KR20180097960A - 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐을 포함하는 골재생용 생체재료 및 콜라겐 분해효소 처리를 통해 줄기세포로부터 골 분화를 유도하는 방법 - Google Patents
삼중나선 구조가 풀린 콜라겐을 포함하는 골재생용 생체재료 및 콜라겐 분해효소 처리를 통해 줄기세포로부터 골 분화를 유도하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
삼중나선 구조가 풀린 콜라겐을 포함하는 골재생용 생체재료 및 콜라겐 분해효소 처리를 통해 줄기세포로부터 골 분화를 유도하는 방법이 제공된다.
Description
기술분야는 골조직 재생에 관한 것으로서, 상세하게는, 삼중 나선구조가 풀린 콜라겐을 포함하는 골재생용 생체재료 및 콜라겐 분해효소의 처리를 통해 줄기세포로부터 골 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.
콜라겐은 체내에 가장 흔하게 존재하는 단백질로서 피부나 인대, 힘줄 등 결합 조직을 구성하는 단백질이다. 콜라겐은 천연 단백질이기에 구하기 쉽고 독성이나 염증을 유발할 확률이 적으며 생체 내부에 존재하는 효소에 의해 쉽게 분해된 후 대사되기 때문에 생체적합성과 생체친화성이 우수하다. 이러한 장점 때문에 콜라겐은 인공 피부나 치과 기자재 등의 치료재로부터 식품이나 화장품까지 다양한 분야에서 폭 넓게 쓰이고 있으며, 최근 수십 년 간 조직공학 분야에서 생체재료로 큰 주목을 받아왔다. 콜라겐은 수십 년 간 창상피복제나 배양피부 등 재생의학용 피부에 주로 쓰여왔고, 최근에는 콜라겐을 기반으로 한 생체재료에 중간엽줄기세포를 이식한 것이 상처 치료에 이용된 바 있다.
콜라겐은 체내에서 결합 조직의 세포외 기질을 구성하는 역할을 한다. 세포외 기질은 조직의 내부나 세포의 외부 공간을 채우고 있는 생체고분자의 집합체로서, 세포 외부의 골격을 유지시키며 세포 지지체의 역할을 한다. 콜라겐은 세 개의 α 나선으로 이루어져 있으며, 각 α 나선은 -Gly-X-Y- 서열의 아미노산으로 구성되어 있다. 현재까지 I형 콜라겐, II형 콜라겐, III형 콜라겐, V형 콜라겐 등 29종의 콜라겐이 알려져 있는데, 이는 α 나선의 종류에 따라 달라진다. 가장 흔한 I형 콜라겐은 뼈, 피부, 힘줄, 인대 등 골 조직에 존재하며, II형 콜라겐은 연골에 주로 존재한다.
콜라겐은 골을 구성하고 있는 세포외 기질 중 가장 많은 비율을 차지하는 것으로 골의 형성과 무기질의 침착을 촉진하는 골전도(osteoconduction) 물질로 알려져 있다. 콜라겐은 이러한 골전도 특성과 생체적합성을 가지기 때문에 오래 전부터 골 재생을 위한 이식재로 사용되어온 물질이다.
콜라겐만으로는 골 재생 효율이 낮아서 최근에는 골형성 단백질 등 골 재생을 촉진한다고 알려진 성장인자를 담지한 콜라겐을 골 재생에 적용하는 사례가 늘고 있지만, 골형성 단백질은 면역거부반응 등의 부작용이 알려져 있기 때문에 사용이 일부 제한된 바가 있다.
해결하고자 하는 과제는 콜라겐의 골 조직 재생효율을 향상시키는 것이다.
하나의 과제의 해결 수단은 콜라겐의 삼중나선 구조가 풀리도록 하는 것이다.
다른 하나의 과제의 해결수단은 각 나선의 펩타이드 결합을 손상시키지 않은 채, 콜라겐의 삼중나선 구조가 풀리도록 하는 것이다.
또 다른 하나의 과제의 해결수단은 콜라겐 분해효소를 콜라겐에 처리하는 것이다.
발명의 효과는 적어도 다음과 같으며, 하기의 내용으로 발명의 효과가 제한되지 않는다.
발명은 골재생율이 향상된 골재생용 생체재료를 제공할 수 있다.
발명은 줄기세포의 골분화 효율을 향상시킬 수 있다.
골재생용 생체재료는 골이식재 또는 골재생재로 사용될 수 있다.
도 1은 I형 콜라겐에서 배양된 인간지방유래 줄기세포(이하, "hASC"라 한다)에서 골분화가 증진된 결과에 관한 것이다. 도 1a는 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, 이하, "ALP"라 한다) 염색결과이다. 도 1b는 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S) 염색결과이다. 도 1c는 Ca2 + 농도의 측정결과이다. 도 1d는 골분화 마커들(ALP, OPN, BSP, OCN, RUNX2, Col I)의 발현량 비교 그래프이다.
도 2는 I형 콜라겐에서 배양된 hASC에서 기질금속단백질 분해효소-13(Matrix Metalloprotease-13, 이하, "MMP-13"이라 한다)의 발현이 증가된 결과에 관한 것이다. 도 2a는 기질금속단백질 분해효소들의 발현량 비교 그래프이다. 도 2b는 웨스턴 블롯팅 결과이다. 도 2c는 hASC의 배양기간에 따른 MMP-13 발현율에 관한 그래프이다.
도 3은 대조 기질들(젤라틴, 파이브로넥틴, 라미닌)에서 배양된 hASC의 MMP-13 발현량을 비교한 그래프이다.
도 4는 siRNA를 이용하여 MMP-13을 녹-다운(knock-down)시킨 때, hASC 에서 골분화가 감소된 결과이다. 도 4a는 MMP-13 억제군과 대조군의 MMP-13 발현량 비교 결과이다. 도 4b는 ALP 염색결과이다. 도 4c는 Alizarin Red S 염색결과이다. 도 4d는 ALP와 RUNX2의 발현량 비교 그래프이다.
도 5는 레트로바이러스(retrovirus)를 이용하여 MMP-13을 과발현(overexpression)시킨 때, hASC 에서 골분화가 증가된 결과이다. 도 5a는 MMP-13 과발현군과 대조군의 MMP-13 발현량 비교 결과이다. 도 5b는 ALP 염색결과이다. 도 5c는 Alizarin Red S 염색결과이다. 도 5d는 ALP와 RUNX2의 발현량 비교 그래프이다.
도 6은 MMP-13 농도 증가에 따라 hASC에서 골분화 효율이 향상된 결과로, Alizarin Red S 염색결과이다.
도 7은 MMP-13 처리로 I형 콜라겐의 삼중나선구조가 풀림을 확인한 것이다. 도 7a는 MMP-13의 처리시간 변화에 따른 시료들의 원편광이색성(circular dichroism) 분석 결과이다. 도 7b는 MMP-13의 처리시간의 경과에 따른 원편광이색성의 변화에 관한 그래프이다.
도 8은 MMP-13 처리로 인한 I형 콜라겐의 절단 여부를 확인한 것으로 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 SDS-아크릴아미드 겔에 대해 쿠마시 블루(coommassie blue) 염색을 수행한 결과이다.
도 9는 siRNA를 이용한 MMP-13 억제군에서, 인테그린들의 발현량을 측정한 것이다.
도 10은 면역염색 결과로 Col I 에서 integrin α3β1과 F-액틴의 발현증가에 관한 것이다.
도 11a는 siRNA를 이용한 integrin α3 억제군에서 integrin α3의 발현량을 측정한 결과이고, 도 11b는 integrin α3 억제군과 MMP-13 억제군에서 ALP 활성도를 측정한 것이다.
도 12는 integrin α3 항체를 이용하여, hASC 표면의 integrin α3을 억제시킨 뒤, MMP-13이 처리된 I형 콜라겐 위에 파종한 결과이다.
도 13은 MMP-13 처리 이후, integrin α3의 발현이 증가된 결과이다.
도 14는 I형 콜라겐에서 세포부착 단백질들의 발현이 증가된 것으로, 도 14a는 세포부착 단백질들(pFAK, FAK, p-p38, Vinculin, β-actin)의 웨스턴 블롯팅 결과이며, 도 14b는 세포부착 단백질들(ITGB1, Vinculin, F-actin)의 면역염색 결과이다.
도 15는 siRNA를 이용하여 MMP-13을 억제한 때, integrin α3(ITGA3), integrin β1(ITGB1), 세포부착 단백질들(FAK, Vinculin), 골분화 마커들(RUNX2, Col I) 각각의 발현량을 측정한 것이다.
도 16은 rhMMP-13 의 농도 변화에 따른 FAK의 발현량의 변화에 관한 qPCR 결과이다.
도 17은 I형 콜라겐에서 RUNX2의 핵으로의 국소화(localization)가 증가된 것으로, 도 17a는 면역염색 결과이고, 도 17b는 RUNX2의 발현량을 측정한 qRT-PCR 결과이며, 도 17c는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 18은 면역염색 결과 이미지로, siRNA를 이용한 MMP-13 억제가 RUNX2의 핵으로의 국소화를 감소시킨 결과에 관한 것이다.
도 19는 마이크로 CT를 이용하여 쥐의 두개골 결손 모델에서 골 재생을 확인한 것이다. 도 19a는 골 재생 정도를 보여주는 마이크로 CT 이미지이다. 도 19b는 골량/총량(bone volune/total volume; BV/TV), 망상골의 두께(trabecular thickness; Tb.Th), 망상골의 수(trabecular number; Tb.N) 및 총 공극률(Po(tot)%)를 측정한 결과이다. 도 19c는 헤마톡실린 및 에오진염색법과 masson's trichrome 염색법을 통해 두개골 조직을 염색한 결과이다.
각 도면에서, * 는 p < 0.05, ** 는 p < 0.005, *** 는 p < 0.0001 을 의미하며, # 은 p < 0.05, ## 은 p < 0.005 를 의미한다.
도 2는 I형 콜라겐에서 배양된 hASC에서 기질금속단백질 분해효소-13(Matrix Metalloprotease-13, 이하, "MMP-13"이라 한다)의 발현이 증가된 결과에 관한 것이다. 도 2a는 기질금속단백질 분해효소들의 발현량 비교 그래프이다. 도 2b는 웨스턴 블롯팅 결과이다. 도 2c는 hASC의 배양기간에 따른 MMP-13 발현율에 관한 그래프이다.
