＮＸＮ－２００２で形質導入したＦＣＸ－００７の構造及び特徴の解明
レンチウイルスベクターＩＮＸＮ－２００２細胞由来のＦＣＸ－００７細胞を、ウシ胎児血清を含まないイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（５０．０％）、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ－ＣＤＭＴＭ（４２．５％）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（７．５％）から構成される凍結保存培地中に懸濁させる。ＦＣＸ－００７原薬（ＤＳ）の構造的特徴は、自家ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）の一次構造と、ＨＤＦ細胞を形質導入及び遺伝子改変するために用いられるレンチウイルスベクターの構造とを含む。
Ｂ．レンチウイルスベクター（ＩＮＸＮ－２００２）
ヒトコラーゲン７Ａ１遺伝子をＨＤＦ細胞に形質導入及び導入するために用いられるＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、ヒトコラーゲン７Ａ１遺伝子をコードする組換えレンチウイルスベクターである。ＩＮＸＮ－２００２ＬＶは、異種ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質で偽型化されたヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）を基材として構築された自己不活性型（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである。ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクターのウイルス粒子は、直径約１２０ｎｍであり、一本鎖ＲＮＡゲノムの２つのコピーを含む多数のタンパク質から成る。具体的な分子式、分子量、又は立体化学は入手できない。
ＩＮＸＮ－２００２ＬＶの構造的特徴は、ＲＮＡウイルスゲノムの一次構造とウイルス粒子の構造とを含む。ＩＮＸＮ－２００２のＲＮＡゲノムの一次構造は、ウイルスゲノムの全ヌクレオチド配列決定によって決定される。ウイルス粒子構造は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質偽型化が追加されたＨＩＶ－１の粒子構造から推定される。核酸構造及びウイルス粒子の構造の概略を以下に記載する。
Ｃ．ＩＮＸＮ－２００２ＲＮＡウイルスゲノム構造
ＩＮＸＮ－２００２ＬＶは、ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質ではなく、異種ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質で偽型化されたヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）を基材として構築された自己不活性型（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである。４００ｂｐ欠失をＬＴＲのＵ３領域に導入することによって、自己不活性型（ＳＩＮ）ベクターが得られる（Ｚｕｆｆｅｒｙ １９９８）。ＩＮＸＮ－２００２ＬＶの構築のためにｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現プラスミドベクター（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を選択した。図６は、ｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現プラスミドベクターの遺伝子エレメントの概略図を示す。
ＨＩＶ－１ウイルスの５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ間のコードエレメントを完全に除去する。ベクターは、マルチクローニング部位、続いて、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）をコードする。ベクターのクローニング能力を最大にするために、マルチクローニング部位からのＢａｍＨＩと、３’左末端反復配列の５’末端のＫｐｎＩでベクターを消化することによって、これらのエレメントを除去した。ＣＭＶプロモータを含むＣＯＬ７Ａ１遺伝子発現カセットを、一本鎖アニーリングにより消化済ベクター中にクローニングして、図１３に示すようにＣＯＬ７Ａ１遺伝子をコードするレンチウイルスベクタープラスミド構築物を作製する。
レンチウイルスベクタープラスミド構築物を、３つのヘルパープラスミド（ｐＣＭＶ－Ｇ、ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２及びｐＣｇｐ）を含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトして、ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクター粒子を生成する。ｐＣＭＶ－Ｇプラスミドは、ＶＳＶ－Ｇ偽型化表面タンパク質を提供し、ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２は、効率的なＲＮＡ輸送及びパッケージングのためにＨＩＶ－１ Ｒｅｖタンパク質を提供し、ｐＣｇｐは、ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクター粒子製造のための構造タンパク質及びウイルス酵素タンパク質を提供する。図１４は、ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクターのプロウイルスＲＮＡゲノム構造の概略図を示す。
Ｄ．ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクター粒子構造
ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１由来のベクターバックボーンを基材として構築され、ＨＩＶ－１ウイルスと類似したウイルス粒子構造を有する。図９は、ＨＩＶ－１粒子の電子顕微鏡写真を示す。
ＨＩＶ－１粒子は、約１２０ｎｍ径の球形をしており、２７７ＭＤａの推定分子量を有する（Ｃａｒｌｓｏｎ ２００８）。この粒子は、エンベロープタンパク質が短く突出した脂質二層膜を有する。エンベロープタンパク質は、感染及び標的細胞へのＲＮＡウイルスゲノムの送達のために、標的細胞上の受容体と相互作用する。ウイルスＲＮＡゲノムの２つの鎖が収容される円錐形の核－コアをウイルス粒子内部に観察することができる。円錐形の核－コアは、ウイルスカプシドタンパク質により形成される。
ＩＮＸＮ－２００２の場合、ＶＳＶ－Ｇ（水胞性口炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ））をＨＩＶ－１エンベロープタンパク質の代替物として使用すると、ベクター安定性、標的細胞指向性、及び形質導入効率（Ｃｒｏｎｉｎ ２００５）の向上が達成される。
製造中、ＩＮＸＮ－２００２ウイルス粒子は、アセンブルして、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面から発芽する。ＶＳＶ－Ｇタンパク質は、ｐＣＭＶ－Ｇヘルパープラスミドにより供給され、ベクターコア及び酵素タンパク質は、ｐＣｇｐヘルパープラスミドにより供給され、ウイルス粒子への効率的なＲＮＡゲノム輸送及びパッケージングに必要なＲｅｖタンパク質は、ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２プラスミドにより供給される。Ｖｐｕ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、及びＴａｔをはじめとする他のＨＩＶ－１補助タンパク質は全て、ＩＮＸＮ－２００２ベクターから除去されることが指摘される。
プロデューサ細胞表面からの発芽後、ウイルス粒子内部にパッケージされたプロテアーゼ酵素が、Ｇａｇ前駆タンパク質をその構成タンパク質（ＭＡ、ＣＡ、ＮＣ）に切断して、未成熟ビリオンを成熟した感染ＩＮＸＮ－２００２ベクター粒子に変換する。図１５は、成熟ＩＮＸＮ－２００２ウイルス粒子の詳細を描く概略図を示す。
ＩＮＸＮ－２００２ＲＮＡゲノムの２つの鎖は、カプシドタンパク質（ＣＡ）により形成される円錐形コア内部にパッケージされる。ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質は、カプシドコア内部のＲＮＡゲノムと安定な複合体を形成する。マトリックスタンパク質は、膜の内側表面上にコートを形成する。ウイルスは、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質をスパイクした細胞膜を通って成長し、脂質エンベロープを形成する。ＨＩＶ－１ウイルス粒子構造についての近年の３次元解析（Ｃａｒｌｓｏｎ ２００８）に基づいて、表１に、ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクターを構成する構成タンパク質、並びに構成要素各々の機能の簡単な説明を示す。
Figure 2023036685000002
Ｅ．ＩＮＸＮ－２００２特性決定
表２は、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅにより製造されたＩＮＸＮ－２００２の特性決定アッセイ及び詳細事項のリストを記載する。特性決定アッセイの結果は、ＩＮＸＮ－２００２ロット番号０７８６－２４０－０００２－１について添付のＣｏＡに記載され、これは、ＦＣＸ－００７臨床製剤の製造での使用が意図されるロットである。
Figure 2023036685000003
Ｆ．インビトロ不死化アッセイによるＩＮＸＮ－２００２の特性決定
インビトロ不死化（ＩＶＩＭ）アッセイを用いて、ＩＮＸＮ－２００２の挿入遺伝毒性の可能性を評価した。試験は、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＣＨＭＣ）で実施した。
ＩＶＩＭ試験の原理は、正常な骨髄（ＢＭ）系統陰性（Ｌｉｎ－）細胞が、インビトロで３～４週間後に増殖を停止するが、癌原遺伝子のアップレギュレーションを招く特定のベクター組込みの存在下では、一部のクローンが、５週間以上経っても増殖し続けるであろうという理解に基づく。こうした不死化クローンの数が、ベクターの発癌性を表す。不死化クローンを拡大し、ＦＡＣＳにより幹細胞マーカについて、ｑＰＣＲによりベクターコピー数を、又はＬＡＭ－ＰＣＲにより組込みの部位についてさらに分析する。Ｅｖｉ１又はＰｒｄｍ１６などの共通の組込み部位（シス）への挿入が、ＩＶＩＭアッセイで作製された不死化クローンにおいて頻繁に観察されている（Ｃａｌｍｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｍｏｄｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００８）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの骨髄（ＢＭ）系統陰性（Ｌｉｎ－）細胞を、系統特異的抗体を用いた磁気選別により完全ＢＭから単離した。次に、Ｌｉｎ－ＢＭ細胞を培養し、完全増殖培地中で２日間刺激した。４日目に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（１０μｇ／ｃｍ２、Ｔａｋａｒａ）でコーティングした４８ウェルプレート内で、ＩＮＸＮ－２００２ベクターを用いて細胞を形質導入した。図１６は、ＩＶＩＭアッセイの概略的配置を示す。
Ｌｉｎ－ＢＭ細胞に対するＩＮＸＮ－２００２形質導入効率を増大するため、ＩＮＸＮ－２００２ベクターを約１４倍濃縮した。形質導入のために、８０μＬの濃縮ＩＮＸＮ－２００２を、１５０μＬの形質導入培地と共に１．５×１０５細胞を含有する各ウェルに添加した。３２℃で、プレートを１０００ｇで７０分間遠心分離する（スピノキュレーション）ことにより、形質導入効率をさらに増大した。細胞を３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで一晩インキュベートした。
形質導入されたＬｉｎ－ＢＭ細胞中に高いＩＮＸＮ－２００２ベクターコピー数を達成するために、ＩＮＸＮ－２００２形質導入を５日目、６日目、及び７日目に反復して、計４回の連続形質導入を行った。
形質導入されたＬｉｎ－ＢＭ細胞を１０日間拡大し、細胞濃度を２日毎に２～４×１０５細胞／ｍｌに調節して、必要に応じて新鮮な培地を供給した。形質導入後１０日目に細胞を採取し、カウントした。次に、細胞の一部をＤＮＡ単離及びｑＰＣＲのために提出して、ベクターコピー数（ＶＣＮ）を決定した。残った細胞は、１８～２１日目の間に可能性があるＩＶＩＭアッセイの平板培養のために培地に戻した。
表３は、１０日目に採取したＩＮＸＮ－２００２形質導入Ｌｉｎ－ＢＭ細胞のパイロット試験ランの結果を示す。
Figure 2023036685000004
濃縮ＩＮＸＮ－２００２ベクター及び４回の連続スピノキュレーション形質導入の使用にもかかわらず、Ｌｉｎ－ＢＭ細胞で達成されたベクターコピー数は、ＩＶＩＭ試験について予想された１～３の目標コピー数よりも有意に低かった。パイロット試験を終了した。
ＩＶＩＭアッセイで得られた低いベクターコピー数、並びにＲＤＥＢ線維芽細胞形質導入ランの全てで達成された低いベクターコピー数によって、ＩＮＸＮ－２００２のこのロットは、ＲＤＥＢ線維芽細胞を形質導入するために用いた場合、呈示する挿入遺伝毒性リスクが最小限であると考えられる。ＩＶＩＭアッセイによるＩＮＸＮ－２００２のこのロットのこれ以上の分析は続行しなかった。
Ｇ．ＩＮＸＮ－２００２で形質導入されたＦＣＳ－００７
ＦＣＸ－００７の製造に用いるヒト皮膚線維芽細胞は、生きた皮膚生検に由来する。Ｌｉｂｅｒａｓｅ（登録商標）を用いて生検を消化することにより皮膚線維芽細胞を放出させた後、標準的な細胞培養技術を用いて細胞を拡大する。ＩＮＸＮ－２００２形質導入後の培養拡大の終了時に、細胞を採取し、洗浄した後、１．０～３．０×１０７細胞／ｍＬを含有するように製剤化する。ＤＳを純度について試験し、ＣＤ９０染色により、≧９８％線維芽細胞を含有すると共に、細胞生存率が≧８５％であることを確認する。
ＤＳ製剤においてＩＮＸＮ－２００２ＬＶで形質導入されたＦＣＸ－００７細胞は、組織培養表面上で培養されたとき典型的な線維芽細胞形態を呈示する。具体的には、細胞は、細い延長部を含む縦長の紡錘形又はスピンドルの外観を呈するか、あるいは、細胞質最先端を有し得る、より大型の平板な星細胞の外観を呈する場合もある。また、これらの形態の混合も観察され得る。図１７は、培養中のＦＣＸ－００７ＤＳの典型的な細胞形態及び構造を示す。
細胞は、線維芽細胞特異的マーカ、ＣＤ９０（Ｔｈｙ－１）、３５ｋＤａ細胞表面糖タンパク質、及び各種コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質をはじめとする、正常線維芽細胞に特有なタンパク質を発現する。
Ｈ．レンチウイルスベクターＩＮＸＮ－２００２由来のＦＣＸ－００７：原薬放出特性
製造中の３段階：製造過程、バルクハーベスト、及び凍結保存後に、ＦＣＸ－００７原薬（ＤＳ）を特性決定する。表４は、ＰＣＴにより製造されたＦＣＸ－００７ＤＳの放出についての特性決定アッセイ及び明細のリストを示す。完成原薬についての特性決定アッセイ結果は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｒｕｎ ８ Ａｒｍ Ａ、Ａｒｍ Ｂ及びＡｒｍ Ｃ（非形質導入対照）について添付のＣｏＴに記載する。
Figure 2023036685000005
Ｉ．ＩＮＸＮ－２００２由来のＦＣＸ－００７ＤＳの更なる特性決定
機能性Ｃ７の発現を確認するために、トレーニング製造ランについてＦＣＸ－００７の更なる特性決定を実施する。以下に示す代表的な評価は、Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｒｕｎ ８（ＴＲ８）からのものであり、この場合、細胞は、多量（３．４ＩＵ／細胞）又は少量（１．７ＩＵ／細胞）のＬＶ－ＣＯＬ７のいずれかで形質導入するか、又はモック形質導入した。これらの形質導入アームは、それぞれアームＡ、Ｂ、及びＣとも称される。
Ｊ．ＩＮＸＮ－２００２で形質導入したＦＣＸ－００７ＤＳ：Ｃ７発現レベル
酵素連結免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が、ＦＣＸ－００７によるＣ７発現を定量する目的で開発された。このアッセイのために、ＴＲ８原薬バイアル（高用量、低用量、及びモック形質導入）を解凍し、３日間培養した後、順化細胞培養上清を収集し、Ｃ７についてアッセイした。図１８の結果は、ウイルス用量依存性タンパク質発現を示し、これは、ＬＶ－ＣＯＬ７形質導入細胞において６０～１２０ｎｇ／ｍＬのＣ７である。
Ｋ．ＩＮＸＮ－２００２で形質導入されたＦＣＸ－００７：Ｃ７三量体形成
Ｃ７三量体の集合体から係留線維を形成する。Ｃ７の免疫沈降、続いて、非変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析により、ＦＣＸ－００７によるＣ７三量体の適切な発現及び形成を検出した。図１９では、ＮＣ１－特異的抗体を用いた凍結後の継代１及び継代２で、ＦＣＸ－００７細胞培養上清から、Ｃ７を免疫沈降させ、非変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離した後、ウエスタンブロットにより視覚化した。ＲＤＥＢ線維芽細胞により産生されるＣ７は、主として三量体（赤色の矢印、約８７０ｋＤａ）であり、モック形質導入細胞（アームＣ、星印）よりも多くのＣ７を発現するＬＶ－ＣＯＬ７形質導入細胞（形質導入アームＡ及びＢ）を含んだ。単量体（２９０ｋＤａ）及び二量体（５８０ｋＤａ）形態も観察された。アッセイ対照は、精製済Ｃ７（Ｐｕｒ ＣＯＬ７）の免疫沈降と、抗体又は試験サンプルを含まない免疫沈降（ＩＰ対照）を含んだ。
Ｌ．ＩＮＸＮ－２００２で形質導入されたＦＣＸ－００７：Ｌａｍ３３２と結合するＣ７
Ｃ７は、真皮／表皮接合部（ＤＥＪ）でＬａｍｉｎｉｎ３３２と相互作用する。Ｃ７とＬａｍｍｉｎ３３２同士の相互作用は、係留線維の機能性にとって重要である（Ｃｈｅｎ ２００２，Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ １９９７，Ｗａｔｅｒｍａｎ ２００７）。この相互作用の検出のための結合アッセイは、Ｉｎｔｒｅｘｏｎで開発された。原薬バイアル（高用量、低用量、及びモック形質導入）を解凍し、２日間培養した。順化細胞培養上清を収集し、Ｌａｍ３３２又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングしたウェルとインキュベートし、Ｃ７ ＮＣ１特異的抗体及びＨＲＰ共役二次抗体を用いて、結合Ｃ７を検出した。アッセイ読み出しは、４５０ｎｍ（ＯＤ４５０）の光学密度である。図２０の結果は、ＢＳＡ対照と比較した、Ｌａｍ３３２とのウイルス用量依存性結合を示す。
Ｍ．ＩＮＸＮ－２００２由来ＦＣＸ－００７遊走評価
Ｃ７の機能を評価するために、遊走アッセイが開発された。Ｃｈｅｎ ２０００は、ＲＤＥＢ患者の皮膚細胞が、組織培養容器上に作製された人工的創縁中に、正常皮膚細胞より高速で遊走すること、並びにＣ７の適用が、遊走速度を回復し得ることを実証している。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；Ｌｏｎｚａ）及びＦＣＸ－００７原薬バイアルからの細胞を解凍して、培養した。培養皿の小さなストリップ内に細胞接着を防止するための挿入物を備えた培養皿中に細胞を接種した。続いて、ストリップを取り出し、開放領域へと細胞が遊走した速度を顕微鏡観察によりモニターし、ＩｍａｇｅＪソフトウエア用の不規則な形状の描写プラグインを用いて定量した。図２１Ａ～２１Ｂは、このアッセイについての遊走率（Ａ）と遊走の画像（Ｂ）との両方を示す。これらの結果は、モック形質導入ＲＤＥＢ患者の線維芽細胞が、ＮＨＤＦよりも速く開放領域に遊走し、ＬＶ－ＣＯＬ７による形質導入が、患者の細胞をＮＨＤＦと類似の遊走速度に戻すことを示している。これらの結果は、Ｃｈｅｎ ２０００により記載されたものと一致している。
実施例２：ＩＮＸＮ－２００４レンチウイルスベクターで形質導入されたＦＣＸ－００７
ＦＣＸ－００７は、ヒトコラーゲン７タンパク質（Ｃ７）を発現するように、ＩＮＸＮ－２００４レンチウイルスベクター（ＬＶ－ＣＯＬ７）により遺伝子改変された自家線維芽細胞産物である。ＦＣＸ－００７ ＤＳ／ＩＮＸＮ－２００４を製造するために使用した材料は、ＩＮＸＮ－２００２作製の場合に、ＩＧＥ－２３０ ＬＶ－ＣＯＬ７ベクタープラスミドが使用された以外は、上の実施例１に記載したものと同様である。ＩＧＥ－３０８ ＬＶ－ＣＯＬ７ベクタープラスミドを用いて、ＩＮＸＮ－２００４ベクターを作製した。同じヘルパープラスミド、ｐＣＭＶ－Ｇ、ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２、及びｐＣｇｐを用いて、２９３ＷＣＢ細胞株を同時トランスフェクトした。
ＩＮＸＮ－２００４レンチウイルスベクター
ＩＧＥ３０８ ＬＶ－ＣＯＬ７ベクタートランスファープラスミド
標準的な分子クローニング方法を用いて、ＩＧＥ３０８プラスミドを構築した。構築方法は、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子をクローニングし、クローン化ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をレンチウイルスベクター（ＳＩＮ）バックボーン、ｐＦＵＧＷに導入することによって、ＩＧＥ－３０８ ＬＶ－ＣＯＬ７ベクタートランスファープラスミドを作製することを含んだ。
ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のクローニング
ＩＧＥ３０８ ＬＶ－ＣＯＬ７ベクタートランスファープラスミドにクローン化されたＣＯＬ７Ａ１遺伝子は、ＩＮＸＮ－２００２（ＩＧＥ２３０ベクタートランスファープラスミド）にクローン化されたものと同じＣＯＬ７Ａ１遺伝子である。
ヒトゲノムｃＤＮＡ由来のＣＯＬ７Ａ１遺伝子を増幅するために、Ｔａｋａｒａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いて、プライマーを設計及び作製した。表５に示す通り、各々が、約２ｋｂのＣＯＬ７Ａ１遺伝子を増幅するように、４つのプライマー対を設計した。
Figure 2023036685000006
発現ベクターにクローニングするための５’オーバーハングと一緒に、ヒトゲノムｃＤＮＡからＣＯＬ７Ａ１の５’末端３７９０塩基対（ｂｐ）を増幅するように設計された２つのプライマー対（ＣｏｌｌＦ２／ＣｏｌｌＲ４とＣｏｌｌＦ４／ＣｏｌｌＲ１）で増幅した。２つの５’ＰＣＲ産物（２１２７ｂｐと２９９３ｂｐ）をオーバーラップエクステンションＰＣＲにより結合して、３７９０ｂｐの最終産物を生成した。
残りの遺伝子をクローニングするために、ＤＮＡの断片（３４１ｂｐ、ＣｏｌｌＡ１－３、表６を合成したが、これは、ＰＣＲ増幅５’３７９０ｂｐ遺伝子断片及びクローニングベクターとのオーバーラップを含むＣＯＬ７Ａ１遺伝子の最終３２２ｂｐを含む。
Figure 2023036685000007
Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、ＮｈｅＩ及びＣｌａＩで事前に消化しておいた誘導性発現ベクター（ＶＶＮ－２５７６７３）中に、２つのＣＯＬ７Ａ１遺伝子断片（３７９０ｂｐとＣｏｌｌＡ１－３）をアセンブルした。バックボーンベクター及びＣＯＬ７Ａ１配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより細菌クローンをスクリーニングして、配列決定のための候補を決定した。消化及びＣＯＬ７Ａ１断片ＤＮＡ配列決定によって陽性クローンを確認した。得られたプラスミドをＶＶＮ－４３１１８３５と名付けた。
Ｏｒｉｇｅｎｅから購入したＶＶＮ－４３１１８３５及びＣＯＬ７Ａ１発現プラスミド（ＳＣ３０００１１）は、ＢｓｔＺ１７Ｉ及びＳａｐＩで消化した。ＣＯＬ７Ａ１遺伝子の６２７６ｂｐ断片をＳＣ３０００１１からＶＶＮ－４３１１８３５にクローン化した。得られたプラスミド、ＶＶＮ－４３１１８３５（同じプラスミド番号を使用した）を完全に配列決定し、ＣＯＬ７Ａ１配列が、完全で、且つ突然変異を含まないことを確認した。
ＶＶＮ－４３１１８３５プラスミドを、ＣＯＬ７Ａ１コード配列のすぐ外側に部位を有する２つの制限酵素、ＮｈｅＩ及びＣｌａＩで消化した。切除したＣＯＬ７Ａ１遺伝子を構成性発現ベクター、ＶＶＮ－２５７２３１にクローン化し、これもやはりＮｈｅＩ及びＣｌａＩで消化して、ＶＶＮ－４３１９９５８を生成した。ＶＶＮ－４３１９９５８は、構成性ＣＭＶプロモータの制御下で、完全長ヒトＣＯＬ７Ａ１を発現する。
図２２は、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子のクローニングの概略図を提供する。
レンチウイルスベクター（ＳＩＮ）へのクローン化ＣＯＬ７Ａ１遺伝子の導入
初めに、ｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現ベクター（ＶＰＫ－２１１、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が、その強化された安全性及び大きなクローニング能力に基づいて、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をコードするＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクターの構築のために選択された。
図７は、ｐＳＭＰＵＷベクターを標準的な第３世代ＳＩＮ ＬＶベクターと比較する。ｐＳＭＰＵＷベクターは、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）をコードし、これにウッドチャック肝炎ウイルス（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が続く。残るｇａｇ（Δｇａｇ）及びＲＲＥエレメントをｐＳＭＰＵＷベクター構築物から除去した。さらに、ｐＳＭＰＵＷベクター構築物は、標準的な第３世代ＳＩＮ ＬＶベクター内の一般に使用される１３３ｂｐ欠失ではなく、３’ＬＴＲ Ｕ３領域内のより大きな４００ｂｐ欠失を使用した。
ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクターの構築のためのｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現ベクターへのＣＯＬ７Ａ１遺伝子のクローニングの詳細は、上の実施例１に記載されており、さらに以下でも説明する。
全コード配列の導入のために、ＣＭＶプロモータ、続いて、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列並びにＢｃｌＩ及びＳａｐＩ制限部位のＣＯＬ７Ａ１遺伝子の切断型を含有する挿入片を作製した。この挿入片を２つの断片、ＣＣｏｌＧ及びＣｏｌＧ２（ＩＤＴ）に合成した（表８）。これらの２つの断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、消化済ｐＳＭＰＵＷベクターとアセンブルした。プラスミドバックボーン（６３９６８－３Ｒ）に特異的なプライマー、及びＣＯＬ７Ａ１遺伝子（ＣｏｌＳ１４）に特異的なプライマーと一緒にコロニーＰＣＲを用いて、陽性クローンを見出した。陽性クローンからのプラスミドを精製し、配列を確認して、ＩＧＥ２２８を作製した。ＩＧＥ２２８は、ＦｓｐＩ及びＢａｍＨＩで消化した。
ＢｃｌＩ及びＳａｐＩ部位を用いて、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をクローニングする最初の試みは成功しなかった。リンカーとしてＰＣＲ産物を用いて、ＢｃｌＩ制限部位を迂回する代替計画が考案された。プライマーＥＰＦ５及びＣｏｌｌＲ３を用いて、プラスミドテンプレートＶＶＮ－４３１９９５８からＰＣＲ産物を作製した。この産物を、ＣＯＬ７Ａ１の５’末端から上流４８ｂｐを切断するＢａｍＨＩ、及びＣＯＬ７Ａ１の５’末端から内部に１６３０ｂｐを切断するＦｓｐＩで消化して、５’リンカーを作製した。
野生型ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をＶＶＮ－４３１９９５８からＦｓｐＩ及びＳａｐＩで切断した。この断片を消化済ＩＧＥ２２８及び５’リンカーに連結して、ＣＯＬ７Ａ１、ＶＶＮ－４５８０８５３（ＩＧＥ２３０とも称する）の発現のためのレンチウイルス構築物を作製した。ＣＯＬ７Ａ１に特異的なプライマーＣｏｌＳ１３と、レンチウイルスバックボーンに特異的な６３９６８－３Ｒを用いて、陽性クローンを見出した。ＣＭＶプロモータからＣＯＬ７Ａ１の３’末端まで、プラスミドを配列決定した。
以下の表７は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をｐＳＭＰＵＷレンチウイルス発現ベクターに導入するために用いられる合成遺伝子配列及びプライマーを示す。
Figure 2023036685000008
図２３は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をｐＳＭＰＵＷ発現ベクターにクローニングして、ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクタートランスファープラスミド、ＩＧＥ２３０を生成する概略図を提供する。
継続的な開発の結果から、ＲＲＥエレメントの欠失及びｐＳＭＰＵＷベクター構築物中の３’ＬＴＲ Ｕ３領域内での大きな４００ｂｐ欠失の使用を、大きなＣＯＬ７Ａ１遺伝子（８．８ｋｂｐ）をパッケージする要件と組み合わせると、ＬＶ－ＣＯＬ７ベクター生成（感染力価）及び後の形質導入並びにＲＤＥＢ線維芽細胞でのＣ７タンパク質発現にマイナスの影響をもたらすことがわかった。
第３世代ＧＥＮ ＳＩＮベクター、ｐＦＵＧＷ（ＦＵＧＷ、プラスミド＃１４８８３、ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ）を選択して、第２世代ＬＶ－ＣＯＬ７ベクター、ＩＮＸＮ－２００４を構築した。ＩＮＸＮ－２００４は、ベクターコピー数を改善するために構築した。図８は、ｐＦＵＧＷレンチウイルス発現プラスミドベクターの遺伝因子の概略図を提供する。
ｐＦＵＧＷベクターは、レンチウイルスベクター生成及びトランスジーン発現向上のために、ＲＲＥ、２つのｃＰＰＴエレメント、並びにＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメントを含有する。大きなＣＯＬ７Ａ１遺伝子（８．８ｋｂｐ）の挿入を収容する目的で、トランスジーンクローニング容量を最大にするために、ＩＧＥ３０８レンチウイルスベクタートランスファープラスミドを構築した。
ＰａｃＩ及びＸｈｏＩでのベクターの消化により、ＷＰＲＥエレメント、ｈＵＢＣプロモータ及びＧＦＰリポータ遺伝子を除去した。ＣＭＶプロモータの５’末端、続いてＣＯＬ７Ａ１遺伝子の３’末端の小さな断片を含有する挿入片を作製した。この挿入片（ＣｏｌＣＮ）は、Ｇ－Ｂｌｏｃｋ断片としてＩＤＴで合成された（表８に示す配列）。Ｇｉｂｓｏｎクローニング誘導体法を用いて、断片を消化済ｐＦＵＧＷベクターとアセンブルした。プラスミドバックボーンに特異的なプライマー（ＦｕｇｗＱＣＦ及びＦｕｇｗＱＣＲ）と共にコロニーＰＣＲを用いて、陽性クローンを同定した。陽性クローン由来のプラスミドを精製し、配列を確認して、ＩＧＥ３０１を作製した。
次に、ＩＧＥ３０１をＢａｅＩで消化した。ＩＧＥ２３０をＡｓｅＩ及びＳａｐＩで消化して、ＣＭＶプロモータの３’末端、５’ＵＴＲ、及びＣＯＬ７Ａ１遺伝子の大部分を含有する断片を作製した。Ｇｉｂｓｏｎクローニング誘導体法を用いて、この断片をＢａｅＩ消化ＩＧＥ３０１ベクターに移入した。ＣＯＬ７Ａ１に特異的なプライマーＣｏｌＳ１３と、レンチウイルスバックボーンに特異的なＦｕｇｗＱＣＲを用いて、陽性クローンを見出した。陽性クローン由来のプラスミドを精製し、配列を確認して、ＩＧＥ３０８を作製した。
以下の表８は、ｐＦＵＧＷレンチウイルス発現ベクターへのＣＯＬ７Ａ１遺伝子の導入に用いられる合成遺伝子配列及びプライマーを提供する。
プラスミドは、製造者のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ ＭａｘｉＰｒｅｐ Ｋｉｔでマキシ－プレップ（Ｍａｘｉ－ｐｒｅｐｐｅｄ）した。
Figure 2023036685000009
図２４は、ＩＮＸＮ－２００４レンチウイルストランスファープラスミド（ＩＧＥ３０８）の構築の概略図を提供する。
ＩＧＥ－３０８プラスミドの製造
５つのステップ：形質転換、グリセロールストック製造、スケールアップ、捕捉、透析濾過及び製剤化から構成されるプロセスを用いて、ＩＧＥ３０８プラスミドを製造した。
形質転換：ＩＧＥ３０８プラスミドのシードストックを、コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＨ１０Ｂ）への形質転換のためにＡｌｄｅｖｒｏｎに提供した。形質転換プレートは、レンチウイルス構築物のための標準的な３４℃で保存した。
グリセロールストック製造－形質転換プレートから単離されたコロニーを採取することによって、シード培養物を作製した。各培養物をミニプレップし、アガロースゲルにより決定されるような最良の培養物を用いて、標準グリセロールストックを作製した。スケールアップ：培地を比較するために、同じ５００ｍＬ培養物を下記培地タイプの各々で増殖させた：迅速増殖（Ｒａｐｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ）培地及び最大収量（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｙｉｅｌｄ）培地（２つの５００ｍＬ培養物の総計について）。ステップ２で作製したグリセロールストックを用いて培養物を接種し、ＱＣアッセイの全パネルを各プレップについて実施した。これによって、Ａｌｄｅｖｒｏｎが、各培地タイプでのプラスミドの安定性を試験することが可能になった。
初期ＱＣ結果に基づいて、３４℃のシェーカフラスコ内での形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖のために迅速増殖培地を選択した。計８Ｌの培養物を調製した。
捕捉－８Ｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を溶解させた後、初めにＤＭＡＥアニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製し、これにより、計８３３．８ｍｇのプラスミドが生成された。ＯＳ樹脂上でのＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）クロマトグラフィーを用いて、追加精製のステップを実施した。このステップによって、６６３ｍｇの精製ＤＮＡが得られた。
濃度及び製剤－精製済プラスミドを連続透析濾過により最終バッファー及び濃度に調節した。使用した最終バッファーはＴＥであった。
計２００ｍｇのＩＧＥ３０８プラスミドを１．４ｍｇ／ｍＬの濃度で発送した。ＩＮＸＮ－２００４の更なる製造の前に、ＩＧＥ３０８プラスミドを分析した。
ＩＧＥ３０８プラスミド配列の分析
ＩＮＸＮ－２００４の製造に用いるＩＧＥ３０８プラスミドは、４倍の２方向性配列包括度を得るためにプライマーウォーキング及びオリゴヌクレオチド合成を用いて、ＧＬＰ条件下、ＳｅｑＷｒｉｇｈｔで十分に配列決定した。ＩＧＥ３０８プラスミドは、１６，７７７ｂｐのサイズを有する。配列は、ＳｅｑＷｒｉｇｈｔに提供されたＩＧＥ３０８構築参照配列に対して１００％の一致を示した。ＩＧＥ３０８プラスミドの遺伝子エレメントを図２５Ａ～２５Ｂに示す。表９は、それらの対応する機能を有する遺伝子エレメントのリストを提供する。
Figure 2023036685000010

