ES2308790T3

ES2308790T3 - Celulas sensibles al tgf-beta 1 derivadas de medula osea.

Info

Publication number: ES2308790T3
Application number: ES97947454T
Authority: ES
Inventors: Erlinda Maria Gordon; Frederick L. Hall; W. French Anderson
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1996-11-12
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2017-11-12
Also published as: WO1998020907A1; CA2271734A1; JP2008206520A; US6844191B2; JP4767983B2; US6063593A; DE69738753D1; EP0946199B1; AU5253498A; US20020141982A1; EP0946199A4; US6277369B1; PT946199E; JP2001503989A; NZ335753A; EP0946199A1; ATE397461T1; US6410015B1; DK0946199T3

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA POBLACION HOMOGENEA DE CELULAS SENSIBLES AL TGF BE 1, DERIVADAS DE LA MEDULA OSEA, UN PROCEDIMIENTO DE SELECCION A PARTIR DE LA MEDULA OSEA Y UN PROCEDIMIENTO DE EXPRESION DE UNA PROTEINA DE RECOMBINANTE DERIVADA DE LAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA. LA SELECCION COMPRENDE LAS ETAPAS DE TRATAMIENTO DE LAS CELULAS DE MEDULA OSEA IN VITRO POR UNA PROTEINA TGF BE 1 QUE SELECCIONA UNA POBLACION HOMOGENEA DE CELULAS PARA UN TRATAMIENTO ULTERIOR. LAS CELULAS SELECCIONADAS PUEDEN EXPANDIRSE Y LUEGO UN GEN QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINA TERAPEUTICA PUEDE INSERTARSE EN DICHAS CELULAS EXPANDIDAS Y LUEGO EXPRESAR LA PROTEINA TERAPEUTICA. SE PUEDEN INTRODUCIR LUEGO LAS CELULAS TRANSDUCIDAS EN UN MAMIFERO PARA DAR UN RESULTADO TERAPEUTICO.

Description

Células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a células derivadas de médula ósea, un método para su selección a partir de médula ósea, y el uso de células derivadas de médula ósea como vehículos para transferencia de genes. Más particularmente, esta invención se refiere al uso de una proteína transformante del factor de crecimiento \beta1 (TGF\beta1) para seleccionar, a partir de médula ósea, una población de células que son responsables de la proteína TGF\beta1. A partir de entonces, las células seleccionadas pueden ser utilizadas como vehículo para transferir a un mamífero, incluido humanos, genes que codifican una proteína terapéutica.

Antecedentes de la invención

Los dos sistemas celulares principales asociados a hueso y médula son los sistemas de célula madre hemopoyética y de célula madre estromal. En el sistema de célula madre estromal, las células madre mesenquimales (también conocidas como células progenitoras mesenquimales) originan progenitores de muchos fenotipos diferenciados, que incluyen osteocitos, condrocitos, miocitos, adipocitos, fibroblastos, y células de médula estromal. Sin embargo, el término "célula madre" no se define fácilmente. De acuerdo con Maureen Owen (Bone and Mineral Research, pp. 1-25 (Elsevier Science Publishers 1985)), "no hay definición rigurosa de célula madre. Éstas tienen una alta capacidad de auto-renovarse a lo largo de la vida y tienen la capacidad de diferenciarse en una variedad de poblaciones celulares funcionales," Owen a 1. Con respecto al sistema de célula madre estromal, Owen declara que

(m)esenquimal, estromal, fibroblástico, reticular, retículo, y fusiforme son términos a menudo utilizados de forma intercambiable para estas células del tejido conectivo, que también han sido designadas como mecanocitos. El término "fibroblástico" se utiliza comúnmente para abarcar a todas estas células...

Las condiciones de cultivo, que promueven el crecimiento clonal de células fibriblásticas, incluyen el uso de suero fetal de ternera, normalmente, frecuente cambio completo de medio... y preparaciones de una sola célula... Cuando las células preparadas de esta manera se cultivan, in vitro, bajo las condiciones de arriba, la mayoría de las células hemopoyéticas mueren y se forman colonias fibroblásticas estromales. Las células de médula cultivadas bajo estas condiciones generales originan colonias fibroblásticas, cada una derivada de una sola célula. Estas células crecen rápidamente hasta confluencia y, a menudo, se llaman fibroblastos de médula.

Owen a 4, 6. Owen añade que "la verdadera complejidad de la población de células madre, que, considerando la heterogeneidad de... clones examinados, no puede ser sobre-estimada" Owen a 10.

Caplan y cols. (Patente de EE.UU Nº 5,486,359) describen que separaron una población homogénea de células madre mesenquimales humanas a partir de médula ósea. Caplan y cols. también describen métodos para caracterizar y usar las células madre mesenquimales purificadas para desarrollar propósitos de diagnóstico y terapéuticos.

En el procedimiento de Caplan y cols., los tapones de médula ósea se agitan en medio de cultivo suplementado con lotes seleccionados (pero no definidos) de suero fetal bovino. Los gránulos lavados de células se resuspenden, se pasan a través de agujas graduadas (calibre 18 y luego calibre 20), se lavan, cuentan y siembran. De forma alternativa, los aspirados de médula ósea se capean en un gradiente de Percoll, tras el cual, se recoge una fracción de baja densidad y se siembra bajo condiciones de cultivo clásicas. En cualquier caso, las células no adherentes se eliminan con el cambio de medio, y las células que permanecen se permiten crecer hasta confluencia, produciendo, de acuerdo con Caplan y cols., una población uniformemente homogénea de células de tipo fibroblasto. De forma específica, Caplan y cols. describen que "las células madre mesenquimales adherentes de hueso esponjoso de la cabeza femoral o de aspirado ilíaco tienen morfología similar; casi todas siendo fibroblásticas, con unas pocas células adipocíticas, poligonales o redondas..." Columna 19, líneas 46-49; Figura 1. Caplan y cols. además describen que estas células fibroblásticas adherentes pueden ser traspasadas bajo condiciones de cultivo clásicas o inducidas para diferenciarse en células formadoras de médula, bajo ciertas condiciones.

Se sabe que ciertas células progenitoras mesenquimales son capaces de auto-renovarse y sufrir crecimiento en presencia del factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF\beta1), una citoquina pleiotrópica con funciones autocrinas y paracrinas.

