KR20230125719A - 근육과 지방을 함께 분화시키는 배양육 제조방법 및 이로 제조된 배양육 - Google Patents

근육과 지방을 함께 분화시키는 배양육 제조방법 및 이로 제조된 배양육 Download PDF

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Abstract

본 발명은 근육과 지방을 함께 분화시키는 배양육 제조방법 및 이로 제조된 배양육에 관한 것으로, 실제 식육과 유사한 식감을 갖는 배양육의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 배양육을 제조하기 위한 닭 근육 줄기세포 배양용 배지를 제공한다.

Description

근육과 지방을 함께 분화시키는 배양육 제조방법 및 이로 제조된 배양육 {METHODS FOR MANUFACTURING CULTURED MEAT BY DIFFERENTIATION OF MUSCLE AND FAT, AND THE CULTURED MEAT THEREBY}
본 발명은 배양육 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 배양육에 관한 발명이다.
체내에서 골격근(skeletal muscle)은 다핵의 수축성 근섬유(muscle fiber)로 구성이 되어 있으며, 상기 근섬유는 발달과정에서 근아세포(myoblast)라 불리는 중배엽 기원의 세포의 융합으로 형성된다. 이러한 근아세포는 근위성세포(satellite cells)라 불리는 근육 줄기세포(muscle stem cell)로부터 분화한다.
근위성세포는 체내에서 휴지 상태(quiescent)로 근섬유의 기저층 아래에 존재한다. 휴지 상태의 근위성세포는 근육 손상, 운동 등의 자극에 의해 활성화되면서 근아세포, 근세포, 근섬유로 분화된다. 근육을 체외에서 배양할 때에는 근위성세포와 근아세포를 아울러 근육 줄기세포로 부른다.
일반적으로 줄기세포를 체외 배양하기 위해서는 체내와 유사한 세포 주변의 미세환경(microenvironment)을 조성해야 한다. 따라서, 체외에서 근육 줄기세포를 배양할 때 역시 체내 세포 주변의 미세환경에서 분비되는 것으로 알려진 다양한 인자들과 함께 배양해야 한다. 이때 사용되는 인자로서는 기초 섬유아세포 성장인자(bFGF), 인슐린, 인슐린 유사 성장인자, 인터페론 등이 있으며, 이러한 인자들을 활용한 다양한 연구가 진행되었다. 또한, 다른 줄기세포 배양과 마찬가지로 근육 줄기세포도 소태아혈청을 사용하여 체외 배양하는 방법이 사용되고 있다.
하지만, 근육 줄기세포를 장기간 체외에서 배양할 경우 근원성 조절인자(MRFs:Myogenic regulatory factors)의 발현이 감소하고, 세포의 증식 및 분화능이 점진적으로 감소하는 것으로 확인된다. 또한 지금까지 닭의 근육 줄기세포를 장기간 배양하기 위한 최적의 체외 배양 조건을 확립한 사례는 알려진 바 없다.
배양육 제조과정에서 가장 큰 문제점은 실제 근내 지방이 같이 존재하는 식육을 그대로 모사할 수 없다는 점이다. 현재까지 알려진 바로는 근육세포와 지방세포를 별도로 배양하여 만든 근육과 지방을 혼합하는 작업이 필요하므로, 근내 지방이 존재하는 식육의 식감을 그대로 모사할 수 없고, 분쇄육 등의 형태로 가공할 수밖에 없다는 문제가 있다.
따라서, 근육과 지방을 공배양(co-culture)하여 근내 지방이 존재하는 식육을 모사한 배양육을 제조려는 시도가 있었으나, 주로 C2C12와 같은 근육세포주를 지방전구세포와 함께 각 지방 및 근육세포 배양에 필요한 인자들을 함께 넣고 배양하면서 서로 다른 세포간 또는 세포내 상호작용을 연구하는 것이 대부분이었다. 또한, 근육 줄기세포를 지방세포로 교차 분화하는 연구가 시도되긴 했으나, 근육과 지방을 동시에 분화시키는 연구는 지금까지 시도된 바 없다.
가축의 근육 줄기세포를 배양한 후 근육과 지방으로 동시에 분화시킬 수 있다면 실제 식육의 근내지방을 직접 모방할 수 있어 실제 식육과 유사한 식감을 표현할 수 있으므로, 배양육 생산 공정에 중요한 의미를 가질 수 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명의 발명자들은 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 다각도로 연구한 결과, 본 발명의 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 닭 근육 줄기세포를 계대 배양하는 경우, 장기간 체외 배양에도 불구하고 근육 줄기세포의 증식능 및 근세포로의 분화능을 유지할 수 있을 뿐 아니라, 근육과 지방으로 동시에 분화할 수 있음을 확인하였고, 이러한 양상은 3차원 배양을 통한 배양육 생산 과정에도 유지됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
미국 등록특허 US 7541183(등록일: 2009.07.02.)
Yablonka-Reuveni Z, Paterson BM. 2001. MyoD and myogenin expression patterns in cultures of fetal and adult chicken myoblasts. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 49:455-462 Kuppusamy P, Kim D, Soundharrajan I, Hwang I, Choi, KC. 2021. Adipose and muscle cell co-culture system: A novel in vitro tool to mimic the in vivo cellular environment. Biology 10:6.