Figure 2023036685000011

Figure 2023036685000012
ＩＧＥ３０８プラスミド（停止コドンＴＧＡなし）のＣＯＬ７Ａ１遺伝子配列をＧｅｎＢａｎｋホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）コラーゲン、ＶＩＩ型、α１（ＣＯＬ７Ａ１）配列（ＮＭ＿００００９４．３）と比較した。配列アラインメントを付録（Ａｐｐｅｎｄｉｘ）４に付与する。３つのサイレント点突然変異を以下の表１０に挙げる通り同定した。配列ギャップは見出されなかった。３つのサイレント点突然変異は、コードされたＣ７タンパク質に影響を及ぼさない。
Figure 2023036685000013
ヘルパープラスミド、ｐＣＭＶ－Ｇ、ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２及びｐＣｇｐ
ＩＮＸＮ－２００４ ＬＶベクターの製造に用いる３つのヘルパープラスミド、ｐＣＭＶ－Ｇ、ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２及びｐＣｇｐは、ＣｏＨから提供された。
２９３Ｔワーキングセルバンク（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）（ＷＣＢ）
ＩＮＸＮ－２００４ ＬＶベクターの製造に用いる２９３ＴＷＣＢは、ＣｏＨから提供された。
ＩＮＸＮ－２００４製造のための他の出発材料
ＩＮＸＮ－２００４ ＬＶベクター製造のための他の出発材料も、ＣｏＨから提供された。
生検組織
標準的な無菌処置を用いて、３つの３～４ｍｍのパンチ皮膚生検（真皮及び表皮層）をＲＤＥＢ被験者身体の非水疱形成領域から収集する。生検は、処置医師により収集され、低温の滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に導入されて、冷蔵感染性輸送用容器を用いて翌日の便で発送される。尚、この容器は、潜在的に生体有害性の組織を輸送するのに適しており、２～８℃の温度を維持するように設計されている。
ａ．試薬、溶媒、及び補助材料
ｉ．試薬及び溶媒
ＦＣＸ－００７原薬製造工程には、２つの動物源試薬：ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びトリプシン－ＥＤＴＡ溶液を使用した。完全増殖培地。
全ての細胞培養拡大ステップにおけるＦＣＸ－００７製造に、完全増殖培地（ＣＧＭ）を使用する。無菌移送により、２０Ｌバッグ中の１８ＬのＩＭＤＭを２ＬのＦＢＳと混合することによって、ＣＧＭを調製する。製剤化したＣＧＭバッグを５±３℃の冷蔵庫内に保存する。
ａ．開始増殖培地
抗体の存在下、Ｔ－７５細胞培養フラスコ中に生検消化後、ＦＣＸ－００７製造に、線維芽細胞の初期接種のために開始増殖培地（ＩＧＭ）を用いる。５００ｍＬ角型培地ボトル中の５８．２ｍＬのＣＧＭに、ＩＳＯ５ ＢＳＣ内の０．６ｍＬの１００倍濃縮抗生物質溶液（ＧＡ）（無菌）を添加することによって初期増殖培地を調製する。最終濃度は、０．４ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、０．２９５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢである。さらに、ＧＳＨ溶液（１．２ｍＬの５０倍溶液）も５００ｍＬ角型培地ボトルに添加する。ボトルを密閉し、３～５回逆さにして混合する。ＩＧＭは、直接使用する前の少なくとも６０分間にわたって３７℃のインキュベータ内で温める。
開始増殖培地は、使用の直前に新しく調製されるため、使用期限は適用されず、また、品質管理出荷検査も実施されない。
ｂ．形質導入培地
線維芽細胞のＩＮＸＮ－２００４形質導入に際し、形質導入培地（ＴＭ）を用いる。形質導入培地は、１０ｍＬのＣＧＭを含有する２５０ｍＬ遠心分離チューブに４０ｍＬのＩＭＤＭを添加し、ＦＢＳ濃度を培地中２％に希釈することによって、ＩＳＯ５ ＢＳＣ内で新しく調製する。２５０ｍＬチューブを混合し、３７．０℃のインキュベータ内部に配置して、ＩＮＸＮ－２００４形質導入に必要になるまで保温する。
形質導入培地は、使用の直前に新しく調製されるため、使用期限は適用されず、また、品質管理出荷検査も実施されない。
ｃ．ＧＳＨ溶液
ＧＳＨを開始増殖培地（ＩＧＭ）及びＣＧＭに添加するが、これらは、細胞増殖を増大するために、早期Ｔ－７５及びＴ－１７５線維芽細胞培養物に使用される。１ＬのＩＭＤＭに５１．１ｇのＧＳＨを溶解させることにより、ＩＳＯ５ ＢＳＣ内で５０×ＧＳＨストック溶液を調製する。溶液は、０．２２μｍで濾過する。濾過液を５０ｍＬ遠心分離チューブ中に、チューブ当たり２０ｍＬで等分に導入し、後の使用のために－８０℃で凍結保存した。
ｄ．ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）溶液
線維芽細胞に対するＩＮＸＮ－２００４形質導入効率を高めるために、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）をＦＣＸ－００７製造工程に使用する。ＩＳＯ５ ＢＳＣ内で、５ｍＬのシリンジ及び１８ｇニードルを用いて、２．５ｍＬのＷＦＩを臨床グレードＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）のバイアル中に無菌移入して、１．０ｍｇ／ｍＬでＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）を再構成する。穏やかに旋回させることにより、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）を入念に溶解させる。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）バイアルの全内容物を、付属の５ｍＬシリンジを用いて回収する。１８ｇニードルに代わって、０．２２μｍシリンジフィルターをシリンジに無菌で取り付け、再構成したＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）を２５０ｍＬ遠心分離チューブ中に滅菌濾過する。適切なサイズのピペットを用いて、１２２．５ｍＬのＰＢＳを、２５０ｍＬ遠心分離チューブ内の再構成ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）に移して、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）を２０μｇ／ｍＬに希釈してから、ピペットを用いて、これを十分に混合する。適切なサイズのピペットを用いて、６．３ｍＬの希釈ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）溶液をＴ－２５フラスコの各々に添加して、５μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）で表面をコーティングする。第１ラウンドのＩＮＸＮ－２００４形質導入のために、５×～１０×Ｔ－２５フラスコを調製する。ＩＮＸＮ－２００４超形質導入の場合、１８×Ｔ－２５フラスコを調製する。
ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）溶液は、使用の直前に新しく調製されるため、使用期限は適用されず、また、品質管理出荷検査も実施されない。
凍結保存培地
凍結保存培地は、２倍濃縮溶液であり、これを、ＦＣＸ－００７製造工程中に、採取及び洗浄線維芽細胞に添加して、液体窒素中での保存のための細胞シードストック及びＦＣＸ－００７原薬を製剤化する。凍結保存培地は、０．８５容積ＰｒｏＦｒｅｅｚｅ（商標）－ＣＤＭ（２×）を０．１５容積ＤＭＳＯと混合して、１容積凍結保存培地を取得することにより調製する。
凍結保存培地は、使用の直前に新しく調製されるため、使用期限は適用されず、また、品質管理出荷検査も実施されない。
実施例３：トレーニングラン８、９及び１０並びに生検酵素消化の強化
トレーニングラン８及び生検酵素消化の強化
前述のＴＲにおいて、生検消化方法は、３～４ｍｍサイズの生検組織の有効な消化を達成することができないことが疑われた。ＴＲ８では、全体的消化効率を改善するために、消化工程中の追加的せん断応力の適用をこの工程に組み込んだ。消化工程を次のように変更した：消化工程中１５±２分毎に５秒間の最大設定で、遠心分離チューブをパルスボルテックスし、毎回のボルテックス後に遠心分離チューブをオービタルシェーカに戻し；６０分のインキュベーション終了時に、遠心分離チューブを１０秒間最大設定でパルスボルテックスする。
ＲＤＥＢドナーからの生検を処理し、強化された消化方法を用いて消化した。ＧＳＨを添加した培地を用いて、消化物からの細胞をＴ－７５フラスコに接種した。細胞は、良好な増殖を示し、継代のために１４日目に９０％密集に達した。ＩＮＸＮ－２００２形質導入条件を評価するために、Ｔ－７５フラスコから採取した細胞を、対照、アームＡ、及びアームＢとして３×Ｔ－１７５フラスコに接種した。３つのアーム全ての細胞を拡大し、１－ＣＳ中の１０ＬパイロットＬＶ－ＣＯＬ７ベクターで形質導入して（対照アームはモック形質導入した）、２×１０－ＣＳ中でさらに拡大した後、凍結保存のために採取した。
Figure 2023036685000014
１０－ＣＳから採取した細胞の総数は、注射用のＦＣＸ－００７薬剤の更なる製造のために適切であると考えられた。採取した細胞は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子コピー数（形質導入効率）、Ｃ７タンパク質発現、細胞生存率、及び細胞純度について試験した。表１２は、３つのアーム全てから採取された細胞の分析結果を提供する。
Figure 2023036685000015
ＣＯＬ７Ａ１遺伝子コピー数及びＣ７タンパク質発現に感染多重度（ＭＯＩ）用量依存性増加が観察された。ＩＮＸＮ－２００２形質導入開発及び最適化の詳細を以下に記載する。低いＩＮＸＮ－２００２ ＩＵ力価は、形質導入ＭＯＩ、及び後のＣＯＬ７Ａ１遺伝子コピー数を制限したが、Ｃ７タンパク質発現は、インビトロ及びインビボ結果により証明される通り、予備臨床現場において、生物学的に関連することが観察された。全体として、これらの結果は、ＲＤＥＢ線維芽細胞をＩＮＸＮ－２００２及び過剰の機能性Ｃ７タンパク質で形質導入することができることを明らかにしている。
ＴＲ８からのアームＡ細胞産物は、概念実証（Ｐｒｏｏｆ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｐｔ）試験並びに毒物学及び生体分布試験のために使用した。
トレーニングラン９
ＲＤＥＢドナーからの生検を処理し、強化された消化方法を用いて消化した。ＧＳＨを添加した培地を用いて、消化物からの細胞をＴ－７５フラスコに接種した。ＴＲ８と同様に、細胞は、良好な増殖を示し、継代のために１９日目に９０％密集に達した。ＬＶ－ＣＯＬ７形質導入条件を評価するために、Ｔ－７５フラスコから採取した細胞を、対照、アームＡ、及びアームＢとして３×Ｔ－１７５フラスコに接種した。３つのアーム全ての細胞を拡大し、１－ＣＳ中のＬＶ－ＨＡ－ＣＯＬ７ベクター（構造にＨＡタグを含む）で形質導入して（対照アームはモック形質導入した）、２×１０－ＣＳ中でさらに拡大した後、採取した。採取した細胞を、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子コピー数（形質導入効率）、Ｃ７タンパク質発現、及び細胞純度について試験した。表１３は、ＴＲ９における細胞増殖を示す。
Figure 2023036685000016
表１４は、３つのアーム全てからの採取された細胞の分析結果を提供する。
Figure 2023036685000017
ここでも、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子コピー数及びＣ７タンパク質発現に、ＭＯＩ用量依存的増加が観察された。これらの結果もやはり、ＲＤＥＢ線維芽細胞が、好適に増殖され、ＬＶ－ＨＡ－ＣＯＬ７ベクターで形質導入されて、Ｃ７タンパク質を発現することができることを明らかにしている。
トレーニングラン１０及び６つの１０－ＣＳへのスケールアップ
提案される臨床プロトコル（モジュール５を参照）によれば、単回処置用量のために４×１０８個のＦＣＸ－００７薬剤細胞が必要であり、反復投与の可能性がある。算定したＦＣＸ－００７薬剤のニーズを満たすために、ＴＲ８及びＴＲ９で達成された細胞収量に基づいて、６つの１０－ＣＳまで最終細胞拡大をスケールアップする必要がある。
ＲＤＥＢドナーからの生検を処理し、強化された消化方法を用いて消化した。ＧＳＨを添加した培地を用いて、消化物からの細胞をＴ－７５フラスコに接種した。細胞は、良好な増殖を示し、継代のために１９日目に９０％密集に達した。Ｔ－７５フラスコから採取した細胞を２×Ｔ－１７５フラスコに接種したが、１つはＩＮＸＮ－２００２形質導入用であり、１つは細胞基質対照用である。１つのフラスコからの細胞を拡大し、１－ＣＳ中のＩＮＸＮ－２００２で形質導入して、６×１０－ＣＳ中でさらに拡大した後、採取した。表１５は、ＴＲ１０における細胞増殖を示す。
Figure 2023036685000018
ＴＲ８及びＴＲ９の細胞と比較して、ＴＲ１０の細胞は、増殖が遅く、継代ステップの各々で得られる細胞も少量であったが、これは、異なるＲＤＥＢドナー間のばらつきの可能性を示している。
６×１０－ＣＳから採取された細胞の総数は、注射用のＦＣＸ－００７薬剤の１回用量の製造に適していると考えられる。
表１６は、採取された細胞の分析結果を提供する。
Figure 2023036685000019
実施例４
ＩＮＸＮ－２００２形質導入開発及び最適化
皮膚線維芽細胞のレンチウイルス形質導入を初めに開発し、モデルレンチウイルスＧＦＰ（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ，ＬＰ－ＥＧＦＰ－ＬＶ１０５－０２０５）と一緒に９６ウェルプレートで培養した正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；Ｌｏｎｚａ，ＣＣ－２５１１）を用いて最適化した。
ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａのＬＶ形質導入プロトコルを出発点として用いて、初期最適化によって、形質導入時の細胞密度、形質導入培養量、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）の使用、超感染（２日連続でのウイルスによる細胞の再形質導入）、細胞平板培養の時間（形質導入の前日に対する形質導入の時点）、並びに形質導入培地中の血清含有量をはじめとする条件を評価した。次に、ＧＭＰ製造現場で最適形質導入手順を実施した。これらの試験の詳細を以下に記載する。
Ａ．ＬＶ形質導入のための細胞接種条件及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティングの作用
指数関数的増殖期のＮＨＤＦを採取し、異なる接種密度で、２つの異なる日に、９６ウェルプレート中に接種した。１組の非組織培養物処理９６ウェルプレートは、製造者の推奨事項に従い、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）でコーティングした（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティング密度は、２０μｇ／ｃｍ２であった）。ＬＶ形質導入の１日前（－１日目）に接種した細胞の場合、使用済培地を除去し、形質導入のために、０日目にＬＶベクターを含む新鮮な培地（１００μＬ）をウェルに添加する。形質導入条件の日（０日目）には、１００μＬの新鮮な培地中の細胞及びＬＶベクターをウェルに同時に添加する。使用したＭＯＩは、全ての条件について２０００ｖｐ／細胞であった。一晩のインキュベーション後、培地を除去し、更なる培養のために、１００μＬの新鮮な培地を細胞に供給した。形質導入から９６時間後、ＢＤ ＬＳＲＩＩに対するＧＦＰシグナルのＦＡＣＳ分析による形質導入効率分析のために、細胞を採取し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ｖ．１０）を用いて分析した。表１７は、様々な条件下のＬＶ形質導入効率を記載する。
Figure 2023036685000020
これらの結果は、ＬＶ形質導入の前日に細胞に予め接種する必要がないことを明らかにしている。細胞及びＬＶベクターを形質導入時に同時に添加することができ、これは、ＧＭＰ製造操作に好都合である。ＬＶ形質導入の前にＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）で培養物表面をコーティングすると、ＬＶ形質導入効率が有意に上昇した。細胞接種密度が低いほど、ＬＶ形質導入効率も低くなったため、ＬＶ形質導入工程中、約１×１０４細胞／ｃｍ２という比較的高い細胞接種密度が要望される。
Ｂ．ＬＶ形質導入効率に対するＭＯＩ及び超形質導入の影響
この試験では、線維芽細胞のＬＶ形質導入に対するＭＯＩ及び超形質導入の影響を調べた。
形質導入に使用する前に、１組の非組織培養物処理９６ウェルプレートをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（２０μｇ／ｃｍ２）で予めコーティングした。形質導入時に１００μＬの量のＬＶベクターを含む３０００個の細胞をウェルに添加した。一晩のインキュベーション後、培地を除去し、更なる培養のために、１００μＬの新鮮な培地を細胞に供給した。超形質導入のために、初期形質導入から１日（約２４時間）後に、培地を除去し、１００μＬの新鮮な培地中の同量のＬＶベクターをウェルに添加した。３時間の形質導入後、培地を除去し、更なる培養のために、細胞に１００μＬの新鮮な培地を供給した。形質導入から９６時間後、ＢＤ ＬＳＲＩＩ上のＧＦＰシグナルのＦＡＣＳ分析による形質導入効率分析のために細胞を採取し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ｖ．１０）を用いて分析した。表１８は、様々な条件下のＬＶ形質導入効率を記載する。
Figure 2023036685000021
ＭＯＩが高くなるほど、超形質導入の有無にかかわらず、形質導入効率は高くなった。超形質導入は、ＬＶ形質導入効率にさらに増加をもたらした。しかし、増加は有意とはみなされず、ＧＭＰ製造現場では達成されなかった。
Ｃ．ＬＶ形質導入培養量及びＦＢＳ濃度
レンチウイルスベクター粒子は、第１に、形質導入を達成するために、培養中の線維芽細胞と接触させる必要がある。他のウイルス粒子と同様に、溶液中のＬＶ粒子は、ブラウン運動に従い、生産性形質導入は、一般にランダム事象である。培地深さの最小量への縮小、又はスピノ形質導入の使用は、標的細胞に対するウイルスベクター形質導入を向上させることが判明している（Ｎｙｂｅｒｇ－Ｈｏｆｆｍａｎ １９９７）。線維芽細胞のＬＶ形質導入に対する形質導入量／培養深さ及び培地ＦＢＳ濃度の作用を評価した。
１組の非組織培養物処理９６ウェルプレートを形質導入に使用する前に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（２０μｇ／ｃｍ２）で予めコーティングした。形質導入の時点で、１０％ＦＢＳを含む１００μＬ又は５０μＬの量の培地中の３０００細胞をＬＶベクターと共にウェルに添加した。同じ形質導入条件を２％ＦＢＳの培地で反復した。一晩のインキュベーション後、培地を除去し、更なる培養のために、１０％ＦＢＳを含む１００μＬの新鮮な培地を細胞に供給した。使用したＭＯＩは、全ての条件について２０００ｖｐ／細胞であった。形質導入から９６時間後、ＢＤ ＬＳＲＩＩ上のＧＦＰシグナルのＦＡＣＳ分析による形質導入効率分析のために細胞を採取し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて分析した。表１９は、異なる条件下でのＬＶ形質導入効率を記載する。
Figure 2023036685000022
予想通り、形質導入培地量（深さ）が減少すると、ＬＶ形質導入効率の顕著な増加が起こった。さらに、結果から、２％ＦＢＳ形質導入培地の使用が、ＬＶ形質導入に有益であることがわかる。これらの結果に基づき、形質導入培地量を最小限、すなわち、１－ＣＳ中約６０ｍＬに保ちながら、２％ＦＢＳ形質導入培地をＧＭＰ製造工程に組み込んだ。ＦＣＸ－００７のＧＭＰ製造工程では、表面積が６３６ｃｍ２の１層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）を線維芽細胞のＬＶ形質導入のために用いる。３時間の形質導入の間、細胞に有害な作用（例えば、乾燥）をもたらすことなく、６０ｍＬ（深さ０．９ｍｍ）の形質導入量を使用することが実現可能であることが判明した。
Ｄ．ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティング及び培養物表面のタイプの評価
培養物表面のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティングは、線維芽細胞のＬＶ形質導入を有意に増大した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）製造者は、４μｇ／ｃｍ２～２０μｇ／ｃｍ２の範囲のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティング量を推奨している。線維芽細胞のＬＶ形質導入に対してマイナスの影響を及ぼすことなく、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）の使用量を最小限にするために、コーティングに使用されるＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）の量を評価した。
さらに、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）製造者は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティングの非組織培養物処理プラスチック表面の使用も推奨している。しかしながら、線維芽細胞培養物に使用される培養フラスコ及びＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）は全て組織培養物処理されている。組織培養物処理及び非組織培養物処理９６ウェルプレートの両方を異なる量のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）でコーティングし、線維芽細胞のＬＶ形質導入について評価した。
非組織培養物処理及び組織培養物処理９６ウェルプレートのいずれも、異なる量のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（２０μｇ／ｃｍ２、１０μｇ／ｃｍ２、及び５μｇ／ｃｍ２）で予めコーティングした後、形質導入に使用した。形質導入時に、２％ＦＢＳを含む５０μＬの量の形質導入培地中の３０００個の細胞をＬＶベクターと共に各ウェルに添加した。３時間の形質導入後、培地を除去し、更なる培養のために、１０％ＦＢＳを含む１００μＬの新鮮な培地を全ての細胞に供給した。使用したＭＯＩは、全ての条件について２０００ｖｐ／細胞であった。形質導入から９６時間後、ＢＤ ＬＳＲＩＩ上のＧＦＰシグナルのＦＡＣＳ分析による形質導入効率分析のために細胞を採取し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて分析した。表２０は、異なる条件下でのＬＶ形質導入効率を記載する。
Figure 2023036685000023
コーティングに用いたＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）の３つの用量全てについて、線維芽細胞のＬＶ形質導入の同等の効率が観察された。結果として、５μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティング密度をＦＣＸ－００７製造工程で使用するために選択した。より低いＬＶ形質導入効率が組織培養物処理表面に観察されたが、この差は、ＦＣＸ－００７製造工程のＩＮＸＮ－２００２形質導入ステップにおける組織培養物処理フラスコの使用を妨げるのに十分に有意であるとは認められなかった。
線維芽細胞ＬＶ形質導入の開発及び最適化の概要
線維芽細胞形質導入のためのＬＶ－ＧＦＰモデルベクターを用いた、前述の試験結果に基づいて、ＲＤＥＢドナー由来の線維芽細胞のＩＮＸＮ－２００２形質導入について、以下のＬＶ形質導入プロトコルを選択した。
５μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）で培養物表面を予めコーティングする。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティングのために、組織培養物処理フラスコを使用することができる。
約１×１０４細胞／ｃｍ２の細胞接種密度で、形質導入時に細胞及びＬＶベクターを同時に添加する。
高い形質導入効率（形質導入当たり１０ｍＬのＩＮＸＮ－２００２ＬＶ－Ｃｏｌ７ベクター）を達成するために、細胞に有毒作用を引き起こさない高ＭＯＩを使用する。
２％ＦＢＳを含む形質導入培地中３７℃で３時間形質導入した後、１０％ＦＢＳを含有する培地を交換するか、又はそうした培地を細胞に供給する。
高い形質導入効率のために、低い形質導入培地量、すなわち、９６ウェルプレートの場合には５０μＬ／ウェル、又は１層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）の場合には６０ｍＬを使用する。
超形質導入は必要ない。
Ｆ．線維芽細胞のＩＮＸＮ－２００２ ＬＶ形質導入
上に開発したＬＶ形質導入プロトコルに基づき、ＩＮＸＮ－２００２を用いて、９６ウェルプレート内で正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、Ｌｏｎｚａ，ＣＣ－２５１１）を形質導入した。ＩＮＸＮ－２００２の相対的低力価を考慮して、３つの用量のＩＮＸＮ－２００２を形質導入のために使用した：１２．５μＬ（１：４希釈）、３．１μＬ（１：１６希釈）、及び０．８μＬ（１：６４希釈）。形質導入細胞ゲノムへのＬＶ－ＣＯＬ７ベクターの安定な組込みを確実にするために、形質導入細胞を３回継代した。継代３で、ゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、ＬＶ－ＣＯＬ７ベクター配列に特異的なプライマーを用いたｑＰＣＲにより分析した。形質導入効率は、細胞当たりの遺伝子コピー数として定量した。表２１は、細胞当たりの遺伝子コピー数として測定される形質導入効率を記載する。
Figure 2023036685000024
最も高い用量のＩＮＸＮ－２００２ベクター、１／４希釈（ＭＯＩ＝４０）では、細胞に対する有意な有毒作用が観察され：細胞のほとんどが、形質導入ステップから回復せず、細胞拡大の終了時には細胞当たり最小の遺伝子コピー数が得られた。最適ＩＮＸＮ－２００２ ＭＯＩは、約１０ＩＵ／細胞であり、これによって、０．８６の遺伝子コピー数が得られた。
トレーニングランにおけるＩＮＸＮ－２００２ ＬＶ形質導入
ＬＶ形質導入プロトコル（セクション［０２６０］）及びＩＮＸＮ－２００２形質導入用ベクター投与／９６ウェル試験からのＭＯＩ結果に続いて、ＲＤＥＢ線維芽細胞のＩＮＸＮ－２００２形質導入をＴＲ８、ＴＲ９、及びＴＲ１０において大規模に実施した。ＩＮＸＮ－２００２形質導入に使用した１層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）は、５μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）で予めコーティングした。形質導入の時点で、１層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に、２％ＦＢＳを含む６０ｍＬの形質導入培地中の細胞及びＩＮＸＮ－２００２を同時に添加した。３７℃のインキュベータ中で３時間後、１０％ＦＢＳを含む１３０ｍＬの完全増殖培地を細胞に供給した。形質導入細胞を２回、すなわち、最初に１つの１０層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に、次に、２つまたは６つの１０層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に継代して、細胞を採取した。採取した細胞の遺伝子コピー数をｑＰＣＲにより分析した。表２２は、実施したトレーニングランからのＩＮＸＮ－２００２形質導入結果を記載する。
Figure 2023036685000025
小規模９６ウェルプレートを用いて開発したＬＶ形質導入プロトコルに従って、ＦＣＸ－００７製造の規模で、ＲＤＥＢ線維芽細胞の好適なＩＮＸＮ－２００２形質導入が達成された。形質導入細胞の遺伝子コピー数は、形質導入のＭＯＩの上昇と共に増加した。ＩＮＸＮ－２００２の力価が低いために、形質導入され、採取された細胞産物の遺伝子コピー数は、比較的低かった。実行可能な方法で高い遺伝子コピー数を含むＦＣＸ－００７細胞産物を作製する目的で、形質導入工程中に細胞に及ぼされる有毒作用が最小であったことから、１０ｍＬのＩＮＸＮ－２００２をＧＭＰ製造形質導入のために選択した。
エンジニアリングラン
ＦＣＸ－００７のＧＭＰ製造のための準備、及び製造マスターバッチレコード（Ｍａｓｔｅｒ Ｂａｔｃｈ Ｒｅｃｏｒｄ）（ＭＢＲ）の完成時に、承認された製造バッチレコードと共に、ＲＤＥＢドナーからの生検を用いてエンジニアリングランを実施した。ＧＭＰグレードＩＮＸＮ－２００２ ＬＶベクターを形質導入のために使用した。表２３は、エンジニアリングランからの細胞増殖数値を提供する。
Figure 2023036685000026
ＥＲからの細胞増殖及び収量は、ＴＲ８及びＴＲ９のものと同等であり、ＴＲ１０よりも顕著に高速で、高く、これは、異なるＲＤＥＢドナー間での細胞増殖のばらつきを示している。表２４に示すように、採取された細胞を充填し、凍結保存した。
Figure 2023036685000027
６×１０－ＣＳから採取された細胞の総数は、注射用ＦＣＸ－００７薬剤の２用量の製造に十分であると考えられる。
採取された細胞は、提案されるＦＣＸ－００７原薬規格に従って試験した。表２５は、採取された細胞についての分析結果を記載する。
Figure 2023036685000028
実施例５－ＬＶ－Ｃｏｌ７形質導入効率を改善するための製造工程開発の説明
前述したプロセスを用いて製造したＦＣＸ－００７細胞製剤は、細胞形質導入のためにＩＮＸＮ－２００２ベクターを使用すると、低い遺伝子コピー数及びＣ７発現レベルによって示される通り、低レベルの遺伝子修飾効率を有した。ＲＤＥＢ線維芽細胞でのＬＶ－Ｃｏｌ７形質導入効率を増加するために、２つのアプローチを実施した：１）優れたベクター力価を提供し、形質導入線維芽細胞において安定したトランスジーン（コラーゲンＶＩＩ）発現を改善した新規ＬＶ－Ｃｏｌ７レンチウイルスベクター（ＩＮＸＮ－２００４）の開発、並びに２）線維芽細胞に対するＬＶ－Ｃｏｌ７形質導入工程の更なる最適化。新規ＩＮＸＮ－２００４ベクターの開発の詳細は、セクション３．２．Ｓ．２．３に記載されている。ＬＶ－Ｃｏｌ７形質導入工程の更なる最適化に関する試験、並びに細胞拡大手順については以下に説明する。
スピン形質導入（スピノキュレーション）
スピン形質導入は、重力環境下で、標的細胞に対するウイルスベクターの遠心分離を含む。標的細胞に対するレトロウイルスベクター形質導入効率を高めるためのスピン形質導入（スピノキュレーション）は、文献に記載されている（Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９５ Ａｕｇ；５４（２－３）：１３１－４３．Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂａｈｎｓｏｎ ＡＢ１，Ｄｕｎｉｇａｎ ＪＴ，Ｂａｙｓａｌ ＢＥ，Ｍｏｈｎｅｙ Ｔ，Ａｔｃｈｉｓｏｎ ＲＷ，Ｎｉｍｇａｏｎｋａｒ ＭＴ，Ｂａｌｌ ＥＤ，Ｂａｒｒａｎｇｅｒ ＪＡ．ａｎｄ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９４ Ｊａｎ；５（１）：１９－２８．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｋｏｔａｎｉ Ｈ１，Ｎｅｗｔｏｎ ＰＢ ３ｒｄ，Ｚｈａｎｇ Ｓ，Ｃｈｉａｎｇ ＹＬ，Ｏｔｔｏ Ｅ，Ｗｅａｖｅｒ Ｌ，Ｂｌａｅｓｅ ＲＭ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＷＦ，ＭｃＧａｒｒｉｔｙ ＧＪ．）。
以前のＴＲ８からのＲＤＥＢ線維芽細胞を培養した。指数関数的増殖期の細胞を採取して、この試験に使用した。以前のＩＮＸＮ－２００２ベクターロットを形質導入に使用した。スピン形質導入のために、５０μＬの形質導入培地（ＩＭＤＭ＋２％ＦＢＳ）中に異なるＭＯＩのＩＮＸＮ－２００２を含む１×１０３細胞を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（５μｇ／ｃｍ２）で予めコーティングされた９６ウェル組織培養物被覆プレートの各ウェルに添加した。細胞及びＩＮＸＮ－２００２ベクターを含有するプレートを１３００ｇ、４℃で１．５時間遠心分離した。遠心分離後、プレートを３７℃のインキュベータに配置して、３時間にわたって細胞を回復及び増殖させた。その後、１００μＬの完全培地（ＩＭＤＭ＋１０ＦＢＳ＋ＧＳＨ）を各ウェルに添加した。プレートをインキュベータに戻して、さらに培養した。前述した標準的な非スピン形質導入を対照として使用した。形質導入後、細胞を３回継代したが、各細胞継代の間に３～５日培養した。最後の継代で、培養上清を採取して、Ｃ７タンパク質レベルを評価すると共に、細胞当たりの遺伝子コピー数分析のために細胞を採取した。表２６は、異なる形質導入条件でのＣｏｌ７発現レベルを示す。
Figure 2023036685000029
表２７は、採取した細胞の細胞当たりのベクターコピー数を記載する。
Figure 2023036685000030
結果は、特に、より低いＭＯＩ、及び試験されたＩＮＸＮ－２００２ベクター希釈率で、スピン形質導入方法を用いて、Ｃｏｌ７産生レベル及び細胞当たりのベクターコピー数のいずれにも軽度の増加を示す。
スピン形質導入パラメータの最適化
ＩＮＸＮ－２００２形質導入効率をさらに高めることを目標として、遠心分離時間、速度及び温度をはじめとするスピン形質導入パラメータを評価した。この試験では、前述のものと同じ細胞培養条件を使用した。初期実験では、遠心分離温度を調べた。細胞及びＩＮＸＮ－２００２ベクターを含有する９６ウェルプレートを１３００ｇ、４℃又は２５℃（ＲＴ）のいずれかで１．５時間遠心分離した。これに続いて、ＩＮＸＮ－２００２形質導入効率に対する遠心分離速度の作用を実験するために、細胞及びＩＮＸＮ－２００２ベクターを含有する９６ウェルプレートを１３００ｇの高速、又は３００ｇの低速のいずれかで、４℃又は２５℃（ＲＴ）にて１又は２時間遠心分離する別の実験を実施した。いずれの実験においても、遠心分離後インキュベーションのために、細胞を３７℃のインキュベータに戻した。３時間後、１００μＬの完全培地を各ウェルに添加した。細胞を３回継代した後、培養上清中のＣｏｌ７発現分析、及び採取細胞中の細胞当たりのベクターコピー数分析のために採取した。
表２８は、Ｃｏｌ７発現レベル及び細胞当たりのベクターコピー数に対するスピン形質導入温度の作用を記載する。標準的な非スピン形質導入を対照として含めた。
ここでも、より高いＣ７タンパク質発現及び細胞当たりのベクターコピー数に示される通り、標準的な非スピン形質導入と比較して、スピン形質導入を用いた場合にＩＮＸＮ－２００２形質導入増大が実証された。スピン形質導入温度は、全体的な形質導入効率に対する影響を示さなかった。
以下の表２９は、ＩＮＸＮ－２００２形質導入効率に対する遠心分離速度並びに温度及び時間の作用を記載する。
Figure 2023036685000031