도 3은 대조 기질들(젤라틴, 파이브로넥틴, 라미닌)에서 배양된 hASC의 MMP-13 발현량을 비교한 그래프이다.
도 4는 siRNA를 이용하여 MMP-13을 녹-다운(knock-down)시킨 때, hASC 에서 골분화가 감소된 결과이다. 도 4a는 MMP-13 억제군과 대조군의 MMP-13 발현량 비교 결과이다. 도 4b는 ALP 염색결과이다. 도 4c는 Alizarin Red S 염색결과이다. 도 4d는 ALP와 RUNX2의 발현량 비교 그래프이다.
도 5는 레트로바이러스(retrovirus)를 이용하여 MMP-13을 과발현(overexpression)시킨 때, hASC 에서 골분화가 증가된 결과이다. 도 5a는 MMP-13 과발현군과 대조군의 MMP-13 발현량 비교 결과이다. 도 5b는 ALP 염색결과이다. 도 5c는 Alizarin Red S 염색결과이다. 도 5d는 ALP와 RUNX2의 발현량 비교 그래프이다.
도 6은 MMP-13 농도 증가에 따라 hASC에서 골분화 효율이 향상된 결과로, Alizarin Red S 염색결과이다.
도 7은 MMP-13 처리로 I형 콜라겐의 삼중나선구조가 풀림을 확인한 것이다. 도 7a는 MMP-13의 처리시간 변화에 따른 시료들의 원편광이색성(circular dichroism) 분석 결과이다. 도 7b는 MMP-13의 처리시간의 경과에 따른 원편광이색성의 변화에 관한 그래프이다.
도 8은 MMP-13 처리로 인한 I형 콜라겐의 절단 여부를 확인한 것으로 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 SDS-아크릴아미드 겔에 대해 쿠마시 블루(coommassie blue) 염색을 수행한 결과이다.
도 9는 siRNA를 이용한 MMP-13 억제군에서, 인테그린들의 발현량을 측정한 것이다.
도 10은 면역염색 결과로 Col I 에서 integrin α3β1과 F-액틴의 발현증가에 관한 것이다.
도 11a는 siRNA를 이용한 integrin α3 억제군에서 integrin α3의 발현량을 측정한 결과이고, 도 11b는 integrin α3 억제군과 MMP-13 억제군에서 ALP 활성도를 측정한 것이다.
도 12는 integrin α3 항체를 이용하여, hASC 표면의 integrin α3을 억제시킨 뒤, MMP-13이 처리된 I형 콜라겐 위에 파종한 결과이다.
도 13은 MMP-13 처리 이후, integrin α3의 발현이 증가된 결과이다.
도 14는 I형 콜라겐에서 세포부착 단백질들의 발현이 증가된 것으로, 도 14a는 세포부착 단백질들(pFAK, FAK, p-p38, Vinculin, β-actin)의 웨스턴 블롯팅 결과이며, 도 14b는 세포부착 단백질들(ITGB1, Vinculin, F-actin)의 면역염색 결과이다.
도 15는 siRNA를 이용하여 MMP-13을 억제한 때, integrin α3(ITGA3), integrin β1(ITGB1), 세포부착 단백질들(FAK, Vinculin), 골분화 마커들(RUNX2, Col I) 각각의 발현량을 측정한 것이다.
도 16은 rhMMP-13 의 농도 변화에 따른 FAK의 발현량의 변화에 관한 qPCR 결과이다.
도 17은 I형 콜라겐에서 RUNX2의 핵으로의 국소화(localization)가 증가된 것으로, 도 17a는 면역염색 결과이고, 도 17b는 RUNX2의 발현량을 측정한 qRT-PCR 결과이며, 도 17c는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 18은 면역염색 결과 이미지로, siRNA를 이용한 MMP-13 억제가 RUNX2의 핵으로의 국소화를 감소시킨 결과에 관한 것이다.
도 19는 마이크로 CT를 이용하여 쥐의 두개골 결손 모델에서 골 재생을 확인한 것이다. 도 19a는 골 재생 정도를 보여주는 마이크로 CT 이미지이다. 도 19b는 골량/총량(bone volune/total volume; BV/TV), 망상골의 두께(trabecular thickness; Tb.Th), 망상골의 수(trabecular number; Tb.N) 및 총 공극률(Po(tot)%)를 측정한 결과이다. 도 19c는 헤마톡실린 및 에오진염색법과 masson's trichrome 염색법을 통해 두개골 조직을 염색한 결과이다.
각 도면에서, * 는 p < 0.05, ** 는 p < 0.005, *** 는 p < 0.0001 을 의미하며, # 은 p < 0.05, ## 은 p < 0.005 를 의미한다.
발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되는 실시형태들과 실험예들을 참조하면 명확해질 것이다. 첨부된 도면은 본 명세서에 개시된 기술의 사상을 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 그 기술의 사상이 제한되는 것으로 해석되어서는 아니됨을 유의해야 한다.
또한, 발명은 이하에서 개시되는 내용에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 이하에서 개시되는 내용은 발명의 개시가 완전하도록 하며, 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이고, 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 기술의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략할 수 있다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함하는(including)", "가진(having)" 이라고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 줄기세포는 골아세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 총칭하는 것으로, 특별히 반대되거나 한정하는 기재가 없는 한 배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포를 모두 총칭할 수 있다.
발명자들은, 콜라겐의 삼중나선 구조가 풀리면 골재생 효율을 향상시킬 수 있다는 착상으로부터 발명을 완성하였다. 콜라겐 분해효소를 일반적인 자연상태의 콜라겐에 처리한 때, 콜라겐의 특징적인 구조인 삼중나선의 풀림이 확인되었고, 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐(이하, "개량 콜라겐"이라 한다)은 삼중나선 구조가 풀리지 않은 자연상태의 콜라겐(이하, "콜라겐"이라 한다)에 비해 높은 수준의 골재생 효율을 보였다. 상세하게는, 개량 콜라겐의 존재 하에서 배양된 줄기세포의 골분화 효율이 콜라겐의 존재 하에서 배양된 줄기세포의 골분화 효율에 비해 높았다.
발명은 후술하는 제1 실시형태, 제2 실시형태 및 제3 실시형태를 포함할 수 있다. 이하에서는, 각 실시형태에 대해 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
(제1 실시형태)
제1 실시형태는, 골분화 세포의 유도 방법이다. 제1 실시형태에 따른 골분화 세포의 유도 방법은, 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시를 사용하여, 콜라겐 분해효소가 처리된 효소처리군에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함한다.
발명자들의 연구결과에 따르면, 줄기세포와 개량 콜라겐 간의 상호작용과 콜라겐 분해효소와 개량 콜라겐 간의 상호작용은 각각 줄기세포의 골분화 효율을 향상시킬 수 있다.
MMP는 세포외기질의 리모델링(remodeling)을 통한 증식, 생존, 형태발생 및 분화 등과 같은 줄기세포의 생체외 세포생물학과 생체내 세포생물학에 있어서 필수적이다. I형 콜라겐은 골조직의 주된 요소로, 인간지방유래 줄기세포의 골분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 세포와 기질 간의 상호작용은 인간지방유래 줄기세포의 골분화에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
하나의 실시예에서, 콜라겐 분해효소는 MMP-13일 수 있고, 콜라겐은 I형 콜라겐일 수 있으며, 줄기세포는, hASC 일 수 있다. 다만, 이들만으로 발명의 권리범위가 제한되지 않는다.
발명자들이 생체 외 실험 및 생체 내 실험을 통해 확인한 바에 따르면, hASC 와 I형 콜라겐 간의 상호작용은, I형 콜라겐과 MMP-13 간의 포지티브 피드백 루프(positive feedback loop)를 통해, hASC 의 골분화 효율을 향상시킬 수 있다. 발명자들의 생체 외 실험결과와 생체 내 실험 결과를 요약하면 다음과 같다.
생체 외 실험 결과
-
I형 콜라겐의 존재 하에서, hASC 의 골분화 중에 MMP 와 인테그린의 발현이 확인되었다.
-
I형 콜라겐은 MMP-13 과 인테그린 알파3(ITGA3)의 발현을 각각 높은 수준으로 촉발시켰다.
-
I형 콜라겐의 존재 하에서, MMP-13은 hASC 의 골분화를 개시하고 증대시켰다.
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I형 콜라겐은, MMP-13 프로모터(promoter)에 결합하는 전사인자로 알려져 있는, RUNX2의 핵 내 이동을 유발하였다.
-
hASC 와 I형 콜라겐 간의 상호작용에 의한 RUNX2의 핵 내 이동은 MMP-13의 발현을 조절할 수 있다.
생체 내 실험 결과
쥐의 피하에 MMP-13이 과발현된 hASC 를 이식했을 때, I형 콜라겐의 존재 하에서, hASC 의 골분화 효율이 증가되었다.
콜라겐 분해효소의 농도는, 각 나선의 펩타이드 결합을 손상시키지 않으면서 삼중나선 구조를 풀 수 있는 수준에서 결정될 수 있고, 예를 들어, 콜라겐 100 중량부에 대해 0.00 중량부 초과 내지 1.00 중량부 이하의 범위에서 결정될 수 있다. 발명자들이 수행한 실험에 따르면, 상기한 농도범위에서, 콜라겐 분해효소는 각 나선의 펩타이드 결합을 손상시키지 않은 채, 콜라겐의 삼중나선 구조를 풀 수 있었으며, 줄기세포의 골분화 효율을 향상시킬 수 있었다.
콜라겐 분해효소의 농도는 상기한 수치범위로 제한되는 것은 아니다. 즉, 각 나선의 펩타이드 결합을 손상시키지 않으면서 삼중나선 구조가 풀리며, 이렇게 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐에서 배양된 줄기세포가 대조군에 비해 향상된 골분화 효율을 보이는 한, 콜라겐 분해효소의 농도가 상기한 수치범위를 벗어나는 경우라도, 그것은 발명의 기술적 사상의 범위를 벗어나지 않으며, 발명의 권리범위 내에 속한다.
