KR20220153170A - 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 - Google Patents

인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 관한 것으로, 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 배양하여 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체(Embryonic Body)를 마련하는 A단계; 상기 A단계를 통해 마련된 배아체를 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖출 때까지 배양하는 B단계; 상기 B단계를 통해 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체로 분화시키는 C단계; 상기 C단계를 통해 분화된 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체를 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)를 포함하도록 자가조직화된 심장 오가노이드로 분화시키는 D단계; 및 상기 D단계를 통해 분화되어 자가조직화된 심장 오가노이드를 배양하여 성숙화시키는 E단계;를 포함하며, 상기 E단계를 통해 성숙화 과정을 거친 심장 오가노이드는 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)가 55 내지 65 : 15 내지 30 : 15의 세포수 비율로 자가조직화된 것을 특징으로 한다.

Description

인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 {METHODS FOR PREPARING HEART ORGANOID DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELL AND HEART ORGANOID DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELL PREPARED BY THEREOF}
본 발명은 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법 및 이를 통해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드에 관한 것이다.
최근까지 지속적인 기술의 발전으로 인해 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)로부터 인간을 구성하는 대부분의 세포를 분화하는 방법이 개발되었지만, 2차원 형태의 배양으로 분화시킨 세포의 경우 성숙도가 상당부분 떨어져 실제 인간 세포에 비해 그 기능성이 떨어지다 보니, 이를 이용해 약물 독성평가, 약물 스크리닝 또는 세포 치료 등에 활용함에 있어 분명한 한계점을 가지고 있다.
이에 따라, 실제 인간을 구성하는 세포의 성숙도에 도달하여 충분한 기능성을 갖춘 세포를 제작하기 위한 다양한 세포 분화 및 배양 관련 기술들이 연구되고 있으며, 특히 실제 장기에 세포들이 단일하게 존재하는 것이 아니라 다양한 세포들이 집합되어 존재하는 형태를 모사하고, 이와 더불어 기능적으로도 충분히 대응되는 기능성을 나타낼 수 있는 장기 오가노이드(Organoid)의 개발 및 연구가 전세계적으로 이루어지고 있다.
실제 인간 장기의 구조 및 기능을 모사할 수 있는 오가노이드의 제작은 장기 특이적인 줄기세포가 있는 것으로 알려진 장, 뇌 등의 장기 줄기세포로부터 지속적인 세포분열 및 분화를 통해 가능하지만, 장기 특이적인 줄기세포가 존재하지 않는 심장의 경우 이와 같은 방법이 적용될 여지가 없어 심장을 구성하는 다양한 세포들을 각각 따로 분화시킨 뒤 혼합하여 제작하는 방식이 유일하게 제시되고 있다.
이와 관련하여, 심장 오가노이드를 제작하기 위해 마련된 종래기술에 대한 선행문헌에는 미국 공개특허공보 제2020-0283735호의 "Organoid and method for producing the same"(이하, '종래기술'이라고 함)이 있다.
하지만, 종래기술을 비롯한 기존의 심장 오가노이드 제조 방법의 경우, 단순히 분화된 심장 구성 세포들을 혼합하거나, 특정 성분들로 구성된 세포외 기질(Extracellular matrix)에 의존하여 배양을 수행하는 방식에 그쳐 심장을 구성하는 다양한 세포들이 발달 초기 단계에서부터 서로 상호작용하면서 발달하는 특성이 심장의 기능적으로 영향을 주는 점을 놓치게 되는 한계점이 존재하였다.
결과적으로, 심장을 구성하는 다양한 세포들이 동시에 분화되며 발달 초기부터 상호작용을 통한 자가조직화를 이루지 못할 경우, 실제 심장의 구조 및 기능을 모사하기에 충분하지 못한 상태를 띠게 됨에 따라 신약 개발 시 질환 모델링을 통한 약물 스크리닝 및 심장 독성 평가를 진행함에 이용하여 유의한 결과를 도출하기에는 상당히 부족한 문제점이 있었다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 창작된 것으로써, 본 발명의 목적은 인간 전분화능 줄기세포로부터 심장을 구성하는 다양한 세포들이 동시에 분화되며 발달 초기부터 상호 작용을 통한 자가조직화를 이루며 배양 분화되어 실제 심장의 구조 및 기능을 모사하기에 충분한 상태를 갖춘 심장 오가노이드 제조 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법은, 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 배양하여 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체(Embryonic Body)를 마련하는 A단계; 상기 A단계를 통해 마련된 배아체를 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖출 때까지 배양하는 B단계; 상기 B단계를 통해 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체로 분화시키는 C단계; 상기 C단계를 통해 분화된 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체를 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)를 포함하도록 자가조직화된 심장 오가노이드로 분화시키는 D단계; 및 상기 D단계를 통해 분화되어 자가조직화된 심장 오가노이드를 배양하여 성숙화시키는 E단계;를 포함하며, 상기 E단계를 통해 성숙화 과정을 거친 심장 오가노이드는 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)가 55 내지 65 : 15 내지 30 : 15의 세포수 비율로 자가조직화된 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 A단계의 인간 전분화능 줄기세포는 인간 배아줄기세포(hESC, Human embryonic stem cell) 또는 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC, Human induced Pluripotent Stem Cell) 중 적어도 하나 이상이다.