Figure 2023036685000032
結果は、スピン形質導入をＲＴ、１３００ｇで１時間実施したとき、Ｃ７タンパク質発現及びベクターコピー数によって示される通り、ＩＮＸＮ－２００２形質導入効率の軽度の改善を示す。改善の有意性がわからなかったため、初めに開発したスピン形質導入パラメータ（１３００ｇ、４℃で１．５時間の遠心分離）を更なる試験での使用のために選択した。
ＩＮＸＮ－２００２形質導入効率をさらに高めるための超形質導入
前述したＩＮＸＮ－２００２形質導入の早期開発において、超形質導入（第２形質導入）を評価した。線維芽細胞に対するＩＮＸＮ－２００２形質導入効率をさらに高めるために、スピン形質導入と組み合わせて、超形質導入を再度評価した。以前の方法とは異なり、現試験では、初期スピン形質導入後１継代を経た細胞に超形質導入を実施した。１細胞継代の含有は、細胞を初期スピン形質導入から回復させて、第２の超形質導入に対してさらに受容性が高くなると予想される。
同様に、以前の指数関数的増殖期のＴＲ８からのＲＤＥＢ線維芽細胞を採取して、この試験に使用した。前述した最適化スピン形質導入方法、１３００ｇ、４℃で１．５時間の遠心分離をＩＮＸＮ－２００２形質導入のために使用した。初期スピン形質導入から７２～９６時間後、形質導入細胞を１回継代した。２回目の継代培養から７２～９６時間後、細胞を採取し、同じスピン形質導入条件を用いて、再形質導入した。超スピン形質導入後、細胞をさらに３回継代した後、培養上清中のＣｏｌ７発現分析、及び採取細胞中の細胞当たりのベクターコピー数分析のために採取した。この試験のために、ＩＮＸＮ－２００２ベクターを使用した。表３０は、ＩＮＸＮ－２００２形質導入効率に対する超スピン形質導入の作用を記載する。
Figure 2023036685000033
超スピン形質導入は、ＲＤＥＢ線維芽細胞に対するＩＮＸＮ－２００２形質導入効率の有意な増大をもたらした。Ｃ７タンパク質発現は、約１．７倍増大し、細胞当たりのベクターコピー数は、約３倍増加した。
データは、追加形質導入によって、Ｃｏｌ７発現の４０％増加及び細胞当たりのコピー数の６０％増加を示した。この増加により、超感染を製造プロトコルに追加した。
ＩＮＸＮ－２００４ベクターによる形質導入
改善された形質導入方法の開発と同時に、異なるレンチウイルスバックボーン（すなわち、ｐＦＵＧＷ）に基づく新規のＬＶ－Ｃｏｌ７ベクター（「ＩＮＸＮ－２００４」と呼ばれる）も開発した。
ＩＮＸＮ－２００４単一スピン形質導入
以前の指数関数的増殖期のＴＲ８からのＲＤＥＢ線維芽細胞を採取し、この試験に使用した。最初の試験では、ＩＮＸＮ－２００４ベクターのパイロットロットを用いて、前述した通りのスピン形質導入の単一ラウンドを実施した。標準的な非スピン形質導入を対照としてこの試験に含めた。細胞を３回継代した後、培養上清中のＣｏｌ７発現分析、及び採取細胞中の細胞当たりのベクターコピー数分析のために採取した。表３１は、ＩＮＸＮ－２００４ベクター形質導入を用いた場合の、Ｃｏｌ７発現レベル及び細胞当たりのベクターコピー数を記載する。
Figure 2023036685000034
ＩＮＸＮ－２００２ベクターと比較して、スピン形質導入方法と組み合わせてＩＮＸＮ－２００４を使用すると、形質導入効率に有意な改善が達成された。さらに、ＩＮＸＮ－２００４ベクターは、約１０倍高いＣ７タンパク質発現及び細胞当たりのベクターコピー数によって示されるように、非スピン形質導入条件下であっても、ＲＤＥＢ線維芽細胞の形質導入において有意により活性であると考えられる。これらの結果は、新規のＩＮＸＮ－２００４ベクターの構築のためのｐＦＵＧＷベースの使用を支持するものである。
上に報告されたことと一致して、ＭＯＩ１７での、比較的低いＣ７発現レベル及びベクターコピー数により示されるように、スピン形質導入は、より高いＭＯＩ条件で線維芽細胞に対するＩＮＸＮ－２００４ベクター有毒作用を悪化させると考えられる。これは、比較的低いＭＯＩの使用が、有効であるとして実証されているため、ＦＣＸ－００７製造に影響を与えない。
ＩＮＸＮ－２００４超スピン形質導入
第２の試験では、超スピン形質導入（前述した通り）をＩＮＸＮ－２００４形質導入に使用した。形質導入の規模は、９６ウェルプレートからＴ－２５フラスコに高めた。形質導入パラメータは、５μｇ／ｃｍ２の同じＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティング密度、及び１×１０４細胞／ｃｍ２の形質導入での同じ細胞密度を含め、不変のままであった。Ｔ－２５フラスコ内の形質導入量は、４．２ｍＬであった。形質導入のために、細胞及びウイルスを含有するＴ－２５フラスコを１３００ｇ、４℃で、１．５時間遠心分離した。細胞を３７℃のインキュベータに戻し、３時間インキュベートした。初期インキュベーション後、更なる培養のために、４．２ｍＬの完全培地をフラスコに添加した。細胞を３回継代した後、培養上清中のＣｏｌ７発現分析、及び採取細胞中の細胞当たりのベクターコピー数分析のために採取した。表３２は、ＩＮＸＮ－２００４ベクター形質導入効率に対する超スピン形質導入の作用を記載する。この試験のために、ＩＮＸＮ－２００４ベクターのパイロットロットを使用した。
Figure 2023036685000035
以前のＩＮＸＮ－２００２ベクターについて観察されたように、低いＭＯＩ形質導入条件下では、超スピン形質導入は、Ｃｏｌ７タンパク質発現レベルの比較的軽度の増加にもかかわらず、形質導入細胞において細胞当たりのベクターコピー数の有意な（約５倍の）増加をもたらした。
形質導入開発及び最適化の概要
以前のＩＮＸＮ－２００２及び新規のＩＮＸＮ－２００４ベクターのいずれを用いた場合も、継続的な工程開発において、ＲＤＥＢ線維芽細胞に対するＬＶ－Ｃｏｌ７形質導入効率の有意な改善が達成された。これらの改善によって、生物学的に効力の高いＦＣＸ－００７細胞製剤の製造が可能になるはずである。製造工程開発の研究結果に基づいて、形質導入用のＩＮＸＮ－２００４ベクターを用いたＦＣＸ－００７の製造のために、以下の形質導入手順を選択した。
５μｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎで培養物表面を予めコーティングする。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）コーティングのために、組織培養物処理フラスコを使用する。
形質導入時に細胞及びＩＮＸＮ－２００４ベクターを同時に添加する。細胞接種密度は、約１×１０４細胞／ｃｍ２である。
４℃の形質導入容器内で、細胞及びＩＮＸＮ－２００４ベクターを、１３００ｇで１．５時間遠心分離する。
２％ＦＢＳを含む形質導入培地中の形質導入後、３７℃で１．５～２．０時間細胞をインキュベートした後、１０％ＦＢＳ含有する完全培地と交換するか、又はそうした培地を細胞に供給する。
低い形質導入培地量（９６ウェルプレートの場合に、５０μＬ／ウェル、又は０．３５ｍＬ／ｃｍ２）を使用する。
初期形質導入後１回の継代を経た細胞に対して超形質導入を実施する。
実施例６－ＩＮＸＮ－２００２により形質導入されたＲＤＥＢ遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞の分析
下記の目的のために、ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクター由来のＲＤＥＢ遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞（ＧＭ－ＨＤＦ）を分析した：
ＩＤ注射によるＲＤＥＢケラチノサイトから成る、樹立複合ヒト皮膚移植片（ブタ真皮上で調製）におけるＣＯＬ７発現の局在化を評価する。
ＲＤＥＢ ＧＭ－ＨＤＦで処置したＳＣＩＤマウスに移植された複合ＲＤＥＢヒト皮膚（ブタ真皮上で調製）における潜在的発癌性／腫瘍原性を評価する。
複合移植片培養物の網状側に線維芽細胞を接種することによりＧＭ－ＨＤＦ（ＩＮＸＮ－２００２由来）を評価する初期の試みは、恐らく、失活ブタ真皮へのＧＭ－ＨＤＦの遊走が不適切であったか、又は１９日目のｒＣ７の適切な拡散及び付着の時間が不十分であったために、成功しなかった。代替アプローチを用いて、６匹の予備試験動物における既存の移植片の直接ＩＤ注射により、機能を評価した。ブタ真皮上で調製したＲＤＥＢ複合移植片は、予想より頑健であることがわかり、樹立ＲＤＥＢ皮膚移植片への直接注射を可能にした。このアプローチは、疾患及び投与の臨床経路をより忠実に模倣する。
この試験報告は、樹立ＲＤＥＢ皮膚移植片へのＧＭ－ＨＤＦのＩＤ注射の初期評価からのデータを提供するものである。インビボ薬理学のための長期目標を達成するために追加試験を計画する。
Ａ．試験材料
Ａ．１ 試験物質
試験物質を調製し、発送前に、原薬出荷規格について試験した。皮膚移植片注射のための試験物質は、各々予定された処置日の１日前に調製した。ＧＭ－ＨＤＦを解凍、洗浄し、ＤＭＥＭ中に再懸濁させて、出荷規定に関して評価した。ＧＭ－ＨＤＦを翌日配達で発送し、４８時間以内に投与した。同じ方法により、非補正ＲＤＥＢ ＨＤＦ（モック形質導入）をＧＭ－ＨＤＦと同一の患者から単離し、拡大した。
複合皮膚移植片の調製に使用される試験物質及び細胞は凍結状態で発送した。皮膚移植片の調製に使用される細胞は、試験のために解凍及び培養され得る。
ロット番号ＴＲ８（非形質導入対照）をＲＤＥＢ－ＨＤＦ陰性対照として使用した。ロット番号ＴＲ８アームＡ（ＧＭ－ＨＤＦ－ＬＶ－ＣＯＬ７）をＧＭ－ＨＤＦ試験物質として使用した。
試験物質分析は、発送前に製造施設で実施した。残った試験物質は、－７０℃で１年間保存する。試験物質は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で保存する。
Ａ．２．他の化学薬品及び材料
他の材料のリストを表３３に記載する。
Figure 2023036685000036
グループ１（陰性グループ）細胞：トレーニングラン８からのドナー由来の非形質導入ＲＤＥＢ細胞を解凍し、形質導入前に１回継代した。細胞の継代から２日後、細胞を収集し、ＣＯＬ７プラスミドＶＶＮ４３１７５１３を含む液体ベースのトランスフェクション剤Ｔｒａｎｓｆｅｘ（ＡＴＣＣ）を用いて、１．２×１０６個の細胞を５０ｍｌコニカルチューブ内の低血清増殖（ＡＴＣＣ ＰＣＳ－２０１－０３０及びＰＣＳ－２０１－０４１）培地中でトランスフェクトした。複合体化Ｔｒａｎｓｆｅｘと１０分間のインキュベーション後、ＤＮＡ及びＯｐｔｉｍｅｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、１×１０６個のトランスフェクトした細胞をＴ１５０フラスコに移し、２×１０５個の細胞をＴ２５中に導入して、３７℃５％ＣＯ２インキュベータ内に１６時間配置し、この温度で、培地を除去し、完全増殖培地（ＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ）、９２０ｍｇ／ｍＬのＬ－グルタチオン還元型（Ｓｉｇｍａ）１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及び１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ））に取り換えた。次に、発送時間まで、３７℃５％ＣＯ２インキュベータに細胞を戻した。発送時間に、フラスコの向きとは関係なく、フラスコの全ての部分が培地と接触するように、全ての細胞フラスコを最大容量まで充填した。
Ｂ．試験設計
Ｂ．１．ランダム化
ＲＤＥＢヒト皮膚移植片の高い失敗率のために、これらの動物グループ内のマウスはランダム化しない。
Ｂ．２．試験に際しての種及び数の正当化
ＮＯＤ．ＣＢ．１７－ＰＲＫＤＣｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスは、概念予備臨床効力／毒物学研究を実証するのに使用される標準的な種であり、ヒト異種移植モデルを用いた評価のために選択されるげっ歯類種である。この試験は、試験物質を評価するために十分なデータを提供し得る試験動物の数を最小限に抑えるように設計した。
Ｂ．３．投与経路
線維芽細胞は、正常ヒト皮膚移植片の皮内移植によって投与し得る。複合移植片は、移植前に接種により細胞に投与し得る。
Ｂ．４．用量投与
レンチウイルス形質導入（ＣＯＬ７Ａ１補正）ＲＤＥＢ ＧＭ－ＨＤＦ（ＩＮＸＮ－２００２を使用）及び陰性対照（ビヒクル又はＲＤＥＢ－ＨＤＦ）の皮内細胞注射は、３０ゲージニードルで実施し得る。注射は、まず皮膚を貫通した後、表面に戻すように上方へと可能な限りニードルを表面に向けてもよい。
複合移植片は、インビトロ試験で概説したプロトコルに従って、移植前に細胞に接種するが、但し、移植前に複合培養系を空気－流体界面まで持ち上げない。
Ｂ．４．１．注射用の線維芽細胞（複合移植片）の調製
注射の１週間前に液体窒素保存から、線維芽細胞を除去し、小さな氷結晶が残るまで３７℃の水中で解凍し、消毒してから、ＢＳＣに移した。バイアルを１０ｍｌ量のＰＢＳ洗浄液中に再懸濁させ、１０００ＲＰＭで１０分間旋回させた。上清を廃棄し、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ１×抗体培地中で洗浄した後、１０００ＲＰＭで１０分間再度旋回させた。ペレットを適切な量で再懸濁させ、１５ｃｍＴＣ皿上で平板培養した。１日置きに培地を交換し、移植片が注射可能になるまで、８０％密集で継代した。注射日に、線維芽細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で中和し、１００００ＲＰＭで１０分間旋回させた後、細胞のペレットを再懸濁させ、細胞のアリコートを採取し、トリパンブルー染色により細胞をカウントすることにより、生存率を決定した。５０ｕＬ体積中１．０×１０６個の細胞をシリンジ中に吸い上げる。３０ｇのニードルを取り付け、マウスに注射することができるようになるまで、４℃で配置する。
Figure 2023036685000037
Figure 2023036685000038