한편, 발명자들은, 콜라겐 분해효소의 농도가 높아질수록 줄기세포의 골분화 효율이 증가됨을 확인하였다. 다시 말하면, 효소처리군의 골분화 효율은 콜라겐 분해효소의 농도에 의존적으로 증가될 수 있다.
효소처리군에 사용된 배지로는, 줄기세포의 배양을 위해 일반적으로 사용되는 것이 사용될 수 있으며, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modifA ation of Eagle's medium, Dulbecco, R.et al., VirProcy 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mo, h's MB752/1 (Waymo, h, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol.Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 사용될 수 있으나, 이것들로 제한되지 않는다. 한편, 상기 배지에는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청 등), 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신), 질소원 및 글루타민 등과 같은 성분들이 더 포함될 수 있고, 당해 업계에서 통상의 지식을 가진 자라면, 사용목적에 따라 추가성분들을 용이하게 변형 사용할 수 있을 것이다.
효소처리군에 사용된 배지의 예로는, 10% 우태아혈청과 1% 페니실린/스트랩토마이신(P/S)이 함유된 돌베코수정이글배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)를 들 수 있으나, 이것 만으로 제한되는 것은 아니다.
줄기세포의 골분화 유도를 위한 배지도, 일반적으로 사용되는 것이 사용될 수 있으며, 일례로, 10% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트랩토마이신(P/S), 10 mM 글라이세롤-2-포스페이트(glycerol-2-phosphate), 50 ㎍/ml 아스코르브 산(ascorbic acid), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 1X 글루타맥스(GlutaMax)가 첨가된 DMEM/High glucose(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/High glucose)가 사용될 수 있다. 다만, 줄기세포의 골분화 유도를 위한 배지가 이것 만으로 제한되는 것은 아니다.
한편, 제1 실시형태에 따른 골분화 세포의 유도 방법에서 얻어진 줄기세포는, 그 자체가 골재생용 생체재료로 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 설명하자면, 효소처리군에서 배양이 완료된 줄기세포는 개량 콜라겐 상에 부착된 형태로 얻어질 수 있는데, 이 때, 개량 콜라겐으로부터 줄기세포를 분리시켜 그 자체를 골재생용 생체재료로 활용할 수 있다.
(제2 실시형태)
제2 실시형태는, 골재생용 생체재료이다. 제2 실시형태에 따른 골재생용 생체재료는, 각 나선의 펩타이드 결합이 유지된 채로, 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐을 포함한다. 다시 말하면, 제2 실시형태에 따른 골재생용 생체재료는 개량 골라겐을 포함한다. 삼중나선 구조가 풀린 개량 콜라겐은 젤, 파이버, 스펀지 형태 등으로 사용될 수 있다.
개량 콜라겐은 그 자체가 제2 실시형태에 따른 골재생용 생체재료가 될 수 있다. 전술한 바와 같이, 개량 콜라겐은 콜라겐에 비해 골재생 효율이 높아서, 개량 콜라겐을 생체 내로 이식하는 경우, 생체 내에 존재하는 줄기세포의 활용 또는 유입을 통해, 높은 골 재생 효율이 발휘될 수 있다.
한편, 제2 실시형태에 따른 골재생용 생체재료는, 개량 콜라겐과 골재생 효율을 높일 수 있는 기타성분들이 포함되도록 구성될 수도 있다. 이 경우, 골이식재는, 개량 콜라겐과 골재생 효율 향상을 위한 기타성분이 모두 포함하도록 구성될 수 있으며, 여기서, 개량 콜라겐은 지지체(scaffold)로 사용될 수 있고, 골재생 효율을 높일 수 있는 기타성분은 개량 콜라겐에 담지될 수 있다. 골재생 효율 향상을 위한 기타성분의 예로는, 골형성 단백질 등을 들 수 있는데, 이것만으로 제한되지 않는다.
개량 콜라겐은, 콜라겐 분해효소를 콜라겐에 처리하는 방법, 콜라겐에 삼중나선 구조가 풀리는 온도를 가해주는 방법, 삼중나선 구조가 풀릴 수 있는 수소이온농도에서 콜라겐을 처리하는 방법 등에 의해 제조될 수 있다.
콜라겐 분해효소의 처리를 통해 개량 콜라겐을 제조하는 경우, 구체적인 제조방법은, 제1 실시형태에 따른 골분화 세포의 유도방법을 참고할 수 있으며, 예를 들어, 콜라겐의 삼중나선구조가 풀린 개량 콜라겐을 생산하기 위해, 콜라겐에 기질분해효소인 MMP가 처리될 수 있다. 이 때, MMP의 농도는 콜라겐의 삼중나선구조를 풀 수 있는 농도로 콜라겐의 펩타이드를 자르지 않는 농도일 수 있으며, 일례로는 콜라겐 1 밀리그램(mg) 당 MMP 10 마이크로그램(㎍)일 수 있다. 미반응 잔류 MMP는 PBS를 사용하여 제거할 수 있다.
콜라겐 분해효소의 처리를 통해 개량 콜라겐을 얻는 경우, 제2 실시형태에 따른 골재생용 생체재료는, 개량 콜라겐과 콜라겐 분해효소를 포함한다. 따라서, 콜라겐 분해효소의 처리를 통해 개량 콜라겐을 얻는 경우, 제2 실시형태에 따른 골재생용 생체재료는, 개량 콜라겐과 콜라겐 분해효소로 구성된 일 형태가 될 수도 있고, 상기한 개량 콜라겐과 콜라겐 분해효소 이외에, 전술한 바 있는, 골재생 효율 향상을 위한 기타성분들을 포함하도록 구성된 일 형태가 될 수도 있다.
발명자들이 연구한 바에 따르면, I형 콜라겐과 MMP-13 간의 상호작용에 의해, 골재생 효율이 향상되는 바, 더욱 바람직하게는, 개량 콜라겐은 I형 콜라겐이고, 콜라겐 분해효소는, MMP-13 일 수 있다.
(제3 실시형태)
제3 실시형태는, 골재생용 생체재료이다. 제3 실시형태에 따른 골재생용 생체재료는, 개량 콜라겐과 줄기세포를 포함한다. 제3 실시형태에 따른 골재생용 생체재료는, 개량 콜라겐에 부착된 줄기세포를 더 포함하는 점에서, 제2 실시형태에 따른 골재생용 생체재료와 차이가 있다.
제3 실시형태에 따른 골재생용 생체재료는, 제1 실시형태에 따른 골분화 세포의 유도방법에서 얻어진 제조물로부터 제작될 수 있고, 구체적으로, 효소처리군에서 줄기세포의 배양이 완료된 뒤, 배양접시로부터 개량 콜라겐과 이에 부착된 줄기세포를 모두 떼어내는 것에 의해 얻어질 수 있다.
제3 실시형태에 따른 골재생용 생체재료는 그 자체가 골이식재 또는 골재생재로 사용될 수 있지만, 전술한 바 있는, 골재생 효율 향상을 위한 기타성분 또한 필요에 따라 추가될 수 있다.
콜라겐의 삼중나선의 풀림 구조는 콜라겐에 콜라겐 분해효소를 처리하는 방법, 콜라겐에 삼중나선 구조가 풀릴 수 있는 온도를 가하는 방법, 삼중나선 구조가 풀릴 수 있는 수소이온농도에서 콜라겐을 처리하는 방법 등에 의해 얻어질 수 있다.
콜라겐 분해효소의 처리를 통해 개량 콜라겐을 제작되는 경우, 구체적인 제조방법은, 제1 실시형태에 따른 골분화 세포의 유도방법을 참고할 수 있으며, 예를 들어, 콜라겐의 삼중나선구조가 풀린 개량 콜라겐을 생산하기 위해, 콜라겐에 기질분해효소인 MMP가 처리될 수 있다. 이 때, MMP의 농도는 콜라겐의 삼중나선구조를 풀 수 있는 농도로 콜라겐의 펩타이드를 자르지 않는 농도이며, 일례로는 콜라겐 1 밀리그램(mg) 당 MMP 10 마이크로그램(㎍)일 수 있다. 미반응 잔류 MMP는 PBS를 사용하여 제거할 수 있다.
콜라겐 분해효소의 처리를 통해 개량 콜라겐이 얻어지는 경우, 제3 실시형태에 따른 골재생 생체재료는, 개량 콜라겐, 줄기세포 및 콜라겐 분해효소로 구성된 일 형태가 될 수도 있고, 상기한 성분들 이외에 골재생 효율 향상을 위한 기타성분들이 더 포함된 일 형태가 될 수도 있다.
발명자들이 연구한 바에 따르면, I형 콜라겐과 MMP-13 간의 상호작용, I형 콜라겐과 hASC 의 상호작용에 의해, 줄기세포의 골분화 효율이 향상되는 바, 더욱 바람직하게는, 개량 콜라겐은 I형 콜라겐이고, 콜라겐 분해효소는 MMP-13 이며, 줄기세포는 hASC 일 수 있다.
발명자들은 콜라겐 분해효소의 처리를 통해 콜라겐이 코팅된 배양접시에서 배양된 hASC의 골 분화가 증진되는 것을 확인하였다. 콜라겐 분해효소의 처리를 통해서 삼중나선 구조가 풀리도록 리모델링된 콜라겐, 즉 개량 콜라겐은 기존에 사용하던 콜라겐과 비교하여 골 재생 효율이 높은 장점이 있다. 또한, 기존의 골이식재에 비해 줄기세포의 골 분화 효율을 향상시킬 수 있으므로, 기존의 콜라겐 이식재를 대체하여 사용하는 경우, 우수한 골재생 효율이 발휘될 수 있다.
발명은 지금까지 존재한 바 없는, 새로운 형태의 골 이식재를 제공할 수 있고, 이러한 새로운 형태의 골 이식재는, 골 질환의 조직재생학적 치료 효율을 높이기 위해 사용될 수 있으며, 일 사용예로, 이러한 새로운 형태의 골 이식재는, 골 관련 질환 환자의 환부에 직접 이식하는 방식으로 사용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예들과 실험예들을 통해 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
<
실시예
1 >
인간지방유래
줄기세포(
hASC
)의 배양
72세 여성으로부터 얻은 지방유래 줄기세포를, 배양배지(10% 우태아혈청 및 1% 페니실린/스트랩토마이신(P/S)이 첨가된 DMEM)에서, 37℃, 5% CO2 조건으로 기질이 코팅되지 않은 일반배양접시를 사용하여 배양하였다.
