CN109257926A - 用于治疗vii型胶原缺乏的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含COL7A1基因或其功能变体的自身失活慢病毒载体及其在治疗VII型胶原缺乏如显性营养不良性表皮松解和隐性营养不良性表皮松解的方法中的用途。

Description

用于治疗VII型胶原缺乏的组合物和方法
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子交的序列表，并且特此将其通过引用以其全文结合。创建于2017年3月9日的所述ASCII副本名称为0100-0016PR1_SL.txt，并且大小为92,924字节。
技术领域
本发明涉及用于治疗VII型胶原缺乏如营养不良性大疱性表皮松解的组合物和方法，所述包括给予包含编码VII型胶原(C7)或其功能变体的核苷酸序列的自体遗传修饰的细胞。
背景技术
VII型胶原(C7)是一种对于在真皮表皮交界(DEJ)处的锚定原纤维形成而言重要的蛋白质，它将多个皮肤层固定在一起(Burgeson 1993；Leigh等人1988)。营养不良性大疱性表皮松解(DEB)是一种遗传病，其特征在于C7缺乏导致附着在表皮与下方的真皮之间的锚定原纤维损伤，从而累及皮肤和器官。编码C7的COL7A1基因的突变导致C7缺乏。患有DEB的患者极易出现严重的起疱。显性营养不良性大疱性表皮松解(DDEB)的特征在于全身性起疱。短暂性大疱性皮肤病是DDEB的一种形式，可在婴儿期自我纠正。隐性营养不良性大疱性表皮松解(RDEB)是一种使人衰弱的皮肤起疱的病症。反常型RDEB(RDEB inversa)是RDEB的另一种形式，其中水疱在皮肤互相摩擦的区域形成。在没有这些原纤维的情况下，皮肤层会分离，从而因为任何皮肤摩擦(包括正常的日常活动，如摩擦或抓挠)而导致严重的起疱、开放性创伤和瘢痕形成。
目前没有治愈性治疗，并且患者主要依靠姑息性伤口护理。采用多种策略的临床前研究显示出令人鼓舞的结果，表明通过恢复RDEB皮肤中的C7功能可以纠正疾病的影响。最初的方法依赖于移植脆弱的工程化表皮组织并且需要去除待替换的皮肤组织，从而导致瘢痕形成(Mavilio等人2006；Chen，Nat.Genet.[自然遗传学]2002；Siprashvili 2010)。其他方法包括通过直接基于病毒的表达和重组蛋白的全身递送来递送校正C7(Remington2009；Woodley等人2003)。所有这些潜在的治疗都有许多缺点，包括成本和生物安全问题。
复制缺陷型、自身失活(SIN)慢病毒载体(LV)的使用为基因疗法提供了几个优势：1)转导分裂细胞和非分裂细胞的能力，2)高转导效率，3)长期持续转基因表达，4)分配编码可能引发免疫应答的病毒蛋白的序列的能力，5)由于转录失活的SIN长末端重复序列(LTR)而增加的安全性，以及6)包装大转基因的能力。来自使用LV载体进行基因疗法的临床试验的安全性研究表明在原癌基因或肿瘤抑制基因中或其附近没有优先整合。患者服用100亿个LV载体转导的T细胞/受试者并且随访时间的中值为4年，未显示白血病或其他不良事件。具有异染性脑白质营养不良、威-奥二氏综合征(Wiskott-Aldrich Syndrome)(WAS)和X-肾上腺脑白质营养不良(ALD)的适应症的试验揭示，在长达21个月、32个月和36个月的随访中没有观察到异常克隆扩增(Biffi等人2013；Aiuti等人2013)。
用自体遗传修饰的人真皮成纤维细胞(GM-HDF)治疗提供了一种有前途的替代方案，该方案是基于在患者自身成纤维细胞中离体校正遗传缺陷(Ortiz-Urda等人2003；Woodley等人2003)。已经报道了hCOL7A1基因校正的成纤维细胞在向具有RDEB皮肤移植物的小鼠中的基底膜区(BMZ)提供C7时优于角质形成细胞(Goto等人2006)。另外，与角质形成细胞的移植相比，可以更容易地完成成纤维细胞的注射。
发明内容
本发明涉及治疗患有VII型胶原(C7)缺乏的患者的方法，所述方法包括从缺乏C7的患者的真皮或表皮获得细胞(优选成纤维细胞或角质形成细胞)，使细胞与包含COL7A1基因或其功能变体的转导慢病毒载体颗粒接触以形成包含具有载体拷贝数的COL7A1基因或其功能变体的自体遗传修饰的细胞，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞的范围内的转导载体拷贝数，培养所述自体遗传修饰的细胞，并且向缺乏C7的患者给予遗传修饰的细胞。可以通过注射，优选皮内注射进行给予。在本发明的一个方面，C7缺乏是营养不良性大疱性表皮松解(DEB)，如隐性营养不良性大疱性表皮松解(RDEB)或显性营养不良性大疱性表皮松解(DDEB)。还设想根据本发明治疗RDEB的亚型，包括Hallopeau-Siemens型RDEB、非Hallopeau-Siemens型RDEB、反常型RDEB(RDEB inversa)、胫前RDEB、肢端RDEB和向心型RDEB(RDEB centripetalis)。
在本发明的一个实施例中，转导慢病毒载体颗粒由转移慢病毒载体构建，所述转移慢病毒载体包含(a)LTR中修饰的5’长末端重复序列，其中所述修饰的5’LTR的启动子是巨细胞病毒启动子，(b)COL741基因或其功能变体，(c)至少一个慢病毒中枢聚嘌呤段，(d)乙型肝炎病毒转录后调控元件(PRE)，以及(e)修饰的3’LTR，其中所述修饰的3’LTR包含相对于野生型3’LTR的缺失，其中将所述COL7A1基因或其功能变体并入细胞中以形成具有功能性COL7A1基因或其功能变体的遗传修饰的细胞。
在实施例中，存在至少两种慢病毒中心聚嘌呤段元件。在另一个实施例中，PRE是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。优选地，用于构建转导载体的转移慢病毒载体选自由pSMPUW和pFUGW组成的组。优选地，转导慢病毒载体颗粒为INXN-2004或INXN-2002。
可以以任何合适方式进行缺乏C7的患者自体的遗传修饰的成纤维细胞的给药，所述方式包括通过注射、局部、口服或包埋在生物相容性基质中。
本发明的另一方面涉及来自缺乏C7的患者如RDEB或DDEB患者自体的遗传修饰的成纤维细胞，所述成纤维细胞被包含功能性COL7A1基因且表达VII型胶原的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有0.1至5.0个拷贝/细胞的范围内的转导载体拷贝数。
另一个实施例涉及由转移载体形成的自身失活慢病毒载体，所述转移载体包含(a)LTR中的修饰的5’长末端，其中所述修饰的5’LTR的启动子是巨细胞病毒启动子，(b)COL7A1基因或其功能变体，(c)至少一种慢病毒中枢聚嘌呤段元件，(d)乙型肝炎病毒转录后调控元件(PRE)，以及(e)修饰的3’LTR，其中所述修饰的3’LTR包含相对于野生型3’LTR的缺失。在一个实施例中，载体包含至少两种慢病毒中心聚嘌呤段元件，并且PRE是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。本发明的载体包括名称为INXN-2004且包含IGE308质粒的序列的载体；或名称为INXN-2002的载体。
本发明的另一个实施例涉及包含从患有RDEB或DDEB的患者获得的成纤维细胞的药物组合物，所述成纤维细胞被包含IGE308质粒序列的名称为INXN-2004的慢病毒载体转导；或被名称为INXN-2002的慢病毒载体转导。
在一个实施例中，本发明涉及使用载体(如INXN-2002和INXN-2004)在体外或离体转导的细胞。
在一个实施例中，本发明涉及使用载体INXN-2002或INXN-2004转导的自体成纤维细胞，其已根据美国专利号8,728,819和国际专利申请中描述的方法获得并增殖。
名称为“Methods for culturing minimally-passaged fibroblasts and usesthereof[用于培养最小传代的成纤维细胞的方法及其用途]”的WO 2008/027984，特此将其各自通过引用并入本文中。
在一个实施例中，本发明涉及浓缩慢病毒用于转导人自体真皮细胞如成纤维细胞和/或角质形成细胞的用途。
在另一个实施例中，本发明涉及经由与慢病毒一起离心来转导人自体真皮细胞，如成纤维细胞和/或角质形成细胞。
在一个实施例中，本发明涉及浓缩慢病毒以及离心用于转导人自体真皮细胞如成纤维细胞和/或角质形成细胞的用途。
在实施例中，本发明涉及人自体真皮细胞如成纤维细胞和/或角质形成细胞的用途，所述人自体真皮细胞已经在两个或更多个单独的转导过程中与慢病毒接触。
在一个实施例中，本发明涉及人自体真皮细胞如成纤维细胞和/或角质形成细胞的用途，所述人自体真皮细胞已经在两个或更多个单独的转导过程中与慢病毒接触，其中在第二或任何后续传导过程之前所述细胞被培养并传代一次、两次或三次。
本发明还涉及对患有假性并指的患者的治疗，包括向所述患者给予从被所述慢病毒载体颗粒转导的所述患者获得的自体细胞群，所述慢病毒载体颗粒包含功能性COL7A1基因或其功能变体且表达VII型胶原。
本发明还涉及治疗、抑制或减少营养不良性大疱性表皮松解(DEB)起疱的方法或治疗患有RDEB的患者的病变的方法，包括给予本发明的自体遗传修饰的细胞。
本发明的另一方面涉及缺乏C7的患者如DDEB或RDEB患者的分离自体的遗传修饰的成纤维细胞群，所述细胞群被包含功能性COL7A1基因或其功能变体且表达VII型胶原的载体颗粒转导；以及制备这些分离群的方法。
本发明还涉及增加遗传修饰的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数/细胞的方法，所述包括使包含编码COL7A1基因或其功能变体的核苷酸序列的转导慢病毒载体与从缺乏C7的患者获得的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞接触以形成转导组合物。对转导组合物进行旋转接种(spinoculation)以形成转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞，其中相对于未进行旋转接种的转导组合物，所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数更高。本发明进一步包括超转导步骤，其中所述转导的细胞进一步与第二转导慢病毒载体接触以形成第二转导组合物，该第二转导组合物可任选地进行旋转接种。在一个方面，转导慢病毒载体为INXN-2002或INXN-2004，优选INXN-2004。已经发现，相对于未进行旋转接种或超转导的转导组合物，转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞具有高至少或约1、2、5、10、20、25、27、28、29、30、35、40、45或50倍的整合转基因拷贝数/细胞。在另一个实施例中，本发明涉及具有至少0.05、0.09、0.41或0.74，或者范围为约0.1至约5、0.1至约1、0.4至约1或0.4至约0.75的整合转基因拷贝数/细胞。已发现使用本文所述的转导方法可以增加表达。例如，已经发现，相对于未进行旋转接种或第二转导的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞，C7的表达增加了10、25、50、100、150或200倍。
附图说明
当结合随后的详细描述考虑时，通过参考附图可以获得对本发明的更完整的理解。附图中示出的实施例仅旨在举例说明本发明，而不应被解释为将本发明限制于所示实施例。
图1A描绘了VII型胶原(C7)三聚体，其形成锚定原纤维。COL7A1基因编码290-kDaα链，其中三条链形成三螺旋(三聚体)。图片来自Bruckner-Tuderman L.MolecularTherapy[分子疗法](2008)17：6-7。
图1B描绘了正常和RDEB皮肤的一般结构。C7锚定原纤维与其他胶原、细胞外基质蛋白和Lam332结合，以介导真皮附着于表皮。锚定原纤维的缺乏可导致水疱形成。
图2描述了根据本发明一个方面的cGMP规模GM-HDF生产过程。将C7表达盒克隆至自身失活慢病毒骨架中。生成了中试规模生产的包含COL741基因(LV-COL7)的慢病毒载体(INXN-2002)，其滴度为约9×106IU/mL，用于cGMP规模生产过程。从RDEB患者活检物中分离成纤维细胞，使之生长，然后分成模拟物、高和低剂量LV-COL7转导的三组。使每组成纤维细胞生长至2×CS10规模，然后冷冻保存(药品)。对于患者治疗，将药品小瓶解冻并配制(药物产品)，然后运回诊所对原始患者进行伤口位点注射。
图3A提供了LV-COL7(用于INXN-2002)拷贝数/细胞。解冻药品小瓶并使用qPCR测定LV-COL7DNA拷贝/细胞。引物对于LV穿梭载体是特异性的。结果显示了拷贝/细胞的剂量依赖性水平，分别为来自高剂量和低剂量组的平均0.38和0.18个拷贝。
图3B提供了通过用LV-COL7转导的RDEB患者成纤维细胞产生的C7表达水平：将药品小瓶解冻并培养3天。收集条件细胞培养物上清液并通过ELISA测定C7水平。结果显示了在LV-COL7转导的细胞中范围为60至120ng/mL C7的病毒剂量依赖性蛋白质表达。
图3C显示了LV-COL7转导的RDEB患者成纤维细胞产生的三聚体形式的C7：条件细胞培养物上清液也用于免疫沉淀测定。免疫沉淀的C7在非变性SDS-PAGE上分离，并通过蛋白质印迹可视化。由RDEB成纤维细胞产生的C7主要是三聚体，其中LV-COL7转导的细胞比模拟物转导的细胞(C组)表达更多的COL7。还观察到一些显示免疫反应性的较低分子量物质。
图4A描绘了纯化的COL7与Lam332的结合。COL7在CHO-DG44细胞中表达，通过尺寸排阻色谱法纯化，并且测定出与BSA相比优先与Lam332结合以建立测定(OD450的增加对应于COL7与层粘连蛋白332结合的增加)。
图4B描绘了在LV-COL7转导的成纤维细胞(由INXN-2002载体转导的)培养物上清液中COL7与Lam332的结合。将药品小瓶解冻并培养3天。收集条件细胞培养物上清液，并测定与BSA对照相比其与Lam332的结合。结果显示与Lam332的病毒剂量依赖性结合。
图5描绘了在SCID小鼠背部的复合RDEB皮肤移植物，所述SCID小鼠皮内注射1×106GM-HDF(由INXN-2002载体转导)并通过用人COL7特异性抗体进行免疫荧光染色来分析。示出了代表性的图像。在皮内注射1×106GM-HDF后第10天，在用RDEB角质形成细胞生成的复合移植物(n＝4)中观察到COL7的定位。由正常角质形成细胞和成纤维细胞生成的阳性对照移植物显示强烈的COL7染色，并且阴性对照移植物在基线测量时未显示COL7染色(DEJ处的箭头用于阴性基线比较)。
图6提供了pSMPUW慢病毒表达质粒载体的示意图。
图7比较了pSMPUW慢病毒表达载体相对于第3代慢病毒表达载体的特征。
图8提供了pFUGW慢病毒表达质粒载体的示意图。
图9描绘了HIV-1病毒颗粒的电子显微照片。
图10提供了检测C7三聚体形成的TR8 GM-HDF的免疫沉淀结果。
图11A提供了检测C7三聚体形成的TR10和ER1 GM-HDF的免疫沉淀结果。
图11B提供了检测C7三聚体形成的TR9的免疫沉淀结果。
图12显示了由GM-HDF表达的C7的Lam332结合结果。
图13提供了编码COL7A1基因的慢病毒载体质粒构建体的示意图。
图14示出了INXN-2002慢病毒载体的前病毒RNA基因组结构的示意图。
图15显示了描绘成熟INXN-2002病毒颗粒的细节的示意图。
图16提供了体外永生化测定以评估INXN-2002的插入基因毒性的可能性的示意图。
图17示出了培养物中FXC-007的典型细胞形态和结构。
图18提供了对于特定剂量的TR8 GM-HDF，通过ELISA测定的C7表达水平的图。
图19提供了蛋白质印迹，其显示C7三聚体针对由FCX-007 GM-HDF产生的NC1特异性抗体的免疫沉淀。
图20显示了检测C7与层粘连蛋白332或牛血清白蛋白(BSA)涂覆的孔的相互作用的结合测定的测定读出(450nm处的光密度(OD450))。结合的C7使用C7NCl特异性抗体和HRP缀合的二级抗体进行检测。
图21A图示了用LV-COL7转导的正常和RDEB患者成纤维细胞随时间的细胞迁移量。
图21B提供了用LV-COL7转导的正常和RDEB患者成纤维细胞随时间的细胞迁移的图像。
图22提供了克隆人COL7A1基因的示意图。
图23提供了将COL7A1基因克隆至pSMPUW表达载体中以产生INXN-2002慢病毒载体转移质粒IGE230的示意图。
图24提供了INXN-2004慢病毒载体转移质粒(IGE308)的构建的示意图。
图25A示意性地描绘了IGE308质粒的基因元件。
图25B示意性地描绘了IGE308质粒的基因元件。
图26提供了GM-HDF注射的复合移植物的免疫荧光分析。
图27提供了示出通过其相对于对照细胞的倍数变化值测量的LV-COL7转录物水平的图。
图28提供了INXN-2002和LV-HA-COL7转导的RDEB成纤维细胞的C7染色的代表性图像。
图29提供了在由TR8、TR9、T10和ER1转导的GM-HDF的细胞上清液中测量的C7蛋白水平的图示。
图30图示了TR8、TR9、TR10和ER1随时间的GM-HDF高运动性的校正。
图31描绘了代表性的间接免疫荧光(IF)图像，用于在两种放大倍数20x和5x下使用对C7特异性的抗体检查GM-HDF细胞的C7蛋白表达。(针对TR12.1和TR13仅测试了A组。仅示出了TR8的A组用于比较先前的过程。)
图32提供了TR11、TR12.1和TR13的每个训练运行组的GM-HDF的C7阳性(C7+)细胞的百分比。
图33提供了对TR8、TR11、TR12.1和13表达的C7蛋白水平的量的图示。误差条表示标准偏差；n＝3。针对TR8、TR12.1和TR13仅示出了A组结果。
图34提供了用于检测C7三聚体(a)TR11、(b)TR12.1和TR13GM-HDF的SDS-PAGE/免疫印迹。
图35描绘了对于TR11、TR12.1和TR13，由与层粘连蛋白332(Lam332)结合的GM-HDF表达的C7的图。
图36提供了细胞迁移测定的结果，其描绘了针对TR11、TR12.1和TR13的GM-HDF随时间的高运动性(迁移％)的校正。提供了正常人真皮成纤维细胞(NHDF)和来自隐性营养不良性表皮松解大疱细胞的对照成纤维细胞的高运动性。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩写具有与本发明领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管用于传递与本文描述的那些类似或等同的信息的任何组合物、方法、试剂盒和装置可用于实施本发明，但本文描述了用于传递信息的优选组合物、方法、试剂盒和手段。
本文引用的所有参考文献在法律允许的全部范围内通过引用并入本文。对这些参考文献的讨论仅仅是为了总结其作者所作的主张。不承认任何参考文献(或任何参考文献的一部分)是相关的现有技术。申请人保留质疑任何引用的参考文献的准确性和针对性的权利。
为了使本发明可更容易理解，本文定义某些术语。另外的定义贯穿详细说明而阐述。
当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，使用词语“一个”或“一种”可以意指“一个”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括对于用于测定值的装置、方法的固有的误差变化，或研究对象之间存在的变化。通常，根据情况，该术语意在包括约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％可变性。
权利要求中术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，但本披露支持仅指替代方案的定义以及“和/或”。
如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”(和任何形式的包含，如“包括”和“包含”)、“具有”(和任何形式的具有，如“具有”和“含有”)、“包括”(以及任何形式的包括，如“包括”和“包含”)或“含有”(以及任何形式的含有，如“包含”和“含有”)是包容性的或开放性的并且不排除其他未列举的元素或方法步骤。预期可以关于本发明的任何方法或组合物来实施本说明书中讨论的任何实施例，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
当核酸和/或核酸序列天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是“同源的”。当蛋白质和/或蛋白质序列的编码DNA天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是同源的。同源分子可称为同源物。例如，如本文所述的任何天然存在的蛋白质可以通过任何可用的诱变方法进行修饰。当表达时，该诱变的核酸编码与原始核酸编码的蛋白质同源的多肽。通常从两种或更多种核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列一致性推断同源性。可用于建立同源性的序列之间的精确一致性百分比随所讨论的核酸和蛋白质而变化，但是通常使用仅仅25％序列一致性来建立同源性。更高水平的序列一致性，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高也可用于建立同源性。用于确定序列一致性百分比的方法(例如，使用默认参数的BLASTP和BLASTN)在本文中进行了描述并且通常是可用的。
在两个核酸序列或多肽的氨基酸序列的上下文中，术语“相同”或“序列一致性”是指当在指定的比较窗口上比对以获得最大对应性时两个序列中的残基是相同的。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个连续位置的片段，通常为约50至约200，更通常为约100至约150，其中在两个序列最佳比对后序列可与相同连续位置数的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2：482的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443；通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.[美国国家科学院院刊]85：2444的相似度搜索法；通过这些算法的计算机化实现(包括但不限于加州山景城智能学(Intelligentics，MountainView Calif.)的PC/基因项目中的CLUSTAL，在Wisconsin Genetics Software Package[威斯康星遗传学软件包](遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)(GCG)，575科学博士(Science Dr.)，麦迪逊市(Madison)，威斯康星州(Wis.)，美国)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)；CLUSTAL程序在Higgins和Sharp(1988)Gene[基因]73：237-244以及Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5：151-153；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.[核酸研究]16：10881-10890；Huang等人(1992)Computer Applications in the Biosciences[生物科学计算机应用]8：155-165；以及Pearson等人(1994)Methods in MolecularBiology[分子生物学方法]24：307-331中进行了详细描述。通常还通过检查和手动比对来进行比对。
在一类实施例中，本文的多肽与参考多肽或其片段是至少70％，通常至少75％，可任选地至少80％、85％、90％、98％或99％或更大程度一致的，例如，如使用默认参数通过BLASTP(或CLUSTAL或任何其他可用的比对软件)测量的。类似地，核酸也可以参考起始核酸来描述，例如，它们可以与参考核酸或其片段是50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或更大程度一致的，例如，如使用默认参数通过BLASTN(或CLUSTAL或任何其他可用的比对软件)测量的。当一个分子与较大分子具有一定百分比的序列一致性时，这意味着当两个分子最佳比对时，根据两个分子最佳比对时的顺序较小分子中所述残基百分比在较大分子中找到匹配残基。
应用于核酸或氨基酸序列的术语“基本上一致”是指核酸或氨基酸序列包含与使用标准参数的上述程序(优选BLAST)的参考序列相比，具有至少90％序列一致性或更高，优选至少95％，更优选至少98％且最优选至少99％的序列。例如，BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3，期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89：10915(1992))。通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定序列一致性的百分比，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含与参考序列(不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(即，缺口)以使两个序列最佳比对。通过确定在两个序列中出现一致核酸碱基或氨基酸残基的位置数来计算百分比，以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列一致性的百分比。优选地，在序列的区域上存在基本一致性，所述序列长度为至少约50个残基，更优选至少约100个残基的区域，并且最优选序列在至少约150个残基上基本一致。在最优选的实施例中，序列在编码区的整个长度上基本一致。
本文披露的蛋白质的“功能变体”可以例如包含参考蛋白的氨基酸序列，其具有至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个保守氨基酸取代。短语“保守氨基酸取代”或“保守突变”是指将一种氨基酸用另一种具有共同特性的氨基酸取代。定义单独氨基酸之间共同特性的功能性方法是分析同源生物的相应蛋白质之间氨基酸变化的标准化频率(Schulz，G.E.和Schirmer，R.H.，Principles ofProtein Structure[蛋白质结构的原理]，Springer-Verlag，纽约(1979))。根据这样的分析，可以定义氨基酸组，其中组内的氨基酸彼此优先交换，因此它们对总体蛋白质结构的影响最相似(Schulz，G.E.和Schirmer，R.H.，同上)。保守突变的实例包括上述亚组内的氨基酸的氨基酸取代，例如精氨酸取代赖氨酸，反之亦然，使得可以保持正电荷；谷氨酸置换天冬氨酸，反之亦然，使得可以保持负电荷；丝氨酸置换苏氨酸，使得可以保持游离的-OH；以及谷氨酰胺置换天冬酰胺，使得可以保持游离的-NH2。在本发明的一个实施例中，COL7A1基因编码C7蛋白或其功能变体，条件是该变体能够将原纤维锚定在表皮与真皮之间。
可替代地或另外地，功能变体可包含具有至少一个非保守氨基酸取代的参考蛋白的氨基酸序列。“非保守突变”涉及不同组之间的氨基酸取代，例如，赖氨酸取代色氨酸，或苯丙氨酸取代丝氨酸等。在这种情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸取代可以增强功能变体的生物活性，使得与参考序列相比，功能变体的生物活性增加。
本文披露的蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可包含代替一种或多种天然存在的氨基酸的合成氨基酸。这些合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环己烷甲酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-甲酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N′-苄基-N′-甲基-赖氨酸、N′，N′-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷甲酸、α-氨基环己烷甲酸、α-氨基环庚烷甲酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-甲酸、α，γ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
本发明包括载体INXN-2002；和在本文中也称为INXN-2004的IGE308，以及与其基本相同和/或同源的载体及其功能变体。
术语“患者”或“受试者”是指哺乳动物，包括人和动物。
术语“治疗”是指减轻或缓解症状，和/或预防DEB(包括RDEB和/或DDEB)的复发和/或进展。
术语“自体细胞”是指获得的且随后返回同一个体的细胞。特别地，可以从DEB患者的身体移取细胞，所述细胞随后可以进行遗传修饰，培养以增殖，然后返回到最初移取的患者的身体。
术语“转导”是指通过病毒感染而不是通过转染使用病毒或逆转录病毒载体递送一种或多种基因。
术语“转导慢病毒载体”或“转导慢病毒载体颗粒”是指由包含COL7A1基因或其功能变体的慢病毒表达/转移质粒载体、包装载体和包封载体共转染包装细胞系形成的感染性慢病毒载体颗粒。转染后从生产细胞培养物的上清液收获转导慢病毒载体。合适的包装细胞系是本领域已知的，并且包括例如293T细胞系。
术语“慢病毒载体”是指含有主要来源于慢病毒的LTR外部的结构和功能遗传元件的载体。
术语“自身失活载体”(SIN)是指这样的载体，其中3’LTR增强子-启动子区域(称为U3区域)已被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止病毒转录超出第一轮病毒复制。因此，载体能够感染并且随后仅一次整合至宿主基因组中，并且不能进一步传播。SIN载体极大地降低了产生不需要的能复制的病毒的风险，因为3’LTR U3区域已被修饰以防止病毒转录超过第一轮复制，从而消除了病毒传播的能力。
术语“药学上可接受的载体”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适用于与自体遗传修饰的细胞接触而不影响其活性，且不毒害人体和动物的组织或引起刺激、过敏反应或其他并发症，与合理的利益/风险比相称的液体溶液。有用的药学上可接受的载体可以是可注射的溶液，其与自体遗传修饰的细胞生物相容并且不会降低它们的活性或导致它们的死亡。
本发明涉及缺乏C7的患者的自体遗传修饰细胞疗法。“缺乏C7的患者”缺乏或基本上减少了对于锚定真皮表皮交界(DEJ)处的原纤维形成是重要的VII型胶原(C7)的产生，从而导致营养不良性大疱性表皮松解(DEB)。本发明涉及收获DEB患者细胞(如成纤维细胞或角质形成细胞)，对收获的细胞进行遗传修饰以插入功能性COL7A1基因或其功能变体，扩增遗传修饰的细胞，并向DEB患者给予遗传修饰的细胞群。
从患有DEB的患者收获细胞。优选成纤维细胞或角质形成细胞。细胞可以通过已知方法获得，包括从患者皮肤样品、刮屑和活检物获得。在一个实施例中，细胞从DEB患者的非起疱皮肤获得。在另一个实施例中，细胞从DEB患者的起疱皮肤获得。从DEB患者收获的细胞具有突变的、非功能性的或丢失的COL7A1基因。使用标准细胞培养技术培养这些细胞。随后用编码功能性VII型胶原基因(C7)或其功能变体的遗传物质离体处理收获的患者细胞。
COL7A1基因具有核酸SEQ ID NO：1，其编码290kDa α链，其中三条链形成三螺旋(三聚体)，如图1A所示。C7具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且是对于在真皮表皮交界(DEJ)处锚定原纤维形成而言重要的蛋白质。C7基因中的突变导致构成锚定原纤维的C7的缺失或减少，所述锚定原纤维保持表皮与真皮的结合。C7锚定原纤维与其他胶原、细胞外基质蛋白和介导真皮附着于表皮的Lam332结合，如图1B所示。锚定原纤维的缺乏导致皮肤起疱。本发明还包括使用包含分别与COL7A1和C7基本相同的核酸和多肽的载体。在另一个实施例中，本发明包括包含编码COL7A1或C7蛋白的功能变体的核酸的载体，条件是该变体能够将原纤维锚定在表皮与真皮之间。本发明的另一方面包括仅使用编码C7蛋白或其功能变体的COL7A1基因的开放阅读框。在一些实施例中，如本领域已知的，COL7A1核酸经密码子优化以增加转导细胞中C7的表达。
根据本发明，可以使用转导慢病毒载体将COL7A1转导至收获的DEB细胞中，所述转导慢病毒载体是复制缺陷型和自身失活的。自身失活慢病毒载体衍生自人免疫缺陷病毒(HIV-1)，所述人免疫缺陷病毒用异源VSV-G包膜蛋白而不是HIV-1包膜蛋白假型化。如先前报道的，将400bp缺失引入LTR的U3区域，从而导致自身失活(SIN)载体(Zuffery 1998)。本发明的载体与第二代和第三代SIN载体不同。特别地，本发明的载体已被修饰为增强安全性特征并增加克隆能力，如本文进一步描述的。
用于构建本发明的转导慢病毒载体的载体经由转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有载体基因组的转导慢病毒载体颗粒。在将包装载体、转移载体和包膜载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收重组病毒，并通过本领域技术人员使用的标准方法滴定。因此，包装构建体可以通过磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔引入人细胞系中，通常与显性可选择标志物如卡那霉素、新霉素、DHFR或谷氨酰胺合酶一起引入，然后在适当的药物存在下进行选择并分离克隆。可选择的标志基因可以与构建体中的包装基因物理连接。
其中包装功能被配置为由合适的包装细胞表达的稳定细胞系是已知的。例如，参见美国专利号5,686,279；和Ory等人，(1996)，其描述了包装细胞。包装细胞与在其中并入的慢病毒载体形成生产细胞。因此，生产细胞是可以产生或释放携带感兴趣治疗基因的包装的感染性病毒颗粒的细胞或细胞系。合适的慢病毒载体包装细胞系的实例包括293细胞。
在本发明的一个实施例中，转导慢病毒载体由慢病毒表达质粒载体构建，所述慢病毒表达质粒载体包含(a)修饰的5’长末端重复序列(LTR)，其中修饰的5’LTR的启动子是巨细胞病毒启动子，(b)COL7A1基因，(c)至少一种慢病毒中枢多嘌呤管道元件，和(d)修饰的3’LTR，其中修饰的3’LTR包含相对于野生型3’LTR的缺失并且包含乙型肝炎病毒转录后调控元件(PRE)的缺失。
在本发明的另一个方面，缺失的乙型肝炎病毒转录后调控元件(PRE)是土拨鼠转录后调控元件PRE(WPRE)。
在本发明的另一方面，慢病毒表达质粒载体包含两种或更多种慢病毒中心聚嘌呤段(cPPT)元件。已发现并入cPPT元件可增加基因表达水平。
在本发明的另一个方面，可以修饰3’LTR以删除400bp片段(如Zuffery 1998所披露的)，而不是常用的标准第3代SIN LV载体的133bp缺失。认为400bp缺失通过阻止通读转录来增加安全性以及增加病毒滴度，因为载体转录物在包装细胞中更稳定。
在本发明的另一个方面，慢病毒表达质粒可以并入乙型肝炎病毒转录后调控元件(PRE)，其优选为土拨鼠转录后调控元件PRE(WPRE)。已经发现WPRE增加载体的病毒滴度。
已显示添加cPPT和修饰的3’LTR缺失可改善包含本发明的COL7A1基因的慢病毒载体的功能，以增加基因表达水平、病毒滴度和安全性。
本发明进一步包括慢病毒转移载体的用途，其中缺失第3代慢病毒表达载体常见的某些元件。特别地，在人类中使用慢病毒载体的安全性问题取决于惧怕产生能复制的慢病毒，这可能是由第3代慢病毒载体的分裂基因组之间的重组引起的。(Tareen等人，2013.)。可以从病毒载体中删除gag序列和/或rev-应答元件(RRE)，以减少与其他辅助质粒的序列同源性，从而增加对人的安全性。因此，在本发明的一个实施例中，载体中不存在gag序列。在本发明的另一个实施例中，载体中不存在gag序列和RRE二者。
产生本发明的慢病毒载体的起始材料优选为包含cPPT和PRE的慢病毒表达质粒载体，所述cPPT和PRE可以容纳大COL7A1基因(8.89kbp)或其功能变体的插入。优选地，构建本发明的转导慢病毒载体的起始材料选自慢病毒表达质粒载体pSMPUW(Cell Biolabs公司，圣地亚哥(San Diego)，加州)和pFUGW(Addgene，坎布里奇(Cambridge)，马萨诸塞州)。
在本发明的一个方面，选择pSMPUW慢病毒表达质粒载体用于构建转导慢病毒载体。图6示出了pSMPUW慢病毒表达质粒载体中遗传元件的示意图。已经从第3代慢病毒表达载体修饰了pSMPUW慢病毒表达载体的特征，以增强基因表达水平和安全性特征，如图7所示。特别地，pSMPUW慢病毒表达载体编码多克隆位点(MCS)，然后编码土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。从pSMPUW载体构建体中除去残留的gag(Δgag)和RRE元件。另外，pSMPUW载体构建体在3’LTR U3区域中使用较大的400bp缺失，而不是常用的标准第3代SINLV载体中的133bp缺失。将野生型COL7A1基因并入pSMPUW载体中。
