KR20230067138A - 다능성 줄기세포 유래 성숙한 심혈관 오가노이드 제조 방법 - Google Patents

다능성 줄기세포 유래 성숙한 심혈관 오가노이드 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 다능성 줄기세포에서 분화유도 전 세포 응집체의 줄기능 특성을 이용한 심혈관 오가노이드 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 심혈관 오가노이드 제조 방법으로 제조된 혈관화된 성숙 심실타입 심혈관 오가노이드는 종래의 구조적 및 기능적으로 미성숙한 심근세포를 포함하고 혈관 형성이 부족한 심혈관 오가노이드의 문제점을 해결할 수 있으므로, 이를 심혈관 질환의 세포 치료제, 질환 모델링 및 신약 독성평가에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

다능성 줄기세포 유래 성숙한 심혈관 오가노이드 제조 방법{Method for generating mature cardiovascular organoids from pluripotent stem cells}
본 발명은 인간 다능성 줄기세포에서 분화유도 전 세포 응집체의 줄기능 특성을 이용한 심혈관 오가노이드 제조 방법에 관한 것이다.
허혈성 심장질환은 전세계적으로 매우 높은 유병률을 보이고 있으며, 단일질환 전체 사망원인 중 1위를 차지하고 있다. 한국 역시 사회·경제적인 발전과 서구화된 생활습관으로 인하여 허혈성 심장질환 환자들이 급증하고 있다. 더욱이 중증의 말기 심부전 환자의 경우, 심장이식술이나 기계적 좌심실 보조장치 이외에는 완치법이 없는 실정이다. 하지만 공여장기의 부족, 장기확보의 어려움, 높은 사망률 및 고가의 치료비용 등의 문제점을 가지고 있다.
인체의 손상된 조직을 재건하기 위한 이식방법에는 이종이식, 동종이식, 자가이식이 있다. 이종이식은 면역 부적합성 및 레트로바이러스를 포함하는 인수공통 병원체 전달의 문제를 갖는다. 또한, 동종이식은 제공자의 면역거부 및 이용불가능성의 문제를 가지며, 자가이식은 필요한 양만큼의 적절한 조직을 얻기 어려우며 환자에 대한 외상의 증가의 문제를 가진다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 인공 대체물이나 세포를 배양하여 조직화시킨 것을 그대로 이식하려고 하는 기술이 주목받고 있다. 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 미분화 세포인 인간 다능성 줄기세포는 심근세포로 분화 가능하며, 2차원 배양 시스템에서 생성된 인간 다능성 줄기세포 유래 심근세포에 관한 많은 연구를 진행하고 있다. 이러한 인간 다능성 줄기세포 유래 심근세포는 심장발달, 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 심장 회복 연구에 광범위하게 사용될 수 있다. 하지만, 기존 2차원 배양 시스템으로부터 생성된 인간 다능성 줄기세포 유래 심근세포는 배아 또는 태아 단계와 유사한 구조적 및 기능적으로 미성숙한 특성을 나타내기 때문에 성숙한 성인 심근세포와 달리 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 심장 독성을 위한 활용에 한계점을 갖고 있다. 2004년 순수한 세포 자체를 이용하여 제작한 셀 시트(cell sheet)를 이용한 망막 재생에 관한 연구가 New England journal of Medicine에 발표된 뒤 조직공학 분야에서 세포만을 이용한 3차원 인공조직에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 조직공학 분야에서 최근 인공 조직보다 주목받고 있는 것이 인공 장기 또는 미니 장기라고 불리는 오가노이드(organoid)이다. 