<
실시예
2 > 골세포 분화 유도
실시예
2.1
I형 콜라겐이 코팅된
코팅배양접시에서
골세포 분화 유도
실시예 1의 hASC를, 트립신을 이용하여 일반 배양접시로부터 떼어낸 후, 2×104 Cell/cm2의 농도로 콜라겐(Corning 社)이 코팅된 코팅배양접시에 접종하고 분화배지에서 37℃ 5% CO2 조건으로 14일 동안 배양하였다. 분화배지로는, 10% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트랩토마이신(P/S), 10 mM 글라이세롤-2-포스페이트(glycerol-2-phosphate), 50 ㎍/ml 아스코르브 산(ascorbic acid), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 1X 글루타맥스(GlutaMax)가 첨가된 DMEM/High glucose(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/High glucose)가 사용되었다.
코팅배양접시는, 다음과 같이 제작되었다. 배양액{DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture}을 사용하여, 1 mL 당 50 마이크로그램 농도로 콜라겐(Corning 社)을 희석시킨 후, 콜라겐 희석용액 1 mL를 12-well 배양접시에 첨가하여 4℃에서 18 시간 이상 보관한 뒤, 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시를 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척하였다.
실시예
2.2
일반배양접시에서
골세포 분화 유도
실시예 1의 hASC를 기질이 코팅되지 않은 일반배양접시에 접종한 것을 제외하고는, 실시예 2.1과 같은 방법으로 hASC를 배양하였다.
실시예
2.3
젤라틴이 코팅된
코팅배양접시에서
골세포 분화 유도
실시예 1의 hASC를 젤라틴(gelatin)이 코팅된 코팅배양접시에 접종한 것을 제외하고는, 실시예 2.1과 같은 방법으로 hASC를 배양하였다.
실시예
2.4
파이브로넥틴이
코팅된
코팅배양접시에서
골세포 분화 유도
실시예 1의 hASC를 파이브로넥틴(fibronectin, FN)이 코팅된 코팅배양접시에 접종한 것을 제외하고는, 실시예 2.1과 같은 방법으로 hASC를 배양하였다.
실시예
2.5
라미닌이
코팅된
코팅배양접시에서
골세포 분화 유도
실시예 1의 hASC를 라미닌(laminin, LN)이 코팅된 코팅배양접시에 접종한 것을 제외하고는, 실시예 2.1과 같은 방법으로 hASC를 배양하였다.
<
실시예
3 > 형질전환된
hASC
제작
실시예
3.1
MMP
-13
siRNA가
형질주입된
hASC
의 제작
리포펙타민(Invitrogen 社)을 이용하여 MMP-13을 녹-다운(knock-down)하는 MMP-13 siRNA(Qiagen 社)를 실시예 1의 hASC 내로 형질주입하고, 배양배지(10% 우태아혈청 및 1% 페니실린/스트랩토마이신(P/S)이 첨가된 DMEM)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. hASC는 콜라겐(Corning 社)이 코팅된 코팅배양접시에서 배양되었다.
MMP-13 siRNA의 유전자 서열 정보는 다음과 같다.
| siRNA | 서열(5' -> 3') | |
| MMP-13 siRNA | 센스 | (서열번호 1) CGAAAUAUCAAAGUCAUUATT |
| 안티 센스 | (서열번호 2) UAAUGACUUUGAUAUUUCGTT | |
실시예
3.2
scrambled
siRNA가
형질주입된
hASC
의 제작
리포펙타민(Invitrogen 社)을 이용하여 scrambled siRNA(Dharmacon 社)를 실시예 1의 hASC 내로 형질주입한 것을 제외하고는, 실시예 3.1과 같은 방법으로 hASC를 배양하였다.
scrambled siRNA의 유전자 서열 정보는 다음과 같다.
| siRNA | 서열(5' -> 3') | |
| Non-targeting Pool | 타겟 서열 | (서열번호 3) UGGUUUACAUGUCGACUAA |
| (서열번호 4) UGGUUUACAUGUUGUGUGA |
||
| (서열번호 5) UGGUUUACAUGUUUUCUGA |
||
| (서열번호 6) UGGUUUACAUGUUUUCCUA |
||
실시예
3.3
MMP
-13 과발현 레트로바이러스가 형질도입된
hASC
의 제작
PCR를 통해서 복제된 Full-length human MMP-13를 pTOP TA V2 클로닝 벡터(Enzynomics 社)에 ligation 시킨 후 EcoR I(Enzynomics 社)를 이용하여 pMXs 레트로바이러스 발현 벡터(Addgene 社)에 Subcloning하여 pMXs-MMP13을 생산하였다.
MMP-13을 포함한 레트로바이러스를 생산하기 위해서 GP2-293세포(Clontech 社)를 4×106 cells/ 100mm plate 농도로 배양하고, 24시간 후에 45마이크로리터(㎕)의 Convoy(ACTGene 社)를 이용하여 10마이크로그램의 pMXs-MMP13과 5마이크로그램의 pVSV-G(Clontech 社)를 10ml의 배양액과 함께 형질주입하였다.
형질주입 24시간 후에 새 배양액으로 교체하였으며, 배양액 교체 48시간 후에 레트로바이러스가 포함된 배양액을 50ml 튜브에 수집하였다. 수집된 배양액의 세포 찌꺼기(debris)를 제거하기 위해서 1300 rpm에서 5분동안 원심분리하고, 0.45마이크로미터(㎛) 구멍을 가지는 필터를 이용하여 필터링 하였다.
세포 찌꺼기가 제거된 레트로바이러스가 포함된 배양액은 레트로바이러스의 농축을 위해서 Retro-X concentrator(Clontech 社)와 3:1(배양액:Retro-X concentrator)의 비율로 섞고 4℃에서 반응시켰다. 24시간 이후에 1500xg에서 45분 동안 원심분리하고 얻어진 레트로바이러스 펠렛(pellet)을 10ml의 새 배양액을 이용하여 재부유(resuspension)시킨 후 10마이크로리터(㎕)의 폴리브렌(polybrene; sigma 社)과 함께 실시예 1의 hASC 내로 형질도입하고, 배양배지(10% 우태아혈청 및 1% 페니실린/스트랩토마이신(P/S)이 첨가된 DMEM)에서, I형 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시를 사용하여, 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
Full-length human MMP-13를 제작하기 위해 사용된 primer 서열 정보는 아래와 같다.
| 유전자 | 서열(5' -> 3') | |
| MMP-13 | 센스 | (서열번호 7) ATGCATCCAGGGGTCCTGGCTGCC |
| 안티 센스 | (서열번호 8) TTAACACCACAAAATGGAATTTGC |
|
실시예
3.4
대조군 레트로바이러스가 형질도입된
hASC
의 제작
폴리브렌(Sigma 社)를 이용하여 대조군 레트로바이러스를 실시예 1의 hASC 내로 형질도입한 것을 제외하고는, 실시예 3.3과 같은 방법으로 hASC를 배양하였다.
GFP를 과발현시키는 레트로바이러스를 인코딩하고 있는 pMXs-GFP 레트로바이러스 발현 벡터(Addgene 社)를 이용하여 대조군 레트로바이러스를 생산하였다. pMXs-MMP13 대신 pMXs-GFP를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3.3과 같은 방법으로 레트로바이러스를 생산하였다.
실시예
3.5
integrin
α3
siRNA가
형질주입된
hASC
의 제작
리포펙타민(Invitrogen 社)을 이용하여 integrin α3을 녹-다운(knock-down)하는 integrin α3 siRNA(Bioneer 社)를 실시예 1의 hASC 내로 형질주입하고, 배양배지(10% 우태아혈청 및 1% 페니실린/스트랩토마이신(P/S)이 첨가된 DMEM)에서, I형 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시를 사용하여, 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
integrin α3 siRNA의 유전자 서열 정보는 다음과 같다.
| siRNA | 서열(5' -> 3') | |
| ITGA3 siRNA | 센스 | (서열번호 9) GACAGUGAUGGGUGAGUCU |
| 안티센스 | (서열번호 10) AGACUCACCCAUCACUGUC |
|
실시예
3.6
scrambled
siRNA가
형질주입된
hASC
의 제작
리포펙타민(Invitrogen 社)을 이용하여 scrambled siRNA(Dharmacon 社)를 실시예 1의 hASC 내로 형질주입한 것을 제외하고는, 실시예 3.5와 같은 방법으로 hASC를 배양하였다. scrambled siRNA의 유전자 서열 정보는 실시예 3.2의 타겟 서열과 같다.
<
실시예
4 > 삼중나선 구조가 풀린, 개량 콜라겐의 제작
MMP-13(Matrix metalloprotease-13, Prospec 社)을 콜라겐(Corning 社)에 표 5와 같이 처리하여 개량 콜라겐을 제작하였다.
| 구분 | 실시예 4.1 (MMP30(1) |
실시예 4.2 (MMP60(2) | 실시예 4.3 (MMP90(3) | 실시예 4.4 (MMP120(4) | 실시예 4.5 (MMP180(5) |
| 효소처리시간 | 30 min | 60 min | 90 min | 120 min | 180 min |
| I형 콜라겐 농도 | 50 ㎍/ml | ||||
| MMP-13 농도 | 100 ng/ml | ||||
| 1)
MMP30: Col I+MMP 30min 2) MMP60: Col I+MMP 60min 3) MMP90: Col I+MMP 90min 4) MMP120: Col I+MMP 120min 5) MMP180: Col I+MMP 180min |
|||||
<
실시예
5 >
MMP
-13 처리와 함께
hASC
배양
MMP-13을 10ng/ml, 50ng/ml, 100ng/ml 의 농도로, 14일 간 2일에 한번씩 처리한 것을 제외하고는, 실시예 2.1과 같은 방법으로 hASC 를 배양하였다.
| MMP-13 농도 | |||||||
| 0 일 | 2 일 | 4 일 | 6 일 | 8 일 | 10 일 | 12 일 | |
| 실시예 5.1 | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml | 10 ng/ml |
| 실시예 5.2 | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml |
| 실시예 5.3 | 100 ng/ml | 100 ng/ml | 100 ng/ml | 100 ng/ml | 100 ng/ml | 100 ng/ml | 100 ng/ml |
<
실험예
1 >
콜라겐에 의한
hASC의
골분화
증진 확인
ALP
(
Alkaline
Phosphatase
) 염색 및 활성분석
ALP(alkaline phosphatase) 염색은 제조사(Sigma)의 지침에 따라 시판되는 BCIP/NBT Liquid Substrate System을 사용하여 수행하였다. p-니트로 페닐포스페이트를 기질로 하여 405 nm 에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 니트로페놀(Nitrophenol)로 전환된 양을 측정하여 ALP의 활성을 조정하였다. ALP효소에 의해서 전환된 니트로페놀의 절대적인 양은 10mM의 니트로페놀 용액(Sigma 社)를 이용하여 연속희석법(Serial dilution method)을 통해 표준시료를 제작하고 표준시료의 흡광도를 측정한 뒤 얻어진 표준곡선을 통해 분석하였다.