在本发明的另一个方面，选择pFUGW慢病毒表达质粒用于构建转导慢病毒载体。图8示出了该质粒载体中遗传元件的示意图。pFUGW载体的特征包括可以改善慢病毒产生和转基因表达的RRE、两个cPPT元件和WPRE元件。
在本发明的另一个方面，慢病毒载体中已缺失WPRE元件。
在本发明的实施例中，本发明的转导慢病毒载体颗粒名称为INXN-2002(载体转移质粒-IGE230)或INXN-2004(载体转移质粒-IGE308)，或包含其功能变体的基本上相同的载体。
用功能性COL7A1基因转化从DEB患者收获的细胞。在本发明的一个方面，用具有COL7A1基因的慢病毒载体转导细胞。在本发明的另一个方面，慢病毒载体是自身失活载体。可以使用任何已知方法评估整合转基因的拷贝数。例如，拷贝数可以通过定量PCR、多重连接依赖性探针扩增、荧光原位杂交(FISH)、基于微阵列的拷贝数筛选和常规核型分析来确定。整合至每个细胞中的转基因的拷贝数可以通过在生产期间给予细胞的病毒剂量来调节。用含有COL7A1的载体转导的RDEB收获细胞中的整合转基因拷贝数是剂量依赖性的。
从DEB患者收获并用功能性COL7A1基因转化的细胞将具有功能性COL7A1基因并表现出正常的细胞形态。可以使用标准细胞培养技术使这些细胞在培养物中增殖或扩增。
在用本发明范围内的COL7A1转导载体转导的收获的成纤维细胞中观察到正常的成纤维细胞形态特征。例如，正常的成纤维细胞形态包括显示具有细长延伸的细长、梭形或纺锤体外观的细胞。正常形态进一步包括可能具有细胞质前缘的外观为较大的扁平星状细胞的细胞。图9显示了用COL7A1转导载体转导的成纤维细胞的正常细胞形态的实例。
还观察到由用COL7A1转导载体转导的收获的DEB患者细胞产生的C7的产生。特别地，C7三聚体的形成在锚定原纤维的组装中是重要的。已经发现用COL7A1转导载体转导的DEB患者细胞能够形成具有正确结构、大小和功能的C7三聚体。
在本发明的一个方面，可以证实用COL7A1转导载体转导的成纤维细胞表达的C7能够利用抗C7特异性抗体的免疫沉淀形成锚定原纤维。例如，抗C7特异性抗体fNC1可用于选择性捕获和从培养物上清液浓缩C7，以通过SDS-PAGE/免疫印迹进行检测。例如，图9和10表明用COL7A1转导载体转导的成纤维细胞产生的C7主要是三聚体。
在本发明的另一个方面，可以使用已知方法评估C7的功能，如使用层粘连蛋白结合测定或细胞迁移测定。已显示C7结合固定的细胞外基质(ECM)组分，其包括纤连蛋白、层粘连蛋白332(Lam332)、COL1和COL4(Chen等人，2002a)。C7与Lam332之间的相互作用通过C7的NH2-末端NC1结构域发生，并且依赖于Lam332和C7NC1二者的天然构象(Rousselle等人，1997)。C7与Lam332之间的关联对于在真皮表皮交界处建立正确的Lam332结构非常重要。这种组织对于与细胞外配体和细胞表面受体的相互作用以及细胞信号传导是重要的(Waterman等人，2007)。在本发明的一个方面，已经开发了使用抗C7NC1结构域的抗体的ELISA来检测C7与纯化的Lam332的结合。尽管文献中已经描述了C7/Lam332结合ELISA(Chen等人，2002a)，但据我们所知，它从未用于测试转导细胞上清液中存在的C7。图12中的结果显示了来自训练和工程化运行的GM-HDF表达的C7与Lam332的剂量依赖性结合。
此外，细胞迁移测定可用于评估功能性C7活性。先前的研究已表明RDEB成纤维细胞和角质形成细胞相对于其正常对应物表现出运动性增加，并且通过C7的表达可以恢复正常运动性(Chen等人，2000；Chen等人，2002b；Cogan等人2014；Baldeschi等人，2003)。合适的测定包括用于测量成纤维细胞和角质形成细胞迁移的胶体金盐迁移测定，或用于测量角质形成细胞迁移的伤口愈合测定。在这样的测定中，具有功能性C7活性的细胞相对于RDEB细胞表现出降低的运动性。
在一个方面，本发明涉及包含来自DEB患者的自体遗传修饰细胞的药物制剂。这些细胞可以以适合于递送至患者(最初从其收获细胞)的任何量存在。例如，细胞可以以1.0-5.0×107个细胞/mL、1.0-4.0×107个细胞/mL、1.0-3.0×107个细胞/mL或1.0-2.0×107个细胞/mL的细胞浓度存在。细胞存在于适于维持细胞活力的悬浮液中，如在杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)中。特别地，制剂中细胞的活力以≥60％、70％、75％或80％的量存在。合适的赋形剂也可以存在于制剂中，如磷酸盐缓冲盐水，其可以用于从解冻小瓶中洗涤自体遗传修饰的细胞。优选地，最终制剂中不存在酚红。
本发明的自体遗传修饰的细胞具有至少或约0.05、0.09、0.41或0.74的转导载体拷贝数，或在约0.1至约6.0、约0.1至约5.5、约0.1至约5.0、约0.1至约4.5，约0.1至约4.0、约0.1至约3.5、约0.1至约3.0、约0.1至约1、0.4至约1或0.4至约0.75范围内的转导载体拷贝数。优选地，转导载体拷贝数在约0.1至约5.0的范围内。已经发现，相对于未进行旋转接种或超转导的转导组合物，转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞具有高至少或约1、2、5、10、20、25、27、28、29、30、35、40、45或50倍的整合转基因拷贝数/细胞。此外，本发明的FCX-007细胞的C7蛋白表达值≥300、350、400、450、500、550或600ng/天/E6细胞。优选地，本发明的自体遗传修饰细胞的C7蛋白表达值≥500ng/天/E6细胞。本发明还发现，相对于未进行旋转接种或第二转导的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞，C7的表达增加了10、25、50、100、150或200倍。
感染复数(MOI)是指转导中使用的载体颗粒数/细胞。根据本发明，即使随着MOI降低，也已达到所需的转导载体拷贝数，如下面的实例所示。例如，本发明涉及MOI≤15、≤14、≤13、≤12、≤11或≤10。优选地，MOI为约1至10。
本发明的制剂可用于治疗患有VH型缺乏的患者的各种疾病。特别地，本发明的制剂适用于治疗DEB，包括DDEB或RDEB。在本发明的实施例中，还可以治疗RDEB的亚型，包括但不限于Hallopeau-Seiemens型RDEB、非Hallopeau-Siemens型RDEB、反常型RDEB、胫前RDEB、肢端RDEB和向心型RDEB。
本发明还涉及治疗、减少、预防和/或抑制归因于C7缺乏的各种症状。例如，已知DEB在水疱后引起瘢痕形成，这可能导致挛缩畸形、如果是口腔和食道受到累及则会吞咽困难，手指和脚趾的融合，以及活动受限。因此，在本发明的一个方面，设想假性并指(也称为手套样手综合征)的治疗、减少、抑制和/或预防。另一方面，本发明涉及与RDEB和/或DDEB相关的深度纤维化和/或瘢痕形成的治疗、减少、抑制和/或预防，所述深度纤维化和/或瘢痕形成可导致粟粒疹、关节挛缩、全身性软组织纤维化、器官纤维化、角膜病变、瘢痕斑块、瘢痕性脱发、甲营养不良、结舌和龋齿频率增加。另一方面，本发明涉及与RDEB相关的口腔粘膜病变和胃肠道病变的治疗、减少、预防和/或抑制。另一个实施例涉及与DEB患者相关的水疱的治疗、预防、减少和/或抑制。
自体遗传修饰的细胞的给药可以在任何适当的时间进行，如本领域技术人员能够基于患者的需要所确定的。例如，给药可以进行一次、每天一次、每月一次、每季度一次或每年1-2次。
含有自体遗传修饰的细胞的本发明制剂可以通过任何已知方法给予患者，包括但不限于注射、局部、口服或包埋在生物相容性基质中。注射可以是，例如，肠胃外、皮内、皮下、肌肉内、静脉内、骨内、动脉内、眼内和腹膜内或直接注射至特定器官/组织，例如，前列腺或肝。通常，制剂可以直接给予受影响的部位，如病变部位。在将制剂直接给予部位之前，可以对受影响的组织进行清创。可替代地，可将制剂包封在合适的递送系统中，如包封在聚合物胶囊中，或包埋在生物相容性基质或移植物例如胶原基质、水凝胶、皮肤移植物或网状物中。
对于患有DEB的患者，本发明的自体遗传修饰的细胞可以单独给予或与其他治疗组合给予。用于治疗DEB的治疗剂的实例包括局部护理，如Zorblisa、皮肤移植物、抗炎剂、抗体、其他潜在基因或基于细胞的疗法。在另一个实施例中，本发明的修饰细胞可以给予皮肤或粘膜区域，其中骨髓移植疗法(或其他系统细胞疗法，如间充质干细胞)不能提供足够的疗法。优选地，自体遗传修饰的细胞的C7表达能力不受与其他治疗剂组合的损害。
本发明进一步涉及增强或增加从缺乏C7地患者获得并根据本发明转导的遗传修饰的细胞中的整合转基因拷贝数/细胞的方法。特别地，已发现转导期间的某些步骤显著增强了这些细胞中转基因的拷贝数。在本发明的一个方面，使得从缺乏C7的患者获得的细胞与本发明的慢病毒载体接触，并对该组合物进行旋转接种(也称为旋转转导)。以这种方式，将慢病毒载体旋转至靶细胞上。相对于没有旋转接种的转导或转导，加入旋转接种意外地使遗传修饰的人真皮成纤维细胞中的拷贝数/细胞增加了≥2倍的水平。然而，为了鉴定增加拷贝数的其他方法，意外地发现第二转导步骤(或超转导)，其中靶细胞通过用旋转接种的第一次转导进行传代，随后通过可任选地采用旋转接种的第二转导进行后续传代。以这种方式，已经发现，相对于不包括旋转接种或超转导的原始传统转导方法，这种采用旋转接种的超转导使拷贝数增加了另外的2倍。
在另一个实施例中，已发现将慢病毒载体由INXN-2002改为INXN-2004使遗传修饰的人真皮成纤维细胞中的转基因拷贝数相对于没有旋转接种或超转导的传统转导增加了4倍。
通过广泛评估整合的转基因拷贝数，已发现相对于不包括旋转接种或超转导的原始转导过程，添加旋转接种、添加超转导与旋转接种以及由INXN-2002改为INXN-2004的累积变化，意外地使拷贝数增加了＞27倍(参见实例9：将TR12.1和TR3与原始研究中的TR8(不包括旋转接种或超转导)进行比较。因此，本发明涉及增加来自缺乏C7的患者的转导细胞的拷贝数。
为了进一步说明本发明，提供了以下非限制性实例。
实例
FCX-007是表达人胶原7型蛋白质的使用慢病毒载体(INXN-2002)(如实例1中所示)或慢病毒载体(INXN-2004)(如实例2中所示)进行遗传修饰的活的自体人真皮成纤维细胞的悬浮液。
实例1
A.用慢病毒载体INXN-2002转导的FCX-007的结构和特征的说明
将来自慢病毒载体INXN-2002细胞的FCX-007细胞悬浮于由Iscove改良的杜氏培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(IMDM)组成的冷冻保存培养基中，该培养基不含胎牛血清(50.0％)、Profreeze-CDMTM(42.5％)和二甲基亚砜(DMSO)(7.5％)。FCX-007药品(DS)的结构特征包括自体人真皮成纤维细胞(HDF)的一级结构和用于转导和基因修饰HDF细胞的慢病毒载体的结构。
B.慢病毒载体(INXN-2002)
用于将人胶原7A1基因转导和引入HDF细胞中的INXN-2002慢病毒载体(LV)是编码人胶原7A1基因的重组慢病毒载体。INXN-2002 LV是一种自身失活(SIN)慢病毒载体，其基于用异源VSV-G包膜蛋白假型化的人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)进行构建。用于INXN-2002慢病毒载体的病毒颗粒直径为约120nm，并且由具有两个拷贝的单链RNA基因组的许多蛋白质构成。无法获得特定的分子式、分子量或立体化学。
INXN-2002 LV的结构特征包括RNA病毒基因组的一级结构和病毒颗粒的结构。INXN-2002的RNA基因组的一级结构由病毒基因组的完整核苷酸测序来确定。通过添加的VSV-G蛋白假型化从HIV-1的颗粒结构推导出病毒颗粒结构。下面提供了核酸结构和病毒颗粒结构的概述。
C.INXN-2002 RNA病毒基因组结构
INXN-2002 LV是一种自身失活(SIN)慢病毒载体，其基于用异源VSV-G包膜蛋白而不是HIV-1包膜蛋白假型化的1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)进行构建。将400bp缺失引入LTR的U3区域，从而导致自身失活(SIN)载体(Zuffery 1998)。选择pSMPUW慢病毒表达质粒载体(Cell Biolabs公司，圣地亚哥，加州)用于构建INXN-2002 LV。图6示出了pSMPUW慢病毒表达质粒载体中遗传元件的示意图。
HIV-1病毒的5’与3’LTR之间的编码元件被完全去掉。载体编码多克隆位点，然后编码土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。为了使载体的克隆能力最大化，通过用来自多克隆位点的BamHI和3’左末端重复序列的5’末端的KpnI消化载体来除去这些元件。通过单链退火将具有CMV启动子的COL7A1基因表达盒克隆至消化的载体中，以生成编码COL7A1基因的慢病毒载体质粒构建体，如图13所示。
将慢病毒载体质粒构建体与三种辅助质粒(pCMV-G、pCMV-Rev2和pCgp)共转染至HEK293T细胞中，以产生INXN-2002慢病毒载体颗粒。pCMV-G质粒提供VSV-G假型表面蛋白，pCMV-Rev2提供用于有效的RNA转运和包装的HIV-1Rev蛋白，并且pCgp提供用于产生INXN-2002慢病毒载体颗粒的结构和病毒酶蛋白。图14示出了INXN-2002慢病毒载体的前病毒RNA基因组结构的示意图。
D.INXN-2002慢病毒载体颗粒结构
INXN-2002慢病毒载体是基于HIV-1衍生的载体骨架构建的，并具有与HIV-1病毒相似的病毒颗粒结构。图9示出了HIV-1颗粒的电子显微照片。
HIV-1颗粒具有直径约120nm的球形，估算的分子量为277MDa(Carlson 2008)。该颗粒具有清除了包膜蛋白的脂质双层膜。包膜蛋白与靶细胞上的受体相互作用，以感染和将RNA病毒基因组递送至靶细胞。可以在病毒颗粒内部观察到锥形核心，其中容纳有病毒RNA基因组的两条链。锥形核心由病毒衣壳蛋白形成。
对于INXN-2002，VSV-G(水疱性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G))用作HIV-1包膜蛋白的替代物，从而提高载体稳定性、靶细胞向性和转导效率(Cronin 2005)。
在生产过程中，INXN-2002病毒颗粒从转染的HEK293T细胞表面组装并出芽。VSV-G蛋白由pCMV-G辅助质粒提供，载体核心和酶蛋白由pCgp辅助质粒提供，并且有效RNA基因组转运和包装至病毒颗粒中所需的Rev蛋白是由pCMV-Rev2质粒提供。应注意的是，INXN-2002载体中缺失所有其他HIV-1辅助蛋白，包括Vpu、Vif、Vpr、Nef和Tat。
在从生产细胞表面出芽后，包装在病毒颗粒内部的蛋白酶将Gag前体蛋白切割成其组成蛋白(MA、CA、NC)，以将未成熟病毒体转化为成熟的感染性INXN-2002载体颗粒。图15显示了描绘成熟INXN-2002病毒颗粒的细节的示意图。
将INXN-2002 RNA基因组的两条链包装在由衣壳蛋白(CA)形成的锥形核心内。核衣壳(NC)蛋白与衣壳核心内的RNA基因组形成稳定的复合物。基质蛋白在膜的内表面上形成涂层。病毒通过掺有VSV-G包膜蛋白的细胞质膜出芽并形成脂质包膜。基于最近对HIV-1病毒颗粒结构的三维分析(Carlson 2008)，表1示出了构成INXN-2002慢病毒载体的组分蛋白质和每种组分功能的简要描述。
表1：INXN-2002慢病毒载体主要组分蛋白质
E.INXN-2002表征
表2提供了由City of Hope制造的INXN-2002的表征测定和规格的列表。表征测定结果在随附的用于INXN-2002批号0786-240-0002-1的CoA中提供，该批号旨在在制造FCX-007临床产品中使用。
表2：INXN-2002的表征
F.通过体外永生化测定表征INXN-2002
使用体外永生化(IVIM)测定评价INXN-2002的插入基因毒性的可能性。该测试在辛辛那提儿童医院医学中心实验血液学和癌症生物学部门(CincinnatiChildren’sHospital Medical Center，Division of Experimental Hematology&Cancer Biology，CCHMC)进行。
IVIM测试的原理是基于以下理解：正常谱系阴性(Lin-)骨髓(BM)细胞在体外3-4周后将停止增殖，但在某些导致原癌基因上调的载体整合的存在下，一些克隆将在5周或更长时间后继续增殖。这种永生化克隆的数量代表载体的致癌潜力。扩增永生化克隆并通过FACS进一步分析干细胞标志物，通过qPCR分析载体拷贝数或通过LAM-PCR分析整合位点。在IVIM测定中生成的永生化克隆中经常观察到在常见整合位点如Evi1或Prdm16中的插入(顺式)(Calmels等人，2005；Modlich等人，2008)。
通过使用谱系特异性抗体的磁性分选从完整BM分离来自C57BL/6小鼠的谱系阴性(Lin-)骨髓(BM)细胞。然后培养Lin-BM细胞并在完全生长培养基中刺激2天。在第4天，用涂覆RetroNectin(10μg/cm2，Takara)的48孔板中的INXN-2002载体转导细胞。图16示出了IVIM测定的示意性设置。
为了增强Lin-BM细胞上的INXN-2002转导效率，使用旋转浓缩器将INXN-2002载体浓缩约14倍。为了转导，将80μL浓缩的INXN-2002添加至含有1.5×105细胞与150μL转导培养基的每个孔中。将培养板在32℃下以1000g离心70分钟(旋转接种(spinocculation))以进一步提高转导效率。在37℃，5％CO2培养箱过夜孵育细胞。
为了在转导的Lin-BM细胞中获得高INXN-2002载体拷贝数，在第5天、第6天和第7天重复INXN-2002转导，共计4次连续转导。
将转导的Lin-BM细胞扩增10天，每两天将细胞浓度调节至2-4×105个细胞/ml，并根据需要提供新鲜培养基。在转导后第10天，收获细胞并计数。然后使一部分细胞进行DNA分离和qPCR以确定载体拷贝数(VCN)。将剩余的细胞放回培养物中，以在第18-21天之间进行IVIM测定的潜在铺板。
表3示出了在第10天收获的INXN-2002转导的Lin-BM细胞的中试运行结果。
表3：第10天转导后的Lin-BM细胞分析
测试制品 细胞总数 细胞活力 每个细胞的载体拷贝
INXN-2002 1.5x 10<sup>6</sup> 89％ 0.09
对照载体-1 2.7x 10<sup>6</sup> 95％ 0.81
对照载体-2 2.1x 10<sup>6</sup> 91％ 3.58
模拟物 3.0x 10<sup>6</sup> 88％ 0.0
尽管使用浓缩的INXN-2002载体和4x连续的旋转接种(spinocculation)转导，但在Lin-BM细胞中达到的载体拷贝数显著低于IVIM测试预期的1-3的靶拷贝数。中试终止。
由于在IVIM测定中经历的低载体拷贝数以及在所有RDEB成纤维细胞转导运行中实现的低载体拷贝数，因此认为当用于转导RDEB成纤维细胞时，这批INXN-2002具有最小的插入基因毒性风险。没有通过IVIM测定进一步分析这批INXN-2002。
G.用INXN-2002转导的FCS-007
用于制造FCX-007的人真皮成纤维细胞来源于活皮肤活检物。使用(Roche)消化活检物以释放真皮成纤维细胞，然后使用标准细胞培养技术将细胞在培养物进行扩增。在INXN-2002转导后培养扩增完成时，收获细胞并洗涤，然后配制成含有1.0-3.0×107个细胞/mL。测试DS的纯度，并通过CD90染色证实含有≥98％成纤维细胞，其中细胞活力≥85％。
当在组织培养物表面上培养时，在DS制剂中用INXN-2002 LV转导的FCX-007细胞显示典型的成纤维细胞形态。具体地，细胞可以显示具有细长延伸的细长、梭形或纺锤体外观，或者细胞可以表现为可以具有细胞质前缘的较大的扁平星状细胞。也可以观察到这些形态的混合物。图17示出了培养物中FCX-007DS的典型细胞形态和结构。
细胞表达正常成纤维细胞特有的蛋白质，包括成纤维细胞特异性标志物CD90(Thy-1)(35kDa细胞表面糖蛋白)和细胞外基质蛋白质如各种类型的胶原。
H.衍生自慢病毒载体INXN-2002的FCX-007：药品释放表征
FCX-007药品的特征在于在制造过程中在三个阶段释放：在过程中、大批收获时和冷冻保存(DS)后。表4提供了由PCT制造的FCX-007DS的释放的表征测定和规格的列表。成品药品的表征测定结果在所附的训练运行8A组、B组和C组(非转导对照)的CoT中提供。
表4：FCX-007药品释放特征
I.来源于INXN-2002表征的其他FCX-007DS
已经在训练生产运行中进行了FCX-007的其他表征以确认功能性C7的表达。下面显示的代表性评估来自训练运行8(TR8)，其中细胞用高剂量(3.4IU/细胞)或低剂量(1.7IU/细胞)的LV-COL7转导，或模拟物转导。这些转导组也分别称为A组、B组和C组。
J.用INXN-2002转导的FCX-007DS：C7表达水平
为了通过FCX-007定量C7表达，开发了酶联免疫荧光测定(ELISA)。对于该测定，将TR8药品小瓶(高剂量、低剂量和模拟物转导的)解冻并培养3天，收集条件细胞培养物上清液并测定C7。图18中的结果显示了在LV-COL7转导的细胞中范围为60至120ng/mL C7的病毒剂量依赖性蛋白质表达。
K.用INXN-2002转导的FCX-007DS：C7三聚体形成
锚定原纤维由C7三聚体的组装形成。通过C7的免疫沉淀然后进行非变性SDS-PAGE/免疫印迹分析，可检测C7三聚体由FCX-007的适当表达和形成。对于图19，使用NC1特异性抗体在解冻后第1代和第2代从FCX-007细胞培养物上清液中免疫沉淀C7，并在非变性SDS-PAGE上分离，然后通过蛋白质印迹可视化。由RDEB成纤维细胞产生的C7主要是三聚体(红色箭头；约870kDa)，其中LV-COL7转导的细胞(转导A组和B组)比模拟物转导的细胞(C组，已加星标)表达更多的C7。还观察到单体(290kDa)和二聚体(580kDa)形式。测定对照包括纯化的C7(Pur COL7)的免疫沉淀和无抗体或测试样品的免疫沉淀(IP对照)。
L.用INXN-2002转导的FCX-007：C7与Lam332结合
C7在真皮/表皮交界(DEJ)处与层粘连蛋白332相互作用。C7与层粘连蛋白332之间的相互作用对于锚定原纤维功能是重要的(Chen 2002，Rousselle 1997，Waterman 2007)。在Intrexon开发了用于检测这种相互作用的结合测定。将药品小瓶(高剂量、低剂量和模拟物转导的)解冻并培养2天。收集条件细胞培养物上清液并与Lam332或牛血清白蛋白(BSA)涂覆的孔一起孵育，并使用C7 NC1特异性抗体和HRP缀合的二级抗体检测结合的C7。测定读出是450nm处的光密度(OD450)。图20中的结果显示与BSA对照相比，与Lam332的病毒剂量依赖性结合。
M.来源于INXN-2002迁移评估的FCX-007
开发了迁移测定以评估C7的功能。Chen 2000已经证明RDEB患者皮肤细胞比正常皮肤细胞更快地迁移到组织培养容器上产生的人工伤口边缘，并且C7的施加可以恢复迁移率。将正常人真皮成纤维细胞(NHDF；Lonza)和来自FCX-007药品小瓶的细胞解冻并培养。将细胞接种至具有插入物的培养皿中以防止细胞粘附在培养皿的小条带中。然后移取条带，通过显微镜监测细胞迁移到开放区域的速率，并使用ImageJ软件的不规则形状描绘插件进行定量。图21A-图21B示出了该测定的迁移百分比(A)和迁移图像(B)。结果显示模拟物转导的RDEB患者成纤维细胞比NHDF更快地迁移到开放区域，并且用LV-COL7转导使患者细胞恢复到与NHDF类似的迁移速率。这些结果与Chen 2000所描述的结果一致。
实例2：用INXN-2004慢病毒载体转导的FCX-007
FCX-007是由INXN-2004慢病毒载体(LV-COL7)遗传修饰以表达人胶原7蛋白(C7)的自体成纤维细胞产物。下面描述的用于制造FCX-007 DS/INXN-2004的材料类似于以上在实例1中所述的材料，不同之处在于IGE-230 LV-COL7载体质粒用于生产INXN-2002。IGE-308 LV-COL7载体质粒用于制备INXN-2004载体。使用相同的辅助质粒pCMV-G、pCMV-Rev2和pCgp共转染293 WCB细胞系。
INXN-2004慢病毒载体
IGE308 LV-COL7载体转移质粒
使用标准分子克隆方法构建IGE308质粒。构建过程包括克隆人COL7A1基因并将克隆的COL7A1基因引入慢病毒载体(SIN)骨架pFUGW中，以产生IGE308 LV-COL7载体转移质粒。
克隆人COL7A1基因
克隆至IGE308 LV-COL7载体转移质粒中的COL7A1基因是克隆至INXN-2002(IGE230载体转移质粒)中的相同COL7A1基因。
用Takara PrimeScript逆转录酶设计和产生引物，以从人基因组cDNA扩增COL7A1基因。设计了四个引物对，如表5所示，每个引物扩增约2kb的COL7A1基因。
表5：用于扩增人COL7A1基因的引物组
用两个引物对(CollF2/CollR4和CollF4/CollR1)扩增产物，所述两个引物对被设计为扩增来自人基因组cDNA的COL7A1的5’末端3790碱基对(bp)以及用于克隆至表达载体中的5’突出端。通过重叠延伸PCR连接两个5’PCR产物(2127bp和2993bp)以生成3790bp最终产物。
为了克隆该基因的其余部分，合成了DNA片段(341bp，Col1A1-3，表6)，所述片段包括具有与PCR扩增的5’3790bp基因片段重叠的COL7A1基因的最终322bp，以及克隆载体。
表6：Col1A1-3片段序列
将两个COL7A1基因片段(3790bp和Col1A1-3)组装到诱导型表达载体(VVN-257673)中，该诱导型表达载体先前已使用In-Fusion HD克隆试剂盒采用NheI和ClaI消化。通过PCR用对骨架载体特异性的引物和COL7A1序列筛选细菌克隆以鉴定测序候选物。通过消化和COL7A1片段DNA测序确认阳性克隆。得到的质粒名称为VVN-4311835。
用BstZ17I和SapI消化购自Origene的VVN-4311835和COL7A1表达质粒(SC300011)。将COL7A1基因的6276bp片段从SC300011克隆至VVN-4311835中。将得到的质粒VVN-4311835(使用相同的质粒编号)完全测序，并确认COL7A1序列完整且没有突变。
用NheI和ClaI消化VVN-4311835质粒，其中这两种限制酶的位点恰好在COL7A1编码序列之外。将切下的COL7A1基因克隆至组成型表达载体VVN-257231中，该载体也用NheI和ClaI消化以产生VVN-4319958。VVN-4319958在组成型CMV启动子的控制下表达全长人COL7A1。
图22提供了克隆人COL7A1基因的示意图。
将克隆的COL7A1基因引入慢病毒载体(SIN)
基于其增强的安全性特征和大的克隆能力，最初选择pSMPUW慢病毒表达载体(VPK-211，Cell Biolabs公司，圣地亚哥，加州)以构建编码COL7A1基因的INXN-2002慢病毒载体。
图7将pSMPUW载体与标准的第3代SIN LV载体进行比较。pSMPUW载体编码多克隆位点(MCS)，然后编码土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。从pSMPUW载体构建体中除去残留的gag(Δgag)和RRE元件。另外，pSMPUW载体构建体在3’LTR U3区域中使用较大的400bp缺失，而不是常用的标准第3代SIN Lv载体中的133bp缺失。
将COL7A1基因克隆至用于构建INXN-2002慢病毒载体的pSMPUW慢病毒表达载体中的细节在以上实例1中进行了描述，并在下面进一步描述。
产生含有CMV启动子的插入物，随后是Kozak序列和具有BclI和SapI限制性位点的截短形式的COL7A1基因，以用于引入整个编码序列。该插入物以两个片段CColG和ColG2(IDT)的形式合成(表8)。使用In-Fusion HD克隆试剂盒将这两个片段与消化的pSMPUW载体组装在一起。使用菌落PCR采用对质粒骨架特异性的引物(63968-3R)和对COL7A1基因特异性的引物(ColS14)鉴定阳性克隆。纯化来自阳性克隆的质粒并确认序列以生成IGE228。用FspI和BamHI消化IGE228。
使用BclI和SapI位点克隆COL7A1基因的最初尝试是不成功的。使用PCR产物作为接头绕过BclI限制性位点设计了另一种策略。引物EPF5和CollR3用于由质粒模板VVN-4319958生成PCR产物。用BamHI和FspI消化该产物，所述BamHI在COL7A1的5’端上游切割48bp，所述FspI切割COL7A1的5’端的1630bp以生成5’接头。
用来自VVN-4319958的FspI和SapI切割野生型COL7A1基因。将该片段与消化的IGE228和5’接头连接以生成用于表达COL7A1的慢病毒构建体VVN-4580853(也称为IGE230)。使用对COL7A1特异性的引物ColS13和对慢病毒骨架特异性的63968-3R来鉴定阳性克隆。从CMV启动子至COL7A1的3’端对质粒进行测序。
以下表7显示了用于将COL7A1基因引入pSMPUW慢病毒表达载体的合成基因序列和引物。
表7：合成基因元件和引物
图23提供了将COL7A1基因克隆至pSMPUW表达载体中以产生INXN-2002慢病毒载体转移质粒IGE230的示意图。
持续发展的结果表明，RRE元件的缺失和在pSMPUW载体构建体中的3’LTRU3区域中大的400bp缺失的使用，结合包装大的COL7A1基因(8.8kbp)的要求，导致了对RDEB成纤维细胞中LV-COL7载体产生(感染滴度)和随后的转导以及C7蛋白表达的负面影响。
选择第3代GEN SIN载体pFUGW(FUGW，质粒#14883，www.addgene.org)来构建第二代LV-COL7载体INXN-2004。构建INXN-2004以提高载体拷贝数。图8提供了pFUGW慢病毒表达质粒载体中遗传元件的示意图。
pFUGW载体含有RRE、两种cPPT元件以及用于实现改善的慢病毒载体产生和转基因表达的WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)元件。构建IGE308慢病毒载体转移质粒以最大化转基因克隆能力以适应大COL7A1基因(8.8kbp)的插入。
通过用PacI和XhoI消化载体除去WPRE元件、hUBC启动子和GFP报告基因。生成含有CMV启动子的5’末端的插入物，然后是COL 7A1基因的3’末端的小片段。该插入物(ColCN)在IDT合成为G-块片段(表8中的序列)。使用Gibson克隆衍生物方法将片段与消化的pFUGW载体组装在一起。使用菌落PCR采用对质粒骨架特异性的引物(FugwQCF和FugwQCR)鉴定阳性克隆。纯化来自阳性克隆的质粒并确认序列以生成IGE301。
然后用BaeI消化IGE301。用AseI和SapI消化IGE230以产生含有CMV启动子的3’末端、5’UTR和大多数COL7A1基因的片段。使用Gibson克隆衍生物方法将片段转移至BaeI消化的IGE301载体。使用对COL7A1特异性的引物ColS13和对慢病毒骨架特异性的FugwQCR来鉴定阳性克隆。纯化来自阳性克隆的质粒并确认序列以生成IGE308。
以下表8提供了用于将COL7A1基因引入pFUGW慢病毒表达载体的合成基因序列和引物。
根据制造商的方案用Qiagen MaxiPrep试剂盒对质粒进行Maxi制备。
表8：在IGE308产生的最后步骤中使用的合成基因元件和引物
图24提供了INXN-2004慢病毒载体转移质粒(IGE308)的构建的示意图。
IGE-308质粒的产生
使用由五个步骤组成的过程产生IGE308质粒：转化、甘油储备物的产生、放大、捕获、渗滤和配制。
转化：向Aldevron提供IGE308质粒的种子库，用于转化为感受态的大肠杆菌(DH10B)。转化板在34℃下储存，这是慢病毒构建体的标准。
甘油储备物的产生-通过挑选从转化板分离的菌落来产生种子培养物。每种培养物都是微量制备的，并且通过琼脂糖凝胶测定的最佳种子培养物用于制备工作甘油储备物。放大-在以下每种培养基类型中培养一个500mL培养物：快速生长培养基和最大产量培养基(总计两个500mL培养物)以比较培养基。使用步骤二中产生的甘油储备物接种培养物，并对每个制备物进行全套QC测定。这也允许Aldevron测试每种培养基类型中质粒的稳定性。
基于最初的QC结果，选择快速生长培养基用于转化的大肠杆菌在34℃的摇瓶中生长。制备总计8L的培养物。
捕获-将8L的大肠杆菌培养物裂解并使用DMAE阴离子交换色谱法初步纯化，产生了总计833.8mg质粒。使用HIC(疏水作用色谱法)色谱法在OS树脂上进行另外的纯化步骤。该步骤产生663mg纯化的DNA。
浓缩和配制-然后将纯化的质粒调节至最终缓冲液并经由连续渗滤进行浓缩。使用的最终缓冲液为TE。
以1.4mg/mL的浓度运送总计200mg的IGE308质粒。在进一步制造INXN-2004之前分析IGE308质粒。
IGE308质粒序列的分析
用于INXN-2004制造的IGE308质粒在SeqWright在GLP条件下使用引物步移和寡核苷酸合成进行完全测序，以产生4倍的双向序列覆盖。IGE308质粒的大小为16,777bp。该序列显示与提供给SeqWright的IGE308构建参考序列100％匹配。IGE308质粒中的基因元件示于图25A-25B中。表9提供了基因元素及其相应功能的列表。
表9：IGE308质粒中基因元件的大小和功能
将IGE308质粒中的COL7A1基因序列(没有终止密码子TGA)与GenBank智人胶原(VII型)α1(COL7A1)序列(NM_000094.3)进行比较。序列比对在附录4中提供。鉴定了三种沉默点突变，如以下表10中所列。未发现序列缺口。三个沉默点突变对编码的C7蛋白没有影响。
表10：IGE308中COL7A1与GenBank共有序列的序列比较
辅助质粒：pCMV-G、pCMV-Rev2和pCgp
由CoH提供用于INXN-2004 LV载体生产的三种辅助质粒pCMV-G、pCMV-Rev2和pCgp。
293T工作细胞库(WCB)
由CoH提供用于INXN-2004 LV载体生产的293T WCB。
INXN-2004制造的其他起始材料
用于INXN-2004 LV载体生产的其他起始材料也由CoH提供。
活检组织
使用标准无菌操作从RDEB受试者身体的未起疱区域收集三个3-4mm穿孔皮肤活检物(真皮和表皮层)。活检物由治疗医师收集，放入含有冷的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)的小瓶中，并在第二天经由在冷藏的感染性包装容器中递送进行运输，该容器适用于运输潜在生物危害组织并且被设计为维持温度为2℃-8℃。
a.试剂、溶剂和辅助材料
i.试剂和溶剂
在FCX-007药品制造过程中使用了两种动物来源的试剂：胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶-EDTA溶液。完全生长培养基
在所有细胞培养扩增步骤中，在FCX-007制造时使用完全生长培养基(CGM)。通过无菌转移在20L袋中将18L的IMDM与2L FBS混合来制备CGM。配制的CGM袋在5℃±3℃的冰箱中储存。
a.起始生长培养基
在FCX-007制造时使用起始生长培养基(IGM)，其用于在抗生素的存在下将活检物消化至T-75细胞培养瓶中后成纤维细胞的初始接种。通过在ISO5 BSC内无菌地将0.6mL的100倍浓缩的抗生素溶液(GA)添加至500mL方形培养基瓶中的58.2mL CGM中来制备起始生长培养基。最终浓度为0.4mg/mL庆大霉素、0.295μg/mL两性霉素B。还将GSH溶液(1.2mL 50X溶液)添加至500mL方形培养基瓶中。将瓶子封闭并倒置3-5次以混合。在立即使用之前，将IGM在37℃培养箱内温热至少60分钟。
起始生长培养基在使用前即刻新鲜制备，因此没有有效期且不进行质量控制释放测试。
b.转导培养基
在INXN-2004转导成纤维细胞期间使用转导培养基(TM)。通过以下方式在ISO5BSC内新鲜制备转导培养基：将40mL IMDM添加至含有10mL CGM的250mL离心管中以将培养基中的FBS浓度稀释至2％。将250mL管混合并置于37.0℃培养箱内温热至INXN-2004转导所需。
转导培养基在使用前立即新鲜制备，因此没有有效期且不进行质量控制释放测试。
c.GSH溶液
将GSH补充至起始生长培养基(IGM)和用于早期T-75和T-175成纤维细胞培养物的CGM以增强细胞生长。通过将51.1g GSH溶解于1L IMDM中，在ISO5 BSC内制备50X GSH储备溶液。溶液经0.22μm过滤。将过滤的溶液等分至50mL离心管中，每管20mL，并在-80℃下冷冻储存以供进一步使用。
d.RetroNectinTM溶液
RetroNectinTM用于FCX-007生产过程，以提高INXN-2004对成纤维细胞的转导效率。在ISO5 BSC内，使用5mL注射器和18g针头，将2.5mL WFI无菌转移至临床级的小瓶中，以1.0mg/mL重构通过轻轻旋转使彻底溶解。使用附带的5mL注射器取出样品瓶的全部内容物。将18g针头用0.22μm注射器式过滤器无菌地替换至注射器上，并将重构的无菌过滤至250mL离心管中。使用适当大小的移液器，将122.5mL PBS转移至250mL离心管中的重构以将稀释至20μg/mL，然后使用移液器充分混合。使用适当大小的移液器，将6.3mL稀释的溶液添加至每个T-25烧瓶中，以用以5μg/cm2涂覆表面。对于第一轮INXN-2004转导，准备5x至10x T-25烧瓶。对于INXN-2004超转导，准备18x T-25烧瓶。