본 발명은 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 근육과 지방을 함께 분화시키는 배양육 제조방법 및 이로 제조된 배양육을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 p38 저해제, EGF 및 덱사메타손을 포함하는 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 p38 저해제는 SB203580일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라, EGF의 함량은 10-1 ng/ml 내지 104 ng/ml일 수 있고, 상기 덱사메타손의 함량은 10-3 μM 내지 100 μM일 수 있고, 상기 SB203580의 함량은 1 μM 내지 100 μM일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일 구현예에 따른 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용한 닭 근육 줄기세포 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (S1) 본 발명의 일 구현예에 따른 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 분리된 닭 근육 줄기세포를 계대 배양하는 단계;및 (S2) 상기 (S1) 단계에서 배양된 닭 근육 줄기세포를 말 혈청이 포함된 분화 배지를 이용하는 단계;를 포함하는 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법을 이용한 배양육 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일구현예에 따른 배양육 생산 방법에 의해 생산된 배양육을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일 구현예에 따른 배양육을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 근육과 지방을 함께 분화시키는 배양육 제조방법은 닭 근육 줄기세포로부터 근육과 함께 지방이 분화되어 축적된 배양육을 제공한다. 이는 동물 근육의 근내지방을 구현할 수 있으므로, 향후 실제 식육과 유사한 배양육을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 배양육 생산 과정을 획기적으로 개선할 수 있다.
또한, 본 발명의 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물은 장기간의 체외 배양중에도 닭 근육 줄기세포의 증식능 및 분화능을 유지시킬 수 있으므로, 배양육 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 닭 근육 줄기세포 분리시 프리플레이팅(preplating) 시간에 따른 분리능 분석결과로, 도 1a는 프리플레이팅 중 부착된 세포와 배양된 세포의 Pax7 양성(Pax7+) 세포 비율을 나타낸 것이다(프리플레이팅 효율= 프리플레이팅 후 배양된 세포의 Pax7 양성 세포 비율 - 프리플레이팅 중 배양용기에 부착된 세포의 Pax7 양성 세포 비율(%)). 도 1b는 프리플레이팅 후 배양된 세포의 염색 결과이다(녹색: Pax7 양성 세포, 청색: 세포핵).
도 2는 닭 근육 줄기세포 배양시 p38 저해제를 첨가한 배지의 영향을 분석한 결과로, 도 2a는 농도에 따른 p38 저해제 처리에 따른 닭 근육 줄기세포의 숫자이고, 도 2b는 농도별 p38 저해제 처리시 계대배양에 따른 근육으로의 분화율 분석결과이다.
도 3은 p38 저해제를 포함하는 배지에서 덱사메타손과 EGF 농도별 처리에 따른 닭 근육 줄기세포 증식율을 분석한 결과로, 도 3a는 p38 저해제가 포함된 배지에 덱사메타손을 농도별로 처리했을 때, 닭 근육 줄기세포의 증식율을 비교한 결과이고, 도 3b는 p38 저해제가 포함된 배지에 EGF를 농도별로 처리했을 때, 닭 근육 줄기세포의 증식율을 비교한 결과이다.
도 4는 닭 근육 줄기세포에 p38 저해제, 덱사메타손 및 EGF가 포함된 배지로 배양한 후, 근육 분화용 배지를 처리하여 분화시킨 결과로, 도 4a는 근육 특이적 유전자인 MYH1과 MyoG 발현 양상을 비교한 결과이고, 도 4b는 MHC 항체로 면역 염색한 결과이고, 도 4c는 지방 축적을 확인한 결과이다.
도 5는 닭 근육 줄기세포의 3차원 배양을 통한 배양육의 배양일자별 근육 관련 유전자 발현 양상을 나타낸 결과이다.
도 6은 닭 근육 줄기세포의 3차원 배양을 통한 배양육의 배양일자별 지방 관련 유전자 발현 양상을 나타낸 결과이다.
도 7은 닭 근육 줄기세포의 3차원 배양을 통한 배양육의 배양정도에 따른 근육 및 지방 발현양상을 현미경으로 확인한 결과이다(광학현미경 결과에서의 붉은 색: 중성지방, 형광현미경 결과에서의 붉은 색: MHC 항체에 대한 반응).
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 개시내용의 특정의 특성을 기술하고 청구함에 있어서, 다음의 용어는 달리 지정되지 않는 한 이하에 기술된 정의에 따라 사용될 것이다.
본 명세서에서 어떤 양태들이 “~를 포함하는”이란 용어와 함께 기술되더라도, “~로 구성된” 및/또는 “본질적으로 ~로 구성된”의 관점에서 기술된 다른 유사 양태들 또한 제공된다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명에서 용어 “배지”, “배양 배지”, “배양용 배지”, “배지 조성물”, “배양용 조성물”, “배양용 배지 조성물”은 체외 배양 조건에서 줄기세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 영양물질을 포함하는 배양액을 의미하는 것으로서 본 명세서에서는 구분되지 않고, 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 “근육 줄기세포”는 생장 정지 상태의 근위성세포(quiescent satellite cells)와 근아세포(myoblast)라 불리는 활성화된 근위성세포(activated satellite cells)와 같은 전구세포를 포함한다. 근육 줄기세포는 근세포로 분화할 수 있고, 특히 가축 유래 근육 줄기세포는 실제 배양육 생산 등에 사용될 수 있어, 농생물학적으로 효용가치가 매우 높은 세포이다.
본 발명에서 “근육 줄기세포의 배양”은 근육 줄기세포가 줄기세포능인 분화능을 유지한 채로, 세포증식하는 것을 의미한다.