실험군으로는 실시예 2.1의 hASC가 사용되었다.
대조군으로는 실시예 2.2의 hASC가 사용되었다.
Alizarin
Red
S 염색 및 흡광도 측정
10% 포르말린 용액으로 실험군과 대조군을 고정하고, 2% Alizarin Red S 용액을 실온에서 30분 동안 처리하여 Alizarin Red S 염색을 수행하였다. 10% ceteylpyridinium chloride(CPC; Sigma 社)를 이용하여 염색약을 추출하여, 562 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
실험군으로는 실시예 2.1의 hASC가 사용되었다.
대조군으로는 실시예 2.2의 hASC가 사용되었다.
칼슘이온(
Ca
2
+
) 측정
칼슘이온의 측정은 제조사(Bioassay systems)의 지침에 따라 시판되는 QuantiChromTM Calcium Assay Kit를 사용하여 수행하였다.
실험군으로는 실시예 2.1의 hASC가 사용되었다.
대조군으로는 실시예 2.2의 hASC가 사용되었다.
qRT
-
PCR
TRIzol 용액을 사용하여 RNA를 추출하고, PrimeScriptTM RT Reagent Kit(TAKARA)를 이용하여 얻어진 cDNA에 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)를 넣어 시료를 만든 후, StepOnePlus(Applied Biosystems) 기기를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다.
사용된 프라이머에 관한 정보는 표 7과 같다.
실험군으로는 실시예 2.1의 hASC가 사용되었다.
대조군으로는 실시예 2.2의 hASC가 사용되었다.
| 마커 | 서열(5' -> 3') | NCBI No. | |
| ALP | 센스 |
(서열번호 11)
GAC AAG AAG CCC TTC ACT GC |
NM _000478.4 |
| 안티센스 |
(서열번호 12)
AGA CTG CGC CTG GTA GTT GT |
||
|
Osteopontin
( OPN ) |
센스 |
(서열번호 13)
GAG GGC TTG GTT FTC AGC |
NM _001040060.1 |
| 안티센스 |
(서열번호 14)
CAA TTC TCA TGG TAG TGA GTT TTC C |
||
| BSP | 센스 |
(서열번호 15)
AGA ACC ACT TCC CCA CCT TT |
NM _004967.3 |
| 안티센스 |
(서열번호 16)
AGG TTC CCC GTT CTC ACT TT |
||
|
Osteocalcin
( OCN ) |
센스 |
(서열번호 17)
GGC GCT ACC TGT ATC AAT GG |
NM _001199662.1 |
| 안티센스 |
(서열번호 18)
TCA GCC AAC TCG TCA CAG TC |
||
| RUNX2 | 센스 |
(서열번호 19)
CAG ACC AGC AGC ACT CCA TA |
NM _004348 |
| 안티센스 |
(서열번호 20)
CAG CGT CAA CAC CAT CAT TC |
||
| COL1 | 센스 |
(서열번호 21)
CCC CTG GAA AGA ATG GAG ATG |
NM _000088.3 |
| 안티센스 |
(서열번호 22)
TCC AAA CCA CTG AAA CCT CTG |
||
| 18S rRNA | 센스 |
(서열번호 23)
GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT |
NR _003286.2 |
| 안티센스 |
(서열번호 24)
CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG |
||
(실험결과)
도 1a 내지 도 1d를 참조하면, 대조군(Uncoating)에 비해 실험군(Col I)에서 hASC의 골분화 효율이 높음을 확인할 수 있다. 다시 말하면, I형 콜라겐 상에서 hASC의 골분화 효율이 증대됨을 확인할 수 있다. 도 1d 에서, 골분화 마커들의 발현율은 Col I, OCN, BSP, RUNX2, OPN, ALP 순으로 높았다.
<
실험예
2 >
MMP
발현 확인
qRT-PCR로 실험군과 대조군에서 MMP의 발현율을 확인하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머 정보는 표 8과 같다.
또한, 실험군과 대조군에 대해 공지된 방법으로 웨스턴 블로팅법을 수행하였다.
실험군으로는 실시예 2.1의 hASC가 사용되었다.
대조군으로는 실시예 2.2의 hASC가 사용되었다.
| 마커 | 서열(5' -> 3') | NCBI No. | |
| MMP1 | 센스 |
(서열번호 25)
GCT AAC CTT TGA TGC TAT AAC TAC GA |
NM _001145938.1 |
| 안티센스 |
(서열번호 26)
TTT GTG CGC ATG TAG AAT CTG |
||
| MMP2 | 센스 |
(서열번호 27)
CCC CAA AAC GGA CAA AGA G |
NM _004530.5 |
| 안티센스 |
(서열번호 28)
CTT CAG CAC AAA CAG GTT GC |
||
| MMP3 | 센스 |
(서열번호 29)
CTC ACA GAC CTG ACT CGG TT |
NM _002422.3 |
| 안티센스 |
(서열번호 30)
AAA GCA GGA TCA CAG TTG GC |
||
| MMP8 | 센스 |
(서열번호 31)
CCC TGA AAG CAT AGT TGG GA |
NM _002424 |
| 안티센스 |
(서열번호 32)
AAA CAT GGA CCA ACA CCT CC |
||
| MMP9 | 센스 |
(서열번호 33)
TTG GTC CAC CTG GTT CAA CT |
NM _004994 |
| 안티센스 |
(서열번호 34)
ACG ACG TCT TCC AGT ACC GA |
||
| MMP10 | 센스 |
(서열번호 35)
GCA AAA GAG GAG GAC TCC AA |
NM _002425.2 |
| 안티센스 |
(서열번호 36)
TCA CAT CCT TTT CGA GGT TGT A |
||
| MMP11 | 센스 |
(서열번호 37)
GGT GCC CTC TGA GAT CGA C |
NM _005940.4 |
| 안티센스 |
(서열번호 38)
TCA CAG GGT CAA ACT TCC AGT |
||
| MMP12 | 센스 |
(서열번호 39)
TGG CCA AGA CCT AAG GAA TG |
NM _002426 |
| 안티센스 |
(서열번호 40)
GAT GCA CAT TTC GAT GAG GA |
||
| MMP13 | 센스 |
(서열번호 41)
AAC GCC AGA CAA ATG TGA CC |
NM _002427 |
| 안티센스 |
(서열번호 42)
AGG TCA TGA GAA GGG TGC TC |
||
| MMP14 | 센스 |
(서열번호 43)
CTT GTT TCT TGT TGC TGC GC |
NM _004995.3 |
| 안티센스 |
(서열번호 44)
GGT CAC ATT TGT CTG GCG TT |
||
| MMP19 | 센스 |
(서열번호 45)
GCT GCC TAC CGA CAA GAT TG |
NM _002429.5 |
| 안티센스 |
(서열번호 46)
TTC ATC GCT GCC CAT GAA TG |
||
| 18S rRNA | 센스 |
(서열번호 23)
GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT |
NR _003286.2 |
| 안티센스 |
(서열번호 24)
CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG |
||
(실험결과)
도 2a 내지 도 2c를 참조하면, 대조군(Uncoating)에 비해 실험군(Col I)에서 MMP-13의 발현이 두드러지게 향상됨이 확인되고, 배양기간이 길어짐에 따라 MMP-13이 증가함을 확인할 수 있다.
<
실험예
3 >
기질별
MMP
-13 발현 확인
qRT-PCR을 이용하여 실험군과 대조군에서 MMP-13의 발현을 확인하였다. qRT-PCR에 사용된 MMP-13에 관한 정보는 표 8과 같다.
대조군으로는 실시예 2.2의 hASC가 사용되었다.
실험군으로는 실시예 2.3의 hASC, 실시예 2.4의 hASC, 실시예 2.5의 hASC 가 각각 사용되었다.
(실험결과)
도 3은 일반배양용기, 젤라틴이 코팅된 코팅배양용기, 파이브로넥틴이 코팅된 코팅배양용기, 라미닌이 코팅된 코팅배양용기에서 배양된 Hasc의 MMP-13 발현량을 측정한 qRT-PCR 결과로, 대조군(Normal)에 비해 실험군(Gelatin, FN, LN)에서 MMP-13의 발현이 증가되었다. 도 2a 및 도 3을 참조하면, 콜라겐이 코팅된 코팅배양용기에서 배양된 hASC의 MMP-13 의 발현율이 가장 높다.
<
실험예
4 >
MMP
-13의
억제(knock-down) 의
경우,
골분화
효율 확인
ALP 염색, ALP 활성 측정, Alizarin Red S 염색, 흡광도 측정 및 qRT-PCR이, 실험군과 대조군에 대해 각각 수행되었다.
ALP 염색과 ALP 활성 측정은 분화배지에서 시료를 배양한 뒤, 5일이 경과된 시점에서 수행되었다. Alizarin Red S 염색과 흡광도 측정은 분화배지에서 시료를 배양한 뒤, 14일이 경과된 시점에서 수행되었다. qRT-PCR은 세포배양 후, 5일이 경과된 시점과 14일이 경과된 시점에서 각각 수행되었다.
qRT-PCR에 사용된 ALP, RUNX2에 관한 정보는 표 7과 같다.