RetroNectinTM溶液在使用前立即新鲜制备，因此没有有效期且不进行质量控制释放测试。
冷冻保存培养基
冷冻保存培养基是一种双倍浓缩溶液，它在FCX-007制造过程中添加至收获和洗涤的成纤维细胞中以配制细胞种子储液和FCX-007药品，以供在液氮中储存。通过以下方法制备冷冻保存培养基：将0.85体积的ProFreezeTM-CDM(2X)与0.15体积的DMSO混合以获得一体积的冷冻保存培养基。
冷冻保存培养基在使用前立即新鲜制备，因此没有有效期且不进行质量控制释放测试。
实例3：训练运行8、9和10和增强的活检物酶促消化
训练运行8和增强的活检物酶促消化
在上述TR中，怀疑活检物消化方法不能实现3-4mm大小的活检组织的有效消化。在TR8中，在消化过程中施加另外的剪切力被并入该过程以提高整体消化效率。消化过程修改为以下内容：在消化过程中每15±2分钟，在最大设定下脉冲涡旋离心管5秒，每次涡旋后将离心管返回至定轨摇床；在孵育60分钟结束时，在最大设定下脉冲涡旋离心管10秒。
使用增强的消化方法处理并消化来自RDEB供体的活检物。使用补充有GSH的培养基将来自消化的细胞接种至T-75烧瓶中。细胞显示出良好的生长并在第14天达到90％汇合以进行传代。为了评价INXN-2002转导条件，将从T-75烧瓶收获的细胞接种至3x T-175烧瓶中，作为对照、A组和B组。将所有三组中的细胞扩增，在1-CS中用10L中试LV-COL7载体进行转导(模拟物转导的对照组)，然后在收获以冷冻保存之前进一步扩增为2x 10-CS。
表11：训练运行8中的细胞生长和细胞产量
从10-CS收获的细胞总数被认为足以进一步生产注射用FCX-007药物产品。测试收获的细胞的COL7A1基因拷贝数(转导效率)、C7蛋白表达、细胞活力和细胞纯度。表12提供了来自所有三组的收获细胞的分析结果。
表12：从训练运行8收获的细胞的分析
1INXN-2002 IU滴度：9.2×106IU/mL，其是使用早期开发阶段H1299感染滴度测定法在Intrexon测定的。
2测定的详细内容3.2.S.4部分中提供。
3BLQ：低于定量限
观察到COL7A1基因拷贝数和C7蛋白表达的感染复数(MOI)剂量依赖性增加。INXN-2002转导开发和优化的细节描述如下。尽管低INXN-2002 IU滴度限制了转导MOI和随后的COL7A1基因拷贝数，但观察到C7蛋白表达在临床前环境中具有生物学相关性，如体外和体内结果所证明。总之，结果显示RDEB成纤维细胞可以用INXN-2002转导并表达功能性C7蛋白。
来自TR8的A组细胞产物用于概念验证研究和毒理学以及生物分布研究。
训练运行9
使用增强的消化方法处理并消化来自RDEB供体的活检物。使用补充有GSH的培养基将来自消化的细胞接种至T-75烧瓶中。与TR8类似，细胞显示出良好的生长并在第19天达到90％汇合以进行传代。为了评价LV-COL7转导条件，将从T-75烧瓶收获的细胞接种至3xT-175烧瓶中，作为对照、A组和B组。将所有三组中的细胞扩增，用1-CS(对照组进行模拟物转导)中的LV-HA-COL7载体(在构建体中含有HA标记)转导，然后在收获之前进一步扩增至2x10-CS。测试收获的细胞的COL7A1基因拷贝数(转导效率)、C7蛋白表达和细胞纯度。表13提供了TR9中的细胞生长。
表13：训练运行9中的细胞生长和细胞产量
1LV-HA-COL7载体是研究载体，其将HA标记并入INXN-2002 LV载体中的COL7A1序列。
2从10-CS收获的细胞总数被认为足以进一步生产注射用FCX-007药物产品。
表14提供了来自所有三组的收获细胞的分析结果。
表14：从训练运行9收获的细胞的分析
1LV-HA-Col7载体滴度：2.0×106IU/mL，其是使用早期开发阶段H1299感染滴度测定法在Intrexon测定的。
2测定的详细内容3.2.S.4部分中提供。
3BLQ：低于定量限
再次观察到COL7A1基因拷贝数和C7蛋白表达的MOI剂量依赖性增加。此外，结果显示RDEB成纤维细胞可以成功生长，用LV-HA-COL7载体转导，并表达C7蛋白。
训练运行10和放大至六个10-CS
根据提出的临床方案(参见模块5)，单次治疗剂量需要4×108FCX-007药物产品细胞，有可能重复给药。为了满足预计的FCX-007产品需求，有必要根据TR8和TR9中获得的细胞产量将最终细胞扩增步骤扩大至六个10-CS。
使用增强的消化方法处理并消化来自RDEB供体的活检。使用补充有GSH的培养基将来自消化的细胞接种至T-75烧瓶中。细胞显示出良好的生长并在第19天达到90％汇合以进行传代。将从T-75烧瓶收获的细胞接种至2xT-175烧瓶中，一个用于INXN-2002转导，而一个用于细胞底物对照。将来自一个烧瓶的细胞扩增，用1-CS中的INXN-2002转导，然后在收获之前进一步扩增至6x 10-CS。表15提供了TR10中的细胞生长。
表15：训练运行10中的细胞生长和细胞产量
相对于TR8和TR9中的细胞，TR10中的细胞生长较慢并且在每个传代步骤中产生较少的细胞，这表明不同RDEB供体之间的潜在可变性。
从6x 10-CS收获的细胞总数被认为足以产生一剂量的注射用FCX-007药物产品。
表16提供了收获细胞的分析结果。
表16：从TR10收获的细胞的分析
1INXN-2002 IU滴度：9.2×106IU/mL，其是使用早期开发阶段H1299感染滴度测定法在Intrexon测定的。
2测定的详细内容在3.2.S.4部分中提供。
实例4
INXN-2002转导开发和优化
最初使用在具有模型慢病毒GFP(GeneCopoeia，LP-EGFP-LV105-0205)的96孔板中培养的正常人真皮成纤维细胞(NHDF；Lonza，CC-2511)开发并优化真皮成纤维细胞的慢病毒转导。
使用GeneCopoeia的LV转导方案作为起点，初步优化评价条件，所述条件包括转导时的细胞密度、转导培养物体积、RetroNectinTM的使用、超感染(连续两天用病毒重复转导细胞)、细胞铺板时间(相对于转导的前一天的转导时间)和转导培养基中的血清含量。然后在GMP生产环境中实施最佳转导程序。研究的细节如下所述。
A.细胞接种条件和RetroNectinTM涂层对LV转导的影响
收获处于指数生长期的NHDF，并在两个不同日期以不同接种密度接种至96孔板中。根据制造商的建议(RetroNectinTM涂层密度为20μg/cm2)，用RetroNectinTM涂覆一组未经组织培养物处理的96孔板。对于在LV转导的前一天(第-1天)接种的细胞，去除用过的培养基，并在第0天将含有LV载体的新鲜培养基(100μL)添加至孔中用于转导。对于转导条件的当天(第0天)，将100μL新鲜培养基中的细胞和LV载体同时添加至孔中。所有条件下使用的MOI均为2000vp/细胞。孵育过夜后，去除培养基并给细胞给予100μL新鲜培养基用于进一步培养。在转导后96小时，收获细胞用于通过BD LSRII上的GFP信号的FACS分析进行转导效率分析，并使用FlowJo软件(v.10)进行分析。表17提供了在不同条件下的LV转导效率。
表17：细胞接种条件和RetroNectinTM涂层对成纤维细胞LV转导的影响(GFP阳性细胞％)
1 96孔板孔的表面积：0.32cm2
NC＝未进行
结果表明，在LV转导的前一天不必预培养细胞。可以在转导时同时添加细胞和LV载体，这便于GMP制造操作。在LV转导之前用RetroNectinTM涂覆培养表面显著增加LV转导效率。在LV转导期间需要约1×104个细胞/cm2的较高细胞接种密度，因为较低的细胞接种密度导致较低的LV转导效率。
B.MOI和超转导对LV转导效率的影响
在该研究中，检查了MOI和超转导对成纤维细胞的LV转导的影响。
在用于转导之前，用RetroNectinTM(20μg/cm2)预涂覆一组未经组织培养物处理的96孔板。在转导时，将100μL体积的3000个细胞与LV载体添加至孔中。孵育过夜后，去除培养基并给细胞给予100μL新鲜培养基用于进一步培养。对于超转导，在初始转导后一天(约24小时)从孔中去除培养基，并向孔中添加100μL新鲜培养基中的相同量的LV载体。转导3小时后，去除培养基并给细胞给予100μL新鲜培养基用于进一步培养。在转导后96小时，收获细胞用于通过BD LSRII上的GFP信号的FACS分析进行转导效率分析，并使用FlowJo软件(v.10)进行分析。表18提供了在不同条件下的LV转导效率。
表18：MOI和超转导对成纤维细胞LV转导的影响(GFP阳性细胞％)
MOI(vp/细胞) 不采用超转导 采用超转导
0 1.6％ 2.0％
200 4.3％ 5.8％
500 7.7％ 10.0％
1000 15.3％ 16.3％
2000 22.6％ 27.5％
越来越高的MOI导致在采用和不采用超转导的情况下更高的转导效率。超转导导致LV转导效率的递增。然而，这一增长被认为并不重要，并未在GMP生产环境中实施。
C.LV转导培养物体积和FBS浓度
慢病毒载体颗粒首先需要与培养物中的成纤维细胞接触以实现转导。与其他病毒颗粒一样，溶液中的LV颗粒遵循布朗运动，并且生产性转导通常是随机事件。已经显示，将培养基深度减少至最小体积或使用脊髓转导可改善靶细胞上的病毒载体转导(Nyberg-Hoffman 1997)。评价转导体积/培养物深度和培养基FBS浓度对成纤维细胞LV转导的影响。
在用于转导之前，用RetroNectinTM(20μg/cm2)预涂覆一组未经组织培养物处理的96孔板。在转导时，向孔中添加100μL体积或50μL体积的含有10％FBS的培养基中的3000个细胞与LV载体。在含有2％FBS的培养基中重复相同的转导条件。孵育过夜后，去除培养基，并给细胞给予100μL含有10％FBS的新鲜培养基进行进一步培养。所有条件下使用的MOI均为2000vp/细胞。在转导后96小时，收获细胞用于通过BD LSRII上的GFP信号的FACS分析进行转导效率分析，并使用FlowJo软件进行分析。表19提供了在不同条件下的LV转导效率。
表19：培养体积(深度)和FBS对LV转导的影响(GFP阳性细胞％)
如所预期的，降低转导介质体积(深度)导致LV转导效率的显著增加。另外，结果表明使用2％FBS转导培养基有益于LV转导。基于这些结果，将2％FBS转导培养基并入GMP制造过程中，同时将转导培养基体积保持在最小值，即在1-CS中保持约60mL。在FCX-007的GMP制造过程中，表面积为636cm2的1层手用于成纤维细胞的LV转导。确定了在3小时转导期间使用60mL的转导体积(深度0.9mm)而不对细胞造成不利影响(例如干燥)是可行的。
D.RetroNectinTM涂层和培养表面类型的评价
培养表面的RetroNectinTM涂层显著增加了成纤维细胞的LV转导。RetroNectinTM制造商建议使用在4μg/cm2至20μg/cm2范围内的RetroNectinTM涂层量。为了在不对成纤维细胞的LV转导产生负面影响的情况下最小化RetroNectinTM的使用量，评价了用于涂层的RetroNectinTM的量。
此外，RetroNectinTM制造商建议使用未经组织培养物处理的塑料表面用于RetroNectinTM涂层。然而，用于成纤维细胞培养的培养瓶和都是组织培养物处理的。用不同量的RetroNectinTM涂覆经组织培养物处理的和未经组织培养物处理的96孔板，并评价成纤维细胞的LV转导。
在用于转导之前，用不同量的RetroNectinTM(20μg/cm2、10μg/cm2和5μg/cm2)预涂覆未经组织培养物处理和经组织培养物处理的96孔板。在转导时，向每个孔中添加50μL体积的含有2％FBS的转导培养基中的3000个细胞与LV载体。转导3小时后，去除培养基，并给细胞给予100μL含有10％FBS的新鲜培养基进行进一步培养。所有条件下使用的MOI均为2000vp/细胞。在转导后96小时，收获细胞用于通过BDLSRII上的GFP信号的FACS分析进行转导效率分析，并使用FlowJo软件进行分析。表20提供了在不同条件下的LV转导效率。
表20：RetroNectinTM量和培养表面类型对成纤维细胞LV转导的影响(GFP阳性细胞％)
对于用于涂层的所有三种剂量的RetroNectinTM，观察到成纤维细胞的LV转导的可比较的效率。因此，选择密度为5μg/cm2的RetroNectinTM涂层用于FCX-007生产过程。尽管在经组织培养物处理的表面中观察到较低的LV转导效率，但该差异不足以阻止在FCX-007制造过程的INXN-2002转导步骤中使用经组织培养物处理的烧瓶。
成纤维细胞LV转导的开发与优化概述
基于上述使用LV-GFP模型载体进行成纤维细胞转导的研究结果，选择以下LV转导方案用于来自RDEB供体的成纤维细胞的INXN-2002转导：
使用RetroNectinTM以5μg/cm2预涂覆培养表面。经组织培养物处理的烧瓶可用于RetroNectinTM涂层。
在转导时同时添加细胞和LV载体，其中细胞接种密度为约1×104个细胞/cm2。
使用不会对细胞产生毒性作用的高MOI，以实现高转导效率(每次转导10mL INXN-2002 LV-Col7载体)。
在含有2％FBS的转导培养基中在37℃下转导3小时，然后用含有10％FBS的培养基更换或培养细胞。
使用低转导培养基体积：对于96孔板为50μL/孔或对于1层为60mL，以获得高转导效率。
不需要超转导。
F.INXN-2002成纤维细胞的LV转导
基于上述开发的LV转导方案，INXN-2002用于在96孔板中转导正常人成纤维细胞(NHDF，Lonza，CC-2511)。考虑到INXN-2002的相对低滴度，使用三剂量的INXN-2002进行转导：12.5μL(1∶4稀释)、3.1μL(1∶16稀释)和0.8μL(1∶64稀释)。将转导的细胞传代三次以确保LV-COL7载体稳定整合至转导的细胞基因组中。在第3代，从细胞提取基因组DNA，并使用对LV-COL7载体序列特异性的引物通过qPCR进行分析。转导效率定量为基因拷贝数/细胞。表21提供了通过基因拷贝数/细胞测量的转导效率
表21：成纤维细胞的INXN-2002转导
1INXN-2002 IU滴度：9.2×106IU/mL，其是使用早期开发阶段H1299感染滴度测定法在Intrexon测定的。
2使用早期开发阶段qPCR测定在Intrexon测定基因拷贝数/细胞，这导致与转移至BioReliance进行FCX-007产物分析的完全开发的测定法相比，基因拷贝数高约10倍。该差异是由于在早期开发阶段测定中使用不同的qPCR引物组和环状质粒标准品。
在最高剂量的INXN-2002载体，1/4稀释度(MOI＝40)下，观察到对细胞的显著毒性作用：大多数细胞未从转导步骤中回收，这导致细胞扩增结束时最小的基因拷贝数/细胞。最佳INXN-2002 MOI为约10IU/细胞，这导致基因拷贝数为0.86。
在训练运行中的INXN-2002 LV转导
根据LV转导方案([0260]段)和来自96孔研究的INXN-2002转导载体给予/MOI结果，RDEB成纤维细胞的INXN-2002转导在TR8、TR9和TR10中大规模进行。将用于INXN-2002转导的1层用RetroNectinTM以5μg/cm2预涂覆。在转导时，将在含有2％FBS的60mL转导培养基中的细胞和INXN-2002同时添加至1层中。在37℃的培养箱中3小时后，给细胞给予含有10％FBS的130mL完全生长培养基。将转导的细胞传代两次，首先传代至一个10层然后传代至两个或六个10层以供细胞收获。通过qPCR分析收获的细胞中的基因拷贝数。表22提供了来自执行的训练运行的INXN-2002转导结果。
表22：训练运行中LV-COL7转导的概述
1MOI是基于使用早期开发阶段H1299感染滴度测定法在Intrexon测定的INXN-2002LV-Col7载体IU滴度确定的，其导致与转移至BioReliance进行FCX-007产品分析的完全开发的测定相比，滴度值高约10倍。该差异是由于在早期开发阶段测定中使用不同的qPCR引物组和环状质粒标准品。
2使用完全开发的qPCR测定对基因拷贝/细胞进行定量，该测定被转移至BioReliance以进行FCX-007产品分析
3BLQ：低于定量限
在使用小规模96孔板开发的LV转导方案之后，成功地实现了INXN-2002对RDEB成纤维细胞的转导，以用于FCX-007制造。转导细胞中的基因拷贝数随着转导的增加的MOI而增加。由于INXN-2002的低滴度，转导的收获的细胞产物中的基因拷贝数相对较低。为了生产具有可行的高基因拷贝数的FCX-007细胞产物，选择10mL INXN-2002用于GMP生产转导，因为其在转导期间对细胞产生最小的毒性作用。
工程化运行
在准备FCX-007的GMP制造以及结束主批次记录(MasterBatch Records，MBR)的生产中，使用具有批准的生产批次记录的来自RDEB供体的活检物执行工程化运行。GMP级INXN-2002 LV载体用于转导。表23提供了来自工程化运行的细胞生长数据。
表23：工程化运行中的细胞生长和细胞产量
来自ER的细胞生长和产量与TR8和TR9中的细胞生长和产量是可比较的，并且比TR10显著更快和更高，这表明不同RDEB供体之间的细胞生长可变性。如表24所示，填充并冷冻保存收获的细胞。
表24：工程化运行中填充的FCX-007药品小瓶
从6x1O-CS收获的细胞总数被认为足以产生两剂量的注射用FCX-007药物产品。
根据提出的FCX-007药品规格测试收获的细胞。表25提供了收获细胞的分析结果。
表25：FCX-007药品工程化运行分析
1测定的详细内容在3.2.S.4.2部分中提供。
2Intrexon内部测定。测定被转移至BioReliance以进行GMP释放测试
3Intrexon内部测定。测定被转移至PCT以进行GMP释放测试
4未对细胞产品材料进行RCL测试，因为该材料未用于进一步研究
实例5-制造过程开发以提高LV-Col7转导效率的描述
当使用INXN-2002载体进行细胞转导时，使用上述过程制造的FCX-007细胞产品具有低水平的基因修饰效率，如低基因拷贝数和C7表达水平所示。为了提高RDEB成纤维细胞的LV-Col7转导效率，采用了两种方法：1)开发新的LV-Col7慢病毒载体(INXN-2004)，其在转导的成纤维细胞中提供更好的载体滴度和改善的稳定转基因(胶原VII)表达，和2)进一步优化成纤维细胞的LV-Col7转导过程。有关新INXN-2004载体开发的详细内容描述于3.2.S.2.3部分中。下面描述了进一步优化LV-Col7转导过程以及细胞扩增过程的研究。
旋转转导(旋转接种)
旋转转导涉及在g力环境下将病毒载体离心到靶细胞上。在文献中已经报道了旋转转导(旋转接种)以增加靶细胞上的逆转录病毒载体转导效率(J Virol Methods.[病毒学方法杂志]1995年8月；54(2-3)：131-43.Centrifugal enhancement ofretroviralmediatedgene transfer[逆转录病毒介导的基因转移的离心增强].BahnsonAB1，Dunigan JT，Baysal BE，Mohney T，Atchison RW，Nimgaonkar MT，Ball ED，BarrangerJA.和Hum Gene Ther[人类基因疗法].1994年1月；5(1)：19-28.Improved methods ofretroviral vector transduction and production for gene therapy[改进的逆转录病毒载体转导和生产方法以用于基因疗法].Kotani H1，Newton PB 3rd，Zhang S，ChiangYL，Otto E，Weaver L，Blaese RM，Anderson WF，McGarrity GJ.)。
培养来自先前TR8的RDEB成纤维细胞。收获指数生长期的细胞并用于该研究。先前的INXN-2002载体批次用于转导。对于旋转转导，将在50μL转导培养基(IMDM+2％FBS)中具有不同MOI的INXN-2002的1x103个细胞添加至96孔组织培养物涂覆的培养板的每个孔中，所述培养板预涂覆了RetroNectin(5μg/cm2)。将含有细胞和INXN-2002载体的培养板在1300g、4℃下离心1.5小时。离心后，将培养板置于37℃培养箱中以使细胞恢复并生长3小时。之后，向每个孔中添加100μl完全培养基(IMDM+10FBS+GSH)。将培养板放回培养箱中进一步培养。上述标准非旋转转导用作对照。转导后，将细胞传代三次，每次细胞传代之间培养3-5天。在最后一次传代时，收获培养物上清液以评价C7蛋白质表达水平，同时收获细胞以分析基因拷贝数/细胞。表26显示了不同转导条件的Col7表达水平。
表26：C7表达水平
表27提供了收获细胞的载体拷贝数/细胞。
表27：载体拷贝数/细胞
INXN-2002，IU滴度：2.36x 106IU/mL(在Intrexon测定)
INXN-2002，IU滴度：2.36x 106IU/mL(在Intrexon测定)
结果显示使用旋转转导方法，Col7产生水平和载体拷贝数/细胞二者有适度增加，尤其是在较低的MOI和测试的INXN-2002载体稀释度下如此。
旋转转导参数的优化
评价旋转转导参数，包括离心时间、速度和温度，目的是进一步提高INXN-2002转导效率。在该研究中使用与上述相同的细胞培养条件。在最初的实验中，检查了离心温度。将含有细胞和INXN-2002载体的96孔板在4℃或25℃(室温)下以1300g离心1.5小时。接下来进行另一个实验，其中含有细胞和INXN-2002载体的96孔板在4℃或25℃(室温)下以1300g的高速或300g的低速离心1小时或2小时，以检查离心速度对INXN-2002转导效率的影响。在两个实验中，将细胞返回37℃培养箱中以在离心后孵育。三小时后，向每个孔中添加100μl完全培养基。将细胞传代三次，然后收获以在培养物上清液中进行Col7表达分析以及在收获的细胞中分析载体拷贝数/细胞。
表28提供了旋转转导温度对Col7表达水平和载体拷贝数/细胞的影响。包括标准非旋转转导作为对照。
此外，与标准非旋转转导相比，使用旋转转导显示了增加的INXN-2002转导，如通过更高的C7蛋白表达和载体拷贝数/细胞所示。旋转转导温度未显示出对整体转导效率的影响。
以下表29提供了离心速度以及温度和时间对INXN-2002转导效率的影响。
表28：旋转转导温度对INXN-2002转导效率的影响
INXN-2002 IU滴度：2.36x 106IU/mL(在Intrexon测定)
表29：旋转转导温度、时间和速度对INXN-2002转导效率的影响
INXN-2002 IU滴度：2.36x 106IU/mL(在Intrexon测定)
结果表明当在室温、1300g下进行旋转转导1小时时INXN-2002转导效率有适度提高，如由C7蛋白表达和载体拷贝数所示。提高的显著性尚不清楚，并且选择最初开发的旋转转导参数(在4℃下以1300g离心1.5小时)用于将来的研究用途。
超转导进一步提高INXN-2002转导效率
如上所述，在INXN-2002转导的早期发展中评价超转导(第二转导)。再次结合旋转转导评价超转导以进一步增加成纤维细胞的INXN-2002转导效率。与先前的方法不同，在当前研究中，在初始旋转转导后的一次传代中对细胞进行超转导。预期包含一个细胞传代允许细胞从初始旋转转导中恢复并变得更容易接受第二超转导。
类似地，收获来自指数生长期的先前TR8的RDEB成纤维细胞并用于该研究。将上述优化的旋转转导方法，即在4℃下以1300g离心1.5小时，用于INXN-2002转导。转导的细胞在初始旋转转导后72-96小时传代一次。在第二次传代中培养72-96小时后，收获细胞并使用相同的旋转转导条件重新转导。在超旋转转导后，将细胞传代另外的三次，然后收获以在培养物上清液中进行Col7表达分析以及在收获的细胞中分析载体拷贝数/细胞。INXN-2002载体用于该研究。表30提供了超旋转转导对INXN-2002转导效率的影响。
表30：超旋转转导的影响
INXN-2002 IU滴度：2.36x 106IU/mL(在Intrexon测定)
超旋转转导导致RDEB成纤维细胞的INXN-2002转导效率的显著增加。C7蛋白表达增加约1.7倍，且载体拷贝数/细胞增加约3倍。
数据表明，通过另外的转导，Col7表达增加40％，且拷贝数/细胞增加60％。由于这种增加，将超感染添加到生产方案中。
使用INXN-2004载体进行转导
在开发改进的转导方法的同时，还开发了基于不同的慢病毒载体骨架(即pFUGW)的新LV-Col7载体(称为“INXN-2004”)。
INXN-2004单次旋转转导
收获来自指数生长期的先前TR8的RDEB成纤维细胞并用于该研究。在第一项研究中，使用中试批次的INXN-2004载体进行如上所述的单轮旋转转导。标准无旋转转导作为对照包含在研究中。将细胞传代三次，然后收获以在培养物上清液中进行Col7表达分析以及在收获的细胞中分析载体拷贝数/细胞。表31提供了使用INXN-2004载体转导的Col7表达水平和载体拷贝数/细胞。
表31：使用INXN-2004转导的C7蛋白质表达和载体拷贝数/细胞
INXN-2004 IU滴度：2.36x 106IU/mL(在Intrexon测定)
相对于INXN-2002载体，使用INXN-2004结合旋转转导方法实现了转导效率的显著提高。另外，即使在无旋转转导条件下，INXN-2004载体在转导RDEB成纤维细胞中显著更有活性，如高约10倍的C7蛋白表达和载体拷贝数/细胞所示。结果支持使用pFUGW基础构建新的INXN-2004载体。
与上述报道一致，旋转转导加剧了在较高MOI条件下INXN-2004载体对成纤维细胞的毒性作用，如MOI17下较低的C7表达水平和载体拷贝数所示。这不会影响FCX-007制造，因为使用较低的MOI被证明是有效的。
INXN-2004超旋转转导
在第二项研究中，超旋转转导(如上所述)用于INXN-2004转导。转导规模从96孔板增加至T-25烧瓶。转导参数保持不变，包括相同的RetroNectinTM涂层密度5μg/cm2，以及在转导时的相同细胞密度1x104个细胞/cm2。T-25烧瓶中的转导体积为4.2mL。为了转导，将含有细胞和病毒的T-25烧瓶在4℃下以1300g离心1.5小时。将细胞放回37℃培养箱中并培养三小时。初始孵育后，将4.2mL完全培养基添加至烧瓶中进一步培养。将细胞传代三次，然后收获以在培养物上清液中进行Col7表达分析以及在收获的细胞中分析载体拷贝数/细胞。表32提供了超旋转转导对INXN-2004载体转导效率的影响。使用中试批次的INXN-2004载体进行研究。
表32：INXN-2004载体的超旋转转导的影响
INXN-2004 IU滴度：2.36x 106IU/mL(在Intrexon测定)
正如先前的INXN-2002载体所观察到的，尽管在低MOI转导条件下Col7蛋白表达水平有相对适度的增加，但超旋转转导导致转导细胞中载体拷贝数/细胞显著增加约5倍。
转导开发与优化概述
使用先前的INXN-2002和新的INXN-2004载体，在持续的过程开发中实现了RDEB成纤维细胞的LV-Col7转导效率的显著提高。这些提高是为了能够制造具有生物效力的FCX-007细胞产品。基于制造过程开发研究结果，选择以下转导程序用于使用INXN-2004载体进行转导来制造FCX-007。
用RetroNectin以5μg/cm2预涂覆培养表面。经组织培养物处理的烧瓶用于RetroNectinTM涂层。
在转导的同时添加细胞和INXN-2004载体。细胞接种密度为约1x 104个细胞/cm2。
将细胞和INXN-2004载体转导混合物在转导容器中在4℃下以1300g离心1.5小时。
在转导后在含有2％FBS的转导培养基中在37℃下孵育细胞1.5-2.0小时，然后用含有10％FBS的完全培养基更换或培养细胞。
使用低转导培养基体积(对于96孔板为50μL/孔，或0.35mL/cm2)。
在初始转导后一次传代后对细胞进行超转导。
实例6-由INXN-2002转导的RDEB遗传修饰的人真皮成纤维细胞的分析
对来自INXN-2002慢病毒载体的RDEB遗传修饰的人真皮成纤维细胞(GM-HDF)进行了分析，目的是：
通过皮内注射评价由RDEB角质形成细胞组成的已建立的复合人皮肤移植物(在猪真皮上制备)中COL7表达的定位。
评估用RDEB GM-HDF治疗的SCID小鼠上移植的复合RDEB人皮肤(在猪真皮上制备)中的潜在致癌性/致瘤性。
通过在复合移植物培养物的网状一侧接种成纤维细胞来评价GM-HDF(来源于INXN-2002)功能的初步尝试是不成功的，这可能是由于在第19天GM-HDF没有充分迁移至失活的猪真皮中或者没有足够的时间充分扩散和沉积rC7。使用可替代的方法通过在研究中在六只备用动物中直接皮内注射现有移植物来评价功能。在猪真皮上制备的RDEB复合移植物似乎比预期的更稳健，使得可以直接注射至已建立的RDEB皮肤移植物中。这种方法更接近地模拟疾病和临床给药途径。
本研究报告提供了将GM-HDF皮内注射至已建立的RDEB移植物的初步评价的数据。计划进行另外的研究以实现体内药理学的长期目标。
A.研究材料
A.1测试制品
制备测试制品并在装运前测试药品释放规格。在每个预定的治疗目的前一天制备用于皮肤移植物注射的测试制品。将GM-HDF解冻，洗涤，重悬于DMEM中，并对释放规格进行评价。GM-HDF运输过夜送达，并在48小时内给予。通过相同的方法从与GM-HDF相同的患者中分离和扩增未校正的RDEB HDF(模拟物转导的)。
冷冻运输用于制备复合皮肤移植物的测试制品和细胞。将用于皮肤移植物制备的细胞解冻并培养以进行测试。
批号TR8(非转导对照)用作RDEB-HDF阴性对照。批号TR8A组(GM-HDF-LV-COL7)用作GM-HDF测试制品。
在装运之前在制造设施上进行测试制品分析。其余测试制品将在-70℃下储存1年。测试制品将被储存在杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中。
A.2.其他化学品和材料
下文表33中提供了其他材料的清单。
表33：其他研究材料
描述 来源
正常的猪皮肤 猪尸体
RDEB角质形成细胞 人皮肤活检物
RDEB成纤维细胞 人皮肤活检物
正常角质形成细胞 人皮肤活检物
正常成纤维细胞 人皮肤活检物
第1组(阴性对照)细胞：将来自训练运行8的供体的未转导的RDEB细胞解冻，并在转染前传代一次。将细胞传代两天后，收集细胞，并使用基于脂质的转染剂Transfex(ATCC)，用COL7质粒VVN 4317513在50ml圆锥管中的低血清生长(ATCC PCS-201-030和PCS-201-041)培养基中转染1.2x 106个细胞。与复合的Transfex，DNA和Optimem(LifeTech)孵育10分钟后，将1x 106个转染的细胞转移至T150烧瓶中，并将2x 105个细胞置于T25中并在37℃、5％CO2培养箱中放置16小时，此时去除培养基并更换为完全生长培养基(IMDM(Sigma)，920mg/L的L-谷胱甘肽还原的(Sigma)10％热失活的FBS(Atlantic Biologicals)和1XGlutamax(LifeTech))。然后将细胞放回37℃5％CO2培养箱中直至装运时。在装运时，将所有的细胞瓶装满，使得不管烧瓶的方向如何，烧瓶的所有部分都与培养基接触。
B.研究设计
B.1.随机化
由于RDEB人皮肤移植物的高失败率，这些动物组中的小鼠不是随机的。
B.2.研究的物种和数量的确定
NOD.CB.17-PRKDC scid/scid小鼠是用于概念验证临床前功效/毒理学研究的标准物种，并且是使用人异种移植物模型进行此类评价的啮齿动物物种的选择。本研究被设计为最小化研究中的动物数量，这些动物将提供足够的数据来评价测试制品。
B.3.给药途径
成纤维细胞将通过皮内注射正常皮肤移植物来给予。复合移植物将在移植前通过接种细胞来给予。
B.4.剂量给药
皮内细胞注射慢病毒转导(COL7A1校正)RDEB GM-HDF(使用INXN-2002)和阴性对照(载体或RDEB-HDF)将使用30号针头进行。通过首先刺穿皮肤，然后尽可能表面地向上朝着表面引导针进行注射。
根据体外研究中概述的方案，在移植前复合移植物将通过接种细胞来给予，区别在于移植前复合培养系统不会被提升到空气-流体界面。
B.4.1.注射用成纤维细胞(复合移植物)的制备
在注射前一周将成纤维细胞从液氮储存器中取出，在37℃水浴中解冻直至留下小的冰晶，然后消毒并转移至BSC。将小瓶重悬于10ml的PBS洗涤体积中并以1000RPM旋转10分钟。弃去上清液，将细胞在DMEM+10％FBS 1x抗生素培养基中洗涤，并以1000RPM再旋转10分钟。将沉淀物重悬于适当的体积中并接种于15cm TC培养皿上。每隔一天更换培养基并以80％汇合率传代，直到移植物可以注射为止。在注射当天，将成纤维细胞用胰蛋白酶消化，在DMEM+10％FBS培养基中中和并以10000RPM旋转10分钟，将细胞沉淀物重悬并取细胞的等分试样，用台盼蓝染色计数细胞以测定活力。将细胞重悬，使得注射器以50uL体积吸入1.0x106个细胞。连接30号针头并在4℃下放置直至小鼠可以tobe注射为止。
表34：复合皮肤移植物(成纤维细胞接种)
表35：复合皮肤移植物(成纤维细胞皮内注射)
表36：用于评价ID注射的异种移植物的研究组
C.皮肤移植物
C.1RDEB人体皮肤移植物
C.1.1成纤维细胞
通过慢病毒基因转移产生的基因工程化人成纤维细胞(RDEB GM-HDF)(包括INXN-2002慢病毒载体)以及作为对照的正常成纤维细胞和未校正的RDEB成纤维细胞是用于最初输注真皮皮肤的细胞类型。将细胞培养在失活的真皮上，以形成约2平方厘米的皮肤模拟物。再生皮肤复合物由在成纤维细胞输注的人失活的真皮上培养的人角质形成细胞组成。
原代角质形成细胞的分离和培养
从新生儿包皮分离野生型角质形成细胞，而从患者皮肤样品分离出原代RDEB角质形成细胞。后者以6mm穿孔活检物的方式获得，浸没在15mL角质形成细胞生长培养基50/50V中，在湿冰上的15mL离心管中运输。运输的样品中不存在气泡。培养基50/50V含有补充有HKGS(0.2％牛垂体提取物[BPE]、牛胰岛素[5mg/mL]、氢化可的松[0.18mg/mL]、牛转铁蛋白[5mg/mL]、人表皮生长因子[0.2ng/mL])的50％培养基154(Invitrogen)以及补充有重组人EGF1-53BPE的50％角质形成细胞SFM(KSFM；Invitrogen)。添加抗生素AV100(阿米卡星/万古霉素)以减少细菌污染。
通过在4℃下用25U/mL分散酶(Becton Dickinson)处理过夜来分离真皮和表皮。然后将表皮从真皮上剥离并置于具有5mL TrypLE 10x的15mL离心管中。将表皮的“皮”在37℃水浴中孵育15-30min，每5分钟轻轻搅拌。用等体积DTI(确定的胰蛋白酶抑制剂)或DMEM+10％FBS中和TrypLE。使细胞在1200rpm下沉淀并在12mL 50/50V中接种于T75PurecoatTM胶原1模拟烧瓶上。如果来自制造商的PureCoatTM烧瓶不可用，则可以在37℃下每10cm塑料盘使用1ml胶原1涂层溶液持续15分钟。胶原1涂层是Vitrogen 100胶原(1ml)、HEPES(2ml)、BSA(100μL的100mg/ml)和1x HBSS(100ml)的0.2μM滤液。在细胞接种之前吸出过量的胶原涂层。旋转烧瓶以确保细胞均匀分布，并在进行任何操作或观察之前将其放置在37℃5％CO2加湿培养箱中至少一晚。使细胞适应组织培养条件3天。适应后，每2天更换一次培养基或根据需要更换培养基。当角质形成细胞约70％汇合时，它们被传代至正常组织培养塑料上。
在50/50V培养基中，角质形成细胞持续5代生长良好。在前四代中使用角质形成细胞。
猪失活真皮的制备
获得多片薄皮片的猪皮。这可以以与失活的人真皮(如上所述)相类似的方式通过皮刀收获的猪皮来制备。在含有1x青霉素/链霉素/两性霉素/庆大霉素的无菌PBS中洗涤猪真皮3次，并在在37℃下含有1MNaCl和2x抗生素的PBS中孵育72小时。分离表皮并丢弃，用含有抗生素的1XPBS洗涤3次，以去除溶液中过量的盐和庆大霉素。
通过在50/50V或KGM中培养猪真皮片持续4天来确认无菌。真皮可以在4℃下在抗生素溶液中储存，每周更换一次PBS。真皮在使用前不应存放超过几个月。
器官型培养接种成纤维细胞
将失活的真皮切成2平方厘米的碎片。将真皮基底膜一侧朝下放入6孔培养板中，并使真皮稍微干燥。
将成纤维细胞接种至每个孔中，以1200rpm离心5分钟并以5％加湿的CO2恢复至37℃，持续3-4天，每天更换培养基。在此期间，成纤维细胞附着在真皮上并开始迁移至组织中。
接种角质形成细胞
在成纤维细胞迁移通过真皮后，小心地分离真皮并转移至环形皮肤支持物(ADS)。添加一层薄薄的Matrigel以密封并将真皮固定在装置中。将5mL KGM添加至ADS的基质区。KGM是DMEM：哈姆氏F12的3∶1混合物，该混合物补充有FBS(10％)、腺嘌呤(1.8x 10-4M)、氢化可的松(0.4μg/mL)、胰岛素(5μg/mL)、霍乱毒素(1x 10-10M)、EGF(10ng/mL)、转铁蛋白(5μg/mL)和三碘-L-甲状腺原氨酸(1.36ng/mL)。胰蛋白酶消化，计数和接种角质形成细胞每个ADS的总体积为100μL的KGM中。将ADS组件返回培养箱中。在至少24hr内勿扰乱ADS。真皮顶部的角质形成细胞必须保持在空气液体界面处。每天更换下室中的KGM。器官型培养将持续1-2周。
移植器官型培养
器官型培养物将在7-10天后可以移植。如上所述对正常人皮肤移植物进行移植。7-10天后将去除绷带和缝合线，并将动物用新的绷带再包扎一周。此后移植物将暴露在空气中至成熟。
收获移植物并进行切片
人道地处死小鼠并小心地收获移植物。将移植物分成两半并切下另外的1mm切片。将切片修剪为1平方毫米并送去进行免疫电子显微术(IEM)。将在干冰上的OCT中剩下的一半冷冻，同时标注中央边缘。切片将从这个边缘开始。切下一半以进行即时分析，剩下的一半将被储存以供以后分析。从中心边缘开始切下十个8μm切片并依次标记。丢弃接下来的四十个切片。重复直至达到移植结束。风干并用冰冷的50/50丙酮/甲醇固定。