El factor de crecimiento transformante \beta (TGF\beta), un péptido de 25 kDa encontrado abundantemente en plaquetas y hueso, liberado en respuesta a daño tisular, se está convirtiendo en una herramienta cada vez más importante para inmunomodulación, curación de heridas, y reparación tisular. TGF\beta es también un quimioatrayente para células de origen mesenquimal, y como tal, recluta fibroblastos en el lugar del daño, estimula la angiogénesis y la síntesis de novo de proteínas de matriz extracelular en concierto con la sobre-regulación de inhibidores de degradación de la matriz. Véase Roberts A.B., Sporn M.B.: The Transforming Growth Factor-\betas, pp. 420-472 (1990). TGF\beta1 y TGF\beta2 son potentes agentes inmunorreguladores que suprimen la proliferación y función de linfocitos T y B in vitro (Id) e in vivo (Véase Wrann M, y cols., "T Cell Suppressor Factor from Human Glioblastoma Cells Is a 12.5 KD Protein Closely Relating to Transforming Growth Factor-beta," EMP. J. 6:1633-36 (1987)). Por lo tanto, parece que TGF\beta juega un papel crucial en enfermedades clínicamente relevantes de vigilancia inmune, regeneración tisular, y reparación. Además, la reparación tras daño tisular como quemaduras, infarto de miocardio, trauma e isquemia cerebral, así como curación quirúrgica de heridas, puede acelerarse con una sola infusión sistémica o aplicación local de este factor de crecimiento peptídico. Véase Beck S.L., y cols., "TGF-\beta1 Induces Bone Closure of Skull Defects," J. Bone Mineral Res. 6(1991). Los efectos terapéuticos de la administración de TGF\beta pueden ser aumentados y/o prolongados por sus pronunciadas funciones autocrinas y paracrinas.

La captura de células madre mesenquimales humanas derivadas de médula ósea con una proteína de fusión del factor de crecimiento b1 transformante (TGFb1) se ha mostrado en Gordon y cols. 1995, Blood, 86, suplemento 1, página 998a.

Compendio de la invención

Aquí se describe una población homogénea de células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea y un método para su selección a partir de médula ósea, preferiblemente de médula ósea humana.

Las células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea de la presente invención han sido llamadas, en la reciente literatura científica publicada, como células progenitoras mesenquimales o células madre mesenquimales. Véase E.M. Gordon, y cols., Human Gene Therapy 8:1385-94 (July 20, 1997). Sin embargo, los inventores ahora reconocen que las células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea se llaman, de forma más apropiada, "células progenitoras premesenquimales" o "células madre premesenquimales", desde que las células seleccionadas morfológicamente parecían ser una forma temprana o más primitiva de células madre mesenquimales o células progenitoras mesenquimales, tal como se evidencia por la forma redonda de tipo blastoide de las células, en lugar de la forma de tipo blastoide normalmente asociada a células madre mesenquimales. Así, las células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea pueden incluir una población homogénea de células madre premesenquimales (también conocidas como células progenitoras premesenquimales) o una población homogénea de células premesenquimales diferenciadas, como células estromlaes. La población homogénea de células madre premesenquimales puede incluir células blastoides pluripotentes.

La selección se lleva a cabo tratando las células de médula ósea in vivo con una proteína TGF\beta1, que selecciona, a partir de células, una población de células que son sensibles a la proteína TGF\beta1. A partir de entonces, las células seleccionadas pueden ser crecidas en el cultivo celular.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para expresar una proteína recombinante a partir de la población homogénea seleccionada de células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea. Las células pueden ser transducidas con un segmento de ADN que codifica una proteína terapéutica para hacer que las células expresen la proteína terapéutica. En un aspecto adicional, la presente invención está dirigida a un método para introducirlas dentro de un receptor para producir un resultado terapéutico.

La proteína TGF\beta1 es una proteína de fusión TGF\beta1 que comprende un sitio de unión a matriz extracelular, que es preferiblemente un sitio de unión a colágeno. Entonces, el sitio de unión a matriz extracelular de la proteína de fusión TGF\beta1 puede ser utilizado para integrar selectivamente la proteína de fusión TGF\beta1 en una matriz extracelular, como colágeno. En una realización, el sitio de unión a colágeno es un sitio de unión a colágeno derivado del factor de von Willebrand.

En todavía otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método de terapia génica que comprende los pasos de capturar células sensibles a TGF\beta1, derivadas de médula ósea, bajo condiciones de bajo suero en una matriz de colágeno impregnada con una proteína de fusión TGF\beta1 que comprende un sitio de unión a colágeno derivado del factor de von Willebrand (TGF\beta1-vWF), que integra selectivamente la proteína de fusión TGF\beta1 a la matriz de colágeno. Luego, las células capturadas pueden ser crecidas en el cultivo celular para formar colonias celulares diferenciadas. Estas colonias celulares crecidas, luego pueden ser transducidas in vitro con un vector viral que comprende un gen que codifica una proteína terapéutica, donde el gen es expresado para producir la proteína terapéutica. A partir de entonces, las células transducidas pueden ser introducidas dentro de un mamífero, como un humano, para producir un resultado terapéutico.

En una realización particular de la invención, se ha descubierto que las células progenitoras premesenquimales aisladas con una proteína de fusión TGF\beta1-vWF, crecidas en cultivo, y transducidas con un vector retroviral que contiene el gen que codifica el factor IX, expresaban niveles significativos de proteína del factor IX. Además, cuando las células transducidas eran transplantadas dentro de ratones inmunocompetentes, el transgén del factor IX humano se expresaba in vivo.

Breve descripción de la figuras

Características, aspectos y ventajas de la invención serán más ampliamente entendidas cuando se consideren con respecto a la siguiente descripción detallada, las reivindicaciones añadidas y los dibujos acompañantes donde:

La Figura 1 es una representación esquemática de la construcción TGF\beta1- factor de fusión de von Willebrand manipulada genéticamente. La proteína expresada contiene una etiqueta de purificación de histidina, un sitio proteasa, una secuencia decapéptida auxiliar de unión a colágeno y la secuencia de cDNA que codifica el fragmento activo maduro del TGF\beta1 humano.