Figure 2023036685000039
Ｃ．皮膚移植片
Ｃ．１ ＲＤＥＢヒト皮膚移植片
Ｃ．１．１ 線維芽細胞
対照としての正常線維芽細胞及び非修正ＲＤＥＢ線維芽細胞と一緒に、ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクターなどのレンチウイルス遺伝子移入により製造した遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞（ＲＤＥＢ ＧＭ－ＨＤＦ）は、初めに真皮を注入するために用いられる細胞型である。細胞を失活真皮上で培養して、約２ｃｍ平方の皮膚同等物を形成する。再生皮膚複合物は、線維芽細胞が注入されたヒト失活真皮の上に培養したヒトケラチノサイトから構成される。
一次ケラチノサイトの単離及び培養
野生型ケラチノサイトは、新生児包皮から単離し、一次ＲＤＥＢケラチノサイトは、患者皮膚サンプルから単離する。後者は、ウェットアイスを用いて輸送された１５ｍＬ遠心分離チューブ内の１５ｍＬのケラチノサイト増殖培地５０／５０Ｖに浸した６ｍｍのパンチ生検として取得する。輸送されるサンプル中に気泡が存在してはならない。培地５０／５０Ｖは、ＨＫＧＳ（０．２％ウシ胎児脳下垂体抽出物［ＢＰＥ］、ウシインスリン［５ｍｇ／ｍＬ］、ヒドロコルチゾン［０．１８ｍｇ／ｍＬ］、ウシトランスフェリン［５ｍｇ／ｍＬ］、ヒト表皮増殖因子［０．２ｍｇ／ｍＬ］）を添加した５０％培地１５４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、組換えヒトＥＧＦ１－５３ＢＰＥを添加した５０％ケラチノサイトＳＦＭ（ＫＳＦＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する。細菌混入を低減するために、抗生物質ＡＶ１００（アミカシン／バンコマイシン）を添加する。
２５Ｕ／ｍＬのディスパーゼ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、４℃にて一晩処理することにより、真皮及び表皮を分離する。次に、真皮から表皮を剥離し、５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ １０×を含む１５ｍＬ遠心分離チューブ内に導入する。表皮「剥離物」を、５分毎に穏やかに攪拌しながら３７℃の水浴中で１５～３０分間インキュベートする。ＴｒｙｐＬＥは、同量のＤＴＩ（規定トリプシン阻害剤）又はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで中和する。細胞を１２００ｒｐｍでペレット化し、Ｔ７５ Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｐｕｒｅｃｏａｔ（商標）コラーゲン１模倣フラスコ上の１２ｍＬの５０／５０Ｖ中で平板培養した。ＰｕｒｅＣｏａｔ（商標）フラスコが製造者から入手できない場合には、代わりに、３７℃で１５分間、１０ｃｍプラスチック皿当たり１ｍｌのコラーゲン１コーティング溶液を使用することができる。コラーゲン１コーティングは、Ｖｉｔｒｏｇｅｎ １００コラーゲン（１ｍｌ）、ＨＥＰＥＳ（２ｍ）、ＢＳＡ（１００ｕＬの１００ｍｇ／ｍｌ）及び１×ＨＢＳＳ（１００ｍｌ）の０．２ｕＭ濾過溶液である。細胞接種の前に、過剰コラーゲンコーティングを吸引する。細胞の均質な分布を確実にするために、フラスコを旋回させ、任意の操作又は観察の前に、少なくとも一晩３７℃５％ＣＯ２インキュベータ内に配置する。細胞を組織培養条件に３日間適応させる。適応後、２日毎又は必要に応じて培地を交換する。約７０％密集になったら、正常組織培養プラスチック上でケラチノサイトを継代する。
５０／５０Ｖ培地中で、ケラチノサイトは、５継代にわたり十分に増殖する。最初の４継代以内にケラチノサイトを使用する。
ブタ失活真皮の調製
分層ブタ皮膚のシートを取得する。これは、デルマトームにより採取されたブタ皮膚から、ヒト真皮を失活させる方法（前述の通り）と同様に調製することができる。１×ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン／ゲンタマイシンを含有する滅菌ＰＢＳ中でブタ真皮を３回洗浄してから、ＰＢＳ中で１Ｍ ＮａＣｌ及び２×抗生物質と一緒に３７℃で７２時間インキュベートする。表皮を分離して、廃棄し、抗生物質を含有する１×ＰＢＳで３回洗浄することにより、溶液中の余剰の塩及びゲンタマイシンを除去する。
５０／５０Ｖ又はＫＧＭ中に１片のブタ真皮を４日間培養することにより、無菌状態を確認する。ＰＢＳを毎週交換しながら、真皮を抗体溶液中に４℃で保存することができる。真皮は、使用前に数ヵ月以上保存すべきではない。
器官型培養接種用線維芽細胞
失活真皮を２ｃｍ平方の切片に切断する。６ウェル培養プレート内に、基底膜側を下にして真皮を配置し、真皮を少し乾燥させる。
線維芽細胞を各ウェルに接種し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５％加湿ＣＯ２で３７℃に３～４日間戻し、毎日培地を交換する。この期間中、線維芽細胞は、真皮に付着して、組織中に遊走し始める。
接種ケラチノサイト
線維芽細胞が真皮を通過して遊走した後、真皮を注意深く剥がし、環状皮膚支持体（ＡＤＳ）に移す。薄層のマトリゲルを添加して密封し、真皮を装置内に固定する。５ｍＬのＫＧＭをＡＤＳの間質コンパートメントに添加する。ＫＧＭは、ＦＢＳ（１０％）、アデニン（１．８×１０～４Ｍ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、コレラ毒素（１×１０～１０Ｍ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍＬ）、及びトリヨード－Ｌ－チロニン（１．３６ｎｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２の３：１混合物である。ＡＤＳ当たり総量１００μＬのＫＧＭ中で、ケラチノサイトをトリプシン処理、カウント、及び接種する。ＡＤＳアセンブリーをインキュベータに戻す。少なくとも２４時間ＡＤＳをかき混ぜない。真皮上部のケラチノサイトは、空気液体界面に維持しなければならない。下方チェンバ内のＫＧＭは毎日交換する。器官型培養は、１～２週間継続する。
器官型培養物の移植
器官型培養物は、７～１０日後に移植することができるようになる。移植は、正常ヒト皮膚移植片について前述した通り、実施される。包帯及び縫合糸を７～１０日後に除去し、さらに１週間新しい包帯に取り換える。その後、移植片を空気にさらして成熟させる。
移植片の採取及び切断
マウスを人道的に犠牲にし、注意深く移植片を採取する。移植片を二等分し、さらに１ｍｍの切片に切断する。切片を１ｍｍ平方にさらに切断して、免疫電子顕微鏡検査（ＩＥＭ）に付す。残りの半分は、中央縁をマークして、ドライアイス上のＯＣＴ中で凍結する。切断は、この縁から開始する。直後の分析のために半分を切断し、残りの半分は、後の分析のために保存する。中央縁から出発して１０個の８μｍ切片を切断し、順次標識する。次の４０の切片は廃棄する。移植片の末端に達するまで繰り返す。空気乾燥してから、氷冷５０／５０アセトン／メタノールで固定する。
樹立ＲＤＥＢ複合移植片の注入
樹立された移植片の後に、皮膚に直接、線維芽細胞を皮内注射する。注射は、５０μＬ以下の量である。
本明細書に記載のように複合移植片を事前に移植したマウスに、注射を実施した：様々な用量のＲＤＥＢ ＧＭ－ＨＤＦと一緒に遠心分離することにより、失活ブタ真皮を接種し、組織培養物中で１週間増殖させた。続いて、真皮をさっとひっくり返し、１００万個のＲＤＥＢケラチノサイトを接種して、１週間以上培地で増殖させた。前述と同様に、この２週間の組織培養期間後、移植片をＳＣＩＤマウスに配置して、正しい位置に縫合し、１３日間包帯をした。その時点で包帯を外し、移植から３８～４１日後に、移植片に５０μＬの線維芽細胞を注射した。
Ｄ．実験手順
Ｄ．１．ＣＯＬ７の局在化
免疫蛍光顕微鏡検査を使用して、ＶＩＩ型コラーゲンの発現を評価した。抗ヒトＣ７特異的抗体ＮＰ１８５を用いた皮膚培養物の免疫蛍光（ＩＦ）分析のために。
Ｄ．１．２．ＮＰ １８５抗体免疫蛍光顕微鏡検査方法
ＣＯ２安楽死を実施した直後、複合移植片をＳＣＩＤマウスから採取した。移植片を二等分して、ＯＣＴブロック中に配置した。組織の凍結ブロックを－２１℃のＬｅｉｃａ ＣＭ１８５０クライオスタット上で８μＭの厚さに切断し、氷冷５０％メタノール／５０％アセトン中に固定した。スライドを再水和し、１×ＰＢＳで３回洗浄し、一次抗体（ＮＰ１８５ １０ｕｇ／ｍｌ；マウス抗ヒトコラーゲンＶＩＩ）中に室温で１時間インキュベートした。スライドを洗浄して、Ａｌｅｘａ ４８８タグ付きヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：４００、１時間、室温、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び核Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２対比染色（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でインキュベートした。サンプルを１×ＰＢＳで３回洗浄し、イメージングの前に、フルオロマウントを用いて据え付けた。画像は、拡大率２０×のＺｅｉｓｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１蛍光顕微鏡で取得した。
１９日目に採取した移植片を陽性及び陰性対照アームとして加えた。実験アームは、３８、３９、又は４１日目に注射し、４８、４９、又は５１日目に採取した（表３７）。
Figure 2023036685000040
Ｅ．データ分析
ＩＦ画像を作成し、盲検的にＰＩに提供した。データを解析し、ＰＩにより解釈した後、盲検解除を行った。
Ｆ．結果
採取した移植組織のＩＦ解析からの代表的な結果を図２６に示す。
陰性対照（画像「ＲＤＥＢ未補正」－陰性ベースライン比較のためにＤＥＪにおける矢印を参照）を除く全てのＮＰ１８５染色条件で、ＤＥＪにおけるＣ７染色を視覚化した。陽性対照に関して、正常ケラチノサイト／線維芽細胞接種移植片のＤＥＪに強度のＤＥＪ染色が認められた。事前に接種した補正線維芽細胞を示し得る小さな切片に、未補正線維芽細胞（画像１ｂ）を注射したグループ１には陽性染色の小さな焦点が認められたが、両マウスにおける残りの未補正線維芽細胞注射移植片は、あまり強くないことがわかる（画像１ａに示される通り）。補正済線維芽細胞を注射した４つのマウス移植片の代表的な画像（４ａ～ｄ）で、ＤＥＪに認められるＣ７染色は、移植からわずか１０日後でも観察された。
試験の過程で、いずれの移植片にも腫瘍は観察されなかった。
Ｇ．結論
ほぼ提案された臨床用量で皮内注射されたＲＤＥＢ ＧＭ－ＨＤＦ ＴＲ８は、失活ブタ真皮上のＲＤＥＢケラチノサイトの複合移植片において、インビボでＤＥＪに局在化したＣ７を産生した。さらに、移植前の複合移植片中へのＧＭ－ＨＤＦの接種から得られた結果は、ＧＭ－ＨＤＦが、ＤＥＪに局在化する発現Ｃ７を持続し得ることを示す。このモデルを用いて、臨床用量を予測するＧＭ－ＨＤＦの作用とほぼ同じ局在化、耐久性、永続性及び表現型補正を特性決定することができる。
試験の結果は、患者のＲＤＥＢの有効な治療法としての自家ＧＭ－ＨＤＦの皮下注射を示す。
実施例７－非ＧＬＰインビトロＧＭ－ＨＤＦ細胞特性決定及び概念実証評価
この試験の目的は、以下：（ａ）ＲＤＥＢ患者の治療に用いようとする、予想される規模のＧＭＰ製造方法を用いて製造されるＧＭ－ＨＤＦを特性決定すること；（ｂ）組込みＬＶのコピー数及びＣ７の発現レベルを評価すること；並びに（ｃ）ＧＭ－ＨＤＦにより発現されるＣ７の機能性を確認することである。
Ａ．試験材料
Ａ．１．試験物質
トレーニングラン８、９、及び１０からのＧＭ－ＨＤＦ、並びにエンジニアリングラン（前述の通り）から得られたＧＭ－ＨＤＦを特性決定した。
Figure 2023036685000041
Ｂ．ｑＰＣＲ分析で使用されるプライマー及びプローブ配列
Figure 2023036685000042
Ｃ．実験手順
Ｃ．１ ＬＶ－ＣＯＬ７コピー数
Ｑｉａｇｅｎ’ｓ ＡｌｌＰｒｅｐキットを用いて、製造者の指示に従い、核酸単離を実施した。３×１０５ＧＭ－ＨＤＦ細胞から単離したｇＤＮＡを１２．５ｎｇ／μｌに標準化した。８μｌの標準化ｇＤＮＡを２０μＬアッセイ（１０μＬ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ、１．８μＬのヌクレアーゼフリー水、０．０６μＬの１００μＭフォワードプライマー、０．０６μＬの１００μＭリバースプライマー、０．０４μＬの１００μＭ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ）に使用した。また、標準曲線の連続希釈線状化Ｃ７レンチウイルスシャトルベクター（１ｅ６コピー／反応～５コピー／反応）、加えて４μＬのヒトｇＤＮＡ（１．５ｅ４細胞／反応）も前述の２０μＬアッセイで検定した。使用したＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイは、ＰＲ１３８４３であった。さらに、２０μＬアッセイ（１０μＬ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ、１．０Ｌのヌクレアーゼフリー水、１μＬの２０×ＡＣＴＢプライマー／プローブセット）における市販のヒトｇＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（１．５ｅ４細胞／反応～２ｅ２細胞／反応）の８μＬの別の標準曲線も実施した。全てのサンプルは、下記のサイクルパラメータを用いてＡＢＩ７９００上に泳動させた：５０℃で２分、９５℃で１０分、並びに９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクル。
Ｃ．２ ＣＯＬ７Ａ１ ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＧＭ－ＨＤＦ細胞のバイアルを解凍し、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ ＡｌｌＰｒｅｐ（商標）キットを用いてｇＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＲＮＡ（８００μｇ）を使用し、Ｑｕａｎｔａ’ｓ ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）を用いて、製造者の指示に従い、ｃＤＮＡを作製した。次に、前述したように、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ ＰＲ１３６５３を用いて、ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡを試験した。データをハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢ（ｄＣＴ）に標準化した後、対照データ（ｄｄＣＴ）と比較した。得られたｄｄＣＴは、式２＾－（ｄｄＣＴ）を用いて、倍率変化に変換した。
Ｃ．３ Ｃ７免疫蛍光
免疫蛍光分析のために、１．２×１０４個のＧＭ－ＨＤＦを２４ウェルプレート内のＰＤＬ／ラミン被覆カバースリップに一晩付着させ、固定した後、メタノール／アセトンの５０％／５０％混合物で透過性にした。カバースリップを１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ中１０％ヤギ血清で、室温にて３０分間遮断した。ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、カバースリップを１％ヤギ血清／ＰＢＳ中１．２５μｇ／ｍＬのｆＮＣ１抗体と一緒にインキュベートし、続いて、ＰＢＳでさらに３回洗浄してから、１％ヤギ血清／ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５－共役ヤギ抗ウサギＩｇＧと一緒に室温で１時間インキュベートした。ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｄｙ Ｐｒｏｂｅｓ Ｒｅａｇｅｎｔでカバースリップを染色してから、スライドに載せた。２９０ミリ秒の露出時間を用い、拡大率２０×のＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡で画像を取得した。ＮＨＤＦ又はＧＭ－ＨＤＦを固定し、透過性にした後、核（青色）を視覚化するために、ＮｕｃＢｌｕｅＬｉｖｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎで、又はＣ７発現（赤色）を視覚化するために、ｆＮＣｌ抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５－共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ（５μｇ／ｍＬ）で染色した。２９０ミリ秒の露出時間を用い、拡大率２０×で画像を取得した。
Ｃ．４ Ｃ７タンパク質ＥＬＩＳＡ
手短には、精製済Ｈｉｓ－ＮＣ１断片（９．８～６２５ｎｇ／ｍＬ）の標準曲線又はＣ７タンパク質（３～５日間培養のＧＭ－ＨＤＦ由来）を含有する収集上清をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６ウェルプレートに４℃で一晩固定化した。標準及びサンプルを同じサンプルマトリックス（２０％ＲＤＥＢ線維芽細胞馴らし培地）中で試験した。コーティングしたウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより３７℃で１時間遮断した。ポリクローナル抗ＮＣ１ Ａｂ（ｆＮＣ１、０．５μｇ／ｍＬ）の使用、続いて、二次抗体ロバ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，０．０８μｇ／ｍＬ）とのインキュベーションにより、検出を達成した。ＴＭＢ基質溶液との比色測定発色によって、結合抗体を検出した。反応をクエンチングした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により４５０ｎｍで吸光度を測定した。
Ｃ．５ Ｃ７三量体の免疫沈降
最初に、１×ＰＢＳ－Ｔで磁気タンパク質Ｇビーズを洗浄した。上清を回収する前、及び後のステップ全てにおいて、少なくとも２分間ビーズを磁石に結合させた。洗浄後、ビーズを５μｇの抗Ｃ７ｆＮＣ１でコーティングしてから、回転（Ｇｌａｓ－Ｃｏｌ、室温で設定３０～１４ｒｐｍ）させながら、１０分間インキュベートした。ビーズを磁石に結合させて、上清を回収し、Ａｂ結合／洗浄バッファーで洗浄した。３～５日間培養したＧＭ－ＨＤＦから上清を収集した。Ｃ７含有上清をビーズ／Ｃ７上清混合物に添加し、回転（設定３０～１４ｒｐｍ）させながら４℃で一晩インキュベートした。翌日、ビーズを磁石に結合させ、洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。標的抗原を２０μＬの溶出バッファー（５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．８、及び１０μｌの４×ローディングダイ（Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ））中に溶出させた。サンプルを７０℃で１０分間変性させた。計３０μｌのうちの１２μｌ（残りのサンプルは、４℃で保存した）を１２ウェルの３～８％Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅゲルにロードし（ウェル毎に）、１５０ボルトで４時間にわたり泳動させた。ゲルをカセットから取り出し、１０％メタノールを含有する転写バッファー中に２０分間浸漬した。ニトロセルロース膜へのゲルの湿潤転写を１５ボルト、４℃で一晩実施した。翌日、電圧を氷上で３０分間５０ボルトに上昇させた。転写の完了後、ＴＢＳ－Ｔ中５％ミルクを用い、攪拌（Ｌａｂｎｅｔ ＰｒｏＢｌｏｔ（商標）Ｒｏｃｋｅｒ ２５、設定６０ｒｐｍ）しながら、室温で２時間ブロットを遮断した後、室温で２時間攪拌しながら、市販の抗Ｃ７ＬＨ７．２（０．２５μｇ／ｍＬ）と一緒にインキュベートした。ブロットを攪拌しながら、１×ＴＢＳ－Ｔで３回（各５分）洗浄した後、室温で１時間攪拌しながら、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（０．１μｇ／ｍＬ）でプローブした。Ｌｕｍｉｇｌｏ Ｕｌｔｒａ（商標）Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質及びＦｕｊｉｆｉｌｍ ＬＡＳ ３０００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ブロットを展開させた。
Ｃ．６ Ｌａｍ３３２結合
９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを１００ｍＭ炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中の１μｇのＬａｍ３３２又はＢＳＡで、４℃にて一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ－Ｔで５回すすいだ後、室温で１時間ＰＢＳ－Ｔ中１％ＢＳＡで遮断した。被覆ウェルをＰＢＳ－Ｔで５回すすいだ後、形質導入細胞からの上清と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔでさらに３回洗浄してから、結合したＣ７をｆＮＣ１抗体（０．５μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ－Ｔ）と一緒に室温で３時間インキュベートした後、ＨＲＰ－共役ロバ抗ウサギＩｇＧ（ＰＢＳ－Ｔ中の最終濃度０．８μｇ／ｍＬ）と一緒に室温で２時間インキュベートした。Ｃ７結合抗体の検出は、ＴＭＢを用いた比色反応によって行い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ３８４プレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍにおける産物の吸光度を読み取ることにより測定した。全てのインキュベーションは、速度設定２のオービタルシェーカ（ＧｅｎｅＭａｔｅ）を用いて実施した。
Ｃ．７ 細胞遊走アッセイ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からのＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）２４ウェル創傷治癒アッセイキットを細胞遊走アッセイに使用した。ＧＭ－ＨＤＦ（０．８×１０５）を２４ウェルプレート内に創傷挿入片の存在下で接種し、４８時間増殖させた。次に、創傷挿入片を回収し、１５μｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１）を含有する低濃度（１％）血清培地中で８時間にわたり細胞をさらに培養した。創傷挿入片の回収から０、２、４、６、及び８時間後、Ｃｅｌｉｇｏ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ）を用いて、創傷の明視野画像を取得した。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて、各時点での創傷の表面積を測定した。データは、創傷面積に及ぶ遊走率（％遊走）として記録する。
Ｃ．７．データ解析
ＳＤＳ ２．３ソフトウエアを使用するＡＢＩ ７９００計器を用いて、ｑＰＣＲを実施した。実験データを映し出し、ＳＤＳ ２．４ソフトウエアにエクスポートした。ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて、前述したアッセイの細胞遊走率（％）を定量した。ＩｍａｇｅＪは、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって開発され、科学的多次元画像のために設計されたオープンソース画像処理プログラムである。
Ｄ．結果
Ｄ．１．Ｃ７発現の特性決定
Ｄ．１．１．ＬＶ－ＣＯＬ７コピー数及び転写物レベル
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイは、ウイルスシャトルベクターの様々な領域に対して設計された。試験されたＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイのうち、Ｃ７コード配列を標的とする設計は、許容不可能なレベルのバックグラウンド増幅を示した。選択されたＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ、ＰＲ１３８４３は、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）に記載される通り、ＬＶバックボーンの５’末端に見出された配列を標的とした。