注射已建立的RDEB复合移植物
在建立的移植物之后，将成纤维细胞皮内注射至皮肤中。注射量不超过50μL的体积。
对预先用如本文所述的复合移植物移植的小鼠进行注射：失活的猪真皮通过与可变剂量的RDEB GM-HDF一起离心进行接种并在组织培养物中生长1周。随后，将真皮翻转并接种100万个RDEB角质形成细胞并使其在培养物中再生长一周。在如上所述的组织培养的这两周时间后，将移植物置于SCID小鼠上并适当缝合，包扎13天。此时去除敷料，并且在移植后38-41天，向移植物注射50uL体积的成纤维细胞。
D.实验程序
D.1.COL7的定位
免疫荧光显微术用于评价VII型胶原的表达。采用抗人C7特异性抗体NP185进行皮肤培养物的免疫荧光(IF)分析。
D.1.2.NP 185抗体免疫荧光显微术的方法
在进行CO2安乐死后立即从SCID小鼠收获复合移植物。将移植物分成两半并置于OCT块中。在-21℃下将冷冻的组织块在Leica CM1850低温恒温器上以8μM的厚度切片，并在冷的50％甲醇/50％丙酮中固定。将载玻片再水合并在1XPBS中洗涤三次，在室温下在一级抗体(NPl8510ug/ml；小鼠抗人胶原VII)中孵育1小时。洗涤载玻片并在Alexa 488标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1∶400，1小时，室温，生命技术公司(life technologies))和核Hoescht33342复染剂(生命技术公司)中孵育。将样品在1xPBS中洗涤三次，在成像前使用封片剂(fluoromount)固定。在Zeiss Observer.Z1荧光显微镜上以20X放大倍数拍摄图像。
在第19天收获的移植物作为阳性和阴性对照组被包括在内。在第38天、第39天或第41天注射实验组，并在第48天、第49天或第51天收获(表37)。
表37：移植、注射和收获日
E.数据分析
制作IF图像并以盲评方式提供给PI。在揭盲之前，通过PI对数据进行分析和解释。
F.结果
来自收获的移植组织的IF分析的代表性结果显示在图26中。
在除阴性对照之外的所有NP185染色条件下对在DEJ处的C7染色进行可视化(图像“RDEB未校正”-参见DEJ处的箭头以用于阴性基线比较)。关于阳性对照，在正常角质形成细胞/成纤维细胞接种的移植物的DEJ中观察到强烈的DEJ染色。在可代表先前接种的已校正的成纤维细胞的小切片中，在注射未校正的成纤维细胞的第1组中观察到小焦点的阳性染色(图像1b)，但两只小鼠中未校正的成纤维细胞注射的移植物的其余部分显现不那么强烈(如图像1a所示)。在注射校正的成纤维细胞(4a-d)的四种小鼠移植物的代表性图像中观察到DEJ处的C7染色，甚至在注射后仅10天也观察到了DEJ处的C7染色。
在研究过程中，在任何移植物中均未观察到肿瘤。
G.结论
以近似提出的临床剂量皮内注射的RDEB GM-HDF TR8产生了C7，所述C7体内位于失活的猪真皮上的RDEB角质形成细胞的复合移植物中的DEJ。此外，在移植前在复合移植物中接种GM-HDF的结果表明GM-HDF可以坚持表达位于DEJ的C7。该模型可用于表征定位、耐久性、持久性和表型校正，其近似于GM-HDF预测临床剂量的效果。
这些研究的结果显示了皮内注射自体GM-HDF为患者中RDEB的有效治疗。
实例7-非GLP体外GM-HDF细胞表征和概念验证评估
本研究的目标如下：(a)表征使用预期的大规模GMP生产方法生产的GM-HDF，以用于治疗RDEB患者；(b)评估整合的LV的拷贝数和C7的表达水平；以及(c)确认GM-HDF表达的C7的功能
A.研究材料
A.1.测试制品
表征来自训练运行8、9和10的GM-HDF以及工程化运行(如上所述)。
表38：TR8、TR9、TR10和ER1的一般生产信息
1对照组细胞进行模拟物转导
2对于TR10和ER1仅生成一个LV-COL7转导组
B.用于qPCR分析的引物和探针序列
表39：用于qPCR分析的引物和探针序列
1引物/探针从IDT购买。
2LV特异性引物/探针序列来源于Greenberg等人(2006)。
C.实验程序
C.1 LV-COL7拷贝数
根据制造商的说明，使用Qiagen的AllPrep试剂盒进行核酸分离。将从3x105个GM-HDF细胞分离的gDNA归一化为12.5ng/μl。在20μL测定中使用8μl归一化gDNA(10μL基因表达、1.8μL无核酸酶水、0.06μL的100μM正向引物、0.06μL的100μM反向引物、0.04μL的100μM 探针)。还在上述20μL测定中测定了连续稀释的线性化C7慢病毒穿梭载体(le6个拷贝/反应至5个拷贝/反应)和4μL的人gDNA(1.5e4个细胞/反应)的标准曲线。使用的测定法是PR13843。还在20μL测定(10μL 基因表达、1.0L无核酸酶水、1μL的20X ACTB引物/探针组)中进行了8μL的商业人gDNA(Clontech)的另外的标准曲线(1.5e4个细胞/反应至2e2个细胞/反应)。所有样品均使用以下循环参数在ABI7900上运行：在50℃下2分钟，在95℃下10分钟，以及在95℃下15秒和在60℃下1分钟的40个循环。
C.2 COL7A1 RT-qPCR
解冻小瓶的GM-HDF细胞，并使用Qiagen的AllPrepTM试剂盒分离gDNA和RNA。根据制造商的说明书，使用Quanta的qScriptTM将RNA(800μg)用于产生cDNA。然后使用如上所述的测定PR13653来测试cDNA和gDNA。针对管家基因ACTB(dCT)将数据归一化，然后与对照数据(ddCT)比较。使用公式2^-(ddCT)将得到的ddCT转换为倍数变化。
C.3 C7免疫荧光
对于免疫荧光分析，使1.2x 104个GM-HDF附接至24孔板中的PDL/Lamin涂覆的盖玻片过夜，然后固定并用50％/50％的甲醇/丙酮混合物透性化处理。将盖玻片用1X PBS洗涤3次，然后在室温下用PBS中的10％山羊血清封闭30分钟。在用PBS洗涤另外的三次后，将盖玻片与1％山羊血清/PBS中的1.25μg/mLfNC1抗体一起孵育，然后用PBS洗涤另外的3次，并在室温下与5μg/mLAlexa 555缀合的山羊抗兔IgG在1％山羊血清/PBS中孵育1小时。在安装到载玻片上之前，用活细胞染色探针试剂对盖玻片进行染色。在ZeissAxioObserver显微镜上以20X放大倍数使用290ms的曝光时间获得图像。将NHDF或GM-HDF固定，透性化处理并用细胞染色剂染色以细胞核可视化(蓝色)或用fNC1抗体和Alexa 555缀合的山羊抗兔IgG(5μg/mL)染色以使C7表达可视化(红色)。以20X放大倍数使用290ms的曝光时间获得图像。
C.4 C7蛋白质ELISA
简而言之，将纯化的His-NC1片段(9.8-625ng/mL)或收集的含有C7蛋白的上清液(来自培养物中三至五天的GM-HDF)的标准曲线在4℃下固定在Nunc 96孔板上过夜。在相同的样品基质(20％RDEB成纤维细胞条件培养基)中测试标准品和样品。用PBST洗涤涂覆的孔并用3％BSA/PBS在37℃下封闭1小时。使用多克隆抗NC1 Ab(fNC1，0.5μg/mL)完成检测，然后与二级抗体驴抗兔IgG HRP(Jackson ImmunoResearch，0.08μg/mL)一起孵育。经由采用TMB底物溶液进行比色显色来检测结合的抗体。淬灭反应后，在Plus 384(Molecular Devices)上测量450nm处的吸光度。
C.5 C7三聚体的免疫沉淀
首先，用1X PBS-T洗涤磁性蛋白G珠粒。在去除上清液之前以及在所有后续步骤中，珠子与磁体结合至少2分钟。洗涤后，用5μg的抗C7fNC1涂覆珠粒并旋转孵育(Glas-Col，设定为在室温下30-14rpm)10分钟。珠粒与磁体结合以去除上清液并用Ab结合/洗涤缓冲液洗涤。从三至五天的培养物中的GM-HDF收集上清液。将含有C7的上清液添加至珠粒/C7上清液混合物中，并在4℃下旋转孵育(设定为30-14rpm)过夜。第二天，珠粒与磁体结合并用洗涤缓冲液洗涤三次。在20μL洗脱缓冲液(50mM甘氨酸，pH 2.8和10μl的4X加样染料)中洗脱靶抗原。将样品在70℃下变性10分钟。然后将12μl的总计30μl(剩余样品在4℃下储存)加载(每孔)至12孔3％-8％Tris Acetate凝胶中并在150伏下运行4小时。从盒中取出凝胶并在含有10％甲醇的转移缓冲液中浸泡20分钟。在15伏，4℃下将凝胶过夜湿转移至硝酸纤维素膜。第二天，在冰上使电压增加到50伏，持续30分钟。转移完成后，在室温下使用TBS-T中的5％牛奶在搅拌下(Labnet ProBlotTM Rocker 25，设定为60rpm)封闭印迹2小时，并在室温下与市售的抗C7 LH7.2(0.25μg/mL)一起在搅拌下孵育2小时。在搅拌下用1X TBS-T(各5min)洗涤印迹3次，然后在室温下用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(0.1μg/mL)在搅拌下探测1小时。使用Lumiglo UltraTM化学发光底物和Fujifilm LAS 3000成像系统使印迹显影。
C.6 Lam332结合
在4℃下将96孔MaxiSorpTM培养板用100mM碳酸盐缓冲液中的1μgLam332或BSA(pH9.3)涂覆过夜。将培养板用PBS-T冲洗五次，然后在室温下用PBS-T中的1％BSA封闭1小时。用PBS-T冲洗涂覆的孔5次，并在4℃下与来自转导细胞的上清液孵育过夜。用PBS-T再洗涤三次后，在室温下将结合的C7与fNC1抗体(0.5μg/mL，PBS-T)孵育3小时，然后在室温下与HRP缀合的驴抗兔IgG(在PBS-T中的最终浓度为0.8μg/mL)孵育2hr。使用TMB经由比色反应检测C7结合的抗体，并通过在 Plus 384读板器(Molecular Devices)上读取450nm处产物的吸光度进行测量。所有孵育均在定轨摇床(GeneMate)上以设定为2的速度进行。
C.7.细胞迁移测定
来自CellBiolabs公司的CytoSelectTM 24孔伤口愈合测定试剂盒用于细胞迁移测定。在伤口插入物的存在下将GM-HDF(0.8x 105)接种在24孔板中并培养48小时。然后去除伤口插入物，并将细胞在含有15μg/mL I型胶原(COL1)的低(1％)血清培养基中进一步培养8小时。在使用成像血细胞计数系统(Cyntellect)去除伤口插入物后0、2、4、6和8小时获得伤口的明场图像。使用ImageJ(National Institutes of Health)测量每个时间点的伤口表面积。数据报告为覆盖伤口面积的迁移百分比(迁移％)。
C.7.数据分析
使用ABI 7900仪器利用SDS2.3软件进行qPCR。在SDS 2.4软件中查看和导出实验数据。ImagJ软件用于定量上述测定的细胞迁移百分比。ImageJ是由国家卫生研究院开发的针对科学多维图像设计的开源图像处理程序。
D.结果
D.1.C7表达的表征
D.1.1.LV-COL7拷贝数和转录水平
针对病毒穿梭载体的各个区域设计测定。在测试的Taqman测定中，靶向C7编码序列的设计显示出不可接受的背景扩增水平。选择的测定PR13843靶向如Greenberg等人(2006)所述的在LV骨架的5’端发现的序列。
获得GM-HDF训练运行细胞，用dPBS洗涤，并重悬于RLT缓冲液中。Qiagen的AllPrep试剂盒用于从每次训练运行的每组的药品小瓶中分离DNA(针对拷贝数)和RNA(针对mRNA转录水平)。然后如上分别在C.1和C.2部分所述对分离的DNA和RNA进行qPCR和RT-qPCR测定。表40示出了来自训练运行8、9和10(TR8、TR9和TR10)以及工程化运行(ER1)的拷贝数/细胞。数据表明，整合至每个细胞中的转基因拷贝数可以通过在生产过程中给予细胞的病毒剂量来调节，并且小于1个拷贝/细胞。类似地，图40中显示的LV-COL7转录物水平也与病毒剂量和拷贝数相关，其中与对照细胞相比，来自训练运行的A组和B组表达更高水平(3至5LOG)的慢病毒C7序列。
表40：GM-HDF生产运行细胞中的LV-COL7拷贝数
1对照组进行模拟物转导，并且未暴露于LV-COL7
2BLQ：低于定量限
3对于TR10和ER1仅生成单个转导组
D.1.2.C7蛋白表达
间接免疫荧光(IF)用于使用对C7特异性的抗体来检测GM-HDF细胞的C7蛋白表达。正常人真皮成纤维细胞(NHDF)用作该测定的阳性对照，并且训练运行的对照组用作阴性对照。在以下图28所示的代表性图像中，一小部分(＜10％)的INXN-2002和LV-HA-COL7转导的RDEB成纤维细胞显示C7染色，这与整合LV的拷贝数一致(表18)。来自C7阳性的GM-HDF的信号比来自NHDF的信号更亮，这表明GM-HDF产生更多量的C7。
通过Intrexon开发直接ELISA以测量GM-HDF分泌至细胞培养基中的C7。如上C.4部分所述的测定使用NCl区域特异性的多克隆抗体。来自三次训练运行的GM-HDF的ELISA测定结果显示C7表达是LV剂量依赖性的，其中表达水平的范围为45-90ng/mL细胞上清液(图29)。
D.2.GM-HDF表达的C7的功能评估9.2.1。C7三聚体的形成
C7三聚体的形成在锚定原纤维的组装中是重要的。为了验证GM-HDF表达的C7能够形成锚定原纤维，我们使用免疫沉淀(IP)采用用于选择性捕获的抗C7特异性抗体(fNC1)评估表达的C7是否形成三聚体，然后通过SDS-PAGE/免疫印迹检测来自培养上清液的C7浓度。
通过测试商业C7抗体和fNC1 C7抗体来确定免疫沉淀的最佳条件。与用市售抗体涂覆相比，用fNCl涂覆蛋白G珠粒导致更高水平的C7结合。在该测定中使用的对照包括无抗体对照以排除C7与珠粒的非特异性结合，以及在有和没有掺入条件培养基中的纯化C7的情况下孵育的抗体涂覆的珠粒，作为用于从GM-HDF培养上清液分离的C7的特异性的对照。
TR8以及TR10和ER1的免疫沉淀结果表明，GM-HDF产生的C7主要是三聚体(分别参见图10和图11)。还观察到一些显示免疫反应性的较低分子量物质，其包括二聚体和290kDa单体形式。通过抗C7抗体(左图，图11B)以及对于并入C7蛋白中的HA标记特异性的抗体，在低水平的免疫印迹上检测到来自TR9的GM-HDF的C7的IP(右图，图11B)。
D.2.2.通过GM-HDF表达的C7与Lam332结合
已显示C7结合固定的细胞外基质(ECM)组分，其包括纤连蛋白、层粘连蛋白332(Lam332)、COL1和COL4(Chen，等人，2002a)。C7与Lam332之间的相互作用通过C7的NH2-末端NC1结构域发生，并且依赖于Lam332和C7NC1二者的天然构象(Rousselle等人，1997)。C7与Lam332之间的关联对于在真皮表皮交界处建立正确的Lam332结构非常重要。这种组织对于与细胞外配体和细胞表面受体的相互作用以及细胞信号传导是重要的(Waterman等人，2007)。Intrexon使用抗C7NC1结构域的抗体开发ELISA以检测C7与纯化的Lam332的结合。尽管已经在文献(Chen，等人，2002a)中描述了C7/Lam332结合ELISA，但据我们所知，它从未用于测试转导细胞的上清液中存在的C7。在图12中的结果显示来自训练和工程化运行的GM-HDF表达的C7与Lam332的剂量依赖性结合。D.2.3.细胞迁移测定
先前的研究已表明RDEB成纤维细胞和角质形成细胞相对于其正常对应物显示出运动性增加，并且可通过C7的表达恢复正常的运动性(Chen，等人，2000；Chen，等人，2002b；Cogan，等人2014；Baldeschi等人，2003)。这些研究中的大多数采用胶体金盐迁移测定来测量成纤维细胞和角质形成细胞的迁移，或采用伤口愈合测定来测量角质形成细胞的迁移。此处，我们使用CytoSelectTM 24孔伤口愈合测定试剂盒(Cell Biolabs公司)来测量NHDF和GM-HDF的运动性。
C7的免疫荧光染色显示，只有一小部分(＜10％)的转导细胞表达高水平的蛋白质，这引发了一个问题，即少量产生C7的细胞是否会对细胞迁移产生全局影响。为了确定培养基中C7的存在是否足以逆转RDEB高运动性表型，对来自三次训练运行的GM-HDF进行伤口愈合测定，其中NHDF作为阳性对照并且模拟物转导的对照(RDEB)组作为阴性对照。
来自TR8、TR10和ER1的对照成纤维细胞显示出可被C7的表达逆转的高运动性表型(图30)。然而，来自TR9的对照成纤维细胞没有显示出显著的高运动性表型，这使得难以在该测定中研究HA标记的C7的功能。
结论
GM-HDF中每个细胞的整合转基因拷贝数依赖于在0.009至0.03个转基因拷贝/细胞范围内的病毒剂量。
通过qRT-PCR、免疫荧光染色和ELISA确认来自GM-HDF细胞的剂量依赖性C7表达。
通过对于TR8、TR10和ER1的免疫沉淀/SDS-PAGE/免疫印迹分析来证实GM-HDF细胞表达的C7的结构主要是三聚体。TR9显示出最小的三聚体形成。
通过在体外结合测定中与层粘连蛋白332结合并通过在体外迁移测定中校正对照RDEB细胞的高运动性表型，证明由TR8GM-HDF细胞产生的C7具有功能。TR9显示出与层粘连蛋白332结合，然而，迁移测定结果是不确定的。用LV-HA-COL7转导产生的TR9HA-GM-HDF显示低水平的三聚体，与Lam332的结合较少以及缺乏明确的高运动性校正。
由于缺乏对TR9HA-GM-HDF表达的HA-C7的体外功能性的确认，选择TR8细胞用于体外和体内杂交药理学/毒理学评价。这消除了评估正常人皮肤或用失活的人皮肤制备的RDEB复合移植物中的表达、定位和持久性的能力。最终，用失活的猪真皮制备的复合移植物用于这些研究。在该方法中，使用人特异性抗C7抗体的免疫染色来区分rC7形式的天然C7。
实例8-药物产品
FCX-007药物产品由每个患者自身活的自体成纤维细胞的无菌悬浮液组成，所述自体成纤维细胞使用INXN-2004 LV-COL7进行基因修饰以编码人野生型COL7A1基因，所述无菌悬浮液在不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中配制。
制剂开发
FCX-007制剂和细胞剂量的开发基于Fibrocell在azficel-T的制造经验；azficel-T是一种注射用活的自体成纤维细胞产物。在DMEM中已成功配制无粘度问题的成纤维细胞，细胞浓度范围为0.5-3.0x 107个细胞/mL(azficel-T BLA#125348)。数据表明当细胞浓度达到5.8x 107个细胞/mL时，粘度成为产品注射的一个问题。因此，选择细胞浓度为1.0-3.0x 107个细胞/mL的DMEM作为FCX-007DP的制剂。
过量
将最多十个FCX-007 DP小瓶作为用于治疗注射的一个剂量运输至诊所。在给药时，将DP小瓶轻轻倒置三次，然后从每个小瓶中无菌地抽取1mL到具有21号针头的无菌1mL注射器中。然后用30号针头替换21号针头进行皮内给药。对剩余的9个产品小瓶重复该过程。
将FCX-007DP小瓶用1.2mL成纤维细胞悬浮液填充为可回收体积为1.0mL的2.0mL容量的小瓶。0.2mL过量旨在确保在诊所中给药时可从小瓶中获得1.0mL。
a.物理化学和生物学性质
i.物理化学性质
FCX-007DP作为基因修饰的自体成纤维细胞悬浮液提供于不含酚红的DMEM中，其中在2mL冷冻小瓶中填充1.2mL。通过测定证明细胞是活的培养物。表41示出了FCX-007DP的物理化学性质。
表41：FCX-007DP的物理化学性质
物理化学性质 值
细胞计数 1.0-3.0x 10<sup>7</sup>细胞
细胞活力 ≥70％
生物学性质
FCX-007是被遗传修饰为表达人胶原7蛋白(C7)的无菌自体成纤维细胞产物。INXN-2004载体拷贝数/细胞和C7蛋白的表达是FCX-007DP的独特生物学性质。FCX-007DP是活细胞悬浮液产品，其是通过在PBS和DMEM缓冲液中洗涤解冻的FCX-007DS细胞由FCX-007DS产生的。在释放以制造FCX-007DP之前，在FCX-007DS上分析INXN-2004载体拷贝数/细胞和C7蛋白质表达。表42示出了FCX-007DP的生物学性质。
表42：FCX-007DP的生物学性质
批配方
为了制备FCX-007药物产品，将FCX-007药品小瓶从液氮冷冻储存器的气相中移出，解冻并合并在ISO 5BSC内。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，然后用不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)洗涤，然后悬浮于不含酚红的DMEM中至目标浓度1.0-3.0x 107个细胞/mL。然后将配制的细胞以1.2mL/小瓶装入2mL冷冻小瓶中。针对每次注射治疗而制备的药物产品材料被定义为一批。建议的治疗批大小为十(10)个含有1.2mL的细胞悬浮液的2mL小瓶。
表43提供了药物产品制造过程中使用的所有组分的清单。
表43：FCX-007药物产品批的组成和数量
1小瓶含有1.2mL的FCX-007细胞悬浮液
2PBS洗涤残留物用不含酚红的DMEM稀释，使得痕量的PBS存在但不可量化
制造过程和过程控制的描述
b.制造工艺流程图
当从液氮储存器中取出FCX-007药品小瓶并使用解冻时，开始FCX-007药品的制造。在ISO5 BSC中，将解冻的FCX-007DS细胞合并到250mL离心管中，所述离心管含有＞5x用于重悬的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤缓冲液的总体积。将细胞在5℃±3℃下以1000rpm离心10分钟，并去除PBS洗涤缓冲液。然后通过重悬并在5℃±3℃下以1000rpm离心10分钟，用＞5x杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)的总体积洗涤。去除DMEM洗涤缓冲液。将洗涤过的细胞重悬于不含酚红的DMEM中至目标浓度2.0x 107个细胞/mL。将细胞悬浮液手动装入ISO5 BSC中的无菌2.0mL冷冻小瓶中至体积为1.2mL/小瓶，以产生FCX-007DP小瓶。药物产品小瓶在2℃-8℃下储存直至通过QA释放，以在Credo CubeTM shipper中运输至临床地点。
制造工艺描述
如上所述制造FCX-007药物产品。INXN-2002是FCX-007的同义名称。
步骤1：从液氮储存器中取出FCX-007药品小瓶并进行批次验证
在液氮冷冻机中储存的FCX-007药品是材料管理部门要求的。然后将FCX-007药品小瓶用于该批FCX-007药物产品生产，随后将其转移至洁净室套间中。
步骤2：解冻冷冻小瓶
按照SOP-0099GMP生产线清除/GTP管线清洗通过QA进行洁净室套间的管线清除，以释放房间以供加工使用。在加工之前以及在加工过程中在BSC中进行无活性EM采样之前，操作员按照SOP-0129(在过程环境和人员监测中)启动房间、人员和BSC环境监测(EM)。
在平衡至37℃的中对FCX-007DS细胞进行消毒和解冻，直至细胞悬浮液几乎完全解冻，剩余一小片冰晶。将解冻的小瓶转移至BSC。
步骤3：PBS洗涤
在BSC内部，使用移液器将约150mL的PBS(＞5体积的FCX-007DS细胞悬浮液)转移至250mL离心管中。将解冻的冷冻小瓶的内容物转移至250mL离心管中。使用稀释的细胞悬液冲洗移液器。用移液器将3.0mL新鲜PBS转移至每个冷冻小瓶中作为冲洗液。将冲洗液转移至250mL离心管中。轻轻旋转离心管以混合细胞悬浮液。将离心管转移至离心机，并在5℃±3℃下以1000RPM离心细胞10分钟。离心后，从管中取出PBS洗涤上清液。
i.步骤4：DMEM洗涤
使用移液器，向管中添加约200mL不含酚红的DMEM(＞5体积的FCX-007DS细胞悬浮液)以重悬细胞沉淀物。轻轻旋转离心管以混合细胞悬浮液。将离心管转移至离心机，并在5℃±3℃下以1000RPM离心细胞10分钟。离心后，使用移液器将0.9mL上清液从离心瓶中转移至2个单独的2mL冷冻小瓶(总计1.8mL)中，标记为“批次，QC-无菌”。将标记为无菌的冷冻小瓶设置在BSC中。从离心管中吸出剩余的DMEM洗涤上清液。
步骤5：将细胞沉淀物重悬于DMEM中
用于重悬细胞沉淀物的DMEM体积计算如下：
解冻的FCX-007DS细胞悬浮液的体积除以1.5
1/1.5体积因子补偿洗涤步骤中可能的细胞损失，以在重悬后导致细胞浓度在1.0-3.0x 107个细胞/mL的特定范围内。
使用移液器转移计算量的DMEM以使细胞沉淀物重悬于离心管。使用移液器将0.1mL的细胞悬浮液转移至标记为“批次，QC-计数和活力”的2mL冷冻小瓶中，并将冷冻小瓶提交至QC进行细胞计数。使用移液器测量剩余的总细胞悬浮液体积，并将细胞悬浮液置于2℃-8℃冰箱中，以供随后的最终填充使用。
步骤5a：重新稀释(如果需要的话)
如果QC细胞浓度高于3.0x 107个细胞/mL，则使用新鲜DMEM进行另外的稀释以达到2.0x 107个细胞/mL的细胞浓度。将细胞悬浮液样品重新提交至QC以进行细胞计数以确认最终细胞浓度。
步骤6：最终填充
从冰箱中取出细胞并将细胞转移至BSC进行最终填充。使用移液器将充分混合的细胞悬浮液按以下顺序手动装入2mL冷冻小瓶中：
将0.1mL细胞悬浮液装入第一个无菌样品小瓶中(添加至步骤4保留的样品中)
以1.2mL/小瓶填充产品小瓶
将0.1mL细胞悬浮液装入第二个无菌样品小瓶中(添加至步骤4保留的样品中)
填充QC小瓶，≤1.8mL/小瓶
提交无菌和QC样品瓶以供测试。
步骤7：储存DP小瓶以供释放和装运
在5℃±3℃下保存DP小瓶，以释放和装运至临床地点。
过程控制的描述
环境控制
所有细胞培养操作均在ISO7环境背景下使用无菌技术在经认证的ISO 5生物安全柜(BSC)中进行。最终的药物产品2mL冷冻小瓶容器是从Corning预先灭菌购买的。执行最终填充的操作员有资格进行无菌填充操作。
过程控制和测试
对于FCX-007药物产品的释放进行的过程控制和测试描述如下。
步骤1
在用于FCX-007DP制造之前，QA验证了正确的FCX-007药品批次。
步骤2
用于解冻FCX-007药品小瓶的的温度控制在37℃。将每个小瓶的内容物解冻，直至仍然在小瓶中保留一小片冰以防止过热。
步骤3
将PBS洗涤体积控制在≥5体积的FCX-007DS细胞库，以确保充分洗涤细胞。离心条件控制在1000rpm，10分钟和5℃±3℃，以确保充分的细胞造粒。
步骤4
与PBS洗涤步骤类似，将DMEM洗涤体积控制在≥5体积的FCX-007DS细胞库，以确保充分洗涤细胞。离心条件控制在1000rpm，10分钟和5℃±3℃，以确保充分的细胞造粒。取两份900μL的DMEM洗涤上清液等分试样用于最终产品的无菌测试。
步骤5和5(a)(如果需要的话)
重悬的细胞浓度控制在1.0-3.0x107个细胞/mL，并且活力≥70％。
步骤6
FCX-007DP小瓶的填充体积控制在每瓶填充1.2mL。在填充的QC小瓶上进行最终细胞计数和活力测量以及革兰氏染色。提交两个无菌小瓶以进行无菌测试。直到药物产品释放后才接收该无菌测试的结果，因此DP的释放在阴性革兰氏染色的基础上进行。快速微生物测试在这种情况下的使用如在2008年4月FDA审查员和赞助商指南“Content and Reviewof Chemistry，Manufacturing，and Control(CMC)Information for Human Somatic CellTherapy Investigation New Drag Applications(IND)[人类体细胞疗法研究新药物应用(IND)的化学、生产和控制(CMC)信息的内容和综述]”中所示。
ii.材料的控制
FCX-007药物产品制造过程采用与原材料接触的单次使用的一次性产品(如移液管，离心管和冷冻小瓶)，以消除清洗和遗留的问题。选择用于制造过程的原材料因符合USPVI标准而对于药物加工是可接受的。所有购买的一次性物品都是通过γ辐射预先灭菌的。PBS和DMEM洗涤缓冲液是从商业供应商处无菌购买的。该过程中的步骤具有确定的适当工艺参数，如时间和温度。
实例9-优化的GM-HDF的体外表征
该实例描述了使用LV-COL7构建体INXN-2004的增强LV转导程序产生的GM-HDF的表征。进行三次训练运行(TR11、TR12.1和TRl3)以产生细胞以供GMP规模下的分析。TR11用LV-COL7载体INXN-2002进行转导，并用于评价在有或没有第二转导步骤(超转导)情况下的离心增强(旋转接种)的LV转导程序。使用如通过评价TR11所确定的增强的转导程序，用LV-COL7载体INXN-2004转导TR12.1和TR13。
使用评估结果如整合的LV-COL7的拷贝数、C7的蛋白质表达以及由GM-HDF表达的C7的功能性的测定来表征来自每次训练运行的GM-HDF。
首先随着超转导步骤的加入，LV整合和C7表达水平增加，并且随着LV-COL7INXN-2004的使用进一步增加。由来自所有三次训练运行的GM-HDF表达的C7组装成三聚体形式，并与层粘连蛋白332结合，所述层粘连蛋白332在锚定原纤维的形成中是重要的。C7通过GM-HDF的表达能够逆转在RDEB成纤维细胞中观察到的高运动性。选择来自TR12.1和13的GM-HDF用于体内GLP毒理学研究。
本研究的目的是(a)证明整合LV拷贝数和C7表达的提高，原因是1)将增强的转导程序并入大规模GMP生产方法中和2)采用INXN-2004 LV-COL7构建体，以及(b)确认GM-HDF表达的C7的功能
1.研究材料
1.1.测试制品
表征来自训练运行(TR)11、12.1和13的GM-HDF。
表44：TR11、TR12.1和TR13的一般生产信息
1将对照组细胞进行模拟物转导
2TR12.1和TR13的B组仅供研究使用。这些组的传代提前终止，因此没有完成全部的生产过程。
1.2.引物和探针序列
表45：用于qPCR分析的引物和探针序列
1从IDT购买的引物/探针。
2来源于Greenberg等人(2006)的LV特异性引物/探针序列。
2.实验程序
2.1.LV-COL7拷贝数
根据制造商的说明，使用Qiagen的AllPrep试剂盒进行核酸分离。从6.7x105GM-HDF细胞中分离gDNA，并在20μL测定中使用8μL的gDNA(10μL 基因表达、1.8μL无核酸酶水、0.06μL的100μM正向引物、0.06μL的100μM反向引物、0.04μL的100μM 探针)。还在上述20μL测定中测定了连续稀释的线性化LV-COL7慢病毒穿梭载体(1e6个拷贝/反应至5个拷贝/反应)和4μL的人gDNA(1.5e4个细胞/反应)的标准曲线。使用的测定是PR13843。还在20μL测定(10μL 基因表达、1.0L无核酸酶水、1μL的20XACTB引物/探针组)中进行了8μL的商业人gDNA(Clontech)的另外的标准曲线(1.5e4个细胞/反应至2e2个细胞/反应)。所有样品均使用以下循环参数在ABI7900HT上一式三份地运行：在50℃下2分钟，在95℃下10分钟，以及在95℃下15秒和在60℃下1分钟的40个循环。
2.2.C7免疫荧光
对于免疫荧光分析，使1.2x 104GM-HDF附接至24孔板中的PDL/Lamin涂覆的盖玻片过夜，然后固定并用50％/50％的甲醇/丙酮混合物透性化处理。将盖玻片用1X PBS洗涤3次，然后在室温下用PBS中的10％山羊血清封闭30分钟。在用PBS洗涤另外的三次后，将盖玻片与1％山羊血清/PBS中1.25μg/mL多克隆fNC1抗体(α-fNC1)一起孵育，然后用PBS洗涤另外的3次，并在室温下与5μg/mL Alexa 555缀合的山羊抗兔IgG在1％山羊血清/PBS中孵育1小时。在安装到载玻片上之前，用活细胞染色探针试剂对盖玻片进行染色。在Zeiss Axio Observer显微镜上以20X放大倍数使用290ms的曝光时间获得图像。将NHDF或GM-HDF固定，透性化处理并用活细胞染色剂染色以细胞核可视化(蓝色)或用fNC1抗体和Alexa 555缀合的山羊抗兔IgG(5μg/mL)染色以使C7表达可视化(红色)。以20X和5X放大倍数使用290ms的曝光时间获得图像。
2.3.C7流式细胞术
将GM-HDF(约500，000个细胞)收集至96孔板V形底板的每个孔中，通过离心(1500pm，5min，室温)浓缩，并去除培养基上清液。然后将细胞重悬于200μL的CytoFix中，转移至96孔V型底板，并在4℃孵育30min。固定后，随后通过离心(1500rpm，5min，4℃)去除固定剂，并将细胞用200μL冰冷的100％甲醇在冰上透性化处理30min。然后在染色程序之前将细胞在-20℃下保存。为了染色，用200μL孵育缓冲液(在100mL PBS中的0.5g BSA)洗涤经透性化处理的细胞两次，在两次洗涤之间离心(300rpm，5min，室温)以去除缓冲液。将洗涤的细胞重悬于含有以1∶400稀释的α-fNC1的100μL孵育缓冲液中，并在室温下孵育1小时。然后如上所述洗涤细胞两次，并重悬于含有以1∶2000稀释的AlexaFluor 555-兔IgG二级抗体的100μL孵育缓冲液中，并在室温下孵育30min。然后如上所述洗涤细胞两次并重悬于100μLPBS中。使用BD LSRII和BD FACSDiva软件(V6.2)采用以下参数通过流式细胞术计算表达C7的细胞：FSC电压＝484，SSC电压＝209，PE＝500。
2.4.C7蛋白ELISA
简而言之，将纯化的His-NC1片段(9.8-625ng/mL)的标准曲线或收集的含有C7蛋白的上清液(来自培养物中三至五天的GM-HDF)在4℃下固定在Nunc 96孔板上过夜。在相同的样品基质(10％RDEB成纤维细胞条件培养基)中测试标准品和样品。用PBST洗涤涂覆的孔并用3％BSA/PBS在37℃下封闭1小时。使用α-fNC1 Ab(0.5μg/mL)完成检测，然后与二级抗体驴抗兔IgG HRP(Jackson ImmunoResearch，0.08μg/mL)一起孵育。经由采用TMB底物溶液进行比色显色来检测结合的抗体。淬灭反应后，在 Plus 384(Molecular Devices)上测量450nm处的吸光度。
2.5.C7三聚体的免疫沉淀
首先，用1X PBS-T洗涤磁性蛋白G珠粒。在去除上清液之前以及在所有后续步骤中，珠粒与磁体结合至少2分钟。洗涤后，用5μg的α-fNC1涂覆珠粒并旋转孵育(Glas-Col，设定为在室温下30-14rpm)10分钟。珠粒与磁体结合以去除上清液并用Ab结合/洗涤缓冲液洗涤。从三至五天的培养物中的GM-HDF收集上清液。将含有C7的上清液添加至珠粒/C7上清液混合物中，并在4℃下旋转孵育(设定为30-14rpm)过夜。第二天，珠粒与磁体结合并用洗涤缓冲液洗涤三次。在20μL洗脱缓冲液(50mM甘氨酸，pH 2.8和10μl的4X加样染料)中洗脱靶抗原。将样品在70℃下变性10分钟。然后将12μl的总计30μl(剩余样品在4℃下储存)加载(每孔)至12孔3％-8％Tris Acetate凝胶中并在150伏下运行4小时。从盒中取出凝胶并在含有10％甲醇的转移缓冲液中浸泡20分钟。在15伏，4℃下将凝胶过夜湿转移至硝酸纤维素膜。第二天，在冰上使电压增加到50伏，持续30分钟。转移完成后，在室温下使用TBS-T中的5％牛奶在搅拌下(Labnet ProBlotTM Rocker 25，设定为60rpm)封闭印迹2小时，并在室温下与市售的抗C7LH7.2(0.25μg/mL)一起在搅拌下孵育2小时。在搅拌下用1X TBS-T(各5min)洗涤印迹3次，然后在室温下用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(0.1μg/mL)在搅拌下探测1小时。使用Lumiglo UltraTM化学发光底物和Fujifilm LAS 3000成像系统使印迹显影。
2.6.Lam332结合
在4℃下将96孔MaxiSorpTM培养板用100mM碳酸盐缓冲液中的1μg Lam332或BSA(pH9.3)涂覆过夜。将培养板用PBS-T冲洗五次，然后在室温下用PBS-T中的1％BSA封闭1小时。用PBS-T冲洗涂覆的孔5次，并在4℃下与来自转导细胞的上清液孵育过夜。用PBS-T再洗涤三次后，在室温下将结合的C7与α-fNC1(0.5μg/mL，PBS-T)孵育3小时，然后在室温下与HRP缀合的驴抗兔IgG(在PBS-T中的最终浓度为0.8μg/mL)孵育2hr。使用TMB经由比色反应检测C7结合的抗体，并通过在SpectraMax 384读板器(Molecular Devices)上读取450nm处产物的吸光度进行测量。所有孵育均在定轨摇床(GeneMate)上以设定为2的速度进行。
2.7.细胞迁移测定
来自Cell Biolabs公司的CytoSelectTM 24孔伤口愈合测定试剂盒用于细胞迁移测定。在伤口插入物的存在下将GM-HDF(0.8x 105)接种在24孔板中并培养48小时。然后去除伤口插入物，并将细胞在含有15μg/mL I型胶原(COL1)的低(1％)血清培养基中进一步培养8小时。在使用成像血细胞计数系统(Cyntellect)去除伤口插入物后0、2、4、6和8小时获得伤口的明场图像。使用ImageJ(National Institutes ofHealth)测量每个时间点的伤口表面积。数据报告为覆盖伤口面积的迁移百分比(迁移％)。
3.数据分析
使用ABI 7900仪器利用SDS2.3软件进行qPCR。在SDS 2.4软件中查看和导出实验数据。使用FlowJo V10软件分析流式细胞术数据。ImagJ软件用于定量2.7部分中所述的测定的细胞迁移百分比。ImageJ是由国家卫生研究院开发的针对科学多维图像设计的开源图像处理程序。
4.结果
4.1.C7表达的表征
该评价的总体目标是通过比较转导方法和LV载体来增加拷贝数和蛋白质表达。具体目标是：
1.评价超转导对整合拷贝数的影响
2.评价旋转接种对整合拷贝数的影响