실험군으로는 실시예 3.1의 hASC가 사용되었고, 대조군으로는 실시예 3.2의 hASC가 사용되었으며, 실험군과 대조군은 모두 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시에서 배양된 것이 사용되었다.
(실험결과)
도 4a 내지 도 4d를 참조하면, MMP-13을 녹-다운(knock-down) 한 경우, 대조군(siControl)에 비해 실험군(siMMP-13)에서 골분화 효율이 저하되었다. 대조군(siControl)에 비해 실험군(siMMP-13)에서 골분화 마커(ALP, RUNX2)의 발현율이 저하되었다.
<
실험예
5 >
MMP
-13의 과발현(
overexpression
)에 따른
골분화
효율 확인
ALP 염색, ALP 활성 측정, Alizarin Red S 염색, 흡광도 측정 및 qRT-PCR이, 실험군과 대조군에 대해 각각 수행되었다. ALP 염색과 ALP 활성 측정은 분화배지에서 시료를 배양한 후, 5일이 경과된 시점에서 수행되었다. Alizarin Red S 염색과 흡광도 측정은 분화배지에서 시료를 배양한 후, 14일이 경과된 시점에서 수행되었다. qRT-PCR은 세포배양 후, 5일이 경과된 시점과 14일이 경과된 시점에서 각각 수행되었다.
qRT-PCR에 사용된 ALP, RUNX2에 관한 정보는 표 7과 같다.
실험군으로는 실시예 3.3의 hASC가 사용되었고, 대조군으로는 실시예 3.4의 hASC가 사용되었으며, 실험군과 대조군은 모두 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시에서 배양된 것이 사용되었다.
(실험결과)
도 5a 내지 도 5d를 참조하면, MMP-13을 과발현(over expression)시킨 때, 실험군(RV-MMP-13)은 대조군(RV-Control)에 비해 향상된 골분화 효율을 보였다. 대조군(RV-Control)에 비해 실험군(RV-MMP-13)에서 골분화 마커의 발현율이 향상되었다. 도 4와 도 5를 참조하면, MMP-13이 골분화 효율을 향상시키는 주된 요소임을 확인할 수 있다.
<
실험예
6 >
MMP
-13의 처리 농도 증가에 따른
hASC의
골분화
효율 향상 확인
실험군과 대조군에 대해 Alizarin Red S 염색과 흡광도 측정을 각각 수행하였다.
실험군으로는 실시예 5.1의 hASC, 실시예 5.2의 hASC, 실시예 5.3의 hASC 가 사용되었고, 대조군으로는 실시예 2.1의 hASC 이 사용되었으며, MMP-13가 처리되지 않았다. 다시 말하면, 대조군은 실시예 2.1의 hASC 에 처리된 MMP-13의 농도는 0 ng/ml 이다.
(실험결과)
도 6은 Alizarin Red S 염색결과이다. 실험군(MMP-13 10ng/ml, MMP-13 50 ng/ml, MMP-13 100 ng/ml)은 대조군(Control)에 비해 향상된 골분화 효율을 보였다. MMP-13의 처리농도가 증가됨에 따라, hASC의 골분화 효율이 증가되었다. 특히, 실험군(MMP-13 100 ng/ml)은, 대조군(Control)에 비해, 2배 이상의 골 분화 효율의 차이를 보였다.
<
실험예
7 >
MMP
-13의 처리시간에 따른 콜라겐의 삼중나선구조의 풀림 확인
실험군과 대조군에 대해 원편광이색성(circular dichroism)을 측정하였다. 원편광이색성 분광기를 이용하여, 콜라겐의 삼중나선구조가 풀리지 않는 25℃ 에서 원편광이색성 측정이 수행되었다.
실험군으로는 실시예 4.1 내지 실시예 4.4의 개량 콜라겐들이 사용되었고, 대조군으로는 콜라겐(Corning社) 이 사용되었다. 실시예 4.1 내지 실시예 4.4는MMP-13 처리 시간이 서로 상이하다.
(실험결과)
도 7a는 MMP-13의 처리시간이 상이한 시료들의 원편광이색성 분석 결과이며, 도 7b는 MMP-13의 처리시간의 경과에 따른 원편광이색성의 변화에 관한 그래프이다.
대조군(Col I)과 달리, 실험군(Col I+MMP 30 min, Col I+MMP 60 min, Col I+MMP 90 min, Col I+MMP 120 min, Col I+MMP 180 min)에서는 콜라겐의 삼중나선구조가 풀렸다. MMP-13의 처리시간이 증가될수록 콜라겐의 삼중나선구조가 랜덤하게 풀림이 확인된다.
실험군(Col I+MMP 30 min, Col I+MMP 60 min, Col I+MMP 90 min, Col I+MMP 120 min, Col I+MMP 180 min)에서는 MMP-13의 처리시간이 길어짐에 따라, 몰타원율이 낮았다.
실험군(Col I+MMP 180 min)은 대조군(Col I)에 비해 대략 2배 이상의 몰타원율의 감소를 보였으며, 제1 구간(효소처리 시간을 기준으로 0분에서 120분의 사이의 구간)에서는 몰타원율의 감소 폭이 컸지만, 제2 구간(효소처리 시간을 기준으로 120분에서 180분의 사이의 구간)에서는, 몰타원율의 감소 폭이 거의 없었다.
제2 구간에서는 콜라겐의 삼중나선 구조가 실질적으로 완전히 풀린 것으로 보인다.
<
실험예
8 > 효소처리 농도에 따른 콜라겐의 절단 여부 확인
SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 방법을 기반으로 하여 MMP-13이 처리된 콜라겐을 로딩한 후, 쿠마시 블루(coommassie blue) 염색법을 이용하여 콜라겐의 절단 여부를 확인하였다. 구체적으로, SDS-PAGE를 수행한 SDS-아크릴아미드 겔에 대해 쿠마시 블루염색을 수행한 뒤, 밴드의 크기를 통해 콜라겐의 절단 여부를 확인하였다.
표 9와 같이, 실험군과 대조군에서, MMP-13을 콜라겐(Corning 社)에 대해 처리하였다.
| 구분 | I형 콜라겐(Col I) | MMP-13 | MMP-13 처리시간 |
| 대조군 (Col I: + / MMP-13: -) |
10 마이크로그램(㎍) | 0 나노그램(ng) | 2 시간 |
| 실험군 (Col I: + / MMP-13: 0.2) |
10 마이크로그램(㎍) | 0.2 나노그램(ng) | 2 시간 |
| 실험군 (Col I: + / MMP-13: 10) |
10 마이크로그램(㎍) | 10 나노그램(ng) | 2 시간 |
| 실험군 (Col I: + / MMP-13: 20) |
10 마이크로그램(㎍) | 20 나노그램(ng) | 2 시간 |
| 대조군 (Col I: - / MMP-13: 20) |
0 마이크로그램(㎍) | 20 나노그램(ng) | 2 시간 |
(실험결과)
MMP-13을 소정의 농도(예를 들어, 콜라겐 10 마이크로그램(㎍) 당 20 나노그램(ng))까지 높였을 때, SDS-아크릴아미드 젤에서 콜라겐 절편을 확인하지 못한 것으로 보아 처리된 농도범위에서 MMP-13이 콜라겐을 자르지 않음이 확인되었다(도 8).
<
실험예
9 >
MMP
-13 녹-다운(
knock
-
down
) 뒤,
인테그린
알파3의
발현 저하 확인
qRT-PCR을 통해, MMP-13 녹-다운에 의한 인테그린 알파3의 발현 저하를 확인하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머에 관한 정보는 표 10과 같다.
실험군으로는 실시예 3.1의 hASC가 사용되었고, 대조군으로는 실시예 3.2의 hASC가 사용되었으며, I형 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시에서 배양된 것이 사용되었다.
| 유전자 | 서열(5' -> 3') | NCBI No. | |
| Integrin α1 | 센스 |
(서열번호 47)
AAT TGG CTC TAG TCA CCA TTG TT |
NM _181501.1 |
| 안티센스 |
(서열번호 48)
CAA ATG AAG CTG CTG ACT GGT |
||
| Integrin α2 | 센스 |
(서열번호 49)
GCA GAT GGA CCA CAC TTT GA |
NM _002203.3 |
| 안티센스 |
(서열번호 50)
TGT CTG TGC CCT TTT CCT CT |
||
| Integrin α3 | 센스 |
(서열번호 51)
ACT GTG AAG GCA CGA GTG TG |
NM _002204.2 |
| 안티센스 |
(서열번호 52)
TGC TGG TTC GGA GGA ATA G |
||
| Integrin α4 | 센스 |
(서열번호 53)
GAT GAA AAT GAG CCT GAA ACG |
NM _000885.5 |
| 안티센스 |
(서열번호 54)
GCC ATA CTA TTG CCA GTG TTG A |
||
| Integrin α5 | 센스 |
(서열번호 55)
TGC AGT GTG AGG CTG TGT ACA |
NM _002205.2 |
| 안티센스 |
(서열번호 56)
GTG GCC ACC TGA CGC TCT |
||
| Integrin α6 | 센스 |
(서열번호 57)
TTG AAT ATA CTG CTA ACC CCG |
NM _000210.2 |
| 안티센스 |
(서열번호 58)
TCG AAA CTG AAC TCT TGA GGA TAG |
||
| Integrin α10 | 센스 |
(서열번호 59)
GTG TGG ATG CTT CAT TCC AG |
NM _003637.4 |
| 안티센스 |
(서열번호 60)
GCC ATC CAA GAC AAT GAC AA |
||
|
Integrin
α11
|
센스 | (서열번호 61) CCA ACC CCA AGG ACA ACA |
NM_001004439.1 |
| 안티센스 | (서열번호 62) CTC CCA CAC TCA TGA GAC CA |
||
| Integrin αV | 센스 |
(서열번호 63)
GCA CCC TCC TTC TGA TCC T |
NM _001144999.2 |
| 안티센스 |
(서열번호 64)
GAG GAC CTG CCC TCC TTC |
||
| Integrin β1 | 센스 |
(서열번호 65)
GAA GGG TTG CCC TCC AGA |
NM _002211.3 |
| 안티센스 |
(서열번호 66)
GCT TGA GCT TCT CTG CTG TT |
||
(실험결과)
도 9는 siRNA를 이용하여 MMP-13을 억제한 뒤, 인테그린의 mRNA의 발현을 확인한 qPCR 결과로, MMP-13의 녹-다운에 의해 인테그린 알파3(integrin α3)의 발현이 가장 특이적으로 감소하였다.