근육 줄기세포는 근섬유의 기저층 아래에 존재하며 근육 조직의 재생을 담당한다. 근육 줄기세포는 근육생리 및 재생에 관한 연구에 이용되어 왔으며, 최근에는 가축의 배양육 생산을 위한 중요한 후보물질로 간주되고 있다. 근육 줄기세포의 체내 생장 환경은 근육섬유, 결체조직, 기질세포 등 다양한 형태의 조직과 다양한 세포들로 구성되어 있기 때문에 근육조직에서 근육 줄기세포를 분리하는 과정은 일련의 단계를 거쳐 진행된다.
동물의 근육 줄기세포를 분리하는 과정은, 먼저 동물에서 채취한 근육 조직을 트립신, 프로나제, 콜라게나제와 같은 단백질 분해 효소를 이용하여 조직에서 세포를 해리시킨다. 거름망을 통해 해리된 단일 세포를 조직 파편 및 근섬유로부터 분리한다. 분리된 세포 군집은 체세포, 혈액 세포, 기질 세포 및 근육 줄기세포와 같은 다양한 유형의 세포를 포함한다. 따라서 높은 순도로 정제된 근육 줄기세포를 얻기 위해 근육 줄기세포의 물리적, 생물학적, 분자적 특징을 기반으로 다양한 분류 방법이 개발되었다.
근육 줄기세포의 분류 방법 중 가장 널리 사용되는 방법은 특별한 도구가 필요하지 않은 밀도 구배 원심분리법(Density gradient centrifugation)과 프리플레이팅법(preplating; 사전배양법)이다.
밀도 구배 원심분리법는 밀도에 따라 세포를 분리하는 방법이다. 근육 줄기세포와 기타 체세포는 밀도가 다르기 때문에 밀도 구배가 있는 용액을 사용하여 원심분리를 통해 다양한 세포들로부터 줄기세포를 분리할 수 있다.
프리플레이팅법은 부착성 세포의 경우 세포 종류에 따라 세포외기질(extracellular matrix; ECM)에 대한 부착 능력의 차이가 있으므로, 이를 이용하여 세포 집단을 나누는 방법이다. 근육 줄기세포와 섬유아세포는 각각 라미닌과 콜라겐/젤라틴 부착 환경을 선호하기 때문에, 콜라겐/젤라틴 코팅된 배양 플레이트에 근육 조직에서 분리된 세포군을 파종한(plating) 후 40-60분에 상층액을 수확하면 대부분의 섬유아세포와 상피세포는 배양 접시에 부착된 상태로 남아 있고, 근육 줄기세포는 배양 접시에 부착되지 않으므로 줄기세포 집단을 분리할 수 있다.
본 발명에서는 닭 근육 줄기세포 분리시 60분 프리플레이팅하는 경우, 배양 용기 바닥에 붙는 근육 줄기세포를 최소화할 수 있다는 것을 확인하였다.
앞서 언급한 바와 같이 근육 줄기세포는 분리하는 과정 자체가 근아세포로의 활성화, 및 근세포와 근섬유로의 분화를 유도하는 과정이므로, 체외에서 근육 줄기세포를 배양하는 것은 다양한 시도에도 불구하고 지금까지 표준화된 방법이 존재하지 않는다.
돼지 근육 줄기세포의 경우, 다양한 배양 배지를 이용한 돼지 근육 줄기세포 배양이 시도되어 왔다. 미확인된 성장인자를 다양하게 포함하는 고농도의 FBS는 체외 배양동안 돼지 근육 줄기세포의 증식능과 근육 분화능의 유지를 돕는다고 알려져 있다. 구체적으로는 고농도의 FBS가 포함된 MEM을 사용하는 것이 다양하게 보고되었고, 상기 MEM 기반 배지는 McCoy의 5A, Ham′s F12, 또는 DMEM/F12 기반 배지에 비해 더 높은 돼지 근육 증식률을 보이는 것으로 알려져 있다.
닭 근육 줄기세포의 경우, FBS 또는 닭 배아 추출물(Chicken Embryo Extract; CEE)를 포함하는 MEM 배지에서 더 높은 세포 증식능을 확인하였다. FBS와 CEE와 같은 물질에는 다양한 미확인된 성장인자가 포함되어 있으며, 이들은 근육 줄기세포의 증식능의 유지를 돕는 것으로 알려져 있다.
하지만 본 발명에서는 10% FBS가 포함된 배지 환경에서 근육 줄기세포의 증식능은 배양기간에 따라 점차 감소하였다(도면 2의 0μM). 근육 줄기세포의 자가재생능 및 기능에 영향을 주는 인자인 PAX7(Paired box 7)을 발현하는 세포 비율이 계대배양 이후 급격히 감소한 것으로 알려져 있다. 또한 유전자발현 분석 결과에서도 근육 줄기세포 표지유전자(PAX7, MYF5, MYOD)의 발현이 계대배양에 따라 급격히 감소하는 것으로 알려져 있고 본 발명에서도 10% FBS가 포함된 배양용 배지로 계대배양하는 경우 근육 세포로의 분화능이 감소되는 것을 확인할 수 있다.
이에 본 발명은 닭으로부터 분리된 근육 줄기세포의 증식능 및 분화능을 장시간동안 체외에서 유지시키기 위한 닭 근육 줄기세포 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 닭 근육 줄기세포 배양용 조성물은 p38 저해제, EGF 및 덱사메타손을 포함할 수 있다.
SB203580으로 대표되는 p38 저해제는 배아줄기세포의 자기 재생능(self-renewal) 및 다양한 중간엽 줄기세포의 증식능을 유도하고, 일부 줄기세포의 분화를 유도한다고 알려져 있으나, 가축 근육 줄기세포의 증식능 및 분화능의 유지에 영향을 끼친다는 것은 보고된 바 없다.