3.比较在超转导和旋转接种的条件下INXN-2002与INXN-2004之间的拷贝数值。
两个GMP批次的LV-COL7构建体用于这些研究：如该实例中所述的INXN-2002和构建体INXN-2004。
4.1.1.LV-COL7拷贝数
获得GM-HDF训练运行细胞，并如上2.1部分中所述测定拷贝数。以下表46提供了来自使用新转导方法的训练运行的拷贝数/细胞。初始优化实现了在转导步骤(“旋转接种”)过程中加入离心。标准转导先前已与INXN-2002一起使用，并产生了在0.013至0.025范围内的整合拷贝数。与先前研究的TR8结果相比，仅添加用于用INXN-2002转导的旋转接种步骤导致整合拷贝数/细胞增加≥2倍至0.05(TR11 B组，表46)。
为了进一步提高整合拷贝数，在GM-HDF生产过程中添加了第二转导(“超转导”)。也利用旋转接种的超转导的添加使INXN-2002的整合拷贝数进一步增加约2倍(TR11 A组，表46)。
小规模研究(未示出)证明第二代INXN-2004 LV-COL7构建体(其利用可替代的第3代自身失活的LV骨架)当利用比INXN-2002所使用的更低的感染复数(MOI)时有可能获得更高的整合拷贝数，从而导致更高的表达水平。当在GMP规模上使用优化的转导程序(采用超转导的旋转接种)时，INXN-2004具有与INXN-2002构建体相比约4至8倍提高的整合LV拷贝数，以实现0.41至0.74的平均拷贝数(分别为TR12.1和TR13，表46)。
值得注意的是，没有测试TR12.1和TR13的B组的拷贝数，因为它们在整个生产过程中没有传代(表44)。准确的拷贝数评估需要在转导后已经传代数次的细胞，以确保不再保留LV的游离基因拷贝(其可以人为提高测量的拷贝数)。
表46：GM-HDF生产运行细胞中的LV-COL7拷贝数
1只有指示组进行超转导；所有TR11、TR12.1和TR13组进行旋转接种
2TR8A组数据表示为RDEB-ADSO-2中呈现的先前结果的比较数据
3对照组进行模拟物转导，并且未暴露于LV-COL7
4BLQ：低于定量下限
5TR12.1和TR13的B组未进行完整的生产过程，并且未检测LV-COL7拷贝数
4.1.2.C7蛋白表达
间接免疫荧光(IF)用于使用对C7特异性的抗体来检测GM-HDF细胞的C7蛋白表达。通过IF分析TR11A组和B组以及TR12.1和TR13的仅A组。正常人真皮成纤维细胞(NHDF)用作阳性对照，并且TR1 1的对照组用作阴性对照。两个放大倍数20x和5x下的代表性图像示于下面的图31中。还被包括在内作为原始过程的比较数据的是来自TR8A组的细胞的IF图像，其具有0.015的LV-COL7拷贝数/细胞。与以上表46中显示的整合LV的拷贝数一致，只有少量TR11GM-HDF用C7抗体可视化，但仍大于来自TR8的C7阳性细胞数量。此外，从TR12.1和TR13GM-HDF测量的较高拷贝数与较高数量的C7检测阳性的细胞相关。值得注意的是，来自C7阳性的GM-HDF的信号比来自NHDF的信号更亮，这表明GM-HDF产生更多量的C7/细胞。
然后使用流式细胞术测定来定量表达C7的特定细胞数。如2.3部分所述，该测定使用NC1区域特异性多克隆抗体。对于该实验，包括来自TR12.1和TR13的B组细胞以比较单个转导程序(B组)与使用第二代LV-COL7构建体(INXN-2004)的超转导程序(A组)。如以下图32所示，每个训练运行组的C7阳性(C7+)细胞的百分比与IF检测到的表达C7的细胞的定性数量一致(图32)，并与测量的拷贝数相关(表46)。TR12.1和TR13的A组与B组之间的C7+细胞的比较证实了所预测到的通过添加第二转导使表达水平几乎加倍。
使用直接ELISA来测量GM-HDF分泌至细胞培养基中的C7。如2.4部分所述，该测定也使用NC1区域特异性的多克隆抗体。来自三次训练运行的GM-HDF的ELISA测定结果显示C7表达依赖于整合的LV拷贝数水平，其中表达水平达到约2300ng/天/1e6细胞(图33)。与作为先前研究(RDEB-ADSO-2)的代表性结果的TR8A组相比，这表示C7表达增加＞200倍(图33)。
4.2.GM-HDF表达的C7的功能评估
4.2.1.C7三聚体的形成
C7三聚体的形成在锚定原纤维的组装中是必不可少的(Bruckner-Tuderman，1999)。为了验证GM-HDF表达的C7能够形成锚定原纤维，使用免疫沉淀(IP)采用用于选择性捕获的抗C7特异性抗体(fNC1)，针对C7三聚体的形成评估GM-HDF，然后通过SDS-PAGE/免疫印迹检测来自培养上清液的C7浓度。纯化的重组C7用作阳性对照，使用不采用C7特异性抗体的捕获步骤作为阴性对照。三次训练运行的IP结果显示GM-HDF产生的C7主要是三聚体(图34)，其中一些较低分子量的物质显示存在免疫反应性，这些物质很可能是C7的二聚体和单体形式。
4.2.2.通过GM-HDF表达的C7与Lam332结合
已显示C7结合固定的细胞外基质(ECM)组分，其包括纤连蛋白、层粘连蛋白332(Lam332)、COL1和COL4(Chen等人，2002a)。C7与Lam332之间的相互作用通过C7的NH2-末端NC1结构域发生，并且依赖于Lam332和C7NC1二者的天然构象(Rousselle等人，1997)。C7与Lam332之间的关联对于在真皮表皮交界处建立正确的Lam332结构非常重要。这种组织对于与细胞外配体和细胞表面受体的相互作用以及细胞信号传导是至关重要的(Waterman等人，2007)。Intrexon使用抗C7NCl结构域的抗体开发ELISA以检测C7与纯化的Lam332的结合。来自图35中所示的两个实验的结果显示了来自三次训练运行的GM-HDF表达的C7与Lam332的拷贝数依赖性结合。TR11对照细胞在两个实验中用作阴性对照。
4.2.3.细胞迁移测定
先前的研究已表明RDEB成纤维细胞和角质形成细胞相对于其正常对应物显示出运动性增加，并且可通过C7的表达恢复正常的运动性(Chen，等人，2000；Chen，等人，2002b；Cogan，等人2014；Baldeschi等人，2003)。这些研究中的大多数采用胶体金盐迁移测定来测量成纤维细胞和角质形成细胞的迁移，或采用伤口愈合测定来测量角质形成细胞的迁移。在该实例中，使用CytoSelectTM 24孔伤口愈合测定试剂盒(Cell Biolabs公司)来测量NHDF和GM-HDF的运动性。
为了确定培养基中C7的存在是否足以逆转RDEB高运动性表型，对来自三次训练运行的GM-HDF进行伤口愈合测定，其中NHDF作为阳性对照并且模拟物转导的对照(RDEB)组作为阴性对照。来自TR11C组(RDEB)的对照成纤维细胞显示出可被C7的表达逆转的高运动性表型(图36)。有趣的是，表型逆转的水平不依赖于整合拷贝数/C7表达水平，这表明即使低水平的C7表达也足以逆转高运动性表型。
5.结论
通过添加增强的转导方法(旋转接种和超转导)和改变LV-COL7构建体INXN-2004，提高了GM-HDF中的整合转基因拷贝数/细胞，其中达到了高达0.74个拷贝/细胞的水平。每次过程改变所实现的倍数增加如下：
·加入旋转接种：≥2倍
·加入超转导(具有旋转接种)：约2倍
·从INXN-2002变为INXN-2004：＞4倍
·原始过程的累计总变化：平均值＞27倍(TR12.1和TRl3与原始研究中使用的TR8相比)
通过免疫荧光染色、流式细胞术和ELISA确认来自GM-HDF细胞的整合拷贝数依赖性C7表达。相对于IND提交16582系列0000中呈现的TR8结果，实现了C7表达＞200倍的提高。
通过免疫沉淀/SDS-PAGE/免疫印迹分析来证实GM-HDF细胞表达的C7的结构主要是三聚体。
此外，通过在体外与层粘连蛋白332结合并通过在体外迁移测定中校正对照RDEB细胞的高运动性表型，证明GM-HDF细胞产生的C7具有功能。
附录4
以下是60010743-ITX-00001_重叠群序列(SEQ ID NO：34)相对于IGE308_参考序列(SEQ ID NO：34)的比较分析。
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gatgacgctg cggcttctgg tggccgcgct ctgcgccggg atcctggcag aggcgccccg 60
agtgcgagcc cagcacaggg agagagtgac ctgcacgcgc ctttacgccg ctgacattgt 120
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cgtccctgga gccagtggat ttcggattag ctggagcaca ggcagtggtc cggagtccag 1920
ccagacactg cccccagact ctactgccac agacatcaca gggctgcagc ctggaaccac 1980
ctaccaggtg gctgtgtcgg tactgcgagg cagagaggag ggccctgctg cagtcatcgt 2040
ggctcgaacg gacccactgg gcccagtgag gacggtccat gtgactcagg ccagcagctc 2100
atctgtcacc attacctgga ccagggttcc tggcgccaca ggatacaggg tttcctggca 2160
ctcagcccac ggcccagaga aatcccagtt ggtttctggg gaggccacgg tggctgagct 2220
ggatggactg gagccagata ctgagtatac ggtgcatgtg agggcccatg tggctggcgt 2280
ggatgggccc cctgcctctg tggttgtgag gactgcccct gagcctgtgg gtcgtgtgtc 2340
gaggctgcag atcctcaatg cttccagcga cgttctacgg atcacctggg taggggtcac 2400
tggagccaca gcttacagac tggcctgggg ccggagtgaa ggcggcccca tgaggcacca 2460
gatactccca ggaaacacag actctgcaga gatccggggt ctcgaaggtg gagtcagcta 2520
ctcagtgcga gtgactgcac ttgtcgggga ccgcgagggc acacctgtct ccattgttgt 2580
cactacgccg cctgaggctc cgccagccct ggggacgctt cacgtggtgc agcgcgggga 2640
gcactcgctg aggctgcgct gggagccggt gcccagagcg cagggcttcc ttctgcactg 2700
gcaacctgag ggtggccagg aacagtcccg ggtcctgggg cccgagctca gcagctatca 2760
cctggacggg ctggagccag cgacacagta ccgcgtgagg ctgagtgtcc tagggccagc 2820
tggagaaggg ccctctgcag aggtgactgc gcgcactgag tcacctcgtg ttccaagcat 2880
tgaactacgt gtggtggaca cctcgatcga ctcggtgact ttggcctgga ctccagtgtc 2940
cagggcatcc agctacatcc tatcctggcg gccactcaga ggccctggcc aggaagtgcc 3000
tgggtccccg cagacacttc cagggatctc aagctcccag cgggtgacag ggctagagcc 3060
tggcgtctct tacatcttct ccctgacgcc tgtcctggat ggtgtgcggg gtcctgaggc 3120
atctgtcaca cagacgccag tgtgcccccg tggcctggcg gatgtggtgt tcctaccaca 3180
tgccactcaa gacaatgctc accgtgcgga ggctacgagg agggtcctgg agcgtctggt 3240
gttggcactt gggcctcttg ggccacaggc agttcaggtt ggcctgctgt cttacagtca 3300
tcggccctcc ccactgttcc cactgaatgg ctcccatgac cttggcatta tcttgcaaag 3360
gatccgtgac atgccctaca tggacccaag tgggaacaac ctgggcacag ccgtggtcac 3420
agctcacaga tacatgttgg caccagatgc tcctgggcgc cgccagcacg taccaggggt 3480
gatggttctg ctagtggatg aacccttgag aggtgacata ttcagcccca tccgtgaggc 3540
ccaggcttct gggcttaatg tggtgatgtt gggaatggct ggagcggacc cagagcagct 3600
gcgtcgcttg gcgccgggta tggactctgt ccagaccttc ttcgccgtgg atgatgggcc 3660
aagcctggac caggcagtca gtggtctggc cacagccctg tgtcaggcat ccttcactac 3720
tcagccccgg ccagagccct gcccagtgta ttgtccaaag ggccagaagg gggaacctgg 3780
agagatgggc ctgagaggac aagttgggcc tcctggcgac cctggcctcc cgggcaggac 3840
cggtgctccc ggcccccagg ggccccctgg aagtgccact gccaagggcg agaggggctt 3900
ccctggagca gatgggcgtc caggcagccc tggccgcgcc gggaatcctg ggacccctgg 3960
agcccctggc ctaaagggct ctccagggtt gcctggccct cgtggggacc cgggagagcg 4020
aggacctcga ggcccaaagg gggagccggg ggctcccgga caagtcatcg gaggtgaagg 4080
acctgggctt cctgggcgga aaggggaccc tggaccatcg ggcccccctg gacctcgtgg 4140
accactgggg gacccaggac cccgtggccc cccagggctt cctggaacag ccatgaaggg 4200
tgacaaaggc gatcgtgggg agcggggtcc ccctggacca ggtgaaggtg gcattgctcc 4260
tggggagcct gggctgccgg gtcttcccgg aagccctgga ccccaaggcc ccgttggccc 4320
ccctggaaag aaaggagaaa aaggtgactc tgaggatgga gctccaggcc tcccaggaca 4380
acctgggtct ccgggtgagc agggcccacg gggacctcct ggagctattg gccccaaagg 4440
tgaccggggc tttccagggc ccctgggtga ggctggagag aagggcgaac gtggaccccc 4500
aggcccagcg ggatcccggg ggctgccagg ggttgctgga cgtcctggag ccaagggtcc 4560
tgaagggcca ccaggaccca ctggccgcca aggagagaag ggggagcctg gtcgccctgg 4620
ggaccctgca gtggtgggac ctgctgttgc tggacccaaa ggagaaaagg gagatgtggg 4680
gcccgctggg cccagaggag ctaccggagt ccaaggggaa cggggcccac ccggcttggt 4740
tcttcctgga gaccctggcc ccaagggaga ccctggagac cggggtccca ttggccttac 4800
tggcagagca ggacccccag gtgactcagg gcctcctgga gagaagggag accctgggcg 4860
gcctggcccc ccaggacctg ttggcccccg aggacgagat ggtgaagttg gagagaaagg 4920
tgacgagggt cctccgggtg acccgggttt gcctggaaaa gcaggcgagc gtggccttcg 4980
gggggcacct ggagttcggg ggcctgtggg tgaaaaggga gaccagggag atcctggaga 5040
ggatggacga aatggcagcc ctggatcatc tggacccaag ggtgaccgtg gggagccggg 5100
tcccccagga cccccgggac ggctggtaga cacaggacct ggagccagag agaagggaga 5160
gcctggggac cgcggacaag agggtcctcg agggcccaag ggtgatcctg gcctccctgg 5220
agcccctggg gaaaggggca ttgaagggtt tcggggaccc ccaggcccac agggggaccc 5280
aggtgtccga ggcccagcag gagaaaaggg tgaccggggt ccccctgggc tggatggccg 5340
gagcggactg gatgggaaac caggagccgc tgggccctct gggccgaatg gtgctgcagg 5400
caaagctggg gacccaggga gagacgggct tccaggcctc cgtggagaac agggcctccc 5460
tggcccctct ggtccccctg gattaccggg aaagccaggc gaggatggca aacctggcct 5520
gaatggaaaa aacggagaac ctggggaccc tggagaagac gggaggaagg gagagaaagg 5580
agattcaggc gcctctggga gagaaggtcg tgatggcccc aagggtgagc gtggagctcc 5640
tggtatcctt ggaccccagg ggcctccagg cctcccaggg ccagtgggcc ctcctggcca 5700
gggttttcct ggtgtcccag gaggcacggg ccccaagggt gaccgtgggg agactggatc 5760
caaaggggag cagggcctcc ctggagagcg tggcctgcga ggagagcctg gaagtgtgcc 5820
gaatgtggat cggttgctgg aaactgctgg catcaaggca tctgccctgc gggagatcgt 5880
ggagacctgg gatgagagct ctggtagctt cctgcctgtg cccgaacggc gtcgaggccc 5940
caagggggac tcaggcgaac agggcccccc aggcaaggag ggccccatcg gctttcctgg 6000
agaacgcggg ctgaagggcg accgtggaga ccctggccct caggggccac ctggtctggc 6060
ccttggggag aggggccccc ccgggccttc cggccttgcc ggggagcctg gaaagcctgg 6120
tattcccggg ctcccaggca gggctggggg tgtgggagag gcaggaaggc caggagagag 6180
gggagaacgg ggagagaaag gagaacgtgg agaacagggc agagatggcc ctcctggact 6240
ccctggaacc cctgggcccc ccggaccccc tggccccaag gtgtctgtgg atgagccagg 6300
tcctggactc tctggagaac agggaccccc tggactcaag ggtgctaagg gggagccggg 6360
cagcaatggt gaccaaggtc ccaaaggaga caggggtgtg ccaggcatca aaggagaccg 6420
gggagagcct ggaccgaggg gtcaggacgg caacccgggt ctaccaggag agcgtggtat 6480
ggctgggcct gaagggaagc cgggtctgca gggtccaaga ggcccccctg gcccagtggg 6540
tggtcatgga gaccctggac cacctggtgc cccgggtctt gctggccctg caggacccca 6600
aggaccttct ggcctgaagg gggagcctgg agagacagga cctccaggac ggggcctgac 6660
tggacctact ggagctgtgg gacttcctgg accccccggc ccttcaggcc ttgtgggtcc 6720
acaggggtct ccaggtttgc ctggacaagt gggggagaca gggaagccgg gagccccagg 6780
tcgagatggt gccagtggaa aagatggaga cagagggagc cctggtgtgc cagggtcacc 6840
aggtctgcct ggccctgtcg gacctaaagg agaacctggc cccacggggg cccctggaca 6900
ggctgtggtc gggctccctg gagcaaaggg agagaaggga gcccctggag gccttgctgg 6960
agacctggtg ggtgagccgg gagccaaagg tgaccgagga ctgccagggc cgcgaggcga 7020
gaagggtgaa gctggccgtg caggggagcc cggagaccct ggggaagatg gtcagaaagg 7080
ggctccagga cccaaaggtt tcaagggtga cccaggagtc ggggtcccgg gctcccctgg 7140
gcctcctggc cctccaggtg tgaagggaga tctgggcctc cctggcctgc ccggtgctcc 7200
tggtgttgtt gggttcccgg gtcagacagg ccctcgagga gagatgggtc agccaggccc 7260
tagtggagag cggggtctgg caggcccccc agggagagaa ggaatcccag gacccctggg 7320
gccacctgga ccaccggggt cagtgggacc acctggggcc tctggactca aaggagacaa 7380
gggagaccct ggagtagggc tgcctgggcc ccgaggcgag cgtggggagc caggcatccg 7440
gggtgaagat ggccgccccg gccaggaggg accccgagga ctcacggggc cccctggcag 7500
caggggagag cgtggggaga agggtgatgt tgggagtgca ggactaaagg gtgacaaggg 7560
agactcagct gtgatcctgg ggcctccagg cccacggggt gccaaggggg acatgggtga 7620
acgagggcct cggggcttgg atggtgacaa aggacctcgg ggagacaatg gggaccctgg 7680
tgacaagggc agcaagggag agcctggtga caagggctca gccgggttgc caggactgcg 7740
tggactcctg ggaccccagg gtcaacctgg tgcagcaggg atccctggtg acccgggatc 7800
cccaggaaag gatggagtgc ctggtatccg aggagaaaaa ggagatgttg gcttcatggg 7860
tccccggggc ctcaagggtg aacggggagt gaagggagcc tgtggccttg atggagagaa 7920
gggagacaag ggagaagctg gtcccccagg ccgccccggg ctggcaggac acaaaggaga 7980
gatgggggag cctggtgtgc cgggccagtc gggggcccct ggcaaggagg gcctgatcgg 8040
tcccaagggt gaccgaggct ttgacgggca gccaggcccc aagggtgacc agggcgagaa 8100
aggggagcgg ggaaccccag gaattggggg cttcccaggc cccagtggaa atgatggctc 8160
tgctggtccc ccagggccac ctggcagtgt tggtcccaga ggccccgaag gacttcaggg 8220
ccagaagggt gagcgaggtc cccccggaga gagagtggtg ggggctcctg gggtccctgg 8280
agctcctggc gagagagggg agcaggggcg gccagggcct gccggtcctc gaggcgagaa 8340
gggagaagct gcactgacgg aggatgacat ccggggcttt gtgcgccaag agatgagtca 8400
gcactgtgcc tgccagggcc agttcatcgc atctggatca cgacccctcc ctagttatgc 8460
tgcagacact gccggctccc agctccatgc tgtgcctgtg ctccgcgtct ctcatgcaga 8520
ggaggaagag cgggtacccc ctgaggatga tgagtactct gaatactccg agtattctgt 8580
ggaggagtac caggaccctg aagctccttg ggatagtgat gacccctgtt ccctgccact 8640
ggatgagggc tcctgcactg cctacaccct gcgctggtac catcgggctg tgacaggcag 8700
cacagaggcc tgtcaccctt ttgtctatgg tggctgtgga gggaatgcca accgttttgg 8760
gacccgtgag gcctgcgagc gccgctgccc accccgggtg gtccagagcc aggggacagg 8820
tactgcccag gactgaggcc cagataatga gctgagattc agcatcccct ggaggagtcg 8880
gggtctcagc agaaccccac tgtccctccc cttggtgcta gaggcttgtg tgcacgtgag 8940
cgtgcgtgtg cacgtccgtt atttcagtga cttggtcccg tgggtctagc cttcccccct 9000
gtggacaaac ccccattgtg gctcctgcca ccctggcaga tgactcactg tgggggggtg 9060
gctgtgggca gtgagcggat gtgactggcg tctgacccgc cccttgaccc aagcctgtga 9120
tgacatggtg ctgattctgg ggggcattaa agctgctgtt ttaaaaggc 9169
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 2944
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人
&lt;400&gt; 2
Met Thr Leu Arg Leu Leu Val Ala Ala Leu Cys Ala Gly Ile Leu Ala
1 5 10 15
Glu Ala Pro Arg Val Arg Ala Gln His Arg Glu Arg Val Thr Cys Thr
20 25 30
Arg Leu Tyr Ala Ala Asp Ile Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser
35 40 45
Ile Gly Arg Ser Asn Phe Arg Glu Val Arg Ser Phe Leu Glu Gly Leu
50 55 60
Val Leu Pro Phe Ser Gly Ala Ala Ser Ala Gln Gly Val Arg Phe Ala
65 70 75 80
Thr Val Gln Tyr Ser Asp Asp Pro Arg Thr Glu Phe Gly Leu Asp Ala
85 90 95
Leu Gly Ser Gly Gly Asp Val Ile Arg Ala Ile Arg Glu Leu Ser Tyr
100 105 110
Lys Gly Gly Asn Thr Arg Thr Gly Ala Ala Ile Leu His Val Ala Asp
115 120 125
His Val Phe Leu Pro Gln Leu Ala Arg Pro Gly Val Pro Lys Val Cys
130 135 140
Ile Leu Ile Thr Asp Gly Lys Ser Gln Asp Leu Val Asp Thr Ala Ala
145 150 155 160
Gln Arg Leu Lys Gly Gln Gly Val Lys Leu Phe Ala Val Gly Ile Lys
165 170 175
Asn Ala Asp Pro Glu Glu Leu Lys Arg Val Ala Ser Gln Pro Thr Ser
180 185 190
Asp Phe Phe Phe Phe Val Asn Asp Phe Ser Ile Leu Arg Thr Leu Leu
195 200 205
Pro Leu Val Ser Arg Arg Val Cys Thr Thr Ala Gly Gly Val Pro Val
210 215 220
Thr Arg Pro Pro Asp Asp Ser Thr Ser Ala Pro Arg Asp Leu Val Leu
225 230 235 240
Ser Glu Pro Ser Ser Gln Ser Leu Arg Val Gln Trp Thr Ala Ala Ser
245 250 255
Gly Pro Val Thr Gly Tyr Lys Val Gln Tyr Thr Pro Leu Thr Gly Leu
260 265 270
Gly Gln Pro Leu Pro Ser Glu Arg Gln Glu Val Asn Val Pro Ala Gly
275 280 285
Glu Thr Ser Val Arg Leu Arg Gly Leu Arg Pro Leu Thr Glu Tyr Gln
290 295 300
Val Thr Val Ile Ala Leu Tyr Ala Asn Ser Ile Gly Glu Ala Val Ser
305 310 315 320
Gly Thr Ala Arg Thr Thr Ala Leu Glu Gly Pro Glu Leu Thr Ile Gln
325 330 335
Asn Thr Thr Ala His Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Ser Val Pro Gly
340 345 350
Ala Thr Gly Tyr Arg Val Thr Trp Arg Val Leu Ser Gly Gly Pro Thr
355 360 365
Gln Gln Gln Glu Leu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Val Leu Leu Arg Asp
370 375 380
Leu Glu Pro Gly Thr Asp Tyr Glu Val Thr Val Ser Thr Leu Phe Gly
385 390 395 400
Arg Ser Val Gly Pro Ala Thr Ser Leu Met Ala Arg Thr Asp Ala Ser
405 410 415
Val Glu Gln Thr Leu Arg Pro Val Ile Leu Gly Pro Thr Ser Ile Leu
420 425 430
Leu Ser Trp Asn Leu Val Pro Glu Ala Arg Gly Tyr Arg Leu Glu Trp
435 440 445
Arg Arg Glu Thr Gly Leu Glu Pro Pro Gln Lys Val Val Leu Pro Ser
450 455 460
Asp Val Thr Arg Tyr Gln Leu Asp Gly Leu Gln Pro Gly Thr Glu Tyr
465 470 475 480
Arg Leu Thr Leu Tyr Thr Leu Leu Glu Gly His Glu Val Ala Thr Pro
485 490 495
Ala Thr Val Val Pro Thr Gly Pro Glu Leu Pro Val Ser Pro Val Thr
500 505 510
Asp Leu Gln Ala Thr Glu Leu Pro Gly Gln Arg Val Arg Val Ser Trp
515 520 525
Ser Pro Val Pro Gly Ala Thr Gln Tyr Arg Ile Ile Val Arg Ser Thr
530 535 540
Gln Gly Val Glu Arg Thr Leu Val Leu Pro Gly Ser Gln Thr Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asp Asp Val Gln Ala Gly Leu Ser Tyr Thr Val Arg Val Ser
565 570 575
Ala Arg Val Gly Pro Arg Glu Gly Ser Ala Ser Val Leu Thr Val Arg
580 585 590
Arg Glu Pro Glu Thr Pro Leu Ala Val Pro Gly Leu Arg Val Val Val
595 600 605
Ser Asp Ala Thr Arg Val Arg Val Ala Trp Gly Pro Val Pro Gly Ala
610 615 620
Ser Gly Phe Arg Ile Ser Trp Ser Thr Gly Ser Gly Pro Glu Ser Ser
625 630 635 640
Gln Thr Leu Pro Pro Asp Ser Thr Ala Thr Asp Ile Thr Gly Leu Gln
645 650 655
Pro Gly Thr Thr Tyr Gln Val Ala Val Ser Val Leu Arg Gly Arg Glu
660 665 670
Glu Gly Pro Ala Ala Val Ile Val Ala Arg Thr Asp Pro Leu Gly Pro
675 680 685
Val Arg Thr Val His Val Thr Gln Ala Ser Ser Ser Ser Val Thr Ile
690 695 700
Thr Trp Thr Arg Val Pro Gly Ala Thr Gly Tyr Arg Val Ser Trp His
705 710 715 720
Ser Ala His Gly Pro Glu Lys Ser Gln Leu Val Ser Gly Glu Ala Thr
725 730 735
Val Ala Glu Leu Asp Gly Leu Glu Pro Asp Thr Glu Tyr Thr Val His
740 745 750
Val Arg Ala His Val Ala Gly Val Asp Gly Pro Pro Ala Ser Val Val
755 760 765
Val Arg Thr Ala Pro Glu Pro Val Gly Arg Val Ser Arg Leu Gln Ile
770 775 780
Leu Asn Ala Ser Ser Asp Val Leu Arg Ile Thr Trp Val Gly Val Thr
785 790 795 800
Gly Ala Thr Ala Tyr Arg Leu Ala Trp Gly Arg Ser Glu Gly Gly Pro