또한, 상기 A단계는 ROCK(Rho-associated kinase) inhibitor(Y-27632)가 첨가된 mTeSR 배양액에 인간 전분화능 줄기세포를 플레이팅하여 1일 간 배양하여 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체를 마련하는 단계이다.
아울러, 상기 B단계는 ROCK(Rho-associated kinase) inhibitor(Y-27632)가 미첨가된 mTeSR 배양액에 상기 A단계를 통해 마련된 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체를 2일 내지 3일간 배양하여 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 마련하는 단계이다.
그리고 상기 C단계는, 상기 B단계를 통해 마련된 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), CHIR99021, BMP4(Bone morphogenetic protein-4) 및 Activin A가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시키는 C-1단계; 및 상기 C-1단계를 통해 배양을 거친 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), XAV939, L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체로 분화시키는 C-2단계;를 포함한다.
여기서, 상기 C-1단계는 상기 B단계를 통해 마련된 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), Wnt 신호 활성화를 위한 GSK-3β(Glycogen Synthase Kinase-3β) 억제제로서 6μM 내지 8μM의 농도를 갖춘 CHIR99021, BMP 신호 활성화를 위한 성분으로서 9ng/ml 내지 10ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4 및 TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 신호 활성화를 위한 성분으로서 8ng/ml 내지 10ng/ml의 농도를 갖춘 Activin A가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시키는 단계이다.
아울러, 상기 C-2단계는 상기 C-1단계를 통해 배양을 거친 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), Wnt 신호 억제를 위한 성분으로서 8μM 내지 12μM의 농도를 갖춘 XAV939, BMP 신호 활성화를 위한 성분으로서 40μg/ml 내지 60μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시키는 단계이다.
또한, 상기 D단계는 상기 C단계를 통해 분화된 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체를 B-27 Supplement(minus Insulin) 및 40μg/ml 내지 60μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 심근세포(Cardiomyocyte)의 분화를 유도하는 D-1단계; 상기 D-1단계를 통해 심근세포(Cardiomyocyte)의 분화 유도가 진행된 구성체를 상기 D-1단계에 이용된 RPMI 1640배지에 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)를 추가하여 2일간 배양시켜 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)의 분화를 유도하는 D-2단계; 상기 D-2단계를 통해 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)의 분화 유도가 진행된 구성체를 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 40μg/ml 내지 60μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시키는 D-3단계; 및 상기 D-3단계를 통한 배양이 완료된 구성체를 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 분화를 통한 심장 오가노이드의 자가조직화를 이루는 D-4단계;를 포함한다.
아울러, 상기 E단계는 상기 D-4단계를 통해 분화되어 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)를 포함하도록 자가조직화된 심장 오가노이드를 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) 및 TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 신호 억제를 위한 성분으로서 10ng/ml 내지 15ng/ml의 농도를 갖춘 SB431542가 첨가된 RPMI 1640배지에서 10일 내지 20일간 배양시켜 성숙화를 진행하는 단계이다.
한편, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드는 앞 서 설명된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법을 통해 마련된다.
본 발명에 의하면 다음과 같은 효과가 있다.
첫째, 심장 줄기세포가 없다는 한계를 극복하고, 인간 전분화능 줄기세포로부터 심장을 구성하는 심근세포, 심장 섬유아세포, 혈관내피세포들이 동시에 분화되며 발달 초기부터 상호 작용을 통한 자가조직화를 이루며 배양 분화되어 실제 심장의 구조 및 기능을 모사하기에 충분한 상태를 갖춘 심장 오가노이드를 제조할 수 있다.