EGF는 상피세포성장인자(Epidermal growth factor)로서 in vivo 및 in vitro에서 표피 및 상피 조직에서뿐만 아니라, 세포 배양시 섬유아세포(fibroblast)의 성장과 증식에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한, 중간엽 줄기세포의 분화를 유도한다고 알려져 있다.
덱사메타손(dexamethasone)은 합성 글루코코르티코이드(glucocorticoid)로서, 중간엽 줄기세포에서 osteogenic, adipogenic, chondrogenic 분화를 유도한다고 알려져 있고, 배아줄기세포에서는 hepatocyte로 분화를 유도한다고 알려져 있다.
이와 같이 p38 저해제, EGF 및 덱사메타손이 줄기세포의 성장 및/또는 분화에 영향을 미친다는 것은 보고된 바 있으나, p38 저해제, EGF 및 덱사메타손이 닭 근육 줄기세포의 증식능 및 분화능의 유지에 영향을 끼친다는 것은 보고된 바 없다.
본 발명의 일 구현예에 따른 p38 저해제를 포함하는 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 닭 근육 줄기세포를 배양하는 경우, p38 저해제를 포함하지 않는 배지 조성물에 비해 농도 의존적으로 세포 증식을 증가시키는 결과를 보였다. 하지만, 상기 증식된 닭 근육 줄기세포는 근육세포로의 분화가 억제되는 현상을 확인할 수 있었다. 특히 이러한 근육 분화 억제 현상은 계대배양 횟수에 따라 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.
하지만, 이런 근육 분화 억제 현상은 p38 저해제에 EGF 와 덱사메타손을 동시에 처리하는 경우, 계대 배양 횟수를 늘리더라도 근육세포로의 분화능 감소가 거의 관찰되지 않았을 뿐만 아니라, 세포 증식률도 높이는 것을 확인할 수 있었다.
다만, 덱사메타손을 p38 저해제와 같이 처리하는 경우 이러한 세포 증식 효과는 크게 나타나지 않았다.
본 발명의 일 구현예에 따른 닭 근육 줄기세포 배양용 조성물에 포함된 SB203580, EGF, 덱사메타손은 각각 1 μM 내지 100 μM, 10-1 ng/ml 내지 104 ng/ml, 10-3 μM 내지 100 μM의 함량을 가진다. SB203580의 함량이 1 μM 이하인 경우 특별한 효과가 없으며, 100 μM 이상인 경우 세포에 독성을 가질 수 있다. EGF의 함량이 10-1 ng/ml 이하인 경우 특별한 효과가 없으며, 104 ng/ml 이상인 경우 농도 증가에 따른 추가적인 효과를 기대할 수 없다. 덱사메타손의 함량이 10-3 μM 이하인 경우 특별한 효과가 없으며, 100 μM 이상인 경우 세포에 독성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물에 포함된 SB203580, EGF 및 덱사메타손은 각각 20 μM, 100 ng/ml 및 10 μM의 함량을 가지지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 p38 저해제, EGF 및 덱사메타손이 포함된 가축 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물의 기본 배지는 줄기세포의 배양에 적절한 해당 분야에서 사용되는 통상의 배지에서 임의로 선택될 수 있다. 또한, 배양 조건 역시 해당 분야에서 사용되는 적절한 조건에서 임의로 선택될 수 있다. 즉 배양하고자 하는 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 세포 배양 최소 배지(CCMM: cell culture minimum medium)으로서, 일반적으로 탄소원, 질소원, 및 미량원소 성분을 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 세포 배양 최소 배지는 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(alpha-modified Minimum Essential Media), GMEM(Glasgow′s Minimal essential Medium), IMDM(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium), DMEM/F12 등이 있지만, 반드시 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 해당 업계에서 세포 배양에 사용되는 DMEM/F-12 배지를 기본 배지로 한다.
본 발명의 배지 조성물에는 추가적으로, 박테리아, 곰팡이 등의 감염을 막기 위해 항생제, 항진균제 및/또는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 해당 업계에서 일반적으로 사용하는 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상적으로 세포배양에 사용되는 항생제를 모두 이용 가능하며, 항진균제로는 알포레리신 B, 마이코플라즈마 억제제로는 젠타마이신, 시프로플로사신, 아지트로마이신 등의 일반적으로 사용하는 물질을 사용할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 시판되는 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic; AA)(Gibco)가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 배지 조성물에는 FBS가 포함될 수 있다. 배지에 포함된 FBS의 함량은 5% 내지 20%이다. 본 발명의 일 구현예에 따른 가축 근육 줄기세포 배양용 조성물에는 5%, 10%, 15%, 또는 20%의 FBS를 포함할 수 있고, 바람직하게는 10%의 FBS를 포함한다. 여기서 %는 v/v%를 의미한다.
또한, 본 발명의 배지 조성물에는 1% 글루타맥스(또는 글루타민)과 0.1 mM 베타-머캅토에탄올을 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 본 발명의 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용한 닭 근육 줄기세포 배양 방법을 제공한다.