<
실험예
10> I형 콜라겐에 의한
인테그린
알파3(integrin α3)의
발현 수준 확인
실험군과 대조군에 대해 공지된 방법으로 면역염색을 수행하였고, 실험군으로는 실시예 2.1의 hASC가 사용되었으며, 대조군으로는 실시예 2.2의 hASC가 사용되었다.
(실험결과)
도 10 을 참고하면, 대조군(Uncoating)에 비해, 실험군(Col I 이 코팅된 코팅배양용기에서 배양된 hASC; Col I)에서 integrin α3β1과 F-액틴의 발현이 증가되었다.
<
실험예
11 >
integrin
α3
녹-다운(
knock
-
down
)에 의한
MMP
-13 발현 및 ALP 활성 저하의 확인
qRT-PCR과 ALP 활성 측정을 수행하여, integrin α3의 녹-다운에 의한 결과를 확인하였다. qRT-PCR에 사용된 MMP-13에 관한 정보는 표 7과 같고, integrin α3에 관한 정보는 표 10과 같다.
실험군으로는 실시예 3.5의 hASC가 사용되었다.
제1 대조군으로는 실시예 3.6의 hASC가 사용되었다.
제2 대조군으로는 실시예 3.1의 hASC(I형 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시에서 배양된 것)이 사용되었다.
(실험결과)
도 11a와 도 11b로부터, integrin α3의 녹-다운에 의한 ALP의 활성 저하가 확인되었다. 제1 대조군(siControl)에 비해 실험군(siITGA3) 및 제2 대조군(siMMP-13)은 저하된 ALP 활성을 보였다. 제2 대조군(siMMP-13)에 비해, 실험군(siITGA3)에서 상대적으로 높은 ALP 활성을 보였으나, 그 차이가 통계적으로 유의적인 수준은 아니라고 분석된다.
<
실험예
12 >
integrin
α3
항체를 이용하여
hASC
표면의
integrin
α3을
억제한 경우, 녹-다운(
knock
-
down
)에 의한
MMP
-13 발현과
ALP
활성의 저하 확인
-
실험군(Col I+rhMMP-13/ anti-ITGA3): integrin α3의 항체를 이용하여 실시예 1의 hASC 표면의 integrin α3를 억제한 뒤, MMP-13이 처리된 Col I 위에 세포를 파종하였다.
-
제1 대조군(Col I/ IgG): 실시예 1의 hASC 를 Col I 위에 파종하였다.
-
제2 대조군(Col I+rhMMP-13/ IgG): 실시예 1의 hASC 를 MMP-13이 처리된 Col I 위에 파종하였다.
-
제3 대조군(Col I/ anti-ITGA3): integrin α3의 항체를 이용하여 실시예 1의 hASC 표면의 integrin α3를 억제한 뒤, Col I 위에 파종하였다.
(실험결과)
도 12는 integrin α3의 항체를 이용하여 hASC 표면의 integrin α3을 억제시킨 것을 MMP-13이 처리된 I형 콜라겐 상에 파종한 결과로, 실험군에서 골분화가 두드러지게 감소되었다.
<
실험예
13>
MMP
-13 처리 이후에
integrin
α3
발현 증가 확인
qRT-PCR을 통해, MMP-13 처리 이후에 integrin α3의 발현 증가를 확인하였다. 도 13은 MMP-13 처리 이후에 integrin α3의 mRNA 발현이 증가되는 것에 관한 qRT-PCR 결과이다.
실험군과 대조군으로는 실시예 1의 hASC를 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시에서 표 11과 같이 MMP-13이 처리한 것이 사용되었고, integrin α3 의 발현을 확인하기 위한 시료는, 세포배양 후 6 시간이 경과된 때, 24 시간이 경과된 때에 실험군과 대조군에서 각각 채취되었다.
| 구분 | MMP-13 | MMP-13 처리시간 |
| 대조군 (w/o MMP -13) |
0 나노그램(ng) | - |
| 실험군 (MMP-13(30min)) |
100 나노그램(ng) | 30 분 |
| 실험군 (MMP-13(2h)) |
100 나노그램(ng) | 2 시간 |
| 실험군 (MMP-13(18h)) |
100 나노그램(ng) | 18 시간 |
<
실험예
14 > I형 콜라겐에서 세포부착 단백질의 발현 증가 확인
웨스턴 블로팅과 면역염색을 통해 I형 콜라겐이 코팅된 코팅배양용기에서 배양된 hASC에서 세포부착 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
실험군으로는 실시예 2.1 의 hASC가 사용되었다.
대조군으로는 실시예 2.2 의 hASC가 사용되었다.
(실험결과)
도 14a는 세포부착 단백질들(pFAK, FAK, p-p38, Vinculin, β-actin)의 웨스턴 블롯팅 이미지이며, 도 14b는 세포부착 단백질들(ITGB1, Vinculin, F-actin)의 면역염색 이미지이다.
도 14a 및 도 14b 를 참조하면, 실험군(Col I)에서 대조군(Uncoating)에 비해 세포부착 단백질들의 발현이 증가되었음을 알 수 있다.
<
실험예
15 >
MMP
-13 억제로 세포부착 단백질의
mRNA
발현 감소 확인
실험군으로 실시예 3.1의 hASC를 사용하고, 대조군으로 실시예 3.2의 hASC를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머에 관한 정보는 표 10과 같다.
(실험결과)
도 15는 siRNA를 이용하여 MMP-13을 억제한 때, integrin α3(ITGA3), integrin β1(ITGB1), 세포부착 단백질들(FAK, Vinculin), 골분화 마커들(RUNX2, Col I) 각각의 발현량을 측정한 것이다 도 15를 참고하면, 대조군(siControl)에 비해, 실험군(siMMP-13)에서 세포부착 단백질들의 발현이 감소되었다.
<
실험예
16 >
MMP
-13 처리에 의해
FAK의
mRNA
발현 증가 확인
실시예 2.1 의 hASC에 대해 rhMMP-13을 0 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml 로 처리한 뒤, qRT-PCR을 수행하였다. qRT-PCR 에 사용된 프라이머 정보는 표 12와 같다.
| 유전자 | 서열(5' -> 3') | NCBI No. | |
| Integrin β1 | 센스 |
(서열번호 65)
GAA GGG TTG CCC TCC AGA |
NM _002211.3 |
| 안티센스 |
(서열번호 66)
GCT TGA GCT TCT CTG CTG TT |
||
| Vinculin | 센스 |
(서열번호 67)
GAT GAG AGG GCA GCT AAC TTT GAA |
NM _003373 |
| 안티센스 |
(서열번호 68)
TTT ATT AGC AGT ACC AAC CGC AGC |
||
| FAK | 센스 |
(서열번호 69)
GTC TGC CTT CGC TTC ACG |
NM _005607.4 |
| 안티센스 |
(서열번호 70)
GCC GAG ATC ATG CCA CTC |
||
(실험결과)
도 16은 rhMMP-13 의 농도별 처리 대한 FAK의 mRNA 발현에 관한 qPCR 결과로, rhMMP-13 처리에 의해 FAK의 발현이 증가되었고, rhMMP-13의 농도가 높을수록 FAK의 발현이 증가되었다.
<
실험예
17 > I형 콜라겐 상에서
RUNX2의
핵으로의
국소화
증가 확인
면역염색, qRT-PCR, 웨스턴 블롯팅을 통해 I형 콜라겐 상에서 RUNX2의 핵으로의 국소화 증가를 확인하였다.
실험군으로는 실시예 2.1 의 hASC가 사용되었다.
대조군으로는 실시예 2.2 의 hASC가 사용되었다.
(실험결과)
도 17a는 면역염색 이미지이고, 도 17b는 RUNX2의 mRNA 발현에 관한 qPCR 결과이며, 도 17c는 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 17a 내지 도 17c를 참조하면, 대조군(Uncoating)에 비해, 실험군(Col I)에서 RUNX2가 핵으로 국소화되었다. 도 17a 에는, RUNX2 가 핵으로 국소화되는 것이 화살표로 표시되어 있다. 대조군(Uncoating)에 비해, 실험군(Col I)에서 RUNX2의 발현이 대략 2배 정도 높았으며(도 17b), 도 17c 에서는 I형 콜라겐(Col I)의 존재 하에서, 세포기질에 비해 핵 내에서 RUNX2가 높은 발현율을 보였다(도 17c).
<
실험예
18 >
MMP
-13 억제로
RUNX2의
핵으로의
국소화
감소 확인
실험군과 대조군에 대해 면역염색을 수행하였다. 실험군으로 I형 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시에서 배양된 실시예 2.1의 hASC 가 사용하고, 제1 대조군으로 I형 콜라겐이 코팅된 코팅배양접시에서 배양된 실시예 2.2의 hASC 가 사용하고, 제2 대조군으로 I형 콜라겐이 코팅되지 않은 일반배양접시에서 배양된 실시예 2.1의 hASC 가 사용하고, 제3 대조군으로는 I형 콜라겐이 코팅되지 않은 일반배양접시에서 배양된 실시예 2.2의 hASC 가 사용하였다.
(실험결과)
도 18은 siRNA를 이용한 MMP-13의 녹-다운(knock down)이 RUNX2의 핵으로의 국소화를 감소시킨 결과로, 제1 대조군(Col/siCon)에 비해 실험군(Col I/siMMP13)에서, RUNX2의 핵으로의 국소화가 감소되었다. 제2 대조군(Uncoating/siMMP13)과 제3 대조군(Uncoating/siCon)에서의 RUNX2의 핵으로의 국소화 수준의 차이는 실질적으로 발견되지 않았다.