현재 생체 내 여러 장기의 줄기세포에서 유래하는 다양한 종류의 오가노이드 모델이 구축되어 있으며, 재생의학이나 세포치료제로써 오가노이드에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 오가노이드는 줄기세포로부터 발생 및 분화를 통하여 형성된 3차원 세포 구조체로서, 해당 장기의 구조적, 기능적 특성을 재현하는 소형 장기 모사체이다. 오가노이드는 3차원 세포 구조체로서 조직을 구성하고 있는 다양한 세포로 구성되어 있고 세포외 기질(ECM, extracellular matrix), 세포 유형 및 가용성 인자를 포함하는 미세 환경을 제공해 주어 기존의 2차원 배양 시스템보다 우수한 심장 조직을 형성할 수 있다는 점에서 최근에 주목받고 있다. 따라서, 기초 생물학 연구 분야에서부터 신약개발, 질병 모델링, 재생 치료 등 다양한 응용 연구 분야에 이르기까지 폭넓게 활용되고 있다. 자가조직화는 외부의 압력 없이, 세포 간의 상호작용을 통해 스스로 조직화를 만들어내는 현상을 말한다. 심장발달 과정은 줄기세포로부터 심혈관 전구 세포로의 분화를 거쳐 첫 번째 및 두 번째 심장 필드, 심장 루핑(looping heart) 및 챔버 형성(chamber formation)을 거쳐 자가조직화한다. 심장 오가노이드는 자가조직화 능력이 있어 생체 내 심장을 모방하여 효과적으로 생성된다. 인간 다능성 줄기세포를 이용하여 심근세포 및 심근 모사조직의 형성을 시도한 많은 연구가 있었으나, 현재까지 구조적, 기능적으로 미성숙 상태에 머물러 있어 성인에서 발병하는 질환 모델링에 사용하기엔 적합하지 않으므로, 심근세포의 성숙 분화유도를 통한 고도로 성숙된 심근세포 및 심장 오가노이드가 필요하다. 또한, 산소 및 영양소 분포를 촉진하는 혈관 네트워크 형성이 부족함으로 배양 배지에 의존 및 장기간 배양이 불가능하고, 생체 내 장기를 구현하기 어렵다. 따라서, 성숙화된 혈관 네트워크를 포함하는 오가노이드를 확립하기 위해서 많은 연구자는 혈관내피세포를 공배양하거나, 외인성 혈관 유도 인자를 처리하여 혈관을 포함하는 오가노이드를 확립하였다. 하지만, 신체 내 자가조직화를 구현하기 위해서는 혈관내피세포를 공배양 하거나, 외인성 혈관 유도 인자를 처리하지 않고 인간 다능성 줄기세포로부터 심장을 구성하는 다양한 세포로의 동시 분화를 유도하는 것이 심장발생 및 심장조직을 모사하는 것에 중요하다. 배아 발생 과정 동안 수정란으로부터 외배엽(ectoderm), 내배엽(endoderm) 및 중배엽(mesoderm)을 포함하는 삼배엽(three germ layer)으로 분화 과정을 거쳐 기관형성 과정동안 모든 세포와 기관을 형성하게 된다. 이러한 삼배엽 중에서 심장과 혈관은 중배엽에 속한다. 따라서, 혈관 네트워크를 포함하는 심장 오가노이드 형성을 위해서는 인간 다능성 줄기세포로부터 중배엽으로의 효율적인 분화 유도가 중요하다.
종래의 연구에서는 심혈관 오가노이드를 생성할 때 세포 응집체의 크기가 중요한 매개변수라고 보고하였다. 세포 응집체는 심혈관 오가노이드로 유도하기 전에 세포 응집체의 크기 (200 μm - 450 μm)를 최적화하기 위해 일반적으로 4 - 7일 동안 배양하였다. 그러나 배양 기간이 길어질수록 인간 다능성 줄기세포 마커 (OCT4, NANOG 및 SOX2)의 발현은 점진적으로 감소하는 반면, 삼배엽 마커의 발현은 증가하였다. 즉, 세포 응집체의 장기간 배양은 특정 세포 유형에 대한 외부 자극 없이 삼배엽으로의 자발적 분화를 유도할 수 있으며, 이러한 자발적인 삼배엽으로의 분화는 외배엽과 내배엽으로의 분화를 억제시키는 반면, 중배엽 계통으로의 특이적인 분화 유도를 통해 생성되는 심혈관 오가노이드의 고효율 제작을 방해하는 요인이 될 수 있다.
본 발명의 목적은 심혈관 질환 모델링 및 약물 독성 검사에 이용할 수 있는 혈관화된 성숙 심실타입 