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La Figura 2 muestra la proliferación de células estromales de médula en concentraciones variables de suero fetal bovino (FBS). El número de células, trazado sobre el eje vertical, se expresa como una función de la concentración de suero (% FBS) sobre un periodo de tiempo de 6 días, trazado sobre el eje horizontal.

La Figura 3 contiene fotografías de geles que muestran secciones de controles teñidas con hematoxilina-eosina (H & E), relleno de colágeno no tratado en Figura 3(a), y relleno de colágeno tratado con TGF\beta1-vWF en Figuras 3(b) y 3(c) tras extirpación a partir de cultivos de médula ósea tras 8 días.

La Figura 4 contiene fotografías de geles que demuestran en la Figura 4(a), aspirados de médula ósea cultivados en medio pobre en suero, que exhiben degeneración y muerte celular; en la Figura 4(b), supervivencia de una población primitiva de células blastoides en geles de colágeno aumentada por una proteína de fusión TGF\beta1 de unión a colágeno recombinante; en la Figura 4(c), crecimiento de células madre capturadas tras la selección, en presencia de factores séricos adicionales; y en la Figura 4(d), formación de colonias de células madre crecidas, revelando derivados estromales/fibroblásticos.

La Figura 5 contiene fotografías de geles que muestran la diferenciación de células madre colágeno/TGF\beta1 capturadas dentro de un linaje osteogénico. La Figura 5(a) muestra aspirados control de médula ósea cultivados en geles de colágeno, en ausencia de la proteína de fusión TGF\beta1 recombinante, mientras que la Figura 5(b) muestra la expansión de colonias osteogénicas, en presencia de la proteína de fusión TGF\beta1 recombinante y tras cultivo posterior en presencia de factores osteoinductores (dexametasona, vitamina C y \beta-glicerofosfato). La Figura 5(c) muestra la formación de "tejidos" osteogénicos en presencia de la proteína de fusión TGF\beta1 y factores osteoinductores. La Figura 5(d) es una ampliación de la Figura 5(c).

La Figura 6 son fotografías de geles que muestran en la Figura 6(a), aspirados control de médula ósea cultivados en pocillos cubiertos de colágeno, en ausencia de TGF\beta1-vWF; in la Figura 6(b), la captura de una población de células precursoras blastoides en pocillos cubiertos de colágeno impregnados con TGF\beta1-vWF, y en la Figura 6(c), células premesenquimales de médula, transplantadas, tras captura y expansión en presencia de TGF\beta1-vWF;, reconstitución con suero, y transducción con el vector LIXSNL.

La Figura 7 muestra la detección, por transcriptasa reversa de la reacción en cadena de la polimerasa (basada en RT-PCR), de secuencias únicas del factor IX humano en la médula ósea (Calle 2) y pulmón (Calle 3) de ratones receptores veintiocho días después del transplante de células progenitoras premesenquimales del, transducidas con vector para el factor IX. Los ratones se sacrificaron para la detección, por RT-PCR, de secuencias del factor IX humano en varios órganos de ratón. Se ven bandas positivas, que identifican las secuencias de cDNA del factor IX humano (Calles 8 y 9), en una región de 180 pares de bases de no homología con las secuencias de cDNA del factor IX de ratón.

Calle 1, LIXSNL/hígado; Calle 2, LIXSNL/médula ósea; Calle 3, LIXSNL/pulmón; Calle 4, LXSNL/hígado; Calle 5, LXSNL/médula ósea; Calle 6, LIXSNL/riñón; Calle 7, Marcador de 1 Kb; Calles 8 y 9, hígado humano; Calle 10, en blanco; Calle 11, LIXSNL/bazo; Calle 12, LXSNL/riñón.

La Figura 8 muestra los resultados de capturar subconjuntos de precursores osteoblásticos obtenidos a partir de médula ósea al exponer las células a varios tipos de proteínas morfológicas de hueso (BMPs) (rhOP-1, rhBMP-2 y bFGF). Tal como muestran las fotografías, estas poblaciones de células poseen características distintivas en términos de menos potencial proliferarivo y más fenotipos diferenciados.

La Figura 9 muestra los resultados de estudios de hueso en cámara, donde células TGF\beta1 capturadas y crecidas manifiestan la capacidad de generar cartílago (mucho más que con TGF\beta-1, TGF\beta1-F2 marcado con colágeno), a pesar de aquellas capturadas con hueso proporcionado con BMPs.

Descripción detallada de la invención

Tal como se indicó arriba, la presente invención se refiere a células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea, un método para su selección a partir de médula ósea, y el uso de las células seleccionadas derivadas de médula ósea como vehículos celulares para transferencia de genes. La presente invención demuestra que una población homogénea de células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea, incluyendo células progenitoras premesenquimales, pueden ser seleccionadas y crecidas en virtud de sus respuestas fisiológicas intrínsecas a TGF\beta1. La presente invención además de-
muestra la utilidad de estas células tratadas para dirigir enfoques de terapia génica en mamíferos, incluyendo humanos.

Los inventores han demostrado la utilidad de la captura, crecimiento, diferenciación, y el potencial de una población diferente de células blastoides redondas obtenidas bajo estrictas condiciones de selección en virtud de una respuesta de supervivencia recientemente definida obtenida por un factor de crecimiento definido. De forma notable, normalmente el TGF-beta se almacena en plaquetas y matriz ósea, donde se libera en respuesta al daño, pero, por el contrario, no está presente en la circulación general. Tal como se mencionó arriba, TGF-beta juega un papel fundamental en el reclutamiento y diferenciación de células precursoras mesenquimales. Esta respuesta fisiológica a TGF-beta (proteínas de fusión) es esencial para la captura (es decir, supervivencia) de estas células blastoides que, por el contrario, no son separadas físicamente de cualquier célula hematopoyética u otras células mesenquimales en base al tamaño, densidad o adherencia. Las células sensibles a TGF-beta proliferan en respuesta a factores séricos y forman colonias características dentro de matrices de colágeno. La morfología de estas células es inicialmente blastoide, y no fibriblástica, ya que las células proliferativas son capaces de manifestar citodiferenciación en células fibroblásticas y/o osteogénicas, indicando un precursor mesenquimal. Tal como se muestra en la Figura 9, dispuestas en cámaras de hueso, las células precursoras premesenquimales TGF-beta capturadas de la presente invención forman cartílago y no hueso, en contraste con las células madre BMP capturadas, que, in vivo, exhiben fenotipo menos proliferativo y más diferenciado (formador de hueso).