805 810 815
Met Arg His Gln Ile Leu Pro Gly Asn Thr Asp Ser Ala Glu Ile Arg
820 825 830
Gly Leu Glu Gly Gly Val Ser Tyr Ser Val Arg Val Thr Ala Leu Val
835 840 845
Gly Asp Arg Glu Gly Thr Pro Val Ser Ile Val Val Thr Thr Pro Pro
850 855 860
Glu Ala Pro Pro Ala Leu Gly Thr Leu His Val Val Gln Arg Gly Glu
865 870 875 880
His Ser Leu Arg Leu Arg Trp Glu Pro Val Pro Arg Ala Gln Gly Phe
885 890 895
Leu Leu His Trp Gln Pro Glu Gly Gly Gln Glu Gln Ser Arg Val Leu
900 905 910
Gly Pro Glu Leu Ser Ser Tyr His Leu Asp Gly Leu Glu Pro Ala Thr
915 920 925
Gln Tyr Arg Val Arg Leu Ser Val Leu Gly Pro Ala Gly Glu Gly Pro
930 935 940
Ser Ala Glu Val Thr Ala Arg Thr Glu Ser Pro Arg Val Pro Ser Ile
945 950 955 960
Glu Leu Arg Val Val Asp Thr Ser Ile Asp Ser Val Thr Leu Ala Trp
965 970 975
Thr Pro Val Ser Arg Ala Ser Ser Tyr Ile Leu Ser Trp Arg Pro Leu
980 985 990
Arg Gly Pro Gly Gln Glu Val Pro Gly Ser Pro Gln Thr Leu Pro Gly
995 1000 1005
Ile Ser Ser Ser Gln Arg Val Thr Gly Leu Glu Pro Gly Val Ser
1010 1015 1020
Tyr Ile Phe Ser Leu Thr Pro Val Leu Asp Gly Val Arg Gly Pro
1025 1030 1035
Glu Ala Ser Val Thr Gln Thr Pro Val Cys Pro Arg Gly Leu Ala
1040 1045 1050
Asp Val Val Phe Leu Pro His Ala Thr Gln Asp Asn Ala His Arg
1055 1060 1065
Ala Glu Ala Thr Arg Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Leu Ala Leu
1070 1075 1080
Gly Pro Leu Gly Pro Gln Ala Val Gln Val Gly Leu Leu Ser Tyr
1085 1090 1095
Ser His Arg Pro Ser Pro Leu Phe Pro Leu Asn Gly Ser His Asp
1100 1105 1110
Leu Gly Ile Ile Leu Gln Arg Ile Arg Asp Met Pro Tyr Met Asp
1115 1120 1125
Pro Ser Gly Asn Asn Leu Gly Thr Ala Val Val Thr Ala His Arg
1130 1135 1140
Tyr Met Leu Ala Pro Asp Ala Pro Gly Arg Arg Gln His Val Pro
1145 1150 1155
Gly Val Met Val Leu Leu Val Asp Glu Pro Leu Arg Gly Asp Ile
1160 1165 1170
Phe Ser Pro Ile Arg Glu Ala Gln Ala Ser Gly Leu Asn Val Val
1175 1180 1185
Met Leu Gly Met Ala Gly Ala Asp Pro Glu Gln Leu Arg Arg Leu
1190 1195 1200
Ala Pro Gly Met Asp Ser Val Gln Thr Phe Phe Ala Val Asp Asp
1205 1210 1215
Gly Pro Ser Leu Asp Gln Ala Val Ser Gly Leu Ala Thr Ala Leu
1220 1225 1230
Cys Gln Ala Ser Phe Thr Thr Gln Pro Arg Pro Glu Pro Cys Pro
1235 1240 1245
Val Tyr Cys Pro Lys Gly Gln Lys Gly Glu Pro Gly Glu Met Gly
1250 1255 1260
Leu Arg Gly Gln Val Gly Pro Pro Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly
1265 1270 1275
Arg Thr Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ser Ala Thr
1280 1285 1290
Ala Lys Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Arg Pro Gly
1295 1300 1305
Ser Pro Gly Arg Ala Gly Asn Pro Gly Thr Pro Gly Ala Pro Gly
1310 1315 1320
Leu Lys Gly Ser Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Asp Pro Gly
1325 1330 1335
Glu Arg Gly Pro Arg Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly
1340 1345 1350
Gln Val Ile Gly Gly Glu Gly Pro Gly Leu Pro Gly Arg Lys Gly
1355 1360 1365
Asp Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Leu Gly
1370 1375 1380
Asp Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Thr Ala Met
1385 1390 1395
Lys Gly Asp Lys Gly Asp Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro
1400 1405 1410
Gly Glu Gly Gly Ile Ala Pro Gly Glu Pro Gly Leu Pro Gly Leu
1415 1420 1425
Pro Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Lys
1430 1435 1440
Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ser Glu Asp Gly Ala Pro Gly Leu Pro
1445 1450 1455
Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Arg Gly Pro Pro
1460 1465 1470
Gly Ala Ile Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Pro Gly Pro Leu
1475 1480 1485
Gly Glu Ala Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Ala
1490 1495 1500
Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Arg Pro Gly Ala Lys
1505 1510 1515
Gly Pro Glu Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Arg Gln Gly Glu Lys
1520 1525 1530
Gly Glu Pro Gly Arg Pro Gly Asp Pro Ala Val Val Gly Pro Ala
1535 1540 1545
Val Ala Gly Pro Lys Gly Glu Lys Gly Asp Val Gly Pro Ala Gly
1550 1555 1560
Pro Arg Gly Ala Thr Gly Val Gln Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly
1565 1570 1575
Leu Val Leu Pro Gly Asp Pro Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Asp
1580 1585 1590
Arg Gly Pro Ile Gly Leu Thr Gly Arg Ala Gly Pro Pro Gly Asp
1595 1600 1605
Ser Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Arg Pro Gly Pro
1610 1615 1620
Pro Gly Pro Val Gly Pro Arg Gly Arg Asp Gly Glu Val Gly Glu
1625 1630 1635
Lys Gly Asp Glu Gly Pro Pro Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Lys
1640 1645 1650
Ala Gly Glu Arg Gly Leu Arg Gly Ala Pro Gly Val Arg Gly Pro
1655 1660 1665
Val Gly Glu Lys Gly Asp Gln Gly Asp Pro Gly Glu Asp Gly Arg
1670 1675 1680
Asn Gly Ser Pro Gly Ser Ser Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Glu
1685 1690 1695
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Leu Val Asp Thr Gly Pro
1700 1705 1710
Gly Ala Arg Glu Lys Gly Glu Pro Gly Asp Arg Gly Gln Glu Gly
1715 1720 1725
Pro Arg Gly Pro Lys Gly Asp Pro Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly
1730 1735 1740
Glu Arg Gly Ile Glu Gly Phe Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly
1745 1750 1755
Asp Pro Gly Val Arg Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly
1760 1765 1770
Pro Pro Gly Leu Asp Gly Arg Ser Gly Leu Asp Gly Lys Pro Gly
1775 1780 1785
Ala Ala Gly Pro Ser Gly Pro Asn Gly Ala Ala Gly Lys Ala Gly
1790 1795 1800
Asp Pro Gly Arg Asp Gly Leu Pro Gly Leu Arg Gly Glu Gln Gly
1805 1810 1815
Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Lys Pro Gly
1820 1825 1830
Glu Asp Gly Lys Pro Gly Leu Asn Gly Lys Asn Gly Glu Pro Gly
1835 1840 1845
Asp Pro Gly Glu Asp Gly Arg Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ser Gly
1850 1855 1860
Ala Ser Gly Arg Glu Gly Arg Asp Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
1865 1870 1875
Ala Pro Gly Ile Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly
1880 1885 1890
Pro Val Gly Pro Pro Gly Gln Gly Phe Pro Gly Val Pro Gly Gly
1895 1900 1905
Thr Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Ser Lys Gly Glu
1910 1915 1920
Gln Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Leu Arg Gly Glu Pro Gly Ser
1925 1930 1935
Val Pro Asn Val Asp Arg Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ile Lys Ala
1940 1945 1950
Ser Ala Leu Arg Glu Ile Val Glu Thr Trp Asp Glu Ser Ser Gly
1955 1960 1965
Ser Phe Leu Pro Val Pro Glu Arg Arg Arg Gly Pro Lys Gly Asp
1970 1975 1980
Ser Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Glu Gly Pro Ile Gly Phe
1985 1990 1995
Pro Gly Glu Arg Gly Leu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Pro Gly Pro
2000 2005 2010
Gln Gly Pro Pro Gly Leu Ala Leu Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly
2015 2020 2025
Pro Ser Gly Leu Ala Gly Glu Pro Gly Lys Pro Gly Ile Pro Gly
2030 2035 2040
Leu Pro Gly Arg Ala Gly Gly Val Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly
2045 2050 2055
Glu Arg Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly
2060 2065 2070
Arg Asp Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gly Pro Pro Gly
2075 2080 2085
Pro Pro Gly Pro Lys Val Ser Val Asp Glu Pro Gly Pro Gly Leu
2090 2095 2100
Ser Gly Glu Gln Gly Pro Pro Gly Leu Lys Gly Ala Lys Gly Glu
2105 2110 2115
Pro Gly Ser Asn Gly Asp Gln Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Val
2120 2125 2130
Pro Gly Ile Lys Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Gln
2135 2140 2145
Asp Gly Asn Pro Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Met Ala Gly Pro
2150 2155 2160
Glu Gly Lys Pro Gly Leu Gln Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro
2165 2170 2175
Val Gly Gly His Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Leu
2180 2185 2190
Ala Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Leu Lys Gly Glu
2195 2200 2205
Pro Gly Glu Thr Gly Pro Pro Gly Arg Gly Leu Thr Gly Pro Thr
2210 2215 2220
Gly Ala Val Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Leu Val
2225 2230 2235
Gly Pro Gln Gly Ser Pro Gly Leu Pro Gly Gln Val Gly Glu Thr
2240 2245 2250
Gly Lys Pro Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Ala Ser Gly Lys Asp
2255 2260 2265
Gly Asp Arg Gly Ser Pro Gly Val Pro Gly Ser Pro Gly Leu Pro
2270 2275 2280
Gly Pro Val Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Ala Pro
2285 2290 2295
Gly Gln Ala Val Val Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Glu Lys Gly
2300 2305 2310
Ala Pro Gly Gly Leu Ala Gly Asp Leu Val Gly Glu Pro Gly Ala
2315 2320 2325
Lys Gly Asp Arg Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Glu Lys Gly Glu
2330 2335 2340
Ala Gly Arg Ala Gly Glu Pro Gly Asp Pro Gly Glu Asp Gly Gln
2345 2350 2355
Lys Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Phe Lys Gly Asp Pro Gly Val
2360 2365 2370
Gly Val Pro Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Lys
2375 2380 2385
Gly Asp Leu Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly Val Val
2390 2395 2400
Gly Phe Pro Gly Gln Thr Gly Pro Arg Gly Glu Met Gly Gln Pro
2405 2410 2415
Gly Pro Ser Gly Glu Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Arg Glu
2420 2425 2430
Gly Ile Pro Gly Pro Leu Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Val
2435 2440 2445
Gly Pro Pro Gly Ala Ser Gly Leu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Pro
2450 2455 2460
Gly Val Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Glu Pro Gly
2465 2470 2475
Ile Arg Gly Glu Asp Gly Arg Pro Gly Gln Glu Gly Pro Arg Gly
2480 2485 2490
Leu Thr Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly
2495 2500 2505
Asp Val Gly Ser Ala Gly Leu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Ser Ala
2510 2515 2520
Val Ile Leu Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Ala Lys Gly Asp Met
2525 2530 2535
Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Leu Asp Gly Asp Lys Gly Pro Arg
2540 2545 2550
Gly Asp Asn Gly Asp Pro Gly Asp Lys Gly Ser Lys Gly Glu Pro
2555 2560 2565
Gly Asp Lys Gly Ser Ala Gly Leu Pro Gly Leu Arg Gly Leu Leu
2570 2575 2580
Gly Pro Gln Gly Gln Pro Gly Ala Ala Gly Ile Pro Gly Asp Pro
2585 2590 2595
Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Pro Gly Ile Arg Gly Glu Lys
2600 2605 2610
Gly Asp Val Gly Phe Met Gly Pro Arg Gly Leu Lys Gly Glu Arg
2615 2620 2625
Gly Val Lys Gly Ala Cys Gly Leu Asp Gly Glu Lys Gly Asp Lys
2630 2635 2640
Gly Glu Ala Gly Pro Pro Gly Arg Pro Gly Leu Ala Gly His Lys
2645 2650 2655
Gly Glu Met Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Gln Ser Gly Ala Pro
2660 2665 2670
Gly Lys Glu Gly Leu Ile Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Asp
2675 2680 2685
Gly Gln Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys Gly Glu Arg
2690 2695 2700
Gly Thr Pro Gly Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro Ser Gly Asn Asp
2705 2710 2715
Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Val Gly Pro Arg
2720 2725 2730
Gly Pro Glu Gly Leu Gln Gly Gln Lys Gly Glu Arg Gly Pro Pro
2735 2740 2745
Gly Glu Arg Val Val Gly Ala Pro Gly Val Pro Gly Ala Pro Gly
2750 2755 2760
Glu Arg Gly Glu Gln Gly Arg Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly
2765 2770 2775
Glu Lys Gly Glu Ala Ala Leu Thr Glu Asp Asp Ile Arg Gly Phe
2780 2785 2790
Val Arg Gln Glu Met Ser Gln His Cys Ala Cys Gln Gly Gln Phe
2795 2800 2805
Ile Ala Ser Gly Ser Arg Pro Leu Pro Ser Tyr Ala Ala Asp Thr
2810 2815 2820
Ala Gly Ser Gln Leu His Ala Val Pro Val Leu Arg Val Ser His
2825 2830 2835
Ala Glu Glu Glu Glu Arg Val Pro Pro Glu Asp Asp Glu Tyr Ser
2840 2845 2850
Glu Tyr Ser Glu Tyr Ser Val Glu Glu Tyr Gln Asp Pro Glu Ala
2855 2860 2865
Pro Trp Asp Ser Asp Asp Pro Cys Ser Leu Pro Leu Asp Glu Gly
2870 2875 2880
Ser Cys Thr Ala Tyr Thr Leu Arg Trp Tyr His Arg Ala Val Thr
2885 2890 2895
Gly Ser Thr Glu Ala Cys His Pro Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gly
2900 2905 2910
Gly Asn Ala Asn Arg Phe Gly Thr Arg Glu Ala Cys Glu Arg Arg
2915 2920 2925
Cys Pro Pro Arg Val Val Gln Ser Gln Gly Thr Gly Thr Ala Gln
2930 2935 2940
Asp
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 53
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 3
cgacttgtgt tgggactggc tagcgccacc atgacgctgc ggcttctggt ggc 53
&lt;210&gt; 4
&lt;211&gt; 22
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 4
gggcttagct acactgtgcg gg 22
&lt;210&gt; 5
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 5
cctgcccagt gtattgtcca aagg 24
&lt;210&gt; 6
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 6
ctgctggcat caaggcatct g 21
&lt;210&gt; 7
&lt;211&gt; 22
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 7
cccgcacagt gtagctaagc cc 22
&lt;210&gt; 8
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 8
cctttggaca atacactggg cagg 24
&lt;210&gt; 9
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 9
cagatgcctt gatgccagca g 21
&lt;210&gt; 10
&lt;211&gt; 53
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 10
cgtgatttca tttgctacac gtaatcgatt cagtcctggg cagtacctgt ccc 53
&lt;210&gt; 11
&lt;211&gt; 341
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
多核苷酸
&lt;400&gt; 11
cgctcccaga acatcaccta ccactgcaag aacagcgtgg cctacatgga ccagcagact 60
ggcaacctca agaaggccct gctcctccag ggctccaacg agatcgagat ccgcgccgag 120
ggcaacagcc gcttcaccta cagcgtcact gtcgatggct gcacgagtca caccggagcc 180
tggggcaaga cagtgattga atacaaaacc accaagacct cccgcctgcg catcatcgat 240
gtggccccct tggacgttgg tgccccagac caggaattcg gcttcgacgt tggccatgtc 300
tgcttcctgt aaatcgatta cgtgtagcaa atgaaatcac g 341
&lt;210&gt; 12
&lt;211&gt; 730
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
多核苷酸
&lt;400&gt; 12
ttcaaatttt cgggggatcg cattagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 60
catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggttga 120
ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 180
atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggta 240
gtacatcaag tgtatcatac gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 300
cccgcctggt attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 360
tgcgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 420
ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 480
ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 540
acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tggtttagtg 600
aaccgtcaga tccgctagca ttgtgtgctt ttcgggccac catgacgctg cggcttctgg 660
tggccgcgct ctgcgccggg atcctggcag aggcgccccg agtgcgagcc cagcacaggg 720
agagagtgac 730
&lt;210&gt; 13
&lt;211&gt; 740
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
多核苷酸
&lt;400&gt; 13
agtgcgagcc cagcacaggg agagagtgac ctgcacgcgc ctttacgccg ctgacattgt 60
gttcttactg gatggctcct catccattgg ccgcagcaat ttccgcgagg tccgcagctt 120
tctcgaaggg ctggtgctgc ctttctctgg agcagccagt gcacagggtg tgcgctttgc 180
cacagtgcag tacagcgatg acccacggac agagttcggc ctggatgcac ttggctctgg 240
gggtgatgtg atccgcgcca tccgtgagct tagctacaag gggggcaaca ctcgcacagg 300
ggctgcaatt ctccatgtgg ctgaccatgt cttcctgccc cagctggccc gacctggtgt 360
ccccaaggtc tgcatcctga tcacgtctct catgcagagg aggaagagcg ggtaccccct 420
gaggatgatg agtactctga atactccgag tattctgtgg aggagtacca ggaccctgaa 480
gctccttggg atagtgatga cccctgttcc ctgccactgg atgagggctc ctgcactgcc 540
tacaccctgc gctggtacca tcgggctgtg acaggcagca cagaggcctg tcaccctttt 600
gtctatggtg gctgtggagg gaatgccaac cgttttggga cccgtgaggc ctgcgagcgc 660
cgctgcccac cccgggtggt ccagagccag gggacaggta ctgcccagga ctgagtacct 720
ttaagaccaa tgacttacaa 740
&lt;210&gt; 14
&lt;211&gt; 20
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 14
atggaaaaac gccagcaacg 20
&lt;210&gt; 15
&lt;211&gt; 20
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 15
ctgtcaccct tttgtctatg 20
&lt;210&gt; 16
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 16
gttgccggac acttcttgtc ctct 24
&lt;210&gt; 17
&lt;211&gt; 22
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 17
cccgcacagt gtagctaagc cc 22
&lt;210&gt; 18
&lt;211&gt; 20
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 18
agaggccccg aaggacttca 20
&lt;210&gt; 19
&lt;211&gt; 467
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
多核苷酸
&lt;400&gt; 19
acagcagaga tccagtttgg ttaattaagc attagttatt aatagtaatc aattacgggg 60
tcattaagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaac cgcgtctctc atgcagagga 120
ggaagagcgg gtaccccctg aggatgatga gtactctgaa tactccgagt attctgtgga 180
ggagtaccag gaccctgaag ctccttggga tagtgatgac ccctgttccc tgccactgga 240
tgagggctcc tgcactgcct acaccctgcg ctggtaccat cgggctgtga caggcagcac 300
agaggcctgt cacccttttg tctatggtgg ctgtggaggg aatgccaacc gttttgggac 360
ccgtgaggcc tgcgagcgcc gctgcccacc ccgggtggtc cagagccagg ggacaggtac 420
tgcccaggac tgatcgatac cgtcgacctc gagacctaga aaaacat 467