둘째, 심장의 구조 및 기능을 모사하기에 충분한 상태를 갖춘 심장 오가노이드를 신약 개발 시 질환 모델링을 통한 약물 스크리닝 및 심장 독성 평가를 진행함에 이용하여 신약 개발의 효율성을 획기적으로 증대시킬 수 있다.
셋째, 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드를 심장 관련 질병 기전연구의 대체 모델로서 이용하여 질병 연구 분야의 기술적 발전에 이바지할 수 있다.
도1은 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 관한 순서도이다.
도2 및 도3은 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법 내 배아체 준비단계 및 배양단계에 따른 배아체의 크기 및 구성 세포수의 변화를 관찰한 결과를 설명하기 위한 사진들이다.
도4는 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 따라 인간 전분화능 줄기세포에서 배아체를 거쳐 심장 오가노이드로 분화되는 과정의 기간별 상태를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도5는 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 따라 인간 전분화능 줄기세포에서 배아체를 거쳐 심장 오가노이드로 분화되는 과정의 기간별 직경 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도6은 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 따라 인간 전분화능 줄기세포에서 배아체를 거쳐 심장 오가노이드로 분화되는 과정의 기간별 박동 비율의 변화를 나타낸 그래프이다.
도7은 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 따라 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드의 형광 염색 사진이다.
도8은 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 따른 실험군 각각의 단계별 배양 조건 및 기간을 정리한 모식도이다.
도9 및 도10은 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 따라 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드의 실험군별 유세포분석 결과를 도시한 그래프이다.
도11 내지 도13은 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 따라 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드의 실험군별 유전자 발현 결과를 도시한 그래프이다.
도14 및 도15는 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 따라 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드의 실험군별 형광염색 결과를 비교한 사진이다.
도16 및 도17은 본 발명의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 따라 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드의 실험군별 칼슘 이미징 결과를 비교한 사진 및 그래프이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지된 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.
1. 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 관한 설명
본 발명에 따른 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법이 어떠한 과정으로 이루어지는지에 대해 이하에서 도1을 참조하여 상세하게 설명한다.
(1) 배아체 준비단계<S110, A단계>
본 단계(S110)에서는 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 배양하여 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체(Embryonic Body)를 마련하는 과정이 이루어진다.
여기서, 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell) 자체를 의미하기도 하나, 더욱 구체적인 의미에서 인간 배아줄기세포(hESC, Human embryonic stem cell) 또는 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC, Human induced Pluripotent Stem Cell) 중 적어도 하나 이상으로 이루어진 세포로 해석될 수도 있다.
구체적으로, 배아체 준비단계(S110)에서는 배양 중인 인간 전분화능 줄기세포를 추출(harvest)한 뒤, 6-웰 플레이트(Well Plate)에 1.5×106개/웰 단위로 10μM의 농도를 갖춘 ROCK(Rho-associated kinase) inhibitor(Y-27632,Tocris Bioscience, UK)가 첨가된 mTeSR 배양액(Stem Cell Technologies, Canada)을 이용하여 플레이팅한다.
여기서, 6-웰 플레이트(Well Plate)에 인간 전분화능 줄기세포를 플레이팅 함에 있어 세포 부착을 위한 코팅을 하지 않으며, 일반적인 오가노이드 배양에 사용되는 매트리젤(Matrigel) 또한 사용되지 않음이 중요하고, Low Attachment 플레이트로 대체 사용도 가능하다.
또한, 도2에 도시된 바와 같이 1일간의 배양이 이루어지고 나면 각 웰에는 200 내지 500개 내외의 세포로 구성되며 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체를 마련된다.
따라서 6-웰 플레이트(Well Plate)의 각 웰에 1.5×106개의 인간 전분화능 줄기세포를 플레이팅 할 경우 배양 1일 경과 후 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체가 3000개 내지 7500개 가량 생성된다.
(2) 배아체 배양단계<S120, B단계>
본 단계(S120)에서는 앞 서 진행된 배아체 준비단계(S110)를 통해 마련된 배아체를 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖출 때까지 추가 배양하는 과정이 이루어진다.
구체적으로, 배아체 배양단계(S120)는 ROCK(Rho-associated kinase) inhibitor(Y-27632)가 미첨가된(없는) mTeSR 배양액에 배아체 준비단계(S110)를 통해 마련된 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체를 2일 내지 3일간 배양하여 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 마련하는 장식으로 진행된다.
여기서, ROCK(Rho-associated kinase) inhibitor(Y-27632)가 미첨가된(없는) mTeSR 배양액을 이용한 배양 과정은 2일 내지 3일간 진행됨에 있어 매일 배양액을 새것으로 교체하여 수행됨이 바람직하다.