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La presente invención se refiere a un método para seleccionar células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea a partir de médula ósea, que comprende los pasos de tratar, in vitro, las células de médula ósea con una proteína TGF\beta1, seleccionando, de ese modo, a partir de las células, una población de células que son sensibles a la proteína TGF\beta1. Las células seleccionadas, luego pueden ser crecidas en el cultivo celular. En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para expresar una proteína recombinante a partir de las células derivadas de médula ósea que comprende insertar un segmento de ADN, que codifica una proteína terapéutica, dentro de las células crecidas, para que las células expresen la proteína terapéutica.

La proteína TGF\beta1 utilizada para tratar, in vitro, las células de médula ósea, es una proteína de fusión TGF\beta1 que comprende un sitio de unión a matriz extracelular. El sitio de unión a matriz extracelular permite a la proteína de fusión TGF\beta1 unirse a una matriz extracelular, como una matriz de colágeno. Un sitio de unión a matriz extracelular preferido es, por ello, un sitio de unión a colágeno. Los tipos de matrices de colágeno incluyen geles e implantes. Esta unión de la proteína de fusión TGF\beta1 a la matriz extracelular permite la captura de células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea en la matriz extracelular.

Las células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea de la presente invención incluyen células madre progenitoras premesenquimales, también llamadas células progenitoras sensibles a TGF\beta (TRPC), y células diferenciadas derivadas de médula ósea, como células estromales.

La introducción, in vitro, de un segmento de ADN dentro de células derivadas de médula ósea, puede ser realizada por procedimientos conocidos, preferiblemente por transducción con un vector viral, más preferiblemente, un vector retroviral. Procedimientos no virales incluyen electroporación, transfección mediada por fosfato cálcico, microinyección y proteoliposomas.

El segmento de ADN introducido dentro de células derivadas de médula ósea en el presente método puede codificar cualquier variedad de proteínas terapéuticas. El método de esta invención es particularmente útil para enfoques de terapia génica para corregir defectos en los sistemas trombosis-hemostasis. Ejemplos de genes o segmentos de ADN adecuados incluyen aquellos que codifican el factor IX humano, el factor VIIIc, el factor de von Willebrand, activadores de plasmógeno tisular, la proteína C, la proteína S y la antitrombina III.

La presente invención también está dirigida a un método para proporcionar a un receptor, incluyendo un mamífero, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína terapéutica, introduciendo células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea dentro del receptor. Previamente a la introducción dentro de un receptor. Las células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea se tratan, in vitro, previamente a la introducción dentro del receptor, primero con una proteína TGF\beta1 para seleccionar las células sensibles a TGF\beta1 a partir del resto de componentes celulares contenidos en una muestra de médula ósea, y segundo, para insertar, dentro de las células sensibles a TGF\beta1, un segmento de ADN que codifique una proteína terapéutica. A partir de entonces, las células transducidas expresarán, in vivo, una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína terapéutica en el receptor.

La presente invención también está dirigida a un método de terapia génica que comprende el primer paso de capturar células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea, preferiblemente células progenitoras premesenquimales, bajo condiciones de bajo suero, en una matriz de colágeno (por ejemplo, implantes y geles) impregnada con una proteína de fusión TGF\beta1 recombinante que comprende un sitio de unión a colágeno, preferiblemente derivado del factor de Willebrand, que integra selectivamente la proteína TGF\beta1 a la matriz de colágeno y prolonga su semi-vida biológica. Véase Tuan T.L., y cols., "Engineering, Expression and Renaturation of Targeted TGF-beta Fusion Proteins," Conn. Tiss. Res. 34:1-9 (1996). Las proteínas de fusión TGF\beta1 manipuladas que incorporan el sitio de unión a colágeno, que está fusionado con un fragmento activo de la proteína TGF\beta1, tal como se muestra en la Fig. 1, exhibe propiedades funcionales que no existen en la naturaleza. Véase Tuan T.L., y cols. Se encontró que estas proteínas de fusión TGF\beta1-vWF integradas selectivamente a colágeno funcionan eficazmente para capturar las células progenitoras blastoides sensibles a TGF\beta1. Las construcciones TGF\beta1 que carecen del dominio de unión a colágeno no eran tan eficaces.

El método de terapia génica de la presente invención comprende crecer las células sensibles a TGF\beta1. para formar colonias celulares diferenciadas, seguido del paso de transducción de las células crecidas in vitro, utilizando procedimientos de transferencia génica conocidos, incluyendo los mediados por virus, y preferiblemente la transferencia génica mediada por retrovirus. En una realización preferida, durante los pasos de captura y crecimiento, se añade TGF\beta1 adicional, preferiblemente de origen purificado, a las células. Luego, las células transducidas pueden expresar la proteína terapéutica.

El método de terapia génica también comprende el paso de introducir las células transducidas dentro de un mamífero, para producir un resultado terapéutico. Más específicamente, y como se muestra con más detalle abajo, la presente invención demuestra la utilidad de matrices de colágeno impregnadas con TGF\beta1-vWF para aislar nuevas células diana como vehículos para llevar a cabo terapia génica ex vivo.

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Para optimizar las condiciones de cultivo celular para efectuar la selección ex vivo de células progenitoras sensibles a TGF\beta1, se añadieron concentraciones variables de suero fetal bovino (FBS) a las células estromales de médula ósea crecidas en Medio Mínimo Esencial de Dulbecco (DMEM) durante 6 días. La Figura 2 muestra una característica disminución en el número de células observado a las 24 horas, seguido de un aumento, dependiente de suero, en los contajes celulares a largo plazo. No se observó aumento en el contaje celular en cultivos suplementados con FBS al 1% o menos, mientras que cultivos suplementados con concentraciones de FBS mayores del 1% mostraron una recuperación progresiva tras un intervalo de tiempo de aproximadamente 3 días. Basado en lo de arriba, se utilizó FBS al 1% y al 0,5% como concentraciones de suero mínimas para desarrollar condiciones favorables para la supervivencia de células sensibles a TGF\beta1.