상기 배양 방법은 줄기세포를 계대 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 줄기세포를 미분화 상태로 유지할 수 있으며, 구체적으로는, 계대 배양하는 동안 또는 그 이후에도 줄기세포를 미분화 상태로 유지할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 3 내지 10 이상 계대 배양 후에도 줄기세포능을 유지할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “계대 배양”은 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 상기 용어, “계대(passage)”는 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기(confluence)까지의 다능성 줄기세포로의 성장을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대 (1 passage)라고 한다. 계대 배양의 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 기계적 분리 또는 효소적 분리로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 본 발명의 가축 근육 줄기세포 배양 방법을 이용한 배양육 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 (S1) 분리된 닭 근육 줄기세포를 p38 저해제, EGF, 덱사메타손을 포함하는 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 배양하는 단계; 및
(S2) 상기 (S1) 단계에서 배양된 닭 근육 줄기세포를 말 혈청이 포함된 분화 배지를 이용하여 배양하는 단계;를 포함하는, 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서는 상기 (S1) 단계에서 계대 배양 횟수는 1 내지 30 계대인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에서는 상기 (S1) 단계에서 계대 배양 횟수는 1 내지 12 계대인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 분화 배지에는 말 혈청이 1~10%(v/v)로 배지에 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 분화 배지에는 말 혈청이 2%(v/v)로 배지에 포함되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 본 발명의 일 구현예에 따른 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법을 이용하여 배양육을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법은 하나의 배양용기에서 근육세포와 지방세포를 동시에 분화시키는 방법으로, 이를 기반으로 배양육 제조시 실제 식육의 식감을 모사할 수 있는 특징이 있다. 즉 지금까지는 근육세포와 지방세포를 별도로 분화시켜 제조된 근육 조직과 지방 조직을 분쇄하여 혼합한 형태의 가공육의 형태였다면, 본 발명의 배양육 생산 방법은 근육 줄기세포로부터 근육세포와 지방세포를 하나의 배양용기에서 동시에 분화시키는 방법으로 근내 지방이 존재하는 식육을 모사할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 닭 근육 줄기세포 계대 배양시 사용되는 배양용 배지에 p38 저해제 단독을 포함된 경우에는 지방세포로 분화되지 않고, 근육세포로만 분화되는 반면, p38 저해제, EGF 및 덱사메타손을 모두 포함한 경우 지방세포 및 근육세포가 동시에 분화되는 것을 확인하였다.
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 모든 숫자는, 언급되었든지 아니든지, 모든 경우에 용어 “약”에 의해 수식될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 정밀한 수치는 본 개시내용의 추가적인 실시양태를 형성하는 것으로 이해되어야 한다. 실시예에 개시된 수치의 정확성을 보장하기 위해 노력을 기울였다. 그러나, 측정된 모든 수치는 내재적으로 이의 각각의 측정 기법에서 실측된 표준 편차로부터 생성된 특정 오차값을 함유할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 닭 근육 줄기세포 분리 및 배양
모든 동물실험은 서울대학교의 Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인(승인번호: SNU-210310-6) 후 서울대학교 동물관리실의 표준 규정에 따라 실시하였다.
유정란은 배아 18일차까지 38℃에서 배양한 후 CO2 흡입을 통해 안락사를 시켰다. 16개 닭 배아의 가슴 근육조직을 채취하였으며, 2X antibioticantimycotic(AA; Gibco, Gaithersburg, USA)를 포함하는 Dulbecco′s phosphatebuffered saline(DPBS; Welgene, Gyeongsan, Korea)로 세척하였다. 지방, 결체 조직, 혈관은 근육조직으로부터 제거되었다. 분리된 조직을 가위로 잘게 잘라준 다음 0.8 mg/mL 프로나제(pronase)(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하여 37℃에서 40분 동안 10분마다 볼텍싱(vortexing)하면서 분해하였다. 분해된 결과물을 100 μm와 40 μm 세포여과기(cell strainer)로 여과하였으며, 이를 3분 동안 1,200 Υ g에서 원심분리하였다. 침전물은 10% 소태아혈청(FBS; Gibco)을 함유하는 α-MEM에 재현탁시켰다.
통상 근육조직으로부터 분리된 세포는 섬유아세포(fibroblast)가 젤라틴 코팅 접시에 먼저 부착되고, 근아세포(myoblast)가 천천히 부착되는 성질을 가지고 있으므로, 이를 이용하여 근아세포를 분리하기 위한 최적의 배양 시간을 분석하기 위해 앞서 분리한 침전물을 0시간, 0.5시간, 1시간, 2시간 동안 젤라틴 코팅 접시에 배양하였다.
배양 이후, 근육 줄기세포를 포함하고 있는 상층액을 3분 동안 1,200 Х g에서 원심분리하여 단일 세포군을 수확하였다. 분리된 닭 근육 줄기세포는 1 well당 6Х104 개를 분주하여 젤라틴 코팅 접시에 증식배지로 3일간 배양시켰다.
이때 사용한 증식 배지는 10%(v/v) FBS, 1 X GlutaMax, 1 X AA 및 0.1 mM BME(베타-머캅토에탄올)을 포함하는 DMEM/F12 배지의 닭 근육 줄기세포 기본 배지를 사용하였다.
세포 염색을 위해 닭 근육 줄기세포는 4%(w/v) 파라포름알데하이드로 4℃에서 30분간 처리하여 고정하였다. 고정된 세포는 DPBS(Welgene)로 두 번 세척한 후, 0.2 %(v/v) Triton X-100 (Sigma-Aldrich)을 15분 동안 처리하고 10%(v/v) 염소 혈청을 1시간동안 처리하였다. 이후 닭 Myosin heavy chain에 대한 1차 항체(1:1000; MAB4470, R&D Systems)와 Pax7에 대한 1차 항체(1:200; R&D Systems)를 추가하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 이후 염소 혈청 및 1차 항체를 제거하고, Alexa Fluor-접합 2차 항체를 4℃에서 하룻밤 처리하였다. 세포핵은 Hoechst 33342(Molecular Probes, Eugene, USA)로 염색하였다.