&lt;210&gt; 20
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 20
gtagacataa tagcaacaga c 21
&lt;210&gt; 21
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 21
tattgctact tgtgattgct c 21
&lt;210&gt; 22
&lt;211&gt; 20
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 22
agaggccccg aaggacttca 20
&lt;210&gt; 23
&lt;211&gt; 8832
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
多核苷酸
&lt;400&gt; 23
atgacgctgc ggcttctggt ggccgcgctc tgcgccggga tcctggcaga ggcgccccga 60
gtgcgagccc agcacaggga gagagtgacc tgcacgcgcc tttacgccgc tgacattgtg 120
ttcttactgg atggctcctc atccattggc cgcagcaatt tccgcgaggt ccgcagcttt 180
ctcgaagggc tggtgctgcc tttctctgga gcagccagtg cacagggtgt gcgctttgcc 240
acagtgcagt acagcgatga cccacggaca gagttcggcc tggatgcact tggctctggg 300
ggtgatgtga tccgcgccat ccgtgagctt agctacaagg ggggcaacac tcgcacaggg 360
gctgcaattc tccatgtggc tgaccatgtc ttcctgcccc agctggcccg acctggtgtc 420
cccaaggtct gcatcctgat cacagacggg aagtcccagg acctggtgga cacagctgcc 480
caaaggctga aggggcaggg ggtcaagcta tttgctgtgg ggatcaagaa tgctgaccct 540
gaggagctga agcgagttgc ctcacagccc accagtgact tcttcttctt cgtcaatgac 600
ttcagcatct tgaggacact actgcccctc gtttcccgga gagtgtgcac gactgctggt 660
ggcgtgcctg tgacccgacc tccggatgac tcgacctctg ctccacgaga cctggtgctg 720
tctgagccaa gcagccaatc cttgagagta cagtggacag cggccagtgg ccctgtgact 780
ggctacaagg tccagtacac tcctctgacg gggctgggac agccactgcc gagtgagcgg 840
caggaggtga acgtcccagc tggtgagacc agtgtgcggc tgcggggtct ccggccactg 900
accgagtacc aagtgactgt gattgccctc tacgccaaca gcatcgggga ggctgtgagc 960
gggacagctc ggaccactgc cctagaaggg ccggaactga ccatccagaa taccacagcc 1020
cacagcctcc tggtggcctg gcggagtgtg ccaggtgcca ctggctaccg tgtgacatgg 1080
cgggtcctca gtggtgggcc cacacagcag caggagctgg gccctgggca gggttcagtg 1140
ttgctgcgtg acttggagcc tggcacggac tatgaggtga ccgtgagcac cctatttggc 1200
cgcagtgtgg ggcccgccac ttccctgatg gctcgcactg acgcttctgt tgagcagacc 1260
ctgcgcccgg tcatcctggg ccccacatcc atcctccttt cctggaactt ggtgcctgag 1320
gcccgtggct accggttgga atggcggcgt gagactggct tggagccacc gcagaaggtg 1380
gtactgccct ctgatgtgac ccgctaccag ttggatgggc tgcagccggg cactgagtac 1440
cgcctcacac tctacactct gctggagggc cacgaggtgg ccacccctgc aaccgtggtt 1500
cccactggac cagagctgcc tgtgagccct gtaacagacc tgcaagccac cgagctgccc 1560
gggcagcggg tgcgagtgtc ctggagccca gtccctggtg ccacccagta ccgcatcatt 1620
gtgcgcagca cccagggggt tgagcggacc ctggtgcttc ctgggagtca gacagcattc 1680
gacttggatg acgttcaggc tgggcttagc tacactgtgc gggtgtctgc tcgagtgggt 1740
ccccgtgagg gcagtgccag tgtcctcact gtccgccggg agccggaaac tccacttgct 1800
gttccagggc tgcgggttgt ggtgtcagat gcaacgcgag tgagggtggc ctggggaccc 1860
gtccctggag ccagtggatt tcggattagc tggagcacag gcagtggtcc ggagtccagc 1920
cagacactgc ccccagactc tactgccaca gacatcacag ggctgcagcc tggaaccacc 1980
taccaggtgg ctgtgtcggt actgcgaggc agagaggagg gccctgctgc agtcatcgtg 2040
gctcgaacgg acccactggg cccagtgagg acggtccatg tgactcaggc cagcagctca 2100
tctgtcacca ttacctggac cagggttcct ggcgccacag gatacagggt ttcctggcac 2160
tcagcccacg gcccagagaa atcccagttg gtttctgggg aggccacggt ggctgagctg 2220
gatggactgg agccagatac tgagtatacg gtgcatgtga gggcccatgt ggctggcgtg 2280
gatgggcccc ctgcctctgt ggttgtgagg actgcccctg agcctgtggg tcgtgtgtcg 2340
aggctgcaga tcctcaatgc ttccagcgac gttctacgga tcacctgggt aggggtcact 2400
ggagccacag cttacagact ggcctggggc cggagtgaag gcggccccat gaggcaccag 2460
atactcccag gaaacacaga ctctgcagag atccggggtc tcgaaggtgg agtcagctac 2520
tcagtgcgag tgactgcact tgtcggggac cgcgagggca cacctgtctc cattgttgtc 2580
actacgccgc ctgaggctcc gccagccctg gggacgcttc acgtggtgca gcgcggggag 2640
cactcgctga ggctgcgctg ggagccggtg cccagagcgc agggcttcct tctgcactgg 2700
caacctgagg gtggccagga acagtcccgg gtcctggggc ccgagctcag cagctatcac 2760
ctggacgggc tggagccagc gacacagtac cgcgtgaggc tgagtgtcct agggccggct 2820
ggagaagggc cctctgcaga ggtgactgcg cgcactgagt cacctcgtgt tccaagcatt 2880
gaactacgtg tggtggacac ctcgatcgac tcggtgactt tggcctggac tccagtgtcc 2940
agggcatcca gctacatcct atcctggcgg ccactcagag gccctggcca ggaagtgcct 3000
gggtccccgc agacacttcc agggatctca agctcccagc gggtgacagg gctagagcct 3060
ggcgtctctt acatcttctc cctgacgcct gtcctggatg gtgtgcgggg tcctgaggca 3120
tctgtcacac agacgccagt gtgcccccgt ggcctggcgg atgtggtgtt cctaccacat 3180
gccactcaag acaatgctca ccgtgcggag gctacgagga gggtcctgga gcgtctggtg 3240
ttggcacttg ggcctcttgg gccacaggca gttcaggttg gcctgctgtc ttacagtcat 3300
cggccctccc cactgttccc actgaatggc tcccatgacc ttggcattat cttgcaaagg 3360
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&lt;210&gt; 24
&lt;211&gt; 8832
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 智人
&lt;400&gt; 24
atgacgctgc ggcttctggt ggccgcgctc tgcgccggga tcctggcaga ggcgccccga 60
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ggagaagctg cactgacgga ggatgacatc cggggctttg tgcgccaaga gatgagtcag 8400
cactgtgcct gccagggcca gttcatcgca tctggatcac gacccctccc tagttatgct 8460
gcagacactg ccggctccca gctccatgct gtgcctgtgc tccgcgtctc tcatgcagag 8520
gaggaagagc gggtaccccc tgaggatgat gagtactctg aatactccga gtattctgtg 8580
gaggagtacc aggaccctga agctccttgg gatagtgatg acccctgttc cctgccactg 8640
gatgagggct cctgcactgc ctacaccctg cgctggtacc atcgggctgt gacaggcagc 8700
acagaggcct gtcacccttt tgtctatggt ggctgtggag ggaatgccaa ccgttttggg 8760
acccgtgagg cctgcgagcg ccgctgccca ccccgggtgg tccagagcca ggggacaggt 8820
actgcccagg ac 8832
&lt;210&gt; 25
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 25
acctgaaagc gaaagggaaa c 21
&lt;210&gt; 26
&lt;211&gt; 23
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 26
cacccatctc tctccttcta gcc 23
&lt;210&gt; 27
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
探针
&lt;400&gt; 27
agctctctcg acgcaggact cggc 24
&lt;210&gt; 28
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 28
cactcccaac gaagacaaga t 21
&lt;210&gt; 29
&lt;211&gt; 22
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 29
gtctaaccag agagacccag ta 22
&lt;210&gt; 30
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
探针
&lt;400&gt; 30
tttgtaaacc ggtgcagctg cttt 24
&lt;210&gt; 31
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 31
acctgaaagc gaaagggaaa c 21
&lt;210&gt; 32
&lt;211&gt; 23
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
引物
&lt;400&gt; 32
cacccatctc tctccttcta gcc 23
&lt;210&gt; 33
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
探针
&lt;400&gt; 33
agctctctcg acgcaggact cggc 24
&lt;210&gt; 34
&lt;211&gt; 16777
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成
多核苷酸
&lt;400&gt; 34
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400
gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat 2460
tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 2520
agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttcgg gtttattaca gggacagcag 2580
agatccagtt tggttaatta agcattagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 2640
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggtt 2700
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 2760
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 2820
tagtacatca agtgtatcat acgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 2880
ggcccgcctg gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 2940
tctgcgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 3000
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 3060
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 3120
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag 3180
tgaaccgtca gatccgctag cattgtgtgc ttttcgggcc accatgacgc tgcggcttct 3240
ggtggccgcg ctctgcgccg ggatcctggc agaggcgccc cgagtgcgag cccagcacag 3300
ggagagagtg acctgcacgc gcctttacgc cgctgacatt gtgttcttac tggatggctc 3360
ctcatccatt ggccgcagca atttccgcga ggtccgcagc tttctcgaag ggctggtgct 3420
gcctttctct ggagcagcca gtgcacaggg tgtgcgcttt gccacagtgc agtacagcga 3480
tgacccacgg acagagttcg gcctggatgc acttggctct gggggtgatg tgatccgcgc 3540
catccgtgag cttagctaca aggggggcaa cactcgcaca ggggctgcaa ttctccatgt 3600
ggctgaccat gtcttcctgc cccagctggc ccgacctggt gtccccaagg tctgcatcct 3660
gatcacagac gggaagtccc aggacctggt ggacacagct gcccaaaggc tgaaggggca 3720
gggggtcaag ctatttgctg tggggatcaa gaatgctgac cctgaggagc tgaagcgagt 3780
tgcctcacag cccaccagtg acttcttctt cttcgtcaat gacttcagca tcttgaggac 3840
actactgccc ctcgtttccc ggagagtgtg cacgactgct ggtggcgtgc ctgtgacccg 3900
acctccggat gactcgacct ctgctccacg agacctggtg ctgtctgagc caagcagcca 3960
atccttgaga gtacagtgga cagcggccag tggccctgtg actggctaca aggtccagta 4020
cactcctctg acggggctgg gacagccact gccgagtgag cggcaggagg tgaacgtccc 4080
agctggtgag accagtgtgc ggctgcgggg tctccggcca ctgaccgagt accaagtgac 4140
tgtgattgcc ctctacgcca acagcatcgg ggaggctgtg agcgggacag ctcggaccac 4200
tgccctagaa gggccggaac tgaccatcca gaataccaca gcccacagcc tcctggtggc 4260
ctggcggagt gtgccaggtg ccactggcta ccgtgtgaca tggcgggtcc tcagtggtgg 4320
gcccacacag cagcaggagc tgggccctgg gcagggttca gtgttgctgc gtgacttgga 4380
gcctggcacg gactatgagg tgaccgtgag caccctattt ggccgcagtg tggggcccgc 4440
cacttccctg atggctcgca ctgacgcttc tgttgagcag accctgcgcc cggtcatcct 4500
gggccccaca tccatcctcc tttcctggaa cttggtgcct gaggcccgtg gctaccggtt 4560
ggaatggcgg cgtgagactg gcttggagcc accgcagaag gtggtactgc cctctgatgt 4620
gacccgctac cagttggatg ggctgcagcc gggcactgag taccgcctca cactctacac 4680
tctgctggag ggccacgagg tggccacccc tgcaaccgtg gttcccactg gaccagagct 4740
gcctgtgagc cctgtaacag acctgcaagc caccgagctg cccgggcagc gggtgcgagt 4800
gtcctggagc ccagtccctg gtgccaccca gtaccgcatc attgtgcgca gcacccaggg 4860
ggttgagcgg accctggtgc ttcctgggag tcagacagca ttcgacttgg atgacgttca 4920
ggctgggctt agctacactg tgcgggtgtc tgctcgagtg ggtccccgtg agggcagtgc 4980
cagtgtcctc actgtccgcc gggagccgga aactccactt gctgttccag ggctgcgggt 5040
tgtggtgtca gatgcaacgc gagtgagggt ggcctgggga cccgtccctg gagccagtgg 5100
atttcggatt agctggagca caggcagtgg tccggagtcc agccagacac tgcccccaga 5160
ctctactgcc acagacatca cagggctgca gcctggaacc acctaccagg tggctgtgtc 5220
ggtactgcga ggcagagagg agggccctgc tgcagtcatc gtggctcgaa cggacccact 5280
gggcccagtg aggacggtcc atgtgactca ggccagcagc tcatctgtca ccattacctg 5340
gaccagggtt cctggcgcca caggatacag ggtttcctgg cactcagccc acggcccaga 5400
gaaatcccag ttggtttctg gggaggccac ggtggctgag ctggatggac tggagccaga 5460
tactgagtat acggtgcatg tgagggccca tgtggctggc gtggatgggc cccctgcctc 5520
tgtggttgtg aggactgccc ctgagcctgt gggtcgtgtg tcgaggctgc agatcctcaa 5580
tgcttccagc gacgttctac ggatcacctg ggtaggggtc actggagcca cagcttacag 5640
actggcctgg ggccggagtg aaggcggccc catgaggcac cagatactcc caggaaacac 5700
agactctgca gagatccggg gtctcgaagg tggagtcagc tactcagtgc gagtgactgc 5760
acttgtcggg gaccgcgagg gcacacctgt ctccattgtt gtcactacgc cgcctgaggc 5820
tccgccagcc ctggggacgc ttcacgtggt gcagcgcggg gagcactcgc tgaggctgcg 5880
ctgggagccg gtgcccagag cgcagggctt ccttctgcac tggcaacctg agggtggcca 5940
ggaacagtcc cgggtcctgg ggcccgagct cagcagctat cacctggacg ggctggagcc 6000
agcgacacag taccgcgtga ggctgagtgt cctagggccg gctggagaag ggccctctgc 6060
agaggtgact gcgcgcactg agtcacctcg tgttccaagc attgaactac gtgtggtgga 6120
cacctcgatc gactcggtga ctttggcctg gactccagtg tccagggcat ccagctacat 6180
cctatcctgg cggccactca gaggccctgg ccaggaagtg cctgggtccc cgcagacact 6240
tccagggatc tcaagctccc agcgggtgac agggctagag cctggcgtct cttacatctt 6300
ctccctgacg cctgtcctgg atggtgtgcg gggtcctgag gcatctgtca cacagacgcc 6360
agtgtgcccc cgtggcctgg cggatgtggt gttcctacca catgccactc aagacaatgc 6420
tcaccgtgcg gaggctacga ggagggtcct ggagcgtctg gtgttggcac ttgggcctct 6480
tgggccacag gcagttcagg ttggcctgct gtcttacagt catcggccct ccccactgtt 6540
cccactgaat ggctcccatg accttggcat tatcttgcaa aggatccgtg acatgcccta 6600
catggaccca agtgggaaca acctgggcac agccgtggtc acagctcaca gatacatgtt 6660
ggcaccagat gctcctgggc gccgccagca cgtaccaggg gtgatggttc tgctagtgga 6720
tgaacccttg agaggtgaca tattcagccc catccgtgag gcccaggctt ctgggcttaa 6780
tgtggtgatg ttgggaatgg ctggagcgga cccagagcag ctgcgtcgct tggcgccggg 6840
tatggactct gtccagacct tcttcgccgt ggatgatggg ccaagcctgg accaggcagt 6900
cagtggtctg gccacagccc tgtgtcaggc atccttcact actcagcccc ggccagagcc 6960
ctgcccagtg tattgtccaa agggccagaa gggggaacct ggagagatgg gcctgagagg 7020
acaagttggg cctcctggcg accctggcct cccgggcagg accggtgctc ccggccccca 7080
ggggccccct ggaagtgcca ctgccaaggg cgagaggggc ttccctggag cagatgggcg 7140
tccaggcagc cctggccgcg ccgggaatcc tgggacccct ggagcccctg gcctaaaggg 7200
ctctccaggg ttgcctggcc ctcgtgggga cccgggagag cgaggacctc gaggcccaaa 7260
gggggagccg ggggctcccg gacaagtcat cggaggtgaa ggacctgggc ttcctgggcg 7320
gaaaggggac cctggaccat cgggcccccc tggacctcgt ggaccactgg gggacccagg 7380
accccgtggc cccccagggc ttcctggaac agccatgaag ggtgacaaag gcgatcgtgg 7440
ggagcggggt ccccctggac caggtgaagg tggcattgct cctggggagc ctgggctgcc 7500
gggtcttccc ggaagccctg gaccccaagg ccccgttggc ccccctggaa agaaaggaga 7560
aaaaggtgac tctgaggatg gagctccagg cctcccagga caacctgggt ctccgggtga 7620
gcagggccca cggggacctc ctggagctat tggccccaaa ggtgaccggg gctttccagg 7680
gcccctgggt gaggctggag agaagggcga acgtggaccc ccaggcccag cgggatcccg 7740
ggggctgcca ggggttgctg gacgtcctgg agccaagggt cctgaagggc caccaggacc 7800
cactggccgc caaggagaga agggggagcc tggtcgccct ggggaccctg cagtggtggg 7860
acctgctgtt gctggaccca aaggagaaaa gggagatgtg gggcccgctg ggcccagagg 7920
agctaccgga gtccaagggg aacggggccc acccggcttg gttcttcctg gagaccctgg 7980
ccccaaggga gaccctggag accggggtcc cattggcctt actggcagag caggaccccc 8040
aggtgactca gggcctcctg gagagaaggg agaccctggg cggcctggcc ccccaggacc 8100
tgttggcccc cgaggacgag atggtgaagt tggagagaaa ggtgacgagg gtcctccggg 8160
tgacccgggt ttgcctggaa aagcaggcga gcgtggcctt cggggggcac ctggagttcg 8220
ggggcctgtg ggtgaaaagg gagaccaggg agatcctgga gaggatggac gaaatggcag 8280
ccctggatca tctggaccca agggtgaccg tggggagccg ggtcccccag gacccccggg 8340
acggctggta gacacaggac ctggagccag agagaaggga gagcctgggg accgcggaca 8400
agagggtcct cgagggccca agggtgatcc tggcctccct ggagcccctg gggaaagggg 8460
cattgaaggg tttcggggac ccccaggccc acagggggac ccaggtgtcc gaggcccagc 8520
aggagaaaag ggtgaccggg gtccccctgg gctggatggc cggagcggac tggatgggaa 8580
accaggagcc gctgggccct ctgggccgaa tggtgctgca ggcaaagctg gggacccagg 8640
gagagacggg cttccaggcc tccgtggaga acaaggcctc cctggcccct ctggtccccc 8700
tggattaccg ggaaagccag gcgaggatgg gaaacctggc ctgaatggaa aaaacggaga 8760
acctggggac cctggagaag acgggaggaa gggagagaaa ggagattcag gcgcctctgg 8820
gagagaaggt cgtgatggcc ccaagggtga gcgtggagct cctggtatcc ttggacccca 8880
ggggcctcca ggcctcccag ggccagtggg ccctcctggc cagggttttc ctggtgtccc 8940
aggaggcacg ggccccaagg gtgaccgtgg ggagactgga tccaaagggg agcagggcct 9000
ccctggagag cgtggcctgc gaggagagcc tggaagtgtg ccgaatgtgg atcggttgct 9060
ggaaactgct ggcatcaagg catctgccct gcgggagatc gtggagacct gggatgagag 9120
ctctggtagc ttcctgcctg tgcccgaacg gcgtcgaggc cccaaggggg actcaggcga 9180
acagggcccc ccaggcaagg agggccccat cggctttcct ggagaacgcg ggctgaaggg 9240
cgaccgtgga gaccctggcc ctcaggggcc acctggtctg gcccttgggg agaggggccc 9300
ccccgggcct tccggccttg ccggggagcc tggaaagcct ggtattcccg ggctcccagg 9360
cagggctggg ggtgtgggag aggcaggaag gccaggagag aggggagaac ggggagagaa 9420
aggagaacgt ggagaacagg gcagagatgg ccctcctgga ctccctggaa cccctgggcc 9480
ccccggaccc cctggcccca aggtgtctgt ggatgagcca ggtcctggac tctctggaga 9540
acagggaccc cctggactca agggtgctaa gggggagccg ggcagcaatg gtgaccaagg 9600
tcccaaagga gacaggggtg tgccaggcat caaaggagac cggggagagc ctggaccgag 9660
gggtcaggac ggcaacccgg gtctaccagg agagcgtggt atggctgggc ctgaagggaa 9720
gccgggtctg cagggtccaa gaggcccccc tggcccagtg ggtggtcatg gagaccctgg 9780
accacctggt gccccgggtc ttgctggccc tgcaggaccc caaggacctt ctggcctgaa 9840
gggggagcct ggagagacag gacctccagg acggggcctg actggaccta ctggagctgt 9900
gggacttcct ggaccccccg gcccttcagg ccttgtgggt ccacaggggt ctccaggttt 9960
gcctggacaa gtgggggaga cagggaagcc gggagcccca ggtcgagatg gtgccagtgg 10020
aaaagatgga gacagaggga gccctggtgt gccagggtca ccaggtctgc ctggccctgt 10080
cggacctaaa ggagaacctg gccccacggg ggcccctgga caggctgtgg tcgggctccc 10140
tggagcaaag ggagagaagg gagcccctgg aggccttgct ggagacctgg tgggtgagcc 10200
gggagccaaa ggtgaccgag gactgccagg gccgcgaggc gagaagggtg aagctggccg 10260
tgcaggggag cccggagacc ctggggaaga tggtcagaaa ggggctccag gacccaaagg 10320
tttcaagggt gacccaggag tcggggtccc gggctcccct gggcctcctg gccctccagg 10380
tgtgaaggga gatctgggcc tccctggcct gcccggtgct cctggtgttg ttgggttccc 10440
gggtcagaca ggccctcgag gagagatggg tcagccaggc cctagtggag agcggggtct 10500
ggcaggcccc ccagggagag aaggaatccc aggacccctg gggccacctg gaccaccggg 10560
gtcagtggga ccacctgggg cctctggact caaaggagac aagggagacc ctggagtagg 10620
gctgcctggg ccccgaggcg agcgtgggga gccaggcatc cggggtgaag atggccgccc 10680
cggccaggag ggaccccgag gactcacggg gccccctggc agcaggggag agcgtgggga 10740
gaagggtgat gttgggagtg caggactaaa gggtgacaag ggagactcag ctgtgatcct 10800
ggggcctcca ggcccacggg gtgccaaggg ggacatgggt gaacgagggc ctcggggctt 10860