La Figura 3 muestra secciones de implantes de colágeno teñidos con hematoxilina-eosina. De forma específica, la Figura 3(a) muestra implantes control no tratados, mientras que las Figuras 3(b) y 3(c) muestran implantes tratados con TGF\beta1-vWF extraídos a partir de cultivos de médula ósea tras 8 días. Los implantes de colágeno no tratados mostraron una ausencia uniforme de elementos celulares, mientras que las secciones de implantes tratados con TGF\beta1-vWF revelaron una población de células pequeñas blastoides mononucleares que tienen una cromatina nuclear y borde nuclear gruesos rodeados en algunas áreas por un estrecho borde de citoplasma agranular azul. Ocasionalmente, se percibe en la Figura 3(c) una población de células pleomórfocas, que incluyen células blastoides y presuntos derivados. Ambos tipos de células parece que han secretado proteínas de matriz extracelular de novo. Estas proteínas de matriz se distinguen de las fibras de colágeno originales.

Tras dirigir los estudios de arriba, utilizando aspirados de médula ósea humana, directamente se observaron cultivos celulares en estudios adicionales donde se investigó la selección (captura) y crecimiento mitótico de células derivadas de médula ósea de roedor, cultivadas en geles de colágeno. Comparando las Figuras 4(a) y 4(b), se muestra que mantener una población relativamente uniforme de células blastoides requería la presencia de la proteína de fusión TGF\beta1-vWF dentro de la matriz de colágeno. Tal como demuestra la Figura 4(b), aparentemente TGF\beta1-vWF soportaba la supervivencia, pero no el crecimiento de estas células blastoides bajo condiciones de bajo suero. Sin embargo, por encima de la adición de 10% de FBS al cultivo celular, las células capturadas comenzaron a proliferar, tal como se evidencia por la formación de dobletes celulares, tal como se muestra en la Figura 4(c), y la formación de colonias multicelulares, tal como se muestra en la Figura 4(d). Se confirmó que las células blastoides capturadas eran una forma de célula mesenquimal (o célula premesenquimal), tal como se muestra en la Figura 5, añadiendo factores osteoinductores (dexametasona, vitamina C, y \beta-glicerofosfato), al medio de crecimiento completo, que inducen citoproliferación y mineralización de las colonias crecientes.

Utilizando un vector que contiene un gen de \beta-galactosidasa como gen reportero, la eficacia de transducción observada en ambas células progenitoras premesenquimales sensibles a TGF\beta1-vWF derivadas de médula ósea de roedor y de humano fue del intervalo de 20-30%. Comparando la administración génica dentro de células madre TGF\beta1-vWF crecidas con aquellas administración dentro de células diferenciadas que tienen un fenotipo de origen mesenquimal, ambas células madre derivadas de médula y células estromales maduras se transdujeron con un vector retroviral que lleva un cDNA del factor IX humano (LIXSNL). La Tabla I de abajo muestra la producción del factor IX tras crecer células seleccionadas en presencia de la proteína de fusión TGF\beta1-vWF, seguido de la transducción de las células con el vector LIXSNL. Las células capturadas y crecidas como resultado del tratamiento con la proteína de fusión TGF\beta1-vWF unida a colágeno, produjeron cantidades significativas (\mug) del factor IX por 10^{6} células.

También se observó que suplementando además los cultivos celulares con TGF\beta1 purificado se inducía un aumento dramático (diez veces) en la producción del factor IX.

TABLA I

1

Se encontró que el nivel de factor IX producido por estos cultivos celulares estimulados con TGF\beta1 era considerablemente mayor que los niveles producidos por células maduras de origen mesenquimal, tras la sola transferencia génica mediada por vector. Sin embargo, estos cultivos estimulados de células progenitoras premesenquimales exhibían actividad coagulante relativamente baja (0,1 mU actividad coagulante/ng proteína), sugiriendo, con ello, que las células eran bioquímicamente inmaduras y/o, tal como se discute abajo, todavía no habían desarrollado un sistema de \tau-carboxilación competente.

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En comparación, se observó una eficacia de transducción similar (de aproximadamente 20%) del vector de \beta-galactosidasa en células diferenciadas estromales de médula. La Tabla II de abajo, muestra la producción del factor IX en células estromales de médula G418-seleccionadas tras transducción con un vector que contiene el gen del factor IX. La cantidad de factor IX biológicamente activo secretado en estos cultivos era proporcional al nivel de antígeno, indicando un sistema de \tau-carboxilación funcional y exhibiendo una relación de actividad coagulante nativa del factor IX a antígeno consistente con la relación observada en plasma normal (1 mU actividad coagulante/5 ng proteína). El nivel de factor IX producido por las células estromales de médula transducidas era comparable a los niveles de expresión resultantes de fibroblastos humanos. Véase Palmer, T.D., y cols., "Production of Human Factor IX in Animals by Genetically Modified Skin Fibroblasts: Potential Therapy for Hemophilia B. Blood" 73:438-445 (1989).

TABLA II

2

Se emprendió un estudio piloto para demostrar el transplante de células progenitoras transfectadas, tal como se describe arriba, dentro de ratones endogámicos. Tal como muestra la Figura 6(b), se capturaron, sobre matrices de colágeno/TGF\beta1-vWF, bajo condiciones pobres en suero (1% de FBS) durante 5 días, células sensibles a TGF\beta1-vWF de médula ósea de ratones B6CBA, tras lo cual, tal como muestra la Figura 6(c), luego, los cultivos seleccionados se reconstituyeron en medio de crecimiento completo (D10) durante 2 días. Los cultivos celulares crecidos fueron luego transducidos con el vector LIXSNL en presencia de 8 \mug/ml de Polibreno. En el día 21, se infiltraron 1x10^{5} células dentro de la vena de la cola de los ratones receptores y se recogieron muestras de sangre cada 7 días a partir de la cola del ratón para ensayos de antígeno del factor IX.