이에 따라, 도3에 도시된 바와 같이 배아체 준비단계(S110)를 거치는 배양 1일차에는 'Day ??3'으로 표시된 부분의 사진과 같이 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체가 마련되고, 이어져 배아체 배양단계(S120)에 따라 배양액의 조건을 달리하여 추가 배양되는 2일 내지 3일간의 시간이 경과되고 나면 'Day 0'로 표시된 부분의 사진과 같이 점차 직경이 커지며 200㎛ 내지 250㎛의 직경 범위내로 들어오게 된다.
(3) 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계<S130, C단계>
본 단계(S130)에서는 배아체 배양단계(S120)를 통해 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체로 분화시키는 과정이 이루어진다.
이와 같은 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)는 더욱 구체적으로 세분화되어 2단계에 걸쳐 순차 진행되는데, 우선 배아체 배양단계(S120)를 통해 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), CHIR99021, BMP4(Bone morphogenetic protein-4) 및 Activin A가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양하는 1차 분화과정(C-1단계)이 선행된다.
구체적으로, 배아체 배양단계(S120)를 통해 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 1차 배양이 2일간 진행되는 배지는 B-27 Supplement(minus Insulin; Thermo Fisher Scientific, USA), 6μM 내지 8μM의 농도를 갖춘 CHIR99021, 9ng/ml 내지 10ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4 및 8ng/ml 내지 10ng/ml의 농도를 갖춘 Activin A가 첨가된 RPMI 1640배지에 해당한다.
여기서, 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)의 1차 분화과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 CHIR99021는 Wnt 신호 활성화를 위한 GSK-3β(Glycogen Synthase Kinase-3β) 억제제로서 6μM의 농도 조건을 갖춤이 가장 바람직하다.
또한, 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)의 1차 분화과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 BMP-4 (Bone morphogenetic protein-4)는 BMP 신호 활성화를 위한 성분으로서 10ng/ml의 농도를 갖춤이 가장 바람직하다.
다음으로, 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)의 1차 분화과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 Activin A는 TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 신호 활성화를 위한 성분으로서 10ng/ml의 농도를 갖춤이 가장 바람직하다.
그 후, 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)의 1차 분화과정을 통해 배양을 거친 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), XAV939, L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 다시 2일간 배양시켜 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체로 분화시키는 2차 분화과정(C-2단계)이 이어진다.
구체적으로, 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)의 1차 분화과정을 통해 배양을 거친 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체의 2차 배양이 2일간 진행되는 배지는 B-27 Supplement(minus Insulin; Thermo Fisher Scientific, USA), 8μM 내지 12μM의 농도를 갖춘 XAV939 및 40μg/ml 내지 60μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)가 첨가된 RPMI 1640배지에 해당한다.
여기서, 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)의 2차 분화과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 XAV939는 Wnt 신호 억제를 위한 성분으로서 10μM의 농도 조건을 갖춤이 가장 바람직하다.
아울러, 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)의 2차 분화과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 XAV939는 실시에 따라 Inhibitor of Wnt Production-2, 3, 4로서 IWP-2, 3, 4을 같은 농도로 대체 실시 가능하다.
또한, 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)의 2차 분화과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)는 Wnt 신호 억제를 위한 성분으로서 50μg/ml의 농도 조건을 갖춤이 가장 바람직하다.
(4) 심장 오가노이드 자가조직화단계<S140, D단계>
본 단계(S140)에서는 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)를 통해 분화된 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체를 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)를 포함하도록 자가조직화된 심장 오가노이드(Heart Organoid)로 분화시키는 과정이 이루어진다.
이와 같은 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)는 더욱 구체적으로 세분화되어 4단계에 걸쳐 순차 진행되는데, 우선 중배엽 및 내배엽 세포 분화단계(S130)를 통해 분화된 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체를 B-27 Supplement(minus Insulin) 및 40μg/ml 내지 60μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 심근세포(Cardiomyocyte)로의 분화를 유도시키는 1차 조직화 과정(D-1단계)가 진행된다.
여기서, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 1차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)는 50μg/ml의 농도를 갖춤이 가장 바람직하다.
그 후, 1차 조직화 과정(D-1단계)를 통해 심근세포(Cardiomyocyte)의 분화 유도가 진행된 구성체를 1차 조직화 과정(D-1단계)에 이용된 RPMI 1640배지에 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)를 추가하여 2일간 배양시켜 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)의 분화를 유도하는 2차 조직화 과정(D-2단계)가 진행된다.