ＧＭ－ＨＤＦトレーニングラン細胞を取得し、ｄＰＢＳで洗浄した後、ＲＬＴバッファー中に再懸濁させた。Ｑｉａｇｅｎ’ｓ ＡｌｌＰｒｅｐキットを用いて、各トレーニングランの各アームからの原薬バイアルからＤＮＡ（コピー数のために）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡ転写物レベルのために）を単離した。次に、単離したＤＮＡ及びＲＮＡを、それぞれ、上のセクションＣ．１及びＣ．２に記載する通りのｑＰＣＲ及びＲＴ－ｑＰＣＲアッセイに付した。表４０は、トレーニングラン８、９、及び１０（ＴＲ８、ＴＲ９、及びＴＲ１０）並びにエンジニアリングラン（ＥＲ１）からのコピー数／細胞を示す。データは、各細胞に組み込まれたトランスジーンのコピー数が、生成中に細胞に投与されるウイルス用量によってモジュレートすることができ、これは、１コピー／細胞未満であることを明らかにしている。同様に、図４０に示すＬＶ－ＣＯＬ７転写物レベルも、ウイルス用量及びコピー数、対照細胞と比較して高レベル（３～５ＬＯＧ）のレンチウイルスＣ７配列を発現するトレーニングランからのアームＡ及びＢと相関する。
Figure 2023036685000043
Ｄ．１．２．Ｃ７タンパク質発現
Ｃ７に特異的な抗体を用いたＧＭ－ＨＤＦ細胞によるＣ７タンパク質発現を調べるために、間接免疫蛍光（ＩＦ）を使用した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）をこのアッセイの陽性対照として使用し、トレーニングランの対照アームを陰性対照として使用した。以下の図２８に示す代表的な画像では、わずかなパーセンテージ（＜１０％）のＩＮＸＮ－２００２及びＬＶ－ＨＡ－ＣＯＬ７－形質導入ＲＤＥＢ線維芽細胞がＣ７染色を示し、これは、組み込まれたＬＶのコピー数（表１８）と一致する。Ｃ７陽性であるＧＭ－ＨＤＦからのシグナルは、ＮＨＤＦからのシグナルより明るく、ＧＭ－ＨＤＦによって産生される、より多量のＣ７を示している。
細胞培地中にＧＭ－ＨＤＦにより分泌されるＣ７を測定するために、Ｉｎｔｒｅｘｏｎによって直接ＥＬＩＳＡが開発された。このアッセイは、上のセクションＣ．４に記載されるように、ＮＣ１領域特異的ポリクローナル抗体を使用するものであった。３つのトレーニングランからのＧＭ－ＨＤＦのＥＬＩＳＡアッセイ結果は、Ｃ７発現がＬＶ用量依存性であり、発現レベルは、４５～９０ｎｇ／ｍＬ（細胞上清）の範囲であることを示す（図２９）。
Ｄ．２．Ｃ７三量体のＧＭ－ＨＤＦ９．２．１．形成により発現されたＣ７の機能性評価
Ｃ７三量体の形成は、係留線維のアセンブリーにおいて重要である。ＧＭ－ＨＤＦにより発現されるＣ７が、係留線維を形成することができることを確認するために、選択的捕捉のための抗Ｃ７特異的抗体（ｆＮＣ１）との免疫沈降（ＩＰ）を用いて、発現されたＣ７が三量体を形成するか否か、次に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／免疫ブロットによる検出のための培養上清からのＣ７の濃度を評価した。
免疫沈降のための最適条件は、市販のＣ７抗体及びｆＮＣ１Ｃ７抗体を試験することによって確立した。ｆＮＣ１によるタンパク質Ｇビーズのコーティングは、市販の抗体によるコーティングと比較して高レベルのＣ７結合をもたらした。このアッセイで使用した対照は、ビーズに対するＣ７の非特異的結合、並びにＧＭ－ＨＤＦ培養上清から単離されたＣ７の特異性についての対照として馴らし培地中にスパイクされた精製済Ｃ７と一緒に、及びこれを含まずにインキュベートした抗体被覆ビーズを除外するために、抗体対照は一切含まない。
ＴＲ８並びにＴＲ１０及びＥＲ１についての免疫沈降結果から、ＧＭ－ＨＤＦにより生成されるＣ７が、主として三量体であることが判明した（それぞれ、図１０、及び図１１）。免疫反応性を示すいくつかの比較的低い分子量種も観察され、これらは、二量体及び２９０ｋＤａ単量体型を含んだ。抗Ｃ７抗体（左側パネル、図１１Ｂ）並びにＣ７タンパク質に組み込まれたＨＡタグに特異的な抗体（右側パネル、図１１Ｂ）の両方によって、ＴＲ９のＧＭ－ＨＤＦからのＣ７のＩＰが、免疫ブロットに低レベルで検出された。
Ｄ．２．２．ＧＭ－ＨＤＦから発現されたＣ７によるＬａｍ３３２結合
Ｃ７は、フィブロネクチン、ラミニン３３２（Ｌａｍ３３２）、ＣＯＬ１、及びＣＯＬ４をはじめとする固定化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分と結合することがわかっている（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２ａ）。Ｃ７とＬａｍ３３２同士の相互作用は、Ｃ７のＮＨ２－末端ＮＣ１ドメインを介して起こり、Ｌａｍ３３２とＣ７ＮＣ１のネイティブ立体構造に依存的である（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｃ７とＬａｍ３３２同士の結合は、真皮表皮接合部に正しいＬａｍ３３２構造を確立する上で重要である。こうした組織化は、細胞外リガンド及び細胞表面受容体との相互作用、並びに細胞シグナル伝達のために重要である（Ｗａｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００７）。Ｉｎｔｒｅｘｏｎは、Ｃ７と精製済Ｌａｍ３３２の結合を検出するために、Ｃ７ＮＣ１ドメインに対する抗体を用いてＥＬＩＳＡを開発した。Ｃ７／Ｌａｍ３３２結合ＥＬＩＳＡは、既に文献に記載されている（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２ａ）が、我々の知る限り、これが、形質導入細胞の上清中に存在するＣ７を試験するために使用されたことは一度もない。図１２の結果は、トレーニングラン及びエンジニアリングランからのＧＭ－ＨＤＦによって発現されたＣ７によるＬａｍ３３２との用量依存的結合を示す。
Ｄ．２．３．細胞遊走アッセイ
以前の試験は、ＲＤＥＢ線維芽細胞及びケラチノサイトが、その正常対応物に対して運動性の増加を示すこと、並びにＣ７の発現によって正常な運動性が回復され得ることを明らかにしている（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２ｂ；Ｃｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｂａｌｄｅｓｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。これらの試験の大部分は、線維芽細胞及びケラチノサイトの遊走を測定するための金塩コロイド遊走アッセイ、又はケラチノサイトの遊走を測定するための創傷治癒アッセイのいずれかを使用した。ここで、本発明者らは、ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）２４ウェル創傷治癒アッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＮＨＤＦ及びＧＭ－ＨＤＦの運動性を測定した。
Ｃ７の免疫蛍光染色は、わずかなパーセンテージ（＜１０％）の形質導入細胞しか高レベルのタンパク質を発現しなかったことを明らかにし、少数のＣ７産生細胞が、細胞遊走に全体的な作用をもたらし得るのか否かに関して疑問が生じた。培地中のＣ７の存在が、ＲＤＥＢ運動過剰表現型を逆転する上で十分であるかを決定するために、３つのトレーニングランからのＧＭ－ＨＤＦに対して創傷治癒アッセイを実施したが、その際、ＮＨＤＦを陽性対照として、モック形質導入対照（ＲＤＥＢ）アームを陰性対照として使用した。
ＴＲ８、ＴＲ１０、及びＥＲ１からの対照線維芽細胞は、Ｃ７の発現により逆転される運動過剰表現型を呈示する（図３０）。しかし、ＴＲ９からの対照線維芽細胞は、有意な運動過剰表現型を呈示せず、このアッセイでＨＡタグ付けＣ７の機能性を調べることを困難にしている。
結論
ＧＭ－ＨＤＦにおいて細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数は、ウイルス用量に依存的であり、細胞当たり０．００９～０．０３トランスジーンコピーの範囲であった。
ｑＰＣＲ、免疫蛍光染色、及びＥＬＩＳＡによって、ＧＭ－ＨＤＦ細胞からの用量依存的Ｃ７発現を確認した。
ＧＭ－ＨＤＦ細胞によって発現されたＣ７の構造は、ＴＲ８、ＴＲ１０、及びＥＲ１についての免疫沈降／ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析によって、主に三量体であることが確認された。ＴＲ９は、最小の三量体形成を示した。
ＴＲ８ ＧＭ－ＨＤＦ細胞から産生されたＣ７は、インビトロ結合アッセイにおけるラミニン３３２との結合、並びにインビトロ遊走アッセイにおける対照ＲＤＥＢ細胞の運動過剰表現型の補正によって、機能性であることが実証された。ＴＲ９は、ラミニン３３２との結合を示したが、遊走アッセイ結果は、曖昧であった。ＬＶ－ＨＡ－ＣＯＬ７による形質導入から作製されたＴＲ９ ＨＡ－ＧＭ－ＨＤＦは、低レベルの三量体、Ｌａｍ３３２との低い結合、及び明瞭な運動過剰補正の欠如を示した。
ＴＲ９ ＨＡ－ＧＭ－ＨＤＦにより発現されたＨＡ－Ｃ７のインビトロ機能性の確認がないことから、インビトロ及びインビボハイブリッド薬理学／毒物学的評価のためにＴＲ８を選択した。これによって、正常ヒト皮膚又は失活ヒト皮膚で調製されたＲＤＥＢ複合移植片における発現、局在化及び永続性を評価する能力が排除された。最終的に、失活ブタ真皮で調製された複合移植片をこれらの試験に使用した。ヒト特異的抗Ｃ７抗体による免疫染色を用いて、このアプローチにおけるネイティブＣ７からｒＣ７を識別した。
実施例８－製剤
ＦＣＸ－００７製剤は、各患者自身の生きた自家線維芽細胞の滅菌懸濁液から構成され、これらの線維芽細胞は、ＩＮＸＮ－２００４ＬＶ－ＣＯＬ７を用いて、ヒト野生型ＣＯＬ７Ａ１遺伝子をコードするように遺伝子改変され、フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に製剤化される。
製剤開発
ＦＣＸ－００７製剤及び細胞用量の開発は、ａｚｆｉｃｅｌ－Ｔ（ＬＡＶＩＶ（登録商標））；注射用の生存自家線維芽細胞製剤に関するＦｉｂｒｏｃｅｌｌの製造経験に基づいた。線維芽細胞は、粘性の問題なく、０．５～３．０×１０７細胞／ｍＬの細胞濃度範囲でＤＭＥＭに製剤化された（ａｚｆｉｃｅｌ－Ｔ ＢＬＡ＃１２５３４８）。データは、細胞濃度が５．８×１０７細胞／ｍＬに達すると、製剤注射について粘性が問題となることを示唆している。結果として、１．０～３．０×１０７細胞／ｍＬの細胞濃度のＤＭＥＭが、ＦＣＸ－００７ＤＰの製剤化として選択された。
余剰量
治療注射用の１用量として最大１０のＦＣＸ－００７ＤＰバイアルを臨床現場に発送する。投与の際、ＤＰバイアルを３回穏やかに反転させてから、２１ゲージニードルを用いて、滅菌１ｍＬシリンジ中に各バイアルから１ｍＬずつ無菌吸引する。次に、２１ゲージニードルを皮内投与用の３０ゲージニードルに取り換える。残る９つの製剤バイアルについてこの方法を繰り返す。
ＦＣＸ－００７ＤＰバイアルは１．２ｍＬの線維芽細胞懸濁液で充填され、１．０ｍＬの回収可能量に対して２．０ｍＬ容量バイアルに導入される。０．２ｍＬの余剰量は、臨床現場での投与時に、バイアルから１．０ｍＬを取得できることを保証することを意図するものである。
ａ．物理化学的及び生物学的性質
ｉ．物理化学的性質
ＦＣＸ－００７ＤＰは、２ｍＬのクライオバイアル中に１．２ｍＬの充填量で、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中の遺伝子改変自家線維芽細胞懸濁液として提供される。細胞は、アッセイによって、生存培養物であることが実証されている。表４１は、ＦＣＸ－００７ＤＰの物理化学的性質を示す。
Figure 2023036685000044
生物学的性質
ＦＣＸ－００７は、ヒトコラーゲン７タンパク質（Ｃ７）を発現するように遺伝子改変された滅菌自家線維芽細胞製剤である。細胞当たりのＩＮＸＮ－２００４ベクターコピー数及びＣ７タンパク質の発現は、ＦＣＸ－００７ＤＰの固有の生物学的特性である。ＦＣＸ－００７ＤＰは、ＰＢＳ及びＤＭＥＭバッファーで解凍ＦＣＸ－００７ＤＳ細胞を洗浄することにより、ＦＣＸ－００７ＤＳから製造される生存細胞懸濁製剤である。ＦＣＸ－００７ＤＰの製造のために出荷する前に、ＦＣＸ－００７ＤＳについて、細胞当たりのＩＮＸＮ－２００４ベクターコピー数及びＣ７タンパク質の発現を分析する。表４２は、ＦＣＸ－００７ＤＰの生物学的性質を示す。
Figure 2023036685000045
製造処方
ＦＣＸ－００７製剤を製造するために、ＦＣＸ－００７原薬バイアルを液体窒素凍結保存の気相から取り出し、解凍してから、ＩＳＯ５ＢＳＣ内にプールする。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、続いて、フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で洗浄した後、１．０～３．０×１０７細胞／ｍＬの目標濃度まで、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中に懸濁させる。次に、製剤化細胞を１．２ｍＬ／バイアルで２ｍＬクライオバイアル中に充填する。各々の注射処置のために製造された製剤は、バッチと定義される。提案される処置バッチサイズは、１．２ｍＬの細胞懸濁液を含有する、最大１０個の２ｍＬバイアルである。
表４３は、薬剤製造工程に使用される全成分のリストを示す。
Figure 2023036685000046
製造工程及び工程管理の説明
ｂ．製造工程フロー図
ＦＣＸ－００７製剤バイアルを液体窒素保存から取り出し、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）を用いて解凍すると、ＦＣＸ－００７製剤の製造が開始する。ＩＳＯ５ ＢＳＣ内で、＞５×バルク量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）洗浄バッファーを含有する２５０ｍＬ遠心分離チューブ中に、解凍したＦＣＸ－００７ＤＳ細胞を再懸濁のためにプールする。５±３℃で、細胞を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＰＢＳ洗浄バッファーを除去する。その後、＞５×バルク量のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）での洗浄、続いて再懸濁、さらに、５±３℃、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を実施する。ＤＭＥＭ洗浄バッファーを除去する。洗浄した細胞は、２．０×１０７細胞／ｍＬの目標濃度まで、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ中に再懸濁させる。ＩＳＯ５ＢＳＣ内で、細胞懸濁液をバイアル当たり１．２ｍＬの量まで滅菌２．０ｍＬクライオバイアル中に手動で充填して、ＦＣＸ－００７ＤＰバイアルを製造する。製剤バイアルは、Ｃｒｅｄｏ Ｃｕｂｅ（商標）荷送人で臨床現場への発送のためにＱＡによる出荷まで、２～８℃で保存する。
製造工程の説明
ＦＣＸ－００７製剤を前述した通りに製造する。ＩＮＸＮ－２００２は、ＦＣＸ－００７の同義名である。
ステップ１：液体窒素保存からのＦＣＸ－００７原薬バイアルの取り出し及びロット確認
液体窒素冷凍庫内に保存したＦＣＸ－００７原薬は、Ｍａｅｒｉａｌｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔから要請される。続いて、ＦＣＸ－００７製剤製造のバッチのためにＦＣＸ－００７原薬バイアルが取り出され、クリーンルームに移される。
ステップ２：クライオバイアルの解凍
処理用途でクリーンルームから取り出すために、ＳＯＰ－００９９ ＧＭＰ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌｉｎｅ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ／ＧＴＰ Ｌｉｎｅ Ｃｌｅａｎｉｎｇに従って、クリーンルームのラインクリアランスをＱＡにより実施する。オペレータは、処理に際してＢＳＣ内での処理及び非バイアルＥＭサンプリングの前に、ＳＯＰ－０１２９（Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）に従って、室内、従業員、及びＢＳＣ環境モニタリング（ＥＭ）を開始する。
ＦＣＸ－００７ ＤＳクライオバイアルを消毒し、細胞懸濁液が、わずかな氷結晶を残してほぼ完全に解凍するまで、３７℃に平衡させたＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）内で解凍する。解凍したバイアルをＢＳＣに移す。
ステップ３：ＰＢＳ洗浄
ＢＳＣ内で、ピペットを用い、約１５０ｍＬのＰＢＳ（＞５容積のＦＣＸ－００７ＤＳ細胞懸濁液）を２５０ｍＬ遠心分離チューブ中に移す。解凍したクライオバイアルの内容物を２５０ｍＬ遠心分離チューブ中に移す。希釈した細胞懸濁液を用いて、ピペットをすすぐ。ピペットを用いて、３．０ｍＬの新鮮なＰＢＳをすすぎ液として各クライオバイアルに移す。すすぎ液を２５０ｍＬ遠心分離チューブに移す。チューブを穏やかに旋回させて、細胞懸濁液を混合する。遠心分離チューブを遠心分離機に移し、１０００ＲＰＭで、５±３℃にて１０分間細胞を遠心分離する。遠心分離の後、ＰＢＳ洗浄物上清をチューブから採取する。
ｉ．ステップ４：ＤＭＥＭ洗浄
ピペットを用いて、フェノールレッドを含まない約２００ｍＬのＤＭＥＭ（＞５容積のＦＣＸ－００７ＤＳ細胞懸濁液）をチューブに添加して、細胞ペレットを再懸濁させる。チューブを穏やかに旋回させて、細胞懸濁液を混合する。遠心分離チューブを遠心分離機に移し、１０００ＲＰＭで、５±３℃にて１０分間細胞を遠心分離する。遠心分離の後、ピペットを用いて、遠心分離ボトルからの０．９ｍＬの上清を、「ロット、ＱＣ－無菌」とラベル付けされた２つの個別の２ｍＬクライオバイアル（計１．８ｍＬ）の各々に移す。無菌のラベルが付いたクライオバイアルをＢＳＣ内に取っておく。残ったＤＭＥＭ洗浄液上清を遠心分離チューブから吸引する。
ステップ５：ＤＭＥＭ中の細胞ペレット再懸濁液
細胞ペレットを再懸濁させるために使用するＤＭＥＭの量は、以下のように計算する：
解凍したＦＣＸ－００７ＤＳ細胞懸濁液の量を１．５で割る
再懸濁後に、１．０～３．０×１０７細胞／ｍＬの規定範囲内の細胞濃度を達成するために、１／１．５体積係数で、洗浄ステップ中に考えられる細胞消失を補償する。
ピペットを用いて、計算量のＤＭＥＭを移して、遠心分離チューブ内で細胞ペレットを再懸濁させる。ピペットを用いて、０．１ｍＬの細胞懸濁液を「ロット、ＱＣ－カウント及び生存率」とラベル付けされた２ｍＬクライオバイアルに移し、細胞カウントのためにクライオバイアルをＱＣに提出する。ピペットを用いて、残った細胞懸濁液総量を測定し、細胞懸濁液を後の最終用途のために２～８℃冷蔵庫内に配置する。
ステップ５ａ：再希釈（必要に応じて）
ＱＣ細胞濃度が、３．０×１０７細胞／ｍＬを超える場合には、新鮮なＤＭＥＭを用いて、２．０×１０７細胞／ｍＬの目標細胞濃度までさらに希釈を実施する。細胞懸濁液サンプルを細胞カウントのためにＱＣに再度提出して、最終細胞濃度を確認する。
ステップ６：最終充填
細胞を冷蔵庫から取り出し、最終充填のために細胞をＢＳＣに移す。ピペットを用いて、十分に混合した細胞懸濁液を下記の順に２ｍＬのクライオバイアルに手動で充填する：
０．１ｍＬの細胞懸濁液を第１の無菌サンプルバイアルに充填する（ステップ４から保持されるサンプルに添加する）。
バイアル当たり１．２ｍＬで製剤バイアルを充填する。
第２の無菌サンプルバイアルに０．１ｍＬの細胞懸濁液を充填する（ステップ４から保持されるサンプルに添加する）。
バイアル当たり≦１．８ｍＬでＱＣバイアルを充填する。
無菌及びＱＣバイアルを試験のために提出する。
ステップ７：出荷及び発送のためのＤＰバイアルの保存
臨床現場への出荷及び発送のために、ＤＰバイアルを５±３℃で保持する。
工程内管理の説明
環境管理
全ての細胞培養操作は、無菌技術を用い、ＩＳＯ７環境バックグラウンド内の認証ＩＳＯ５生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）において実施する。最終製剤２ｍＬクライオバイアル容器は、Ｃｏｒｎｉｎｇから予め滅菌した状態で購入する。最終充填を実施するオペレータは、無菌充填操作の能力を有する者である。
工程内管理及び試験
ＦＣＸ－００７製剤の出荷のために実施される工程管理及び試験を以下に説明する。
ステップ１
ＦＣＸ－００７ＤＰ製造で使用する前に、正しいＦＣＸ－００７原薬ロットをＱＡによって確認する。
ステップ２
ＦＣＸ－００７原薬バイアルを解凍するために使用するＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）の温度を３７℃に制御する。過熱を防ぐために、バイアル中に氷の小片がまだ残る程度まで、各バイアルの内容物を解凍する。
ステップ３
細胞の適切な洗浄を確実にするために、ＰＢＳ洗浄量を≧５容積のＦＣＸ－００７ＤＳ細胞プールに制御する。遠心分離条件は、十分な細胞ペレット化を確実にするために、１０００ｒｐｍ、１０分、及び５±３℃に制御する。
ステップ４
ＰＢＳ洗浄ステップと同様に、細胞の適切な洗浄を確実にするために、ＤＭＥＭ洗浄量を≧５容積のＦＣＸ－００７ＤＳ細胞プールに制御する。遠心分離条件は、十分な細胞ペレット化を確実にするために、１０００ｒｐｍ、１０分、及び５±３℃に制御する。最終製剤の無菌試験で使用するために、２つの９００μＬアリコートのＤＭＥＭ洗浄上清を採取する。
ステップ５及び５（ａ）（必要に応じて）
再懸濁細胞濃度は、１．０～３．０×１０７細胞／ｍＬ、及び生存率≧７０％に制御する。
ステップ６
ＦＣＸ－００７ＤＰバイアルの充填量は、バイアル当たり１．２ｍＬに制御する。最終細胞カウント及び生存率測定、並びにグラム染色は、充填ＱＣバイアルで実施する。２つの無菌バイアルを無菌試験のために提出する。この無菌試験の結果は、薬剤出荷後まで受領されないため、ＤＰの出荷は、陰性グラム染色に基づいて実施する。この状況下での迅速微生物試験の使用は、以下：Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ ＦＤＡ Ｒｅｖｉｅｗｅｒｓ ａｎｄ Ｓｐｏｎｓｏｒｓ “Ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＭＣ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＩＮＤｓ）”２００８年４月に指示されている。
ｉｉ．材料の管理
ＦＣＸ－００７製剤製造工程では、原料と接触する１回限り使用の、使い捨て製品（例えば、ピペット、遠心分離チューブ、及びクライオバイアル）を使用して、考察事項から清浄及び持ち越しを除外する。製造工程で使用するために選択される原料は、ＵＳＰ ＶＩに準拠するものとして、薬剤処理について許容される。使い捨て品目は全て、γ線照射により予め滅菌された状態で購入する。ＰＢＳ及びＤＭＥＭ洗浄バッファーは、供給業者から滅菌状態で購入する。工程のステップは、時間及び温度などの特定された適切な工程パラメータを有する。
実施例９－最適化ＧＭ－ＨＤＦのインビトロ特性決定
この実施例は、ＬＶ－ＣＯＬ７構築物ＩＮＸＮ－２００４による強化ＬＶ形質導入手順を用いて作製されたＧＭ－ＨＤＦの特性決定を記載する。３つのトレーニングラン（ＴＲ１１、ＴＲ１２．１、及びＴＲ１３）を実施して、ＧＭＰ規模の分析のための細胞を作製した。ＴＲ１１は、ＬＶ－ＣＯＬ７ベクターＩＮＸＮ－２００２で形質導入し、第２の形質導入ステップ（超形質導入）を含む、及び含まない、遠心分離強化（スピノキュレーション）ＬＶ形質導入手順の評価に使用した。ＴＲ１１の評価により決定されるように、強化形質導入手順を使用して、ＴＲ１２．１及びＴＲ１３をＬＶ－ＣＯＬ７ベクターＩＮＸＮ－２００４で形質導入した。
組込みＬＶ－ＣＯＬ７のコピー数、Ｃ７のタンパク質発現、及びＧＭ－ＨＤＦにより発現されたＣ７の機能性などの結果を評価するためのアッセイを用いて、各トレーニングランからのＧＭ－ＨＤＦを特性決定した。
ＬＶ組込み及びＣ７発現レベルは、まず、超形質導入ステップの追加により増大し、ＬＶ－ＣＯＬ７ ＩＮＸＮ－２００４の使用によってさらに増大した。３つの全てのトレーニングランからのＧＭ－ＨＤＦから発現されたＣ７は、三量体の形態にアセンブルし、ラミニン３３２に結合したが、これは、係留線維の形成に重要である。ＧＭ－ＨＤＦによるＣ７の発現は、ＲＤＥＢ線維芽細胞に観察される運動過剰を逆転させることができた。インビボＧＬＰ毒物学試験に使用するために、ＴＲ１２．１及びＴＲ１３からのＧＭ－ＨＤＦを選択した。