En el momento del transplante, se encontró que la producción media del factor IX era de 2.8 ug/10^{6} células/24 horas, con una actividad de coagulación media de 676 mU/10^{6} células/24 horas y una relación de actividad de coagulación de 1 mU a 4,2 ng de proteína (n=3). Infiltrando células progenitoras transducidas con LIXSNL a través de la vena de la cola de ratones inmunocompetentes (n=3), se produjeron niveles detectables, in vivo, del factor IX humano, específicamente, hasta 14,6 ng de factor IX humano/ml plasma a día 7, 9,7 ng/ml a las 2 semanas tras transplante, seguido de disminución a niveles no detectables a los 28 días tras transplante.

El nivel esperado de expresión trangénica del factor IX se estimó basado en la cantidad de factor IX producido en cultivos de células progenitoras transducidas de ratón, medidas en el tiempo de transplante, utilizando la fórmula:

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donde el "# de células transplantadas" era 1x10^{5}, la "producción de factor IX" media era 2.8 ug/10^{6} células por 24 hr, el "peso(wt)/kg x volumen de plasma (ml)" medio era 20 gm para un volumen de plasma de 1 ml (50 ml/kg), y la semi-vida (t1/2) para el factor IX recombinante era 24 horas. Los niveles plasmáticos medios del factor IX de 14,6 ng/ml y 9,7 ng/ml observados en tres ratones transplantados en los días 7 y 14, respectivamente, se aproximaron estrechamente al nivel pronóstico de aproximadamente 14 ng/ml.

Como muestra la Figura 7, se detectaron, por RT-PCR, tránscritos del factor IX en médula ósea y pulmón de animales tratados, pero no en hígado, riñón o bazo.

Las implicaciones terapéuticas de la presente invención para terapia génica son sustanciales. En particular, existe el potencial para utilizar tecnología de célula madre mio-fibro-osteogénica para terapias génicas fetales de distrofia muscular, enfermedades del tejido conectivo, enfermedades de almacenamiento lipídico, y enfermedades esqueléticas, así como hemofilia. Además, la terapia génica somática se puede convertir en el tratamiento óptimo para la hemofilia B (deficiencia en el factor de coagulación IX).

Además, la terapia génica para tratar la hemofilia B, precisamente puede no requerir una expresión regulada, ni integración génica específica de sitio. Mientras que los niveles de factor IX tan altos como 150% se encuentran en individuos sanos, un nivel de factor IX del 5% podría eliminar enfermedades de pinzamiento causadas por hemorragias recurrentes de articulaciones. Debido a que el factor IX normalmente circula en plasma, cualquier célula manipulada, que tenga acceso vascular que produzca niveles suficientes de factor IX funcional, puede ser una fuente continua in vivo, obviando así la necesidad de transfusiones repetidas. En particular, las células progenitoras premesenquimales son un candidato atractivo debido a su capacidad para auto-renovarse y diferenciarse en fenotipos secretores presentes dentro de la mádula ósea.

La presente invención se ilustrará en detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos están incluidos para propósitos ilustrativos y no se deben considerar como limitantes de la presente invención.

Ejemplo 1 Producción de una Proteína de Fusión TGF\beta1-vWF Recombinante

Se manipuló un vector de expresión procariótico para producir una proteína de fusión de tres partes ("tripartite"), tal como muestra la Figura 1, que consiste en una etiqueta de purificación 6xHis, un sitio auxiliar de unión a colágeno derivado del factor de van Willebrand, y una secuencia de cDNA que codifica el fragmento activo maduro de TGF\beta1 (TGF\beta1-vWF) humano. El método para preparar la proteína de fusión (TGF\beta1-vWF) es el objeto de la Solicitud de EE.UU dependiente Nº 08/465,772, presentada el 6 de Junio de 1995, e incorporada aquí por referencia. Véase también Tuan T.L. y cols., "Engineering, Expression and Renaturation of Targeted TGF-beta Fusion Proteins," Conn. Tiss. Res. 34:1-9 (1996), también incorporado aquí por referencia.

Se aisló y purificó hasta la homogeneidad una proteína de fusión, expresada a partir del vector de arriba, a partir de cuerpos de inclusión de E. Coli, utilizando cromatografía de quelato de níquel, solubilizado con urea 8 M, y renaturalizado por replegamiento oxidativo bajo condiciones redox optimizadas. Véase Solicitud de EE.UU Nº 08/465,772, incorporada aquí por referencia; véase también Tuan T.L., y cols.. La actividad biológica de esta construcción, luego se evaluó por ensayos de proliferación celular in vitro, utilizando TGF\beta1 purificado como un control clásico.

Ejemplo 2 Preparación de Matrices de Colágeno

Se prepararon matrices sólidas de colágeno, tal como se describió previamente por Nimni y colaboradores. Véase Nimni y cols., Biotechnology 17:51-82 (1980). Específicamente, se cortaron círculos de 5 mm a partir de hojas de colágeno (1 mm de grosor aprox.), esterilizados con etanol al 70%, lavados en DMEM, e incubados con TGF\beta1-vWF (50 \mul/implante; 1 \mug) durante 2 horas a 37ºC, previo al cultivo con aspirados de médula ósea en platos de 6 pocillos.

Ejemplo 3 Establecimiento de Condiciones Iniciales de Cultivo para Seleccionar Células Sensibles a TGF\beta1

Para establecer las condiciones de mínimo crecimiento requeridas para seleccionar células sensibles a TGF\beta1, se monitorizó, por contaje celular, la relación de supervivencia de células estromales adherentes maduras en cultivos que contienen DMEM suplementado con concentraciones variables de FBS (Biowhittaker). La concentración más alta de FBS (0,5% a 1%) que proporcionó una caída precipitada en el número de células sin recuperación significativa más de 6 días, tal como se demuestra en la Figura 2, se utilizó como medio de selección para experimentos exitosos. Se sembraron aproximadamente 1 X 10^{6} células de médula ósea humana normales (obtenidas a partir del hospital USC Norris) en cada uno de los 6 pocillos del plato (Falcon) que contiene 1) implantes de colágeno tratados con TGF\beta1-vWF, 2) implantes de colágeno no tratados (5 mm de diámetro), o 3) una fina capa de colágeno Tipo 1 de cola de rata (Beckton-Dickenson) pre-incubado con la proteína de fusión TGF\beta1-vWF. Se crecieron las células en condiciones mínimas de suero: 1% de FBS en DMEM suplementado con 200 \mug/ml de ampicilina. El medio se reemplazó con DMEM- 1% de FBS cada 4 días durante 12 días, tras lo cual, el medio se repuso con 10% de FBS previo a la transducción de las células. Se eliminó un implante de colágeno tratado o no tratado con TGF\beta-vWF cada 4 días durante 12 días, se fijó en formalina al 10%, se insertó en parafina, se seccionó, y tiñó con hematoxilina-eosina para examen histológico.