<
실험예
19 > 쥐의 두개골 결손 모델에서
MMP
-13의 골 재생 효과 확인
I형 콜라겐 1 mg당 1㎍의 MMP-13을 쥐의 두개골 결손 모델에 적용한 뒤, 8주 뒤에 마이크로 CT로 골 재생을 확인하였다.
도 19는 마이크로 CT를 통해 쥐의 두개골 결손 모델에서 골 재생이 확인된 결과이다. 도 19a는 골 재생 정도를 보여주는 마이크로 CT 이미지이고, 대조군(Col I sponge/PBS)에 비해 실험군(Col I sponge/MMP-13)에서, 골이 높게 형성되었다. 도 19b는 골량/총량(bone volune/total volume; BV/TV), 망상골의 두께(trabecular thickness; Tb.Th), 망상골의 수(trabecular number; Tb.N) 및 총 공극률(Po(tot)%)를 측정한 결과이며, 대조군(Col I sponge/PBS)에 비해 실험군(Col I sponge/MMP-13)에서, 골량/총량 및 망상골의 두께가 유의적으로 증가되었으며, 총 공극률이 유의적으로 감소되었다. 도 19c는 헤마톡실린 및 에오진염색법 과 masson's trichrome 염색법을 통해 두개골 조직을 염색한 결과이며, 대조군(Col I sponge/PBS)에 비해 실험군(Col I sponge/MMP-13)에서, 두개골 조직의 두께와 골 형성 정도가 증가되었다.
통계적 분석
각 실험은 최소 5번 반복되었으며, 정량 데이터는 평균±표준오차로 표시하였고, 집단 간의 비교를 일원분산분석(one-way ANOVA)을 시행한 후, 집단 내 차이를 스튜던트-t 검정을 사용하여 집단 간의 통계적 유의성을 분석하였다. p < 0.05 인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Colleage of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> BIOMATERIAL FOR BONE REGENERATION INCLUDING UNWOUND COLLAGEN AND
<130> C35-70220
<160> 70
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-13 siRNA sense
<400> 1
cgaaauauca aagucauuat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-13 siRNA antisense
<400> 2
uaaugacuuu gauauuucgt t 21
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scrambled siRNA
<400> 3
ugguuuacau gucgacuaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scrambled siRNA
<400> 4
ugguuuacau guuguguga 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scrambled siRNA
<400> 5
ugguuuacau guuuucuga 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> scrambled siRNA
<400> 6
ugguuuacau guuuuccua 19
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-13 sense
<400> 7
atgcatccag gggtcctggc tgcc 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-13 antisense
<400> 8
ttaacaccac aaaatggaat ttgc 24
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA3 siRNA sense
<400> 9
gacagugaug ggugagucu 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA3 siRNA antisense
<400> 10
agacucaccc aucacuguc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alkaline phosphatase sense
<400> 11
gacaagaagc ccttcactgc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alkaline phosphatase antisense
<400> 12
agactgcgcc tggtagttgt 20
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Osteopontin sense
<400> 13
gagggcttgg tttcagc 17
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Osteopontin antisense
<400> 14
caattctcat ggtagtgagt tttcc 25
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSP sense
<400> 15
agaaccactt ccccaccttt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BSP antisense
<400> 16
aggttccccg ttctcacttt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Osteocalcin sense
<400> 17
ggcgctacct gtatcaatgg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Osteocalcin antisense
<400> 18
tcagccaact cgtcacagtc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RUNX2 sense
<400> 19
cagaccagca gcactccata 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RUNX2 antisense
<400> 20
cagcgtcaac accatcattc 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COL 1 sense
<400> 21
cccctggaaa gaatggagat g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COL 1 antisense
<400> 22
tccaaaccac tgaaacctct g 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18S rRNA sense
<400> 23
gtaacccgtt gaaccccatt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18S rRNA antisense
<400> 24
ccatccaatc ggtagtagcg 20
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP1 sense
<400> 25
gctaaccttt gatgctataa ctacga 26
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP1 antisense
<400> 26
tttgtgcgca tgtagaatct g 21
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP2 sense
<400> 27
ccccaaaacg gacaaagag 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP2 antisense
<400> 28
cttcagcaca aacaggttgc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP3 sense
<400> 29
ctcacagacc tgactcggtt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP3 antisense
<400> 30
aaagcaggat cacagttggc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP8 sense
<400> 31
ccctgaaagc atagttggga 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP8 antisense
<400> 32
aaacatggac caacacctcc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP9 sense
<400> 33
ttggtccacc tggttcaact 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP9 antisense
<400> 34
acgacgtctt ccagtaccga 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP10 sense
<400> 35
gcaaaagagg aggactccaa 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP10 antisense
<400> 36
tcacatcctt ttcgaggttg ta 22
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP11 sense
<400> 37
ggtgccctct gagatcgac 19
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP11 antisense
<400> 38
tcacagggtc aaacttccag t 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP12 sense
<400> 39
tggccaagac ctaaggaatg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP12 antisense
<400> 40
gatgcacatt tcgatgagga 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP13 sense
<400> 41
aacgccagac aaatgtgacc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP13 antisense
<400> 42
aggtcatgag aagggtgctc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP14 sense
<400> 43
cttgtttctt gttgctgcgc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP14 antisense
<400> 44
ggtcacattt gtctggcgtt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP19 sense
<400> 45
gctgcctacc gacaagattg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP19 antisense
<400> 46
ttcatcgctg cccatgaatg 20
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 1 sense
<400> 47
aattggctct agtcaccatt gtt 23
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 1 antisense
<400> 48
caaatgaagc tgctgactgg t 21
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 2 sense
<400> 49
gcagatggac cacactttga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 2 antisense
<400> 50
tgtctgtgcc cttttcctct 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 3 sense
<400> 51
actgtgaagg cacgagtgtg 20
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 3 antisense
<400> 52
tgctggttcg gaggaatag 19
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 4 sense
<400> 53
gatgaaaatg agcctgaaac g 21
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 4 antisense
<400> 54
gccatactat tgccagtgtt ga 22
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 5 sense
<400> 55
tgcagtgtga ggctgtgtac a 21
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 5 antisense
<400> 56
gtggccacct gacgctct 18
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 6 sense
<400> 57
ttgaatatac tgctaacccc g 21
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 6 antisense
<400> 58
tcgaaactga actcttgagg atag 24
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 10 sense
<400> 59
gtgtggatgc ttcattccag 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 10 antisense
<400> 60
gccatccaag acaatgacaa 20
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 11 sense
<400> 61
ccaaccccaa ggacaaca 18
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha 11 antisense
<400> 62
ctcccacact catgagacca 20
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha V sense
<400> 63
gcaccctcct tctgatcct 19
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin alpha V antisense
<400> 64
gaggacctgc cctccttc 18
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin beta 1 sense
<400> 65
gaagggttgc cctccaga 18
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Integrin beta 1 antisense
<400> 66
gcttgagctt ctctgctgtt 20
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vinculin sense
<400> 67
gatgagaggg cagctaactt tgaa 24
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vinculin antisense
<400> 68
tttattagca gtaccaaccg cagc 24
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAK sense
<400> 69
gtctgccttc gcttcacg 18
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAK antisense
<400> 70
gccgagatca tgccactc 18
Claims (13)
- 콜라겐이 코팅된 배양접시에 콜라겐 분해효소가 처리된 효소처리군에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 골세포 분화 유도 방법.
- 제1 항에 있어서,
상기 콜라겐은 I형 콜라겐이고, 상기 콜라겐 분해효소는 기질금속단백질분해효소-13(MMP-13)인 골세포 분화 유도 방법. - 제1 항에 있어서,
상기 콜라겐은 I형 콜라겐이고, 상기 줄기세포는 인간지방유래 줄기세포인 골세포 분화 유도 방법. - 제3 항에 있어서,
상기 콜라겐 분해효소는 MMP-13인 골세포 분화 유도 방법. - 제4 항에 있어서,
상기 MMP-13은, 상기 콜라겐 100 중량부에 대해 0.00 중량부 초과 내지 1.00 중량부 이하의 범위에서, 상기 콜라겐이 코팅된 배양접시에 처리되는 골세포 분화 유도 방법. - 제1 항에 있어서,
상기 효소처리군에서 상기 줄기세포는 대조군에 비해 증대된 골분화 효율을 보이는 골세포 분화 유도 방법. - 각 나선의 펩타이드 결합이 유지된 채로, 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐을 포함하는 골재생용 생체재료.
- 제7 항에 있어서,
콜라겐 분해효소;를 더 포함하는 골재생용 생체재료. - 제8 항에 있어서,
상기 콜라겐은 I형 콜라겐이고, 상기 콜라겐 분해효소는 MMP-13인 골재생용 생체재료. - 제7 항에 있어서,
상기 콜라겐에 부착된 줄기세포를 더 포함하는 골재생용 생체재료. - 제10 항에 있어서,
상기 콜라겐은 I형 콜라겐이고, 상기 줄기세포는 인간지방유래 줄기세포인 골재생용 생체재료. - 제7 항에 있어서,
상기 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐은, 삼중나선 구조를 가진 콜라겐에 비해 증대된 골재생 효율을 보이는 골재생용 생체재료. - 제12 항에 있어서,
상기 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐은, 상기 삼중나선 구조를 가진 콜라겐에 비해, 줄기세포의 골분화 효율이 높은 골재생용 생체재료.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170024804A KR20180097960A (ko) | 2017-02-24 | 2017-02-24 | 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐을 포함하는 골재생용 생체재료 및 콜라겐 분해효소 처리를 통해 줄기세포로부터 골 분화를 유도하는 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170024804A KR20180097960A (ko) | 2017-02-24 | 2017-02-24 | 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐을 포함하는 골재생용 생체재료 및 콜라겐 분해효소 처리를 통해 줄기세포로부터 골 분화를 유도하는 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180097960A true KR20180097960A (ko) | 2018-09-03 |
Family
ID=63600939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170024804A KR20180097960A (ko) | 2017-02-24 | 2017-02-24 | 삼중나선 구조가 풀린 콜라겐을 포함하는 골재생용 생체재료 및 콜라겐 분해효소 처리를 통해 줄기세포로부터 골 분화를 유도하는 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20180097960A (ko) |
-
2017
- 2017-02-24 KR KR1020170024804A patent/KR20180097960A/ko unknown
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