프리플레이팅(사전배양)을 다양한 시간 동안 진행한 결과 진행시간에 따라 근육 줄기세포를 나타내는 Pax7+ 세포비율이 늘어남을 확인하였다(도 1a, 1b). 하지만, 프리플레이팅을 오래 할수록 근육 줄기세포 또한 바닥에 높은 비율로 붙는 것을 확인하였고, 이에 따라 세포 수율이 갈수록 낮아지므로 60분의 프리플레이팅이 적합할 것으로 판단하였다.
실시예 2. 닭 근육 줄기세포 배지의 최적화
실시예 2.1. P38 저해제 농도의 최적화
닭 근육 줄기세포 배지에 있어서, P38 저해제의 최적의 농도를 찾기 위해 p38 저해제인 SB203580을 0 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM를 포함하는 닭 근육 줄기세포 기본배지로 1계대, 2계대, 3계대 및 4계대에서의 세포 수 및 근육세포로의 분화 정도를 분석하였다.
계대수에 따른 근육세포로의 분화능 분석을 위해서 각 계대별 닭 근육 줄기세포를 2%(v/v) 말혈청(Biowest, Nuaille, France), 1 Х glutamax, 1 Х AA 및 0.1 mM BME을 포함하는 DMEM으로 구성된 근육세포 분화 배지에서 3일간 배양하며 2일차에 배양액을 한번 갈아주었다. 근섬유가 형성된 후 추가 분석을 위하여 Trizol로 mRNA를 추출하거나 4% 파라포름알데히드로 고정하였다.
그 결과 도 2에서와 같이 p38 저해제(SB203580)의 농도가 높아질수록 세포 증식이 증가하는 경향을 보였고, 20 μM에서 최대의 세포 수를 보였다. 이와 같은 세포 증식 증진 효과는 계대수와는 무관하게 1, 2, 3, 4계대에서 모두 관찰되었다.
하지만, 계대 배양된 닭 근육 줄기세포에서 근육세포로의 분화능은 알려진 바와 같이 계대가 증가할수록 현저하게 감소되는 경향을 보였으며, 오히려 p38 저해제(SB203580)를 처리했을 때 근육세포로의 분화능은 오히려 더 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 닭 근육 줄기세포의 배양에 있어서, p38 저해제(SB203580)는 닭 근육 줄기세포의 세포 증식은 증가시키지만, 근육세포로의 분화능은 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 2.2 덱사메타손 및 EGF 농도의 최적화
앞서, p38 저해제(SB203580)를 농도별로 첨가한 닭 근육 줄기세포 기본 배지로 증식한 닭 근육 줄기세포를 근육세포로 분화할 경우 계대배양 횟수에 따라 분화율이 감소함을 확인하였으므로, EGF와 덱사메타손을 처리하여 분화율 감소 문제를 해결하고자 하였다.
덱사메타손 및 EGF의 농도를 최적화하기 위해 20 μM의 p38 저해제(SB203580)가 포함된 닭 근육 줄기세포 기본 배양액에 다양한 농도의 덱사메타손(0 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 100 μM), EGF(0 ng/mL, 0.1 ng/mL, 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL)을 포함한 배지, 또는 둘을 모두 포한하는 배지(10 μM 덱사메타손+100 mg/ml EGF)로 1일, 2일, 3일 배양 후 세포 수를 측정하였다. 그 결과 p38 저해제(SB203580)가 첨가된 닭 근육 줄기세포 기본 배지에 덱사메타손을 농도별로 처리하는 경우 세포 증식율에 영향이 없었다(도 3a), 하지만, p38 저해제(SB203580)가 첨가된 닭 근육 줄기세포 기본 배지에 EGF를 농도별로 처리한 경우 농도에 따라 세포 증식율이 증가하는 경향을 보였다(도 3b).
이를 활용하여 덱사메타손 10 μm와 EGF 100 ng/mL을 첨가한 p38 저해제(SB203580) (20 μM) 첨가 기본 배지를 최적 배지로 선정하였다. 최적 배지의 경우 덱사메타손과 EGF 단독 처리에 비하여 시너지 효과가 있음을 확인하였다(도 3a, b).
실시예 3. 최적화된 배지로 배양된 닭 근육 줄기세포의 분화능 분석
각 계대별 닭 근육 줄기세포의 근육 분화능을 분석하기 위해 닭 근육 줄기세포 배양용 기본 배지에 20 μM p38 저해제(SB203580)가 포함된 배지(p38i) 및 20 μM p38 저해제, 20 ng/ml EGF, 및 10 μM 덱사메타손이 포함된 배지(p38i+EGF+Dexa)를 이용하여 닭 근육 줄기세포를 배양한 후, 각 계대의 닭 근육 줄기세포에 근육세포 분화배지를 처리하여 근육으로 분화시켰을 때의 분화능을 분석하였다. 근육세포로의 분화 정도는 근육 표지 유전자인 MYH1(미오신 중쇄 1; myosin heavy chain 1) 및 MyoG(미오신 쥐; Myosin G) 유전자의 상대적인 발현율을 RT-PCR로 분석하였다.
구체적으로는 닭 근육 줄기세포에서 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, USA)을 사용하여 Total RNA를 추출한 후, High-Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applied Biosystems, Foster City, USA)를 사용하여 cDNA를 합성했다. cDNA는 아래 나열된 각 프라이머 세트와 DyNAmo HS SYBR Green qPCR 키트 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 증폭하였다. 사용된 프라이머는 아래 표 1에 기재하였다.