Ejemplo 4 Captura y Crecimiento de Sellas Progenitoras Premesenquimales en Geles de Colágeno

Se obtuvieron aspirados de médula ósea a partir de ratas Fisher de un mes de vida muertas por eutanasia. El tejido de la médula ósea de la diáfisis femoral se lavó en DMEM que contenía penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 U/ml). Luego, las células de médula ósea se recogieron sacando la médula ósea varias veces en jeringas graduadas con agujas del calibre 18. Luego, las células se aglomeraron por centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos, se resuspendieron en medio libre de suero, y se contaron con un hemocitómetro.

Se preparó colágeno tipo I del tendón de cola de rata, tal como se describe por Nimni y cols. . De forma específica, tendones de cola de rata se recogieron y lavaron con PBS 1X, se digirieron durante toda la noche con pepsina (0,5 mg/ml), se precipitaron dos veces con NaCl 1M (pH 7,5) y se dializaron en ácido acético 0,5M, seguido de diálisis en HCl 0,001N. La concentración de colágeno se determinó por un ensayo de hidroxiprolina, mientras que su pureza se confirmó por mapeo con 2-D péptido, tal como se describe por Benya y cols., Collagen Res 1:17-26 (1981). Se diluyeron tres mg/ml de colágeno tres veces con DMEM 3X para hacer una solución de colágeno IX, de ahí, el pH se ajustó a 7,5 y se almacenaron alícuotas a 4ºC.

Los aglomerados celulares lavados se suspendieron en 10 \mul de medio libre de suero y en 200 \mul de colágeno neutralizado, tras lo cual se añadieron 10 \mul de TGF\beta-vWF recombinante o medio control. Luego, las mezclas célula/colágeno se transfectaron a platos de cultivo tisular de 24 pocillos y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos hasta que las moléculas de colágeno se agregaron en fibrillas, atrapando así las células dentro de los geles de colágeno. Luego, se cubrió el gel con 0,5 ml de FBS al 0,5% en medio DMEM, y se incubaron las células a 37ºC durante 7 días sin cambiar el medio. Tras 7 días de privación de suero, se reemplazó el medio con medio D10, el cual fue cambiado cada 3 días. Siete días después de la reconstitución con medio D10, los cultivos seleccionados se suplementaron con agentes osteoinductores: dexametasona 10^{-8}M, ácido M ascórbico 2.8 x 10^{-4}M y \beta-glicerol-fosfato10 mM en medio D10.

Ejemplo 5 Transducción de Células TGF\beta1 Seleccionadas y Células Estromales de Médula Ósea con Vectores Retrovirales de Galactosidasa \beta y de Factor IX (LIXSNL)

Las células sensibles a TGF\beta1-vWF capturadas dentro de implantes de colágeno (o en platos cubiertos de colágeno) y las células estromales de médula humana seleccionadas por siembra diferencial en DMEM-FBS al 10% (D10) se expusieron durante dos horas tanto al vector de \beta-galactosidasa (G1BgSvNa) como al vector del factor IX (LIXSNL), en presencia de 8 \mug/ml de Polibreno. Los nombres G1BgSvNa y LIXSNL indican el orden de las regiones promotoras y codificantes (G1 o L = MoMuLV LTR; Bg = cDNA de \beta galactosidasa; IX = cDNA del factor IX humano; Sv o S = promotor SV40; Na o N = gen de neomicina fosfotransferasa). Los títulos de los vectores fueron 1.3 X 10^{6} cfu/ml para G1BgSvNa y 1 X 10^{6}cfu/ml para LIXSNL. El vector LIXSNL, que contiene sólo el gen de resistencia a neomicina, sirvió como vector control. Los vectores retrovirales G1BgSvNa yLIXSNL se proporcionaron, como clones celulares productores de PA317, por Genetic Therapy, Inc., Gaithersburg, MD y por el Dr. Dusty Miller, Universidad de Washington, Seattle, Washington, respectivamente.

Tras cuarenta y ocho horas, los implantes de colágeno se fijaron con paraformaldehido y se tiñeron con tinción de X-gal (\beta galactosidasa) para detectar las células productoras de \beta galactosidasa citoplasmática. También se tiñeron con tinción X-gal las células estromales de médula transducidas con la \beta galactosidasa antes y después de la selección de G418. La eficacia de transducción de las células estromales se determinó en células transducidas no seleccionadas por determinación del número de células teñidas de azul. Véase Skotzko M.J., y cols., "Retroviral Vector-mediated Gene Transfer of Antisense Cyclin G1 (CYCG1) Inhibits Proliferation of Human Osteogenic Sarcoma Cells," Cancer Research 55:5493-5498 (1995). A intervalos en serie, se recogió el medio de los cultivos celulares transducidos con los vectores del factor IX y control y se almacenó en alícuotas a -70ºC hasta su ensayo para actividad de coagulación del factor IX y para antígeno.

Se midió la actividad coagulante del factor IX tal como describen Gordon E.M., y cols., "Characterization of Monoclonal Antibody-purified Factor IX Produced in Human Hepatoma (HepG2) Cell Cultures after Retroviral Vector-Mediated Transfer," J. Int. Pediatr. Heamtol. Oncol. 2:185-191, (1995) utilizando una modificación del tiempo parcial de la tromboplastina, mientras que la cantidad de antígeno del factor IX se midió utilizando una técnica de radioinmunoensayo específica, tal como describen Gordon E.M., y cols., "Expression of Coagulation Factor IX (Christmas factor) in Human Hepatoma (HepG2) Cell Cultures after Retroviral Vector-Mediated Transfer," Amer. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 15:195-203 (1993). Se analizó cualquier importancia en las diferencias entre grupos analizando la varianza. Véase Dixon W.J., y cols., BMDP Statistical Software (Berkley: University of California Press, 1990).