여기서, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 2차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 추가 첨가되는 BMP4(Bone morphogenetic protein-4)는 BMP 신호 활성화를 위한 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
또한, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 2차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 추가 첨가되는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)는 혈관 분화 및 형성에 관여하는 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
또한, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 2차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 추가 첨가되는 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)는 FGF 신호 활성화를 위한 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
다음으로, 2차 조직화 과정(D-2단계)를 통해 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)의 분화 유도가 진행된 구성체를 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 40μg/ml 내지 60μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시키는 3차 조직화 과정(D-3단계)가 진행된다.
여기서, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 3차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)는 50μg/ml의 농도를 갖춤이 가장 바람직하다.
또한, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 3차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 BMP4(Bone morphogenetic protein-4)는 BMP 신호 활성화를 위한 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
아울러, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 3차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 추가 첨가되는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)는 혈관 분화 및 형성에 관여하는 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
또한, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 3차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 추가 첨가되는 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)는 FGF 신호 활성화를 위한 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
마지막으로, 3차 조직화 과정(D-3단계)를 통해 배양이 완료된 구성체를 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)을 제외하고 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 분화를 통한 심장 오가노이드의 자가조직화를 이루는 4차 조직화 과정(D-4단계)가 진행된다.
여기서, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 4차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 BMP4(Bone morphogenetic protein-4)는 BMP 신호 활성화를 위한 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
아울러, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 4차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 추가 첨가되는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)는 혈관 분화 및 형성에 관여하는 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
또한, 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)의 4차 조직화 과정에 사용되는 RPMI 1640배지에 추가 첨가되는 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)는 FGF 신호 활성화를 위한 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
이와 같은 일련의 세부과정을 거쳐 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)가 완료되고 나면 분화를 통해 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)가 자가조직화된 심장 오가노이드가 마련된다.
(5) 심장 오가노이드 성숙화 단계<S150, E단계>
본 단계(S150)에서는 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)를 통해 분화되어 자가조직화된 심장 오가노이드를 배양하여 성숙화시키는 과정이 이루어진다.
구체적으로, 심장 오가노이드 성숙화 단계(S150)는 심장 오가노이드 자가조직화 단계(S140)를 통해 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)를 포함하도록 자가조직화된 심장 오가노이드를 성숙화용 배지에서 10일 내지 20일간 배양시켜 성숙화를 진행한다.
여기서, 심장 오가노이드의 성숙화용 배지는 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) 및 TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 신호 억제를 위한 성분으로서 10ng/ml 내지 15ng/ml의 농도를 갖춘 SB431542가 첨가된 RPMI 1640배지에 해당한다.
또한, 심장 오가노이드 성숙화 단계(S150)에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)는 혈관 분화 및 형성에 관여하는 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
아울러, 심장 오가노이드 성숙화 단계(S150)에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)는 FGF 신호 활성화를 위한 성분으로서 30ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
또한, 심장 오가노이드 성숙화 단계(S150)에 사용되는 RPMI 1640배지에 첨가되는 SB431542는 TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 신호 억제를 위한 성분으로서 10ng/ml의 농도를 갖춤이 바람직하다.
결과적으로, 도4에 도시된 바와 같이 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC, Human induced Pluripotent Stem Cell)로부터 유래되어 배아체(EB)를 거쳐, 6일차(Day 6)의 중배엽 및 내배엽 세포로 분화된 상태를 거친 뒤, 10일차(Day 10)의 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)가 자가조직화된 심장 오가노이드 상태로 분화된 뒤, 최종적으로 24일차(Day 24)의 성숙화된 심장 오가노이드 상태를 확인할 수 있다.
이러한 각각의 단계별 직경의 변화 과정은 도5에 도시된 바와 같이 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체가 최종적으로 25일차(Day 25)의 300㎛ 내지 400㎛의 직경을 갖춘 성숙화된 심장 오가노이드가 마련됨을 확인할 수 있다.
이와 더불어, 각각의 단계별 박동 비율의 변화 과정은 도6에 도시된 바와 같이 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체 상태에 해당하는 0일차(Day 0)에서부터 최종적으로 21일차(Day 21)에서 30일차(Day 30)의 성숙화된 심장 오가노이드의 경우 96% 이상의 개체에서 박동을 보여줌을 확인할 수 있다.