この試験の目的は、（ａ）１）大規模ＧＭＰ製造方法に組み込まれた強化形質導入手順と２）ＩＮＸＮ－２００４ ＬＶ－ＣＯＬ７構築物の採用によって、組込みＬＶのコピー数及びＣ７の発現の改善を実証すること、並びに（ｂ）ＧＭ－ＨＤＦによって発現されるＣ７の機能性を確認することであった。
１．試験材料
１．１．試験物質
トレーニングラン（ＴＲ）１１、１２．１及び１３からのＧＭ－ＨＤＦを特性決定した。
Figure 2023036685000047
１．２．プライマー及びプローブ配列
Figure 2023036685000048
２．実験手順
２．１．ＬＶ－ＣＯＬ７コピー数
Ｑｉａｇｅｎ’ｓ ＡｌｌＰｒｅｐキットを用いて、製造者の指示に従い、核酸単離を実施した。６．７×１０５ＧＭ－ＨＤＦ細胞からｇＤＮＡを単離し、８μｌのｇＤＮＡを２０μＬアッセイ（１０μＬ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ、１．８μＬのヌクレアーゼフリー水、０．０６μＬの１００μＭフォワードプライマー、０．０６μＬの１００μＭリバースプライマー、０．０４μＬの１００μＭ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ）に使用した。また、連続的に希釈した線状化ＬＶ－ＣＯＬ７レンチウイルスシャトルベクター（１ｅ６コピー／反応～５コピー／反応）の標準曲線、加えて４μＬのヒトｇＤＮＡ（１．５ｅ４細胞／反応）も前述の２０μＬアッセイで検定した。使用したＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイは、ＰＲ１３８４３であった。さらに、２０μＬアッセイ（１０μＬ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ、１．０Ｌのヌクレアーゼフリー水、１μＬの２０×ＡＣＴＢプライマー／プローブセット）における市販のヒトｇＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（１．５ｅ４細胞／反応～２ｅ２細胞／反応）の８μＬの別の標準曲線も実施した。全てのサンプルは、下記のサイクルパラメータを用いてＡＢＩ７９００ＨＴ上に３回反復して泳動させた：５０℃で２分、９５℃で１０分、並びに９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクル。
２．２．Ｃ７免疫蛍光
免疫蛍光分析のために、１．２×１０４個のＧＭ－ＨＤＦを２４ウェルプレート内のＰＤＬ／ラミンコートカバースリップに一晩付着させ、固定した後、メタノール／アセトンの５０％／５０％混合物で透過性にした。カバースリップを１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ中１０％ヤギ血清で、室温にて３０分間遮断した。ＰＢＳでさらに３回洗浄した後、カバースリップを１％ヤギ血清／ＰＢＳ中１．２５μｇ／ｍＬのポリクローナルｆＮＣ１抗体（α－ｆＮＣ１）と一緒にインキュベートし、続いて、ＰＢＳでさらに３回洗浄してから、１％ヤギ血清／ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５－共役ヤギ抗ウサギＩｇＧと一緒に室温で１時間インキュベートした。ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｄｙ Ｐｒｏｂｅｓ Ｒｅａｇｅｎｔでカバースリップを染色してから、スライドに載せた。２９０ミリ秒の露出時間を用い、拡大率２０×のＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡で画像を取得した。ＮＨＤＦ又はＧＭ－ＨＤＦを固定し、透過性にした後、核（青色）を視覚化するために、ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎで、又はＣ７発現（赤色）を視覚化するために、ｆＮＣｌ抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５－共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ（５μｇ／ｍＬ）で染色した。２９０ミリ秒の露出時間を用い、拡大率２０×及び５×で画像を取得した。
２．３．Ｃ７フローサイトメトリー
ＧＭ－ＨＤＦ（約５００，０００細胞）を９６ウェルプレートＶ字底プレートの各ウェル中に収集し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分、室温）により濃縮した後、培地上清を採取した。次に、細胞を２００μＬのＣｙｔｏＦｉｘ中に再懸濁させてから、９６ウェルＶ字底プレートに移し、４℃で３０分間インキュベートした。固定の後、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分、４℃）により固定液を除去し、２００μＬの氷冷１００％メタノールで細胞を氷上で３０分間透過性にした。次に、染色手順の前に、細胞を－２０℃に維持した。染色のために、透過性細胞を２００μＬのインキュベーションバッファー（１００ｍＬのＰＢＳ中０．５ｇＢＳＡ）で２回洗浄し、洗浄と洗浄の間に、遠心分離（３００ｒｐｍ、５分、室温）によりバッファーを除去した。洗浄した細胞は、１：４００に希釈したα－ｆＮＣ１を含有する１００μｌのインキュベーションバッファー中に再懸濁させ、室温で１時間インキュベートした。次に、前述のように細胞を２回洗浄してから、１：２０００に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５－ウサギＩｇＧ二次抗体を含有する１００μＬのインキュベーションバッファー中に再懸濁させて、３０分間室温でインキュベートした。次に、前述のように細胞を２回洗浄し、１００μＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。下記パラメータ：ＦＳＣ電圧＝４８４、ＳＳＣ電圧＝２０９、ＰＥ＝５００を含むＢＤ ＬＳＲＩＩ及びＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖ６．２）を用いたフローサイトメトリーにより、Ｃ７発現細胞を数えた。
２．４．Ｃ７タンパク質ＥＬＩＳＡ
手短には、精製済Ｈｉｓ－ＮＣ１断片（９．８～６２５ｎｇ／ｍＬ）の標準曲線又はＣ７タンパク質（３～５日間培養のＧＭ－ＨＤＦ由来）を含有する収集上清をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６ウェルプレートに４℃で一晩固定化した。標準及びサンプルを同じサンプルマトリックス（１０％ＲＤＥＢ線維芽細胞馴らし培地）中で試験した。コーティングされたウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより３７℃で１時間遮断した。α－ｆＮＣ１ Ａｂ（０．５μｇ／ｍＬ）の使用、続いて、二次抗体ロバ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，０．０８μｇ／ｍＬ）とのインキュベーションにより、検出を達成した。ＴＭＢ基質溶液との比色測定発色によって、結合抗体を検出した。反応をクエンチングした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により４５０ｎｍで吸光度を測定した。
２．５．Ｃ７三量体の免疫沈降
最初に、１×ＰＢＳ－Ｔで磁気タンパク質Ｇビーズを洗浄した。上清を回収する前、並びに後の全ステップにおいて、少なくとも２分間ビーズを磁石に結合させた。洗浄後、ビーズを５μｇのα－ｆＮＣ１でコーティングしてから、回転（Ｇｌａｓ－Ｃｏｌ、室温で設定３０～１４ｒｐｍ）させながら、１０分間インキュベートした。ビーズを磁石に結合させて、上清を回収し、Ａｂ結合／洗浄バッファーで洗浄した。３～５日間培養したＧＭ－ＨＤＦから上清を収集した。Ｃ７含有上清をビーズ／Ｃ７上清混合物に添加し、回転（設定３０～１４ｒｐｍ）させながら４℃で一晩インキュベートした。翌日、ビーズを磁石に結合させ、洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。標的抗原を２０μＬの溶出バッファー（５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．８、及び１０μｌの４×ローディングダイ（Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ））中に溶出させた。サンプルを７０℃で１０分間変性させた。計３０μｌのうちの１２μｌ（残りのサンプルは、４℃で保存した）を１２ウェルの３～８％Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅゲルにロードし（ウェル毎に）、１５０ボルトで４時間にわたり泳動させた。ゲルをカセットから取り出し、１０％メタノールを含有する転写バッファー中に２０分間浸漬した。ニトロセルロース膜へのゲルの湿潤転写を１５ボルト、４℃で一晩実施した。翌日、電圧を氷上で３０分間５０ボルトに上昇させた。転写の完了後、ＴＢＳ－Ｔ中５％ミルクを用い、攪拌（Ｌａｂｎｅｔ ＰｒｏＢｌｏｔ（商標）Ｒｏｃｋｅｒ ２５、設定６０ｒｐｍ）しながら、室温で２時間ブロットを遮断した後、室温で２時間攪拌しながら、市販の抗Ｃ７ＬＨ７．２（０．２５μｇ／ｍＬ）と一緒にインキュベートした。ブロットを攪拌しながら、１×ＴＢＳ－Ｔで３回（各５分）洗浄した後、室温で１時間攪拌しながら、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（０．１μｇ／ｍＬ）でプローブした。Ｌｕｍｉｇｌｏ Ｕｌｔｒａ（商標）Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質及びＦｕｊｉｆｉｌｍ ＬＡＳ ３０００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ブロットを展開させた。
２．６．Ｌａｍ３３２結合
９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを１００ｍＭ炭酸塩バッファー（ｐＨ９．３）中の１μｇのＬａｍ３３２又はＢＳＡで、４℃にて一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ－Ｔで５回すすいだ後、室温で１時間ＰＢＳ－Ｔ中の１％ＢＳＡで遮断した。被覆ウェルをＰＢＳ－Ｔで５回すすいだ後、形質導入細胞からの上清と一緒に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔでさらに３回洗浄してから、結合したＣ７をα－ｆＮＣ１抗体（０．５μｇ／ｍＬ、ＰＢＳ－Ｔ）と一緒に室温で３時間インキュベートした後、ＨＲＰ－共役ロバ抗ウサギＩｇＧ（ＰＢＳ－Ｔ中の最終濃度０．８μｇ／ｍＬ）と一緒に室温で２時間インキュベートした。Ｃ７結合抗体の検出は、ＴＭＢを用いた比色反応によって行い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ３８４プレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍにおける産物の吸光度を読み取ることにより測定した。全てのインキュベーションは、速度設定２のオービタルシェーカ（ＧｅｎｅＭａｔｅ）を用いて実施した。
２．７．細胞遊走アッセイ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からのＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）２４ウェル創傷治癒アッセイキットを細胞遊走アッセイに使用した。ＧＭ－ＨＤＦ（０．８×１０５）を２４ウェルプレート内に創傷挿入片の存在下で接種し、４８時間増殖させた。次に、創傷挿入片を回収し、１５μｇ／ｍＬのＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１）を含有する低濃度（１％）血清培地中で８時間にわたり細胞をさらに培養した。創傷挿入片の回収から０、２、４、６、及び８時間後、Ｃｅｌｉｇｏ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ）を用いて、創傷の明視野画像を取得した。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて、各時点での創傷の表面積を測定した。データは、創傷面積に及ぶ遊走率（％遊走）として記録する。
３．データ解析
ＳＤＳ２．３ソフトウエアを使用するＡＢＩ ７９００計器を用いて、ｑＰＣＲを実施した。実験データを映し出し、ＳＤＳ ２．４ソフトウエアにエクスポートした。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウエアを用いて、フローサイトメトリーデータを解析した。ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて、セクション２．７に記載したアッセイの細胞遊走率（％）を定量した。ＩｍａｇｅＪは、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって開発され、科学的多次元画像のために設計されたオープンソース画像処理プログラムである。
４．結果
４．１．Ｃ７発現の特性決定
この評価の全体的な目的は、形質転換方法及びＬＶベクターの比較によってコピー数及びタンパク質発現を増大することである。具体的な目的は、以下：
１．組み込まれたコピー数に対する超形質導入の作用を評価すること
２．組み込まれたコピー数に対するスピノキュレーションの作用を評価すること
３．超形質導入及びスピノキュレートした条件下で、ＩＮＸＮ－２００２とＩＮＸＮ－２００４のコピー数の値を比較すること
であった。
これらの試験のために、ＬＶ－ＣＯＬ７構築物の２つのＧＭＰロットを使用した：ＩＮＸＮ－２００２及びこの実施例に記載する構築物ＩＮＸＮ－２００４。
４．１．１．ＬＶ－ＣＯＬ７コピー数
ＧＭ－ＨＤＦトレーニングラン細胞を取得し、上のセクション２．１に記載のようにコピー数を決定した。表４６は、新規の形質転換方法を使用したトレーニングランからのコピー数／細胞を記載する。初期最適化では、形質導入ステップ（「スピノキュレーション」）最中に、遠心分離の追加（「スピノキュレーション））を実施した。標準的な形質導入では、これまで、ＩＮＸＮ－２００２を使用して、０．０１３～０．０２５の範囲の組込みコピー数が得られていた。ＩＮＸＮ－２００２による形質導入のためのスピノキュレーションステップを追加しただけで、以前の試験でのＴＲ８の結果と比較して、組込みコピー数が細胞当たり０．０５（ＴＲ１１アームＢ、表４６）へと≧２倍増加した。
組込みコピー数をさらに増大するために、ＧＭ－ＨＤＦ製造工程に第２の形質導入（「超形質導入」）を追加した。やはりスピノキュレーションを使用する超形質導入の追加によって、ＩＮＸＮ－２００２の組込みコピー数が約２倍増加した（ＴＲ１１アームＡ、表４６）。
小規模の研究試験（示していない）によって、別の第３世代自己不活性型ＬＶバックボーンを使用する第２世代ＩＮＸＮ－２００４ ＬＶ－ＣＯＬ７構築物が、ＩＮＸＮ－２００２に用いたものより低い感染多重度（ＭＯＩ）を使用しながら、より高い組込みコピー数を達成し、より高い発現レベルをもたらす可能性を有することが明らかにされた。最適化形質導入手順（超形質導入を含むスピノキュレーション）によりＧＭＰ－規模で使用されると、ＩＮＸＮ－２００４は、ＩＮＸＮ－２００２構築物に対して、約４～８倍の組込みＬＶコピー数をさらに改善して、０．４１～０．７４（それぞれ、ＴＲ１２．１及びＴＲ１３、表４６）の平均コピー数を達成した。
留意すべきは、ＴＲ１２．１及びＴＲ１３のアームＢは、全製造工程を通して継代しなかったため、コピー数について試験されなかったことである（表４４）。正確なコピー数の評価には、測定されるコピー数を不自然に増大させ得るＬＶのエピソームコピーがもはや残留しないことを確実にするために、形質導入後に数回継代した細胞が必要である。
Figure 2023036685000049
４．１．２．Ｃ７タンパク質発現
Ｃ７に特異的な抗体を用いたＧＭ－ＨＤＦによるＣ７タンパク質発現を調べるために、間接的な免疫蛍光（ＩＦ）を使用した。ＴＲ１１アームＡ及びＢ、並びにＴＲ１２．１及びＴＲ１３のアームＡのみをＩＦにより分析した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を陽性対照として使用し、ＴＲ１１の対照アームを陰性対照として使用した。２つの倍率、２０×及び５×の代表的な画像を以下の図３１に示す。また、細胞当たり０．０１５の組込みＬＶ－ＣＯＬ７コピー数を有するＴＲ８アームＡからの細胞のＩＦ画像も、原工程の比較基準として含まれる。上の表４６に示した組込みＬＶのコピー数と一致して、少数のＴＲ１１ ＧＭ－ＨＤＦのみが、Ｃ７抗体と一緒に視覚化されたが、それでもＴＲ８からのＣ７陽性細胞の数よりも多かった。さらに、ＴＲ１２．１及びＴＲ１３ＧＭ－ＨＤＦから測定された比較的高いコピー数は、Ｃ７検出について陽性の細胞の比較的高い数と相関する。注目すべきは、Ｃ７陽性であるＧＭ－ＨＤＦからのシグナルは、ＮＨＤＦからのシグナルよりも明るいことであり、これは、細胞当たりＧＭ－ＨＤＦによって産生される多量のＣ７を示唆している。
次に、フローサイトメトリーアッセイを用いて、Ｃ７を発現する細胞の具体的な数を定量した。セクション２．３に記載される通り、このアッセイは、ＮＣ１領域特異的ポリクローナル抗体を使用した。この実験のために、ＴＲ１２．１及びＴＲ１３のアームＢ細胞を加えて、単一形質導入手順（アームＢ）と、第２世代ＬＶ－ＣＯＬ７構築物（ＩＮＸＮ－２００４）を用いた超形質導入手順（アームＡ）を比較した。以下の図３２に示すように、各トレーニングランアームについてのＣ７陽性（Ｃ７＋）細胞のパーセンテージは、ＩＦにより検出される通り、Ｃ７発現細胞の定性数と一致し（図３２）、測定されたコピー数と相関する（表４６）。ＴＲ１２．１及びＴＲ１３のアームＡ及びアームＢのＣ７＋細胞の比較によって、第２世代の追加によって予測され得る発現レベルのほぼ２倍が確認される。
細胞培地中にＧＭ－ＨＤＦにより分泌されるＣ７を測定するために、直接ＥＬＩＳＡを使用した。このアッセイは、上のセクション２．４に記載されるように、ＮＣ１領域特異的ポリクローナル抗体を使用するものであった。３つのトレーニングランからのＧＭ－ＨＤＦのＥＬＩＳＡアッセイ結果は、Ｃ７発現が組込みＬＶコピー数のレベルに依存的であり、発現レベルが、約２３００ｎｇ／日／１ｅ６細胞に達することを示す（図３３）。以前の試験からの代表的な結果（ＲＤＥＢ－ＡＤＳＯ－２）としてのＴＲ８アームＡと比較して、これはＣ７発現の＞２００倍増加をもたらす（図３３）。
４．２．ＧＭ－ＨＤＦにより発現されたＣ７の機能性評価
４．２．１．Ｃ７三量体の形成
Ｃ７三量体の形成は、係留線維のアセンブリーにおいて重要である（Ｂｒｕｃｋｎｅｒ－Ｔｕｄｅｒｍａｎ，１９９９）。ＧＭ－ＨＤＦにより発現されるＣ７が、係留線維を形成することができることを確認するために、選択的捕捉のための抗Ｃ７特異的抗体（ｆＮＣ１）との免疫沈降（ＩＰ）を用いて、Ｃ７三量体の形成、次に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／免疫ブロットによる検出のための培養上清からのＣ７の濃度を評価した。精製済組換えＣ７を陽性対照として使用し、Ｃ７特異的抗体なしの捕捉ステップを陰性対照として使用した。３つのトレーニングランについてのＩＰ結果から、ＧＭ－ＨＤＦによって産生されたＣ７が、主として三量体であり（図３４）、免疫反応性を示すいくつかの低分子量種（恐らく、Ｃ７の二量体及び単量体）を含むことが判明した。
４．２．２．ＧＭ－ＨＤＦから発現されたＣ７によるＬａｍ３３２結合
Ｃ７は、フィブロネクチン、ラミニン３３２（Ｌａｍ３３２）、ＣＯＬ１、及びＣＯＬ４をはじめとする固定化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分と結合することがわかっている（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２ａ）。Ｃ７とＬａｍ３３２同士の相互作用は、Ｃ７のＮＨ２－末端ＮＣ１ドメインを介して起こり、Ｌａｍ３３２及びＣ７ＮＣ１両方のネイティブ立体構造に依存的である（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｃ７とＬａｍ３３２同士の結合は、真皮表皮接合部に正しいＬａｍ３３２構造を確立する上で重要である。こうした組織化は、細胞外リガンドと細胞表面受容体との相互作用、並びに細胞シグナル伝達のために重要である（Ｗａｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００７）。Ｉｎｔｒｅｘｏｎは、Ｃ７と精製済Ｌａｍ３３２の結合を検出するために、Ｃ７ＮＣ１ドメインに対する抗体を用いてＥＬＩＳＡを開発した。図３５に示す２つの実験の結果は、３つのトレーニングランからのＧＭ－ＨＤＦによって発現されたＣ７によるＬａｍ３３２とのコピー数依存的結合を示す。ＴＲ１１対照細胞は、双方の実験で陰性対象として使用された。
４．２．３．細胞遊走アッセイ
以前の試験は、ＲＤＥＢ線維芽細胞及びケラチノサイトが、その正常対応物に対して運動性の増大を示すこと、並びにＣ７の発現によって正常な運動性が回復され得ることを明らかにした（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２ｂ；Ｃｏｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｂａｌｄｅｓｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，２００３）。これらの試験の大部分は、線維芽細胞及びケラチノサイトの遊走を測定するための金塩コロイド遊走アッセイ、又はケラチノサイトの遊走を測定するための創傷治癒アッセイのいずれかを使用した。この実施例では、ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）２４ウェル創傷治癒アッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＮＨＤＦ及びＧＭ－ＨＤＦの運動性を測定した。
培地中のＣ７の存在が、ＲＤＥＢ運動過剰表現型を逆転する上で十分であるか否かを決定するために、３つのトレーニングランからのＧＭ－ＨＤＦに対して創傷治癒アッセイを実施したが、その際、ＮＨＤＦを陽性対照として、モック形質導入対照（ＲＤＥＢ）アームを陰性対照として使用した。ＴＲ１１アームＣ（ＲＤＥＢ）からの対照線維芽細胞は、Ｃ７の発現により逆転される運動過剰表現型を呈示した（図３６）。興味深いことに、表現型逆転のレベルは、組込みコピー数／Ｃ７発現レベルに依存的ではなく、これは、運動過剰表現型を逆転するのに、低レベルのＣ７発現でも十分であることを示唆している。
５．結論
ＧＭ－ＨＤＦにおいて細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数は、強化形質導入方法（スピノキュレーション及び超形質導入）の追加と、ＬＶ－ＣＯＬ７構築物ＩＮＸＮ－２００４への変更の両方によって改善され、細胞当たり０．７４コピーという高いレベルが達成された。各工程変更によって達成された倍率改善は以下の通りである：
・スピノキュレーションの追加：≧２倍
・超形質導入（スピノキュレーションを含む）の追加：約２倍
・ＩＮＸＮ－２００２からＩＮＸＮ－２００４への変更：＞４倍
・原工程からの総累加変化：平均＞２７倍（初期試験で使用したＴＲ８と比較したＴＲ１２．１及びＴＲ１３）
ＧＭ－ＨＤＦ細胞からの組込みコピー数依存的Ｃ７発現を免疫蛍光染色、フローサイトメトリー、及びＥＬＩＳＡによって確認した。ＩＮＤ提出１６５８２ Ｓｅｒｉａｌ００００に示されるＴＲ８結果に対して、Ｃ７発現に＞２００倍の改善が達成された。
ＧＭ－ＨＤＦ細胞により発現されるＣ７の構造は、免疫沈降／ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／免疫ブロット分析により主として三量体であることが確認された。
さらに、ＧＭ－ＨＤＦ細胞から産生されるＣ７は、インビトロでのラミニン３３２との結合について、及びインビトロ遊走アッセイにおける対照ＲＤＥＢ細胞の運動過剰表現型の補正によって、機能性であることが確認された。
付録（ＡＰＰＥＮＤＩＸ）４
Figure 2023036685000050