Ejemplo 6 Transplante de Células Progenitoras Premesenquimales de Múrido Transducidas con un Vector Retroviral del Factor IX (LIXSNL)

Se capturaron, en platos cubiertos con colágeno e impregnados con TGF\beta1-vWF, células de médula ósea sensibles a TGF\beta1 de 6 semanas, 20 gm, de ratones B6CBA inmunocompetentes (Jackson Labs, Barr Harbor, Maine) bajo condiciones pobres en suero (DMEM-1% de FBS) durante 5 días. Luego, los cultivos se reconstituyeron con medio D10 (DMEM-10% de FBS). Los cultivos crecidos se transdujeron en el 7º día con el vector del factor IX LIXSNL o con el vector control LIXSNL en presencia de 8 \mug/ml de Polibreno y se mantuvo en D10 durante dos semanas más. En el día 21, se inyectaron 1 X 10^{5} células dentro de la vena de la cola de ratones de la misma cepa (n = 3 para cada grupo). Se recogieron muestras de sangre cada 7 días a partir de la cola del ratón para llevar a cabo el ensayo de antígeno del factor IX.

Ejemplo 7 Análisis de la Reacción en Cadena de la Polimerasa Basada en la Transcriptasa Reversa (RT-PCR) del Transgén del Factor IX Humano en Órganos de Múrido

Se aisló ARN total de distintos órganos de los ratones tratados en el Ejemplo 6 por el método del isotiocianato de guanidina, tal como describen Chormczynski P., y cols., "Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction," Anal. Biochem. 192:156-59 (1988). La primera hebra de cDNA del ARN total se sintetizó por transcriptasa reversa, tal como se describe en el kit cDNA Cyrcle de Invitrogen (Invitrogen, San Diego, CA), seguido de amplificación por PCR. Cada reacción en un volumen de 20 \mul contenía 1 \mug de ARN, 1 \mug de cebador al azar y 5 unidades de transcriptasa reversa AMV.

Primero, el ARN y los cebadores al azar se calentaron juntos a 65ºC para eliminar su estructura secundaria y luego se dejaron a temperatura ambiente durante 2 minutos. Las reacciones siguientes se llevaron a cabo en un tampón 1X de transcriptasa reversa que comprende DNTPs 5mM, pirofosfato sódico 4mM y 5 unidades de transcriptasa reversa, a 42ºC durante 60 minutos. La muestra se calentó a 95ºC durante 2 minutos para desnaturalizar el híbrido ARN-cDNA. Para amplificar, por PCR, el gen del factor IX humano, se diseñaron los cebadores utilizando la región del gen del factor IX dentro del cual se da una diferencia entre la homología de las secuencias de aminoácidos del cDNA humano y de ratón.

Los oligonucleótidos utilizados para efectuar la amplificación por PCR de la secuencia del factor IX eran los siguientes: (707) sentido 21-mer 5' ACT CAA GGC ACC CAA TCA TTT 3'; (708) 5' AAC TGT AAT TTT AAC ACC AGT TTC AAC 3'. De forma adicional, se utilizó ARN de hígado humano como control positivo para la reacción de amplificación.

El cDNA sintetizado a partir de la reacción de arriba se desnaturalizó, primero a 94ºC durante 5 minutos, luego a 80ºC durante 1 minuto, seguido de 60ºC durante 45 segundos (paso 1). Luego, la muestra se calentó a 72ºC durante 2 minutos (paso 2), seguido de calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 45 segundos, y 72ºC durante 10 minutos (paso 3). Los pasos 1 y 2 se realizaron una sola vez, mientras que el paso 3 se llevó a cabo 30 veces. Tras completar la reacción, las muestras se corrieron en geles de agarosa al 2,5%, para visualizar las bandas del factor IX, tal como demuestra la Figura 7.

Por consiguiente, los hallazgos de arriba demuestran que TGF\beta1 se puede utilizar en un protocolo de terapia génica, donde las células derivadas de médula ósea, preferiblemente células madre pluripotentes, son las dianas deseadas para administrar un gen a un individuo.

Claims

1. Un método para obtener una población de células blastoides redondas, a partir de médula ósea, donde las células son células premesenquimales que sobreviven, pero no crecen, en presencia de TGF\beta1 bajo condiciones de bajo suero, el método comprende:

(a) tratar las células de médula ósea en una matriz bajo condiciones de bajo suero, donde la matriz está comprendida por una proteína de fusión TGF\beta1 que comprende un sitio de unión a colágeno derivado del factor de Willebrand, donde la proteína de fusión está funcionalmente asociada al gel de colágeno, y las células de médula ósea están atrapadas dentro del gel de colágeno, y

(b) seleccionar dicha población de células.

2. Un método para expresar una proteína recombinante a partir de células derivadas de médula ósea, que comprende los pasos de:

(a) seleccionar una población de células a partir de médula ósea, según el método de la reivindicación 1; e

(b) insertar dentro de las células sensibles a TGF\beta1 un segmento de ADN que codifica una proteína terapéutica, donde las células sensibles a TGF\beta1 expresan la proteína terapéutica.

3. El método de la reivindicación 2, donde las células de médula ósea son células humanas.

4. El método de la reivindicación 2 o 3, donde las células sensibles a TGF\beta1 son células progenitoras premesenquimales o células estromales.

5. El método de la reivindicación 4, donde las células progenitoras premesenquimales son células blastoides pluripotentes.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el segmento de ADN ha sido insertado, in vitro, dentro de células sensibles a TGF\beta1por un vector viral.

7. El método de la reivindicación 6, donde el vector viral es un vector retroviral.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde el segmento de ADN codifica el factor IX humano.

9. Un método de la reivindicación 1 que además comprende los pasos de:

(a) crecer la población de células seleccionadas para formar colonias celulares diferenciadas; y

(b) transducir las células crecidas in vitro con un vector viral que comprende un gen que codifica una proteína terapéutica, causando, así, que las células transducidas expresen una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína terapéutica.

10. Un método para la producción de una composición farmacéutica que comprende los pasos del método de la reivindicación 9, útil para terapia génica.

11. El método de la reivindicación 9 o 10, donde se proporciona TGF\beta1 adicional durante los pasos (a) y (b).

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde las células sensibles a TGF\beta1 derivadas de médula ósea son células progenitoras premesenquimales o células estromales.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el vector viral es un vector retroviral.