무엇보다, 이와 같은 일련의 세부과정을 거쳐 심장 오가노이드 성숙화 단계(S150)가 완료되고 나면 분화를 통해 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)가 55 내지 65 : 15 내지 30 : 15의 세포수 비율에 따라 자가조직화된 심장 오가노이드가 마련되어 실제 인간의 심장을 구성하는 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)의 6 : 2 : 1.5의 세포수 비율과 매우 근접하게 된다.
이와 관련하여, 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드의 형광 염색을 수행하여 심근세포의 마커(cTnT)와 심실형 심근세포의 마커(MYL2)의 발현을 이미지 분석하여 확인한 결과 도7에 도시된 바와 같다.
이러한, 실제 심장과 유사한 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)의 구성세포 간 세포수의 비율이 유사 혹은 동일하게 대응되고, 동시 분화되어 발달 초기부터 상호 작용을 거쳐 자가조직화 및 성숙화된 심장 오가노이드는 실제 심장의 구조 및 기능을 모사하기에 충분한 상태를 갖춰 신약 개발 시 질환 모델링을 통한 약물 스크리닝 및 심장 독성 평가를 진행함에 이용하여 신약 개발의 효율성을 획기적으로 증대시킬 수 있다.
2. 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 의해 마련된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드의 기능성 확인 실험에 관한 설명
우선, 앞 서 설명한 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법을 통해 제조되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드를 하나의 실험군으로 설정하고, 이와 대비하여 또 다른 실험군을 설정하여 상호 구조성 및 기능성 측면에서의 실제 심장 대비 적합정도를 비교한 결과를 아래에서 설명하고자 한다.
(1) 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드의 실험군 제조
도8에 도시한 바와 같이 배양 조건을 달리하여 분화된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 각각을 실험군1 및 실험군2로 설정하였다.
실험군1 및 실험군2의 경우, 배아체 준비단계(S110) 및 배아체 배양단계(S120)를 통해 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 마련하는 과정은 공통적으로 동일하게 진행된다.
또한, 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), 6μM의 농도를 갖춘 CHIR99021, 10ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4 및 10ng/ml의 농도를 갖춘 Activin A가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 1차 배양시킨 뒤, 1차 배양을 거친 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), 10μM의 농도를 갖춘 XAV939, 50μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양하여 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체로 분화시키는 과정 또한 동일하게 진행되고, 추후 진행되는 과정은 다른 배양조건 하에서 진행된다.
- 실험군1
실험군1은 도8에 도시된 바와 같이 분화된 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체를 B-27 Supplement(minus Insulin) 및 50μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 심근세포(Cardiomyocyte)의 분화를 유도하는 과정을 진행한 뒤, B-27 Supplement(minus Vitamin A), 50μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양하고, 이 후 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)을 제외하고 B-27 Supplement(minus Vitamin A)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양하여 심장 오가노이드의 자가조직화을 진행하였다.
다음으로, 실험군1에 해당하는 자가조직화된 심장 오가노이드는 B-27 Supplement(minus Vitamin A)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 10일 내지 30일간 배양시켜 성숙화하는 과정을 거치도록하여 실험군1을 완성하였다.
-실험군2
실험군2는 도8에 도시된 바와 같이 분화된 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체를 B-27 Supplement(minus Insulin) 및 50μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 심근세포(Cardiomyocyte)의 분화를 유도하는 과정을 진행한 뒤, 앞 서 사용된 RPMI 1640배지에 30ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 30ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor), 30ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)를 추가하여 2일간 배양하고, B-27 Supplement(minus Vitamin A), 30μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid), 30ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 30ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 30ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양하며, 이 후 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)을 제외하고 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 30ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 30ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 30ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양하여 심장 오가노이드의 자가조직화을 진행하였다.
다음으로, 실험군2에 해당하는 자가조직화된 심장 오가노이드는 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 30ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor), 30ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) 및 10ng/ml의 농도를 갖춘 SB431542가 첨가된 RPMI 1640배지에서 10일 내지 20일간 배양시켜 성숙화하는 과정을 거치도록하여 실험군2를 완성하였다.
(2) 실험군 별 심장 오가노이드 세포 구성 비교 실험
앞 서 설명한 방법을 통해 마련된 실험군1과 실험군2를 이용해 심장 오가노이드의 세포 구성에 관한 비교 분석을 다양한 실험을 통해 수행하였다.
우선, 심근세포의 마커는 cTnT, 섬유아세포의 마커는 CD90, 혈관내피세포 마커는 VE-Cadherin 또는 CD31을 사용하여 유세포 분석을 수행하였고, 그 결과는 도9 및 도10에 도시된 바와 같다.