Figure 2023036685000051

Figure 2023036685000052

Figure 2023036685000053

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Figure 2023036685000058

Figure 2023036685000059
以下は、ＩＧＥ３０８＿ＲＥＦＳＥＱＵＥＮＣＥ（配列番号３４）に対する６００１０７４３－ＩＴＸ－００００１＿ＣＯＮＴＩＧ ＳＥＱＵＥＮＣＥ（配列番号３４）の比較分析である。
Figure 2023036685000060

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Figure 2023036685000071

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Figure 2023036685000073

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Figure 2023036685000084

Figure 2023036685000085
参考文献
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Ｗａｔｅｒｍａｎ ＥＡ，Ｓａｋａｉ Ｎ，Ｎｇｕｙｅｎ ＮＴ，Ｈｏｒｓｔ ＢＡ，Ｖｅｉｔｃｈ ＤＰ，Ｄｅｙ ＣＮ，Ｏｒｔｉｚ－Ｕｒｄａ Ｓ，Ｋｈａｖａｒｉ ＰＡ，Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃｈ ＭＰ．２００７．ａ ｌａｍｉｎｉｎ－ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｒｉｖｅｓ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ－３－ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７：４２６４－７０．
Ｗｏｏｄｌｅｙ Ｄ．Ｔ．Ｋｅｅｎｅ Ｄ．Ｒ．Ａｔｈａ Ｔ．Ｈｕａｎｇ Ｙ．Ｒａｍ Ｒ．Ｋａｓａｈａｒａ Ｎ．Ｃｈｅｎ Ｍ．Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００４；１０：３１８－３２６．
Ｗｏｏｄｌｅｙ Ｄ．Ｔ．Ｋｒｕｅｇｅｒ Ｇ．Ｇ．Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ Ｃ．Ｍ．Ｆａｉｒｌｅｙ Ｊ．ａ．Ａｔｈａ Ｔ．Ｈｕａｎｇ Ｙ．Ｃｌｉａｎ Ｌ．Ｋｅｅｎｅ Ｄ．Ｒ．Ｃｈｅｎ Ｍ．Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅ－ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｌｏｎｅ ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｙｐｅ ＶＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｔ ｔｈｅ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｚｏｎｅ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００３；１２１：１０２１－１０２８．
Ｗｏｏｄｌｅｙ Ｄ．Ｔ．Ｋｅｅｎｅ Ｄ．Ｒ．Ａｔｈａ Ｔ．Ｈｕａｎｇ Ｙ．Ｌｉｐｍａｎ Ｋ．Ｌｉ Ｗ．Ｃｈｅｎ Ｍ．Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ ＶＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００４；１０：６９３－６９５．