Gene Primer sequence (5′→3′) Product size (bp) Accession No.
MYOG Forward ATGGGGAAAACTTCCTGGGC 109 NM_204184.1
Reverse TTCTCCTCCAAAGCCCCTCT
MYH1 Forward TCCGCAAGATCCAACACGAA 150 NM_001013397.2
Reverse ATGCCACTTTGTTGTCACGA
GAPDH Forward CGTCCTCTCTGGCAAAGTCC 132 NM_204305.1
앞서 확인한 바와 같이 p38i 배지를 이용하여 닭 근육 줄기세포를 배양하는 경우, 앞서 도 2b에서 확인한 바와 같이 2계대부터 근육으로 거의 분화되지 않았다. 하지만, 세 가지 성분이 모두 포함된 배지(p38i+EGF+Dexa)를 이용하여 닭 근육 줄기세포를 배양하여 분화시킨 경우 9계대 근육 줄기세포의 분화에서도 안정적으로 근육세포 마커인 MYH1, MyoG를 발현하는 양상을 보였다(도 4a).
또한, MHC 세포 염색 결과에서도 p38i 배지를 이용하여 닭 근육 줄기세포를 배양한 경우 비교적 초기 계대(4계대)에서도 근육으로의 분화능을 거의 잃어버린 반면, p38i+EGF+Dexa 배지를 이용한 경우 고계대(12계대)에서도 특징적인 근육세포의 모양을 보이는 것을 확인하였다(도 4b).
또한, 상기 근육세포가 지방세포로 분화했는지 여부를 확인하기 위해, 근육세포 분화배지 처리한 닭 근육 줄기 세포는 4%(w/v) 파라포름알데하이드로 4℃에서 30 분간 처리하여 고정하였다. 고정된 세포는 DPBS(Welgene)로 두 번 세척한 후, 60%(v/v) isopropanol을 5분간 반응시킨 후 오일 레드 오(Oil Red O) 용액을 넣어 10 내지 20분간 섞어주면서 반응시켰다. 이후 수차례 세척한 후 현미경으로 관찰하였다.
관찰 결과, p38i 배지를 이용하여 증식된 닭 근육 줄기세포는 근육세포 분화 배지를 처리하였을 때 근육세포로 분화되지 않은 것과 마찬가지로 지방세포로도 분화하지 않았다. 하지만, p38i+EGF+Dexa 배지를 이용하여 증식된 닭 근육 줄기세포는 근육 분화 배지를 처리하여 근육으로 분화를 유도했음에도 불구하고, 근육세포의 분화와 함께 지방이 축적되는 현상을 확인하였다(도 4c).
따라서, 이와 같은 결과를 활용하여 근육과 지방을 동시에 포함하는 닭 배양육 생산이 가능할 것으로 보인다.
실시예 4. 닭 근육 줄기세포의 3차원 배양과 배지 조성을 활용한 배양육 생산
닭 근육 줄기세포 배양용 기본 배지에 20 μM p38 저해제(SB203580)가 포함된 배지 (p38i) 및 20 μM p38 저해제, 20 ng/ml EGF, 및 10 μM 덱사메타손이 포함된 배지(p38i+EGF+Dexa)를 이용하여 닭 근육 줄기세포를 배양한 후, 충분한 세포숫자가 될 때까지 계대배양하였다.
3차원 배양을 위하여 아래 과정에 따라 세포가 포함된(Cell-laden) 하이드로젤을 제조하였다. 일반적으로 세포의 3차원 배양에 사용되는 collagen, gelatin, fibrin, alginate, matrigel, laminin, GelMA, Poly(ethylene glycol) diacrylate(PEGDA), N-isopropylacrylamide(NIPAAm), acrylic acid, polyacrylamide(PAAm) 등의 수용성 젤에 세포를 104 내지 108 cells/mL의 농도로 넣어준 다음, 닭 근육 줄기세포 배양용 기본 배지에 20 μM p38 저해제(SB203580)가 포함된 배지 (p38i) 및 20 μM p38 저해제, 20 ng/ml EGF, 및 10 μM 덱사메타손이 포함된 배지(p38i+EGF+Dexa)를 이용하여 1 내지 5일간 배양하였다. 이후 0 내지 2%(v/v) 말혈청(Biowest, Nuaille, France, 혹은 KnockOutTM Serum Replacement (KSR; Gibco)), 1 Х glutamax, 1 Х AA 및 0.1 mM BME을 포함하는 분화 배양액으로 교체하여 배양을 진행하였다. 37℃ CO2 incubator에서 분화를 유도하고 성숙된 근섬유 확인 전까지 2 또는 3일 간격으로 새로운 배지로 교체해주면서 배양하였다.
각 배양일자에 따라 근육 표지 인자인 MYH1(myosin heavy chain 1) 및 MyoG(myosin G), 지방 표지 인자인 FASN(fatty acid synthase), SCD1(stearoyl-CoA desaturase1), PPAR-α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha), PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma), PGC1-α(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 alpha), C/EBP-α (CCAAT/enhancer-binding protein alpha) 유전자의 상대적인 발현율을 RT-PCR로 분석하였다.
구체적으로는 닭 근육 줄기세포에서 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, USA)을 사용하여 Total RNA를 추출한 후, High-Capacity RNA-to-cDNA Kit(Applied Biosystems, Foster City, USA)를 사용하여 cDNA를 합성했다. cDNA는 아래 나열된 각 프라이머 세트와 DyNAmo HS SYBR Green qPCR 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 증폭하였다. 사용된 프라이머는 아래 표 2에 기재하였다.