실험군 1의 경우, 도9 및 도10과 같이 심근세포 마커 92%, 섬유아세포 마커 6%, 혈관내피세포 마커 4% 로 분석되었으며, 실험군 2의 경우, 심근세포 마커 51%, 섬유아세포 마커 24%, 내피세포 마커 14%로 분석되었다.
더욱 자세히 각각의 실험결과를 백분율로 환산하면, 실험군 1에서는 심근세포 90%, 섬유아세포 6%, 내피세포 4%의 구성 비율을 보여주며, 실험군 2에서는 심근세포 58%, 섬유아세포 27%, 내피세포 15%의 구성 비율을 보여주었다.
다음으로, Quantitative Real-time PCR을 이용해 각 실험군별 심장 오가노이드에서 마커 유전자들의 상대적 발현을 분석하였으며, 심근세포 마커로 NKX2.5, TNNT2, MYL2, MYL7을 사용했다.
그 결과, 도11 내지 도13에 도시된 바와 같이 실험군 1 대비 실험군 2에서 발현량이 감소함을 확인할 수 있으며, 심장 섬유아세포 마커인 CD90, PDGFR, Vimentin, TCF21과 Endoderm 마커인 CD34, PECAM1, Sox17, FOXA2는 실험군 2 심장 오가노이드에서 증가된 발현을 보임을 확인할 수 있다.
더욱 구체적으로, 앞 서 설명한 방법을 통해 마련된 실험군1과 실험군2의 심장 오가노이드 각각에 대한 면역 형광염색 시험을 수행한 결과, 도14 및 도15에 도시된 바와 같이 실험군2의 심장 오가노이드에서 혈관내피세포 마커(VE-Cadherin)와 섬유아세포 마커(Vimentin)의 분포가 증가 되어있고, 심근세포 마커(cTnT) 발현은 전반적으로 감소된 분포를 보임을 알 수 있다.
특히 실험군2의 심장 오가노이드는 실험군1에 비교하여 혈관내피세포 마커인 VE-Cadherin의 경우 심장 오가노이드의 가장 바깥쪽을 감싸는 형태로 분포되고 있음을 알 수 있다.
(3) 실험군 별 심장 오가노이드의 칼슘 이온 채널 기능성 비교 실험
앞 서 설명한 방법을 통해 마련된 실험군1과 실험군2를 이용해 심장 오가노이드의 칼슘 이온 채널 기능성을 측정하여 비교 분석하였다.
우선, 살아있는 세포 내부의 칼슘 농도를 측정하기 위해 세포 투과성이 있는 Fluo-4, AM(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 이용하여 실험군별 심장 오가노이드의 칼슘 이온 농도 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도16 및 도17에 도시된 바와 같이 92% 이상 심근세포로 이루어진 실험군 1보다 심근세포, 섬유아세포, 혈관내피세포가 동시에 분화된 실험군 2에서 비교적 칼슘 이온 이동과 박동이 느린 것을 확인할 수 있었다.
정리하면, 실험군 2와 같이 제조된 심장 오가노이드가 심장 줄기세포가 없다는 한계를 극복하고, 인간 전분화능 줄기세포로부터 심장을 구성하는 심근세포, 심장 섬유아세포, 혈관내피세포들이 동시에 분화되며 발달 초기부터 상호 작용을 통한 자가조직화를 이루며 배양 분화되어 실제 심장의 구조 및 기능을 모사하기에 충분한 상태를 갖추게 된다.
이에 따라, 앞 서 설명한 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법을 통해 제조되는 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드의 적정 실시예에 해당하는 실험군2가 심장의 구조 및 기능을 모사하기에 충분한 상태를 갖춘 심장 오가노이드를 신약 개발 시 질환 모델링을 통한 약물 스크리닝 및 심장 독성 평가를 진행함에 이용하여 신약 개발의 효율성을 획기적으로 증대시킬 수을 뿐만 아니라, 심장 관련 질병 기전연구의 대체 모델로서 이용하기에 적합하다.