ggatggtgac aaaggacctc ggggagacaa tggggaccct ggtgacaagg gcagcaaggg 10920
agagcctggt gacaagggct cagccgggtt gccaggactg cgtggactcc tgggacccca 10980
gggtcaacct ggtgcagcag ggatccctgg tgacccggga tccccaggaa aggatggagt 11040
gcctggtatc cgaggagaaa aaggagatgt tggcttcatg ggtccccggg gcctcaaggg 11100
tgaacgggga gtgaagggag cctgtggcct tgatggagag aagggagaca agggagaagc 11160
tggtccccca ggccgccccg ggctggcagg acacaaagga gagatggggg agcctggtgt 11220
gccgggccag tcgggggccc ctggcaagga gggcctgatc ggtcccaagg gtgaccgagg 11280
ctttgacggg cagccaggcc ccaagggtga ccagggcgag aaaggggagc ggggaacccc 11340
aggaattggg ggcttcccag gccccagtgg aaatgatggc tctgctggtc ccccagggcc 11400
acctggcagt gttggtccca gaggccccga aggacttcag ggccagaagg gtgagcgagg 11460
tccccccgga gagagagtgg tgggggctcc tggggtccct ggagctcctg gcgagagagg 11520
ggagcagggg cggccagggc ctgccggtcc tcgaggcgag aagggagaag ctgcactgac 11580
ggaggatgac atccggggct ttgtgcgcca agagatgagt cagcactgtg cctgccaggg 11640
ccagttcatc gcatctggat cacgacccct ccctagttat gctgcagaca ctgccggctc 11700
ccagctccat gctgtgcctg tgctccgcgt ctctcatgca gaggaggaag agcgggtacc 11760
ccctgaggat gatgagtact ctgaatactc cgagtattct gtggaggagt accaggaccc 11820
tgaagctcct tgggatagtg atgacccctg ttccctgcca ctggatgagg gctcctgcac 11880
tgcctacacc ctgcgctggt accatcgggc tgtgacaggc agcacagagg cctgtcaccc 11940
ttttgtctat ggtggctgtg gagggaatgc caaccgtttt gggacccgtg aggcctgcga 12000
gcgccgctgc ccaccccggg tggtccagag ccaggggaca ggtactgccc aggactgatc 12060
gataccgtcg acctcgagac ctagaaaaac atggagcaat cacaagtagc aatacagcag 12120
ctaccaatgc tgattgtgcc tggctagaag cacaagagga ggaggaggtg ggttttccag 12180
tcacacctca ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact 12240
ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatatcc 12300
ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct acttccctga ttggcagaac tacacaccag 12360
ggccagggat cagatatcca ctgacctttg gatggtgcta caagctagta ccagttgagc 12420
aagagaaggt agaagaagcc aatgaaggag agaacacccg cttgttacac cctgtgagcc 12480
tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag tattagagtg gaggtttgac agccgcctag 12540
catttcatca catggcccga gagctgcatc cggactgtac tgggtctctc tggttagacc 12600
agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 12660
gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 12720
gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagggcccgt ttaaacccgc 12780
tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 12840
ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 12900
gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 12960
aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 13020
tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc 13080
gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 13140
ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 13200
cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 13260
gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 13320
gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 13380
ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 13440
tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt 13500
ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 13560
aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 13620
gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc 13680
cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa 13740
ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt 13800
gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca 13860
ttttcggatc tgatcagcac gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt 13920
ataatacgac aaggtgagga actaaaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct 13980
caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg 14040
ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag 14100
cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct 14160
ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg 14220
gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc 14280
ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtgc tacgagattt 14340
cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg 14400
ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt 14460
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 14520
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 14580
ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 14640
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 14700
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 14760
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 14820
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 14880
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 14940
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 15000
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 15060
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 15120
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 15180
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 15240
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 15300
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 15360
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 15420
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 15480
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 15540
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 15600
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 15660
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 15720
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 15780
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 15840
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 15900
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 15960
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 16020
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 16080
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 16140
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 16200
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 16260
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 16320
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 16380
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 16440
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 16500
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 16560
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 16620
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 16680
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 16740
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgac 16777

Claims (115)

1.一种治疗患有VII型胶原(C7)缺乏的患者的方法，包括：
从所述缺乏C7的患者的真皮或表皮获得细胞，
使所述细胞与包含编码COL7A1或其功能变体的核苷酸序列的转导慢病毒载体接触，以形成具有载体拷贝数的自体遗传修饰的细胞，其中所述慢病毒载体具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数，
培养所述自体遗传修饰的细胞，
并且向所述缺乏C7的患者给予有效量的所述遗传修饰的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自成纤维细胞和角质形成细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述C7缺乏是营养不良性大疱性表皮松解。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述营养不良性大疱性表皮松解选自隐性营养不良性大疱性表皮松解(RDEB)和显性营养不良性大疱性表皮松解(DDEB)。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述C7缺乏是RDEB。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述RDEB是选自下组的亚型，所述组由Hallopeau-Siemens型RDEB、非Hallopeau-Siemens型RDEB、反常型RDEB、胫前RDEB、肢端RDEV和向心型RDEB组成。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述C7缺乏是DDEB。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述转导慢病毒载体的形式是慢病毒载体颗粒。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述转导慢病毒载体颗粒由转移慢病毒载体构建，所述转移慢病毒载体包含(a)LTR中修饰的5’长末端重复序列，其中所述修饰的5’LTR的启动子是巨细胞病毒启动子，(b)功能性COL7A1基因，(c)至少一个慢病毒中心聚嘌呤段，以及(d)修饰的3’LTR，其中所述修饰的3’LTR包含相对于野生型3’LTR的缺失，其中肝炎病毒转录后调控元件(PRE)已缺失，其中所述COL7A1基因或其功能变体被并入所述细胞中以形成具有功能性COL7A1基因的遗传修饰的细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中存在至少两种慢病毒中心聚嘌呤段元件。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述缺失的PRE是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
13.如权利要求9所述的方法，其中转导慢病毒载体颗粒是由选自由pSMPUW和pFUGW组成的组的慢病毒表达质粒载体构建的。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述慢病毒表达质粒载体是pFUGW。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述转导慢病毒载体颗粒是INXN-2004。
16.如权利要求9所述的方法，其中所述转导慢病毒载体颗粒是INXN-2002。
17.如权利要求1所述的方法，其中通过注射、局部、口服或包埋在生物相容性基质中向所述患者给予遗传修饰的成纤维细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其中通过注射给予所述遗传修饰的成纤维细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其中将所述遗传修饰的细胞皮内注射至所述患者内。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述遗传修饰的成纤维细胞被包封在聚合物胶囊中。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述遗传修饰的成纤维细胞被包埋在胶原基质中。
22.如权利要求17所述的方法，其中所述遗传修饰的成纤维细胞被包埋在水凝胶或网状物中。
23.一种来自患有VII型胶原缺乏的患者的自体遗传修饰的成纤维细胞，所述自体遗传修饰的成纤维细胞被包含功能性COL7A1基因或其功能变体并表达VII型胶原的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数量。
24.一种来自患有隐性营养不良性大疱性表皮松解的患者的自体遗传修饰的成纤维细胞，所述自体遗传修饰的成纤维细胞被包含功能性COL7A1基因或其功能变体并表达VII型胶原的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数。
25.一种来自患有显性营养不良性大疱性表皮松解的患者的自体遗传修饰的成纤维细胞，所述自体遗传修饰的成纤维细胞被包含功能性COL7A1基因或其功能变体并表达VII型胶原的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数。
26.一种由转移载体形成的自身失活慢病毒载体，所述转移载体包含(a)LTR中修饰的5’长末端，其中所述修饰的5’LTR的启动子是巨细胞病毒启动子，(b)COL7A1基因或其功能变体，(c)至少一种慢病毒中心聚嘌呤段元件，以及(d)修饰的3’LTR，其中所述修饰的3’LTR包含相对于野生型3’LTR的缺失，并且其中肝炎病毒转录后调控元件(PRE)已缺失。
27.如权利要求26所述的载体，其中所述载体包含至少两种慢病毒中心聚嘌呤段元件。
28.如权利要求26所述的载体，其中所述缺失的PRE是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
29.如权利要求26所述的载体，其中所述载体包含(a)LTR中修饰的5’长末端，其中所述修饰的5’LTR的启动子是巨细胞病毒启动子，(b)COL7A1基因，(c)两种慢病毒中心聚嘌呤段元件，(d)进一步包含WPRE，以及(e)修饰的3’LTR，其中所述修饰的3’LTR包含相对于野生型3’LTR的缺失。
30.如权利要求26所述的载体，其中所述载体名称为INXN-2004。
31.如权利要求26所述的载体，其中所述载体名称为INXN-2002。
32.一种名称为IGE-308的转移载体。
33.一种名称为INXN-2004的慢病毒载体颗粒。
34.一种名称为INXN-2002的慢病毒载体颗粒。
35.一种产生所述INXN-2002慢病毒载体颗粒的稳定的病毒包装细胞系。
36.一种产生所述INXN-2004慢病毒载体颗粒的稳定的病毒包装细胞系。
37.一种包含从患有RDEB的患者获得的成纤维细胞的药物组合物，所述成纤维细胞被具有IGE-308序列的名称为INXN-2004的慢病毒载体转导。
38.一种药物组合物，其包含从患有RDEB的患者获得的用名称为INXN-2002的慢病毒载体转导的成纤维细胞。
39.一种包含从患有DDEB的患者获得的成纤维细胞的药物组合物，所述成纤维细胞被具有IGE-308序列的名称为INXN-2004的慢病毒载体转导。
40.一种药物组合物，其包含从患有DDEB的患者获得的用名称为INXN-2002的慢病毒载体转导的成纤维细胞。
41.一种用权利要求33所述的载体体外或离体转导的细胞。
42.一种用权利要求34所述的载体体外或离体转导的细胞。
43.一种治疗患有假性并指的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予从所述患者获得的自体细胞群，所述自体细胞群被包含功能性COL7A1基因或其功能变体并表达VII型胶原的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述自体细胞群选自角质形成细胞和成纤维细胞。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述自体细胞群是成纤维细胞。
46.如权利要求43所述的方法，其中通过注射、局部、口服或包埋在生物相容性基质中向患者给予所述细胞。
47.一种治疗、抑制或减少营养不良性大疱性表皮松解(DEB)患者起疱的方法，所述方法包括向所述患者给予从所述患者获得的自体细胞群，所述自体细胞群被包含功能性COL7A1基因或其功能变体并表达VII型胶原蛋白的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述自体细胞群选自角质形成细胞和成纤维细胞。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述自体细胞群是成纤维细胞。
50.如权利要求47所述的方法，其中通过注射、局部、口服或包埋在生物相容性基质中向患者给予所述细胞。
51.如权利要求47所述的方法，其中所述患者患有隐性营养不良性大疱性表皮松解。
52.如权利要求47所述的方法，其中所述患者患有显性营养不良性大疱性表皮松解。
53.一种治疗患有隐性营养不良性大疱性表皮松解的患者的病变的方法，所述方法包括向所述患者给予从所述患者获得的自体细胞群，所述自体细胞群被包含功能性COL7A1基因或其功能变体并表达VII型胶原的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述自体细胞群选自角质形成细胞和成纤维细胞。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述自体细胞群是成纤维细胞。
56.如权利要求53所述的方法，其中通过注射、局部、口服或包埋在生物相容性基质中向患者给予所述细胞。
57.如权利要求53所述的方法，其中所述病变存在于口腔粘膜中。
58.如权利要求53所述的方法，其中所述病变存在于胃肠道中。
59.一种患有VII型胶原缺乏的患者自体的分离的遗传修饰的成纤维细胞群，所述成纤维细胞群被包含功能性COL7A1基因或其功能变体并表达VII型胶原的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数。
60.如权利要求59所述的群，其中所述慢病毒载体颗粒是INXN-2002。
61.如权利要求59所述的群，其中所述慢病毒载体颗粒是INXN-2004。
62.一种患有隐性营养不良性大疱性表皮松解的患者自体的分离的遗传修饰的成纤维细胞群，所述成纤维细胞群被包含功能性COL7A1基因或其功能变体并表达VII型胶原的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数。
63.如权利要求62所述的群，其中所述慢病毒载体颗粒是INXN-2002。
64.如权利要求62所述的群，其中所述慢病毒载体颗粒是INXN-2004。
65.一种患有显性营养不良性大疱性表皮松解的患者自体的分离的遗传修饰的成纤维细胞群，所述成纤维细胞群被包含功能性COL7A1基因或其功能变体并表达VII型胶原的慢病毒载体颗粒转导，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数。
66.如权利要求65所述的群，其中所述慢病毒载体颗粒是INXN-2002。
67.如权利要求65所述的群，其中所述慢病毒载体颗粒是INXN-2004。
68.一种制备患有C7缺乏的患者自体的分离的表达VII型胶原(C7)的遗传修饰的细胞群的方法，所述方法包括从所述缺乏C7的患者的真皮或表皮收获细胞，使所述细胞与包含COL7A1基因或其功能变体的转导慢病毒载体颗粒接触以形成包含具有载体拷贝数的COL7A1基因的自体遗传修饰的细胞，其中所述慢病毒载体颗粒具有在0.1至5.0个拷贝/细胞范围内的转导载体拷贝数，并且培养所述自体遗传修饰的细胞以获得分离的表达C7的遗传修饰的细胞群。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述细胞选自成纤维细胞和角质形成细胞。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。
71.如权利要求68所述的方法，其中所述C7缺乏是营养不良性大疱性表皮松解。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述营养不良性大疱性表皮松解选自隐性营养不良性大疱性表皮松解(RDEB)和显性营养不良性大疱性表皮松解(DDEB)。
73.如权利要求71所述的方法，其中所述C7缺乏是RDEB。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述RDEB是选自下组的亚型，所述组由Hallopeau-Siemens型RDEB、非Hallopeau-Siemens型RDEB、反常型RDEB、胫前RDEB、肢端RDEV和向心型RDEB组成。
75.如权利要求71所述的方法，其中所述C7缺乏是DDEB。
76.如权利要求68所述的方法，其中所述转导慢病毒载体颗粒是INXN-2002。
77.如权利要求68所述的方法，其中所述转导慢病毒载体颗粒是INXN-2004。
78.一种分离的表达VII型胶原(C7)的遗传修饰的细胞群，其通过如权利要求68所述的方法产生。
79.一种分离的表达VII型胶原(C7)的遗传修饰的细胞群，其通过如权利要求76所述的方法产生。
80.一种分离的表达VII型胶原(C7)的遗传修饰的细胞群，其通过如权利要求77所述的方法产生。
81.一种包含如权利要求78所述的分离的群的药物制剂。
82.一种包含如权利要求79所述的分离的群的药物制剂。
83.一种包含如权利要求80所述的分离的群的药物制剂。
84.一种增加遗传修饰的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞中的整合转基因拷贝数/细胞的方法，所述方法包括使包含编码COL7A1基因或其功能变体的核苷酸序列的转导慢病毒载体与从缺乏C7的患者获得的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞接触以形成转导组合物，并且使所述转导组合物进行旋转接种以形成转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞，其中相对于未进行旋转接种的转导组合物，所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数更高。
85.如权利要求84所述的方法，其中将所述转导的人真皮成纤维细胞与第二转导慢病毒载体接触以形成第二转导组合物。
86.如权利要求85所述的方法，其中将所述第二转导组合物进行旋转接种。
87.如权利要求84所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有与未进行旋转接种的转导组合物相比高至少1倍的整合转基因拷贝数/细胞。
88.如权利要求84所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有与未进行旋转接种的转导组合物相比高至少2倍的整合转基因拷贝数/细胞。
89.如权利要求86所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有与未进行旋转接种或第二转导的转导组合物相比高至少5倍的整合转基因拷贝数/细胞。
90.如权利要求86所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有与未进行旋转接种或第二转导的转导组合物相比高至少10倍的整合转基因拷贝数/细胞。
91.如权利要求86所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有与未进行旋转接种或第二转导的转导组合物相比高至少20倍的整合转基因拷贝数/细胞。
92.如权利要求86所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有与未进行旋转接种或第二转导的转导组合物相比高至少27倍的整合转基因拷贝数/细胞。
93.如权利要求84所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有至少0.05的整合转基因拷贝数/细胞。
94.如权利要求84所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有至少0.09的整合转基因拷贝数/细胞。
95.如权利要求85所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有至少0.41的整合转基因拷贝数/细胞。
96.如权利要求86所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有至少0.74的整合转基因拷贝数/细胞。
97.如权利要求84所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有约0.1至约5之间的整合转基因拷贝数/细胞。
98.如权利要求84所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有约0.1至约1之间的整合转基因拷贝数/细胞。
99.如权利要求84所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有约0.4至约1之间的整合转基因拷贝数/细胞。
100.如权利要求84所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞具有约0.4至约0.75之间的整合转基因拷贝数/细胞。
101.如权利要求84所述的方法，其中所述转导慢病毒载体的形式是慢病毒载体颗粒。
102.如权利要求100所述的方法，其中所述转导慢病毒载体颗粒是INXN-2002。
103.如权利要求100所述的方法，其中所述转导慢病毒载体颗粒是INXN-2004。
104.如权利要求86所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相对于未进行旋转接种或第二转导的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞具有增加的C7表达。
105.如权利要求86所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相对于未进行旋转接种或第二转导的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞具有增加至少100倍的C7表达。
106.如权利要求86所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相对于未进行旋转接种或第二转导的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞具有增加至少200倍的表达。
107.一种增加遗传修饰的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞中的整合转基因拷贝数/细胞的方法，包括
(a)使包含编码COL7A1基因或其功能变体的核苷酸序列的转导慢病毒载体与从缺乏C7的患者获得的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞接触，以形成第一转导组合物，
(b)将所述第一转导组合物进行旋转接种以形成转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞，
(c)使步骤(b)的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞与第二转导慢病毒载体接触，以形成第二转导组合物；
(d)将所述第一转导组合物进行旋转接种以形成转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞，
其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数与未进行旋转接种或第二转导步骤的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相比高至少5、10、15、20、25、27、28、29、30、35、40、45或50倍。
108.如权利要求106所述的方法，其中所述第一和第二转导慢病毒载体是INXN-2004。
109.如权利要求106所述的方法，其中所述细胞是人真皮成纤维细胞。
110.如权利要求106所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数与未进行旋转接种或第二转导步骤的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相比高至少5倍。
111.如权利要求106所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数与未进行旋转接种或第二转导步骤的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相比高至少10倍。
112.如权利要求106所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数与未进行旋转接种或第二转导步骤的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相比高至少27倍。
113.如权利要求106所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数与未进行旋转接种或第二转导步骤的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相比高约5倍。
114.如权利要求106所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数与未进行旋转接种或第二转导步骤的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相比高约10倍。
115.如权利要求106所述的方法，其中所述转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞的整合转基因拷贝数与未进行旋转接种或第二转导步骤的转导的人真皮成纤维细胞或角质形成细胞相比高约27倍。
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