Gene Primer sequence (5′→3′) Product size (bp) Accession No.
MYOG Forward ATGGGGAAAACTTCCTGGGC 109 NM_204184.1
Reverse TTCTCCTCCAAAGCCCCTCT
MYH1 Forward TCCGCAAGATCCAACACGAA 150 NM_001013397.2
Reverse ATGCCACTTTGTTGTCACGA
GAPDH Forward CGTCCTCTCTGGCAAAGTCC 132 NM_204305.1
Reverse TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC
FASN Forward TTCTGATTCTGGCTCCACTG 122 NM_205155.4
Reverse CCTGCTTAGCACTCTCAACG
SCD1 Forward CTGCTCACATGTTTGGCAAT 129 NM_204890.2
Reverse TGGAGTAGTCGTAGGGGAATG
PPAR-α Forward CAATGCACTGGAACTGGATG 126 XM_046906390.1
Reverse ACATGCACAATGCTCTCCTG
PPAR-γ Forward CTCCAGGATTGCCAAAGTGC 138 NM_001001460.1
Reverse GTCCCCACACACACGACATT
PGC1-α Forward GTACAGCGACCAGTCTGAGG 94 NM_001006457
Reverse CAAGTTTGCCTCATTCTCTTCATC
C/EBP-α Forward TTCTACGAGGTCGATTCCCG 96 NM_001031459.1
Reverse AGCCTCTCTGTAGCCGTAG
2차원 배양인 실시예 3의 결과와 유사하게 3차원 배양 결과에서 배양일자가 증가함에 따라 배양육의 근육 표지 인자인 MYOG와 MYH1이 증가하였고, 지방 표지인자인 FASN, SCD1, PPAR-α, PPAR-γ, PGC1-α, C/EBP-α 역시 증가하는 양상을 보였다(도 5, 6).
배양 초기와 후기에 근육 분화 정도 및 지방 발현율을 확인하기 위하여 면역형광염색법과 지방염색법을 시행하였다.
면역형광염색을 위해 3차원 배양된 근육 줄기세포는 4%(w/v) 파라포름알데하이드로 4℃에서 30 분간 처리하여 고정하였다. 고정된 세포는 DPBS(Welgene)로 두 번 세척한 후, 0.2 %(v/v) Triton X-100(Sigma-Aldrich)을 15 분 동안 처리하고 10%(v/v) 염소 혈청을 1 시간동안 처리하였다. 이후 닭 Myosin heavy chain에 대한 1차 항체(1:1000; MAB4470, R&D Systems)를 추가하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 이후 염소 혈청 및 1차 항체를 제거하고, Alexa Fluor-접합 2차 항체를 4℃에서 하룻밤 처리하였다. 세포핵은 Hoechst 33342(Molecular Probes, Eugene, USA)로 염색하였다.
지방 염색은 다음과 같이 진행하였다. 3차원 배양된 닭 근육 줄기세포는 4%(w/v) 파라포름알데하이드로 4℃에서 30 분간 처리하여 고정하였다. 고정된 세포는 DPBS(Welgene)로 두 번 세척한 후, 60%(v/v) isopropanol을 5분간 반응시킨 후 오일 레드 오(Oil Red O) 용액을 넣어 10 내지 20 분간 섞어주면서 반응시켰다. 이후 수차례 세척한 후 현미경으로 관찰하였다.
관찰결과 닭 근육 줄기세포의 3차원 배양을 통한 배양육의 경우 배양 초기에는 근육으로의 분화만 확인된 반면, 배양이 진행됨에 따라 근육 분화와 함께 중성지방의 축적이 확인되었다(도 7).

Claims (15)

  1. 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물에 있어서, p38 저해제, EGF 및 덱사메타손을 포함하는, 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 p38 저해제는 SB203580인, 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 SB203580의 함량은 1 μM 내지 100 μM이고, 상기 EGF의 함량은 10-1 ng/ml 내지 104 ng/ml이고, 상기 덱사메타손의 함량은 10-3 μM 내지 100 μM인, 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 SB203580의 함량은 20 μM, 상기 EGF의 함량은 100 ng/ml이고, 상기 덱사메타손의 함량은 10 μM 인, 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용한 닭 근육 줄기세포 배양 방법.
  6. 제5항의 닭 근육 줄기세포 배양 방법을 이용한 배양육 생산 방법.
  7. 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법에 있어서,
    (S1) 분리된 닭 근육 줄기세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 닭 근육 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용하여 계대 배양하는 단계; 및
    (S2) 상기 (S1) 단계에서 배양된 닭 근육 줄기세포를 말 혈청이 포함된 분화 배지를 이용하여 배양하는 단계;를 포함하는, 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (S1) 단계에서의 계대 배양 횟수는 1 내지 30 계대인, 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 계대 배양 횟수는 1 내지 12 계대인, 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 (S2) 단계의 말 혈청은 1~10%(v/v)로 배지에 포함되는, 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 말 혈청은 2%(v/v)로 배지에 포함되는, 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시배양육에 분화시키는 방법.
  12. 제7항의 닭 근육 줄기세포에서 근육세포 및 지방세포를 동시에 분화시키는 방법을 이용한 배양육 생산 방법.
  13. 제12항의 배양육 생산 방법으로 생산된 배양육.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 닭 배양육은 근육세포와 근내 지방이 동시에 존재하는 배양육.
  15. 제14항의 배양육을 포함하는 식품 조성물.
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