본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의해서 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 보호범위는 아래 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 인간 전분화능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cell)를 배양하여 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체(Embryonic Body)를 마련하는 A단계;
    상기 A단계를 통해 마련된 배아체를 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖출 때까지 배양하는 B단계;
    상기 B단계를 통해 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체로 분화시키는 C단계;
    상기 C단계를 통해 분화된 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체를 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)를 포함하도록 자가조직화된 심장 오가노이드로 분화시키는 D단계; 및
    상기 D단계를 통해 분화되어 자가조직화된 심장 오가노이드를 배양하여 성숙화시키는 E단계;를 포함하며,
    상기 E단계를 통해 성숙화 과정을 거친 심장 오가노이드는 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)가 55 내지 65 : 15 내지 30 : 15의 세포수 비율로 자가조직화된 것을 특징으로 하는
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 A단계의 인간 전분화능 줄기세포는 인간 배아줄기세포(hESC, Human embryonic stem cell) 또는 인간 유도만능 줄기세포(hiPSC, Human induced Pluripotent Stem Cell) 중 적어도 하나 이상인 것을 특징으로 하는
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 A단계는 ROCK(Rho-associated kinase) inhibitor(Y-27632)가 첨가된 mTeSR 배양액에 인간 전분화능 줄기세포를 플레이팅하여 1일 간 배양하여 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체를 마련하는 단계인 것을 특징으로 하는
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 B단계는 ROCK(Rho-associated kinase) inhibitor(Y-27632)가 미첨가된 mTeSR 배양액에 상기 A단계를 통해 마련된 100㎛ 내지 130㎛의 직경을 갖춘 배아체를 2일 내지 3일간 배양하여 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 마련하는 단계인 것을 특징으로 하는
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 C단계는,
    상기 B단계를 통해 마련된 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), CHIR99021, BMP4(Bone morphogenetic protein-4) 및 Activin A가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시키는 C-1단계; 및
    상기 C-1단계를 통해 배양을 거친 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), XAV939, L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체로 분화시키는 C-2단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 C-1단계는 상기 B단계를 통해 마련된 200㎛ 내지 250㎛의 직경을 갖춘 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), Wnt 신호 활성화를 위한 GSK-3β(Glycogen Synthase Kinase-3β) 억제제로서 6μM 내지 8μM의 농도를 갖춘 CHIR99021, BMP 신호 활성화를 위한 성분으로서 9ng/ml 내지 10ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4 및 TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 신호 활성화를 위한 성분으로서 8ng/ml 내지 10ng/ml의 농도를 갖춘 Activin A가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시키는 단계인 것을 특징으로 하는
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 C-2단계는 상기 C-1단계를 통해 배양을 거친 인간 전분화능 줄기세포 유래 배아체를 B-27 Supplement(minus Insulin), Wnt 신호 억제를 위한 성분으로서 8μM 내지 12μM의 농도를 갖춘 XAV939, BMP 신호 활성화를 위한 성분으로서 40μg/ml 내지 60μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시키는 단계인 것을 특징으로 하는
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 D단계는
    상기 C단계를 통해 분화된 중배엽 세포 및 내배엽 세포를 포함하는 구성체를 B-27 Supplement(minus Insulin) 및 40μg/ml 내지 60μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)이 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 심근세포(Cardiomyocyte)의 분화를 유도하는 D-1단계;
    상기 D-1단계를 통해 심근세포(Cardiomyocyte)의 분화 유도가 진행된 구성체를 상기 D-1단계에 이용된 RPMI 1640배지에 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)를 추가하여 2일간 배양시켜 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)의 분화를 유도하는 D-2단계;
    상기 D-2단계를 통해 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)의 분화 유도가 진행된 구성체를 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 40μg/ml 내지 60μg/ml의 농도를 갖춘 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시키는 D-3단계; 및
    상기 D-3단계를 통한 배양이 완료된 구성체를 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 BMP4, 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 및 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2)가 첨가된 RPMI 1640배지에서 2일간 배양시켜 분화를 통한 심장 오가노이드의 자가조직화를 이루는 D-4단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 E단계는 상기 D-4단계를 통해 분화되어 심근세포(Cardiomyocyte), 섬유아세포(Fibroblast) 및 혈관내피세포(Endothelial Cell)를 포함하도록 자가조직화된 심장 오가노이드를 B-27 Supplement(minus Vitamin A), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 VEGF(Vascular endothelial growth factor), 20ng/ml 내지 40ng/ml의 농도를 갖춘 FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2) 및 TGF-β(Transforming Growth Factor-β) 신호 억제를 위한 성분으로서 10ng/ml 내지 15ng/ml의 농도를 갖춘 SB431542가 첨가된 RPMI 1640배지에서 10일 내지 20일간 배양시켜 성숙화를 진행하는 단계인 것을 특징으로 하는
    인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드 제조 방법에 의해 제조된 인간 전분화능 줄기세포 유래 심장 오가노이드.
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