本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）欠損症に罹患している患者を治療する方法であって、
前記Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞を取得するステップと、
ＣＯＬ７Ａ１をコードするヌクレオチド配列又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と前記細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有する自家遺伝子改変細胞を形成するステップにおいて、前記レンチウイルスベクターが、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップと、
前記自家遺伝子改変細胞を培養するステップと、
有効量の前記遺伝子改変細胞を前記Ｃ７欠損症患者に投与するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
［２］
請求項１に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞及びケラチノサイトから選択されることを特徴とする方法。
［３］
請求項２に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［４］
請求項１に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、栄養障害型表皮水疱症であることを特徴とする方法。
［５］
請求項４に記載の方法において、前記栄養障害型表皮水疱症が、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）及び優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）から選択されることを特徴とする方法。
［６］
請求項５に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、ＲＤＥＢであることを特徴とする方法。
［７］
請求項６に記載の方法において、前記ＲＤＥＢが、アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型、非アロポー・シーメンス（ｎｏｎ－Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、異型ＲＤＥＢ、前脛骨性ＲＤＥＢ、末端性ＲＤＥＶ、及び求心型ＲＤＥＢからなる群から選択される亜型であることを特徴とする方法。
［８］
請求項５に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、ＤＤＥＢであることを特徴とする方法。
［９］
請求項１に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクターが、レンチウイルスベクター粒子の形態であることを特徴とする方法。
［１０］
請求項９に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端反復（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子と、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列と、（ｄ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）と、を含むトランスファーレンチウイルスベクターから構築され、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が欠失しており、前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体は、前記細胞に組み込まれて、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を有する遺伝子改変細胞を形成することを特徴とする方法。
［１１］
請求項１０に記載の方法において、少なくとも２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントがあることを特徴とする方法。
［１２］
請求項１０に記載の方法において、前記欠失ＰＲＥが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であることを特徴とする方法。
［１３］
請求項９に記載の方法において、形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ｐＳＭＰＵＷ及びｐＦＵＧＷからなる群から選択されるレンチウイルス発現プラスミドベクターから構築されることを特徴とする方法。
［１４］
請求項１３に記載の方法において、前記レンチウイルス発現プラスミドベクターが、ｐＦＵＧＷであることを特徴とする方法。
［１５］
請求項９に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする方法。
［１６］
請求項９に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする方法。
［１７］
請求項１に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって前記患者に投与されることを特徴とする方法。
［１８］
請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、注射により投与されることを特徴とする方法。
［１９］
請求項１８に記載の方法において、前記遺伝子改変細胞が、前記患者に皮内注射されることを特徴とする方法。
［２０］
請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、ポリマーカプセル中に封入されることを特徴とする方法。
［２１］
請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、コラーゲンマトリックス中に埋め込まれることを特徴とする方法。
［２２］
請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、ハイドロゲル又はメッシュ中に埋め込まれることを特徴とする方法。
［２３］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現するＶＩＩ型コラーゲン欠損症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする自家遺伝子改変線維芽細胞。
［２４］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、劣性栄養障害型表皮水疱症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする自家遺伝子改変線維芽細胞。
［２５］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、優性栄養障害型表皮水疱症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする自家遺伝子改変線維芽細胞。
［２６］
以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体と、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントと、（ｄ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、前記野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）と、を含むトランスファーベクターから形成される自己不活性型レンチウイルスベクターにおいて、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が欠失していることを特徴とする自己不活性型レンチウイルスベクター。
［２７］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、少なくとも２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントを含むことを特徴とするベクター。
［２８］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記欠失したＰＲＥが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であることを特徴とするベクター。
［２９］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子と、（ｃ）２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントと、（ｄ）さらにＷＰＲＥと、（ｅ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）を含むことを特徴とするベクター。
［３０］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、ＩＮＸＮ－２００４と称されることを特徴とするベクター。
［３１］
請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、ＩＮＸＮ－２００２と称されることを特徴とするベクター。
［３２］
ＩＧＥ－３０８と称されることを特徴とするトランスファーベクター。
［３３］
ＩＮＸＮ－２００４と称されることを特徴とするレンチウイルスベクター粒子。
［３４］
ＩＮＸＮ－２００２と称されることを特徴とするレンチウイルスベクター粒子。
［３５］
ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクター粒子を産生することを特徴とする安定なウイルスパッケージング細胞株。
［３６］
ＩＮＸＮ－２００４レンチウイルスベクター粒子を産生することを特徴とする安定なウイルスパッケージング細胞株。
［３７］
ＩＧＥ３０８の配列を有する、ＩＮＸＮ－２００４と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＲＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
［３８］
ＩＮＸＮ－２００２と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＲＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
［３９］
ＩＧＥ３０８の配列を有する、ＩＮＸＮ－２００４と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
［４０］
ＩＮＸＮ－２００２と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
［４１］
請求項３３に記載のベクターを用いて、インビトロ又はエクスビボで形質導入されることを特徴とする細胞。
［４２］
請求項３４に記載のベクターを用いて、インビトロ又はエクスビボで形質導入されることを特徴とする細胞。
［４３］
偽合指症に罹患している患者の治療方法であって、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする方法。
［４４］
請求項４３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、ケラチノサイト及び線維芽細胞から選択されることを特徴とする方法。
［４５］
請求項４３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［４６］
請求項４３に記載の方法において、前記細胞の患者への投与が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって為されることを特徴とする方法。
［４７］
栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）患者の水疱形成を治療、阻害若しくは軽減する方法であって、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする方法。
［４８］
請求項４７に記載の方法において、前記自家細胞集団が、ケラチノサイト及び線維芽細胞から選択されることを特徴とする方法。
［４９］
請求項４８に記載の方法において、前記自家細胞集団が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［５０］
請求項４７に記載の方法において、前記細胞の患者への投与が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって為されることを特徴とする方法。
［５１］
請求項４７に記載の方法において、前記患者が、劣性栄養障害型表皮水疱症に罹患していることを特徴とする方法。
［５２］
請求項４７に記載の方法において、前記患者が、優性栄養障害型表皮水疱症に罹患していることを特徴とする方法。
［５３］
劣性栄養障害型表皮水疱症患者の病変を治療する方法であって、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする方法。
［５４］
請求項５３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、ケラチノサイト及び線維芽細胞から選択されることを特徴とする方法。
［５５］
請求項５３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［５６］
請求項５３に記載の方法において、前記細胞の患者への投与が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって為されることを特徴とする方法。
［５７］
請求項５３に記載の方法において、前記病変が、口腔粘膜に存在することを特徴とする方法。
［５８］
請求項５３に記載の方法において、前記病変が、胃腸管に存在することを特徴とする方法。
［５９］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、ＶＩＩ型コラーゲン欠損症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする集団。
［６０］
請求項５９に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする集団。
［６１］
請求項５９に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする集団。
［６２］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、劣性栄養障害型表皮水疱症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする集団。
［６３］
請求項６２に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする集団。
［６４］
請求項６２に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする集団。
［６５］
機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、優性栄養障害型表皮水疱症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする集団。
［６６］
請求項６５に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする集団。
［６７］
請求項６５に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする集団。
［６８］
ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する、Ｃ７欠損症患者の自家遺伝子改変細胞の単離された集団を製造する方法であって、前記Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞を採取するステップと、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と前記細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有するＣＯＬ７Ａ１遺伝子を含む自家遺伝子改変細胞を形成するステップにおいて、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップと、前記自家遺伝子改変細胞を培養して、Ｃ７を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団を取得するステップと、を含むことを特徴とする方法。
［６９］
請求項６８に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞及びケラチノサイトから選択されることを特徴とする方法。
［７０］
請求項６９に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［７１］
請求項６８に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、栄養障害型表皮水疱症であることを特徴とする方法。
［７２］
請求項７１に記載の方法において、前記栄養障害型表皮水疱症が、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）及び優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）から選択されることを特徴とする方法。
［７３］
請求項７１に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症がＲＤＥＢであることを特徴とする方法。
［７４］
請求項７３に記載の方法において、前記ＲＤＥＢが、アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型、非アロポー・シーメンス（ｎｏｎ－Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、異型ＲＤＥＢ、前脛骨性ＲＤＥＢ、末端性ＲＤＥＶ、及び求心型ＲＤＥＢからなる群から選択される亜型であることを特徴とする方法。
［７５］
請求項７１に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、ＤＤＥＢであることを特徴とする方法。
［７６］
請求項６８に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする方法。
［７７］
請求項６８に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする方法。
［７８］
請求項６８に記載の方法により製造されることを特徴とする、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
［７９］
請求項７６に記載の方法により製造されることを特徴とする、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
［８０］
請求項７７に記載の方法により製造されることを特徴とする、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
［８１］
請求項７８に記載の単離された集団を含むことを特徴とする医薬製剤。
［８２］
請求項７９に記載の単離された集団を含むことを特徴とする医薬製剤。
［８３］
請求項８０に記載の単離された集団を含むことを特徴とする医薬製剤。
［８４］
遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトにおける細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数を増加する方法であって、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体をコードするヌクレオチド配列を含む形質導入用レンチウイルスベクターを、Ｃ７欠損症患者から得たヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと接触させて、形質導入組成物を形成するステップと、前記形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップを含む方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物よりも多いことを特徴とする方法。
［８５］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞を第２の形質導入レンチウイルスベクターとさらに接触させて、第２の形質導入組成物を形成することを特徴とする方法。
［８６］
請求項８５に記載の方法において、前記第２の形質導入組成物をスピノキュレーションに付すことを特徴とする方法。
［８７］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも１倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも２倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも５倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも１０倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも２０倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８８］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも２７倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［８９］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．０５の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９０］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．０９の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９１］
請求項８５に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．４１の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９２］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．７４の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９３］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．１～約５の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９４］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．１～約１の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９５］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．４～約１の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［９６］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．４～約０．７５の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
［１００］
請求項８４に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクターが、レンチウイルスベクター粒子の形態であることを特徴とする方法。
［１０１］
請求項１００に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする方法。
［１０２］
請求項１００に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする方法。
［１０３］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトが、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、増大したＣ７の発現を有することを特徴とする方法。
［１０４］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトが、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトと比べて、少なくとも１００倍増大したＣ７の発現を有することを特徴とする方法。
［１０５］
請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトが、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトと比べて、少なくとも２００倍増大した発現を有することを特徴とする方法。
［１０６］
遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトにおける細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数を増加する方法であって、
（ａ）ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体をコードするヌクレオチド配列を含む形質導入用レンチウイルスベクターを、Ｃ７欠損症患者から得たヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと接触させて、第１の形質導入組成物を形成するステップと、
（ｂ）前記第１の形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを第２の形質導入用レンチウイルスベクターと接触させて、第２の形質導入組成物を形成するステップと、
（ｄ）前記第１の形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップと、
を含む方法において、
前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、若しくは５０倍多いことを特徴とする方法。
［１０７］
請求項１０６に記載の方法において、前記第１及び第２の形質導入用レンチウイルスベクターが、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする方法。
［１０８］
請求項１０６に記載の方法において、前記細胞が、ヒト皮膚線維芽細胞であることを特徴とする方法。
［１０９］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも５倍多いことを特徴とする方法。
［１１０］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも１０倍多いことを特徴とする方法。
［１１１］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも２７倍多いことを特徴とする方法。
［１１２］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、約５倍多いことを特徴とする方法。
［１１３］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、約１０倍多いことを特徴とする方法。
［１１４］
請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、約２７倍多いことを特徴とする方法。

Claims (115)

  1. ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）欠損症に罹患している患者を治療する方法であって、
    前記Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞を取得するステップと、
    ＣＯＬ７Ａ１をコードするヌクレオチド配列又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と前記細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有する自家遺伝子改変細胞を形成するステップにおいて、前記レンチウイルスベクターが、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップと、
    前記自家遺伝子改変細胞を培養するステップと、
    有効量の前記遺伝子改変細胞を前記Ｃ７欠損症患者に投与するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 請求項１に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞及びケラチノサイトから選択されることを特徴とする方法。
  3. 請求項２に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
  4. 請求項１に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、栄養障害型表皮水疱症であることを特徴とする方法。
  5. 請求項４に記載の方法において、前記栄養障害型表皮水疱症が、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）及び優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）から選択されることを特徴とする方法。
  6. 請求項５に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、ＲＤＥＢであることを特徴とする方法。
  7. 請求項６に記載の方法において、前記ＲＤＥＢが、アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型、非アロポー・シーメンス（ｎｏｎ－Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、異型ＲＤＥＢ、前脛骨性ＲＤＥＢ、末端性ＲＤＥＶ、及び求心型ＲＤＥＢからなる群から選択される亜型であることを特徴とする方法。
  8. 請求項５に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、ＤＤＥＢであることを特徴とする方法。
  9. 請求項１に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクターが、レンチウイルスベクター粒子の形態であることを特徴とする方法。
  10. 請求項９に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端反復（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子と、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列と、（ｄ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）と、を含むトランスファーレンチウイルスベクターから構築され、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が欠失しており、前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体は、前記細胞に組み込まれて、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子を有する遺伝子改変細胞を形成することを特徴とする方法。
  11. 請求項１０に記載の方法において、少なくとも２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントがあることを特徴とする方法。
  12. 請求項１０に記載の方法において、前記欠失ＰＲＥが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であることを特徴とする方法。
  13. 請求項９に記載の方法において、形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ｐＳＭＰＵＷ及びｐＦＵＧＷからなる群から選択されるレンチウイルス発現プラスミドベクターから構築されることを特徴とする方法。
  14. 請求項１３に記載の方法において、前記レンチウイルス発現プラスミドベクターが、ｐＦＵＧＷであることを特徴とする方法。
  15. 請求項９に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする方法。
  16. 請求項９に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする方法。
  17. 請求項１に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって前記患者に投与されることを特徴とする方法。
  18. 請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、注射により投与されることを特徴とする方法。
  19. 請求項１８に記載の方法において、前記遺伝子改変細胞が、前記患者に皮内注射されることを特徴とする方法。
  20. 請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、ポリマーカプセル中に封入されることを特徴とする方法。
  21. 請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、コラーゲンマトリックス中に埋め込まれることを特徴とする方法。
  22. 請求項１７に記載の方法において、前記遺伝子改変線維芽細胞が、ハイドロゲル又はメッシュ中に埋め込まれることを特徴とする方法。
  23. 機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現するＶＩＩ型コラーゲン欠損症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする自家遺伝子改変線維芽細胞。
  24. 機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、劣性栄養障害型表皮水疱症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする自家遺伝子改変線維芽細胞。
  25. 機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、優性栄養障害型表皮水疱症患者由来の自家遺伝子改変線維芽細胞において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする自家遺伝子改変線維芽細胞。
  26. 以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体と、（ｃ）少なくとも１つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントと、（ｄ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、前記野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）と、を含むトランスファーベクターから形成される自己不活性型レンチウイルスベクターにおいて、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が欠失していることを特徴とする自己不活性型レンチウイルスベクター。
  27. 請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、少なくとも２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントを含むことを特徴とするベクター。
  28. 請求項２６に記載のベクターにおいて、前記欠失したＰＲＥが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）であることを特徴とするベクター。
  29. 請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、以下：（ａ）ＬＴＲ内の修飾５’長末端（前記修飾５’ＬＴＲのプロモータは、サイトメガロウイルスプロモータである）と、（ｂ）前記ＣＯＬ７Ａ１遺伝子と、（ｃ）２つのレンチウイルス中央ポリプリン配列エレメントと、（ｄ）さらにＷＰＲＥと、（ｅ）修飾３’ＬＴＲ（前記修飾３’ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲに対して欠失を含む）を含むことを特徴とするベクター。
  30. 請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、ＩＮＸＮ－２００４と称されることを特徴とするベクター。
  31. 請求項２６に記載のベクターにおいて、前記ベクターが、ＩＮＸＮ－２００２と称されることを特徴とするベクター。
  32. ＩＧＥ－３０８と称されることを特徴とするトランスファーベクター。
  33. ＩＮＸＮ－２００４と称されることを特徴とするレンチウイルスベクター粒子。
  34. ＩＮＸＮ－２００２と称されることを特徴とするレンチウイルスベクター粒子。
  35. ＩＮＸＮ－２００２レンチウイルスベクター粒子を産生することを特徴とする安定なウイルスパッケージング細胞株。
  36. ＩＮＸＮ－２００４レンチウイルスベクター粒子を産生することを特徴とする安定なウイルスパッケージング細胞株。
  37. ＩＧＥ３０８の配列を有する、ＩＮＸＮ－２００４と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＲＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
  38. ＩＮＸＮ－２００２と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＲＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
  39. ＩＧＥ３０８の配列を有する、ＩＮＸＮ－２００４と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
  40. ＩＮＸＮ－２００２と称するレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＤＥＢ患者から得た線維芽細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
  41. 請求項３３に記載のベクターを用いて、インビトロ又はエクスビボで形質導入されることを特徴とする細胞。
  42. 請求項３４に記載のベクターを用いて、インビトロ又はエクスビボで形質導入されることを特徴とする細胞。
  43. 偽合指症に罹患している患者の治療方法であって、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする方法。
  44. 請求項４３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、ケラチノサイト及び線維芽細胞から選択されることを特徴とする方法。
  45. 請求項４３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
  46. 請求項４３に記載の方法において、前記細胞の患者への投与が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって為されることを特徴とする方法。
  47. 栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）患者の水疱形成を治療、阻害若しくは軽減する方法であって、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする方法。
  48. 請求項４７に記載の方法において、前記自家細胞集団が、ケラチノサイト及び線維芽細胞から選択されることを特徴とする方法。
  49. 請求項４８に記載の方法において、前記自家細胞集団が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
  50. 請求項４７に記載の方法において、前記細胞の患者への投与が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって為されることを特徴とする方法。
  51. 請求項４７に記載の方法において、前記患者が、劣性栄養障害型表皮水疱症に罹患していることを特徴とする方法。
  52. 請求項４７に記載の方法において、前記患者が、優性栄養障害型表皮水疱症に罹患していることを特徴とする方法。
  53. 劣性栄養障害型表皮水疱症患者の病変を治療する方法であって、機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、前記患者由来の自家細胞集団を前記患者に投与するステップを含む方法において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする方法。
  54. 請求項５３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、ケラチノサイト及び線維芽細胞から選択されることを特徴とする方法。
  55. 請求項５３に記載の方法において、前記自家細胞集団が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
  56. 請求項５３に記載の方法において、前記細胞の患者への投与が、注射、局所、経口、又は生体適合性マトリックスへの埋込みによって為されることを特徴とする方法。
  57. 請求項５３に記載の方法において、前記病変が、口腔粘膜に存在することを特徴とする方法。
  58. 請求項５３に記載の方法において、前記病変が、胃腸管に存在することを特徴とする方法。
  59. 機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、ＶＩＩ型コラーゲン欠損症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする集団。
  60. 請求項５９に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする集団。
  61. 請求項５９に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする集団。
  62. 機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、劣性栄養障害型表皮水疱症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする集団。
  63. 請求項６２に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする集団。
  64. 請求項６２に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする集団。
  65. 機能性ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含むレンチウイルスベクター粒子で形質導入され、且つＶＩＩ型コラーゲンを発現する、優性栄養障害型表皮水疱症患者の自家遺伝子改変線維芽細胞の単離された集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有することを特徴とする集団。
  66. 請求項６５に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする集団。
  67. 請求項６５に記載の集団において、前記レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする集団。
  68. ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する、Ｃ７欠損症患者の自家遺伝子改変細胞の単離された集団を製造する方法であって、前記Ｃ７欠損症患者の真皮又は表皮から細胞を採取するステップと、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体を含む形質導入用レンチウイルスベクター粒子と前記細胞を接触させて、特定のベクターコピー数を有するＣＯＬ７Ａ１遺伝子を含む自家遺伝子改変細胞を形成するステップにおいて、前記レンチウイルスベクター粒子が、細胞当たり０．１～５．０コピーの範囲の形質導入用ベクターコピー数を有するステップと、前記自家遺伝子改変細胞を培養して、Ｃ７を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団を取得するステップと、を含むことを特徴とする方法。
  69. 請求項６８に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞及びケラチノサイトから選択されることを特徴とする方法。
  70. 請求項６９に記載の方法において、前記細胞が、線維芽細胞であることを特徴とする方法。
  71. 請求項６８に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、栄養障害型表皮水疱症であることを特徴とする方法。
  72. 請求項７１に記載の方法において、前記栄養障害型表皮水疱症が、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）及び優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）から選択されることを特徴とする方法。
  73. 請求項７１に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症がＲＤＥＢであることを特徴とする方法。
  74. 請求項７３に記載の方法において、前記ＲＤＥＢが、アロポー・シーメンス（Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型、非アロポー・シーメンス（ｎｏｎ－Ｈａｌｌｏｐｅａｕ－Ｓｉｅｍｅｎｓ）型ＲＤＥＢ、異型ＲＤＥＢ、前脛骨性ＲＤＥＢ、末端性ＲＤＥＶ、及び求心型ＲＤＥＢからなる群から選択される亜型であることを特徴とする方法。
  75. 請求項７１に記載の方法において、前記Ｃ７欠損症が、ＤＤＥＢであることを特徴とする方法。
  76. 請求項６８に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする方法。
  77. 請求項６８に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする方法。
  78. 請求項６８に記載の方法により製造されることを特徴とする、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
  79. 請求項７６に記載の方法により製造されることを特徴とする、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
  80. 請求項７７に記載の方法により製造されることを特徴とする、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）を発現する遺伝子改変細胞の単離された集団。
  81. 請求項７８に記載の単離された集団を含むことを特徴とする医薬製剤。
  82. 請求項７９に記載の単離された集団を含むことを特徴とする医薬製剤。
  83. 請求項８０に記載の単離された集団を含むことを特徴とする医薬製剤。
  84. 遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトにおける細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数を増加する方法であって、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体をコードするヌクレオチド配列を含む形質導入用レンチウイルスベクターを、Ｃ７欠損症患者から得たヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと接触させて、形質導入組成物を形成するステップと、前記形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップを含む方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物よりも多いことを特徴とする方法。
  85. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞を第２の形質導入レンチウイルスベクターとさらに接触させて、第２の形質導入組成物を形成することを特徴とする方法。
  86. 請求項８５に記載の方法において、前記第２の形質導入組成物をスピノキュレーションに付すことを特徴とする方法。
  87. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも１倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  88. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーションに付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも２倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  89. 請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも５倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  90. 請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも１０倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  91. 請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも２０倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  92. 請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない形質導入組成物と比べて、細胞当たり少なくとも２７倍多い組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  93. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．０５の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  94. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．０９の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  95. 請求項８５に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．４１の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  96. 請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり少なくとも０．７４の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  97. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．１～約５の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  98. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．１～約１の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  99. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．４～約１の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  100. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞が、細胞当たり約０．４～約０．７５の組込みトランスジーンコピー数を有することを特徴とする方法。
  101. 請求項８４に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクターが、レンチウイルスベクター粒子の形態であることを特徴とする方法。
  102. 請求項１００に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００２であることを特徴とする方法。
  103. 請求項１００に記載の方法において、前記形質導入用レンチウイルスベクター粒子が、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする方法。
  104. 請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトが、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、増大したＣ７の発現を有することを特徴とする方法。
  105. 請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトが、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトと比べて、少なくとも１００倍増大したＣ７の発現を有することを特徴とする方法。
  106. 請求項８６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトが、スピノキュレーション又は第２の形質導入に付していない前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又は前記ケラチノサイトと比べて、少なくとも２００倍増大した発現を有することを特徴とする方法。
  107. 遺伝子改変ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトにおける細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数を増加する方法であって、
    （ａ）ＣＯＬ７Ａ１遺伝子又はその機能性変異体をコードするヌクレオチド配列を含む形質導入用レンチウイルスベクターを、Ｃ７欠損症患者から得たヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと接触させて、第１の形質導入組成物を形成するステップと、
    （ｂ）前記第１の形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）の前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを第２の形質導入用レンチウイルスベクターと接触させて、第２の形質導入組成物を形成するステップと、
    （ｄ）前記第１の形質導入組成物をスピノキュレーションに付して、形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトを形成するステップと、
    を含む方法において、
    前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、若しくは５０倍多いことを特徴とする方法。
  108. 請求項１０６に記載の方法において、前記第１及び第２の形質導入用レンチウイルスベクターが、ＩＮＸＮ－２００４であることを特徴とする方法。
  109. 請求項１０６に記載の方法において、前記細胞が、ヒト皮膚線維芽細胞であることを特徴とする方法。
  110. 請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも５倍多いことを特徴とする方法。
  111. 請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも１０倍多いことを特徴とする方法。
  112. 請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、少なくとも２７倍多いことを特徴とする方法。
  113. 請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、約５倍多いことを特徴とする方法。
  114. 請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、約１０倍多いことを特徴とする方法。
  115. 請求項１０６に記載の方法において、前記形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトの組込みトランスジーンコピー数が、スピノキュレーション又は第２の形質導入ステップに付していない形質導入ヒト皮膚線維芽細胞又はケラチノサイトと比べて、約２７倍多いことを特徴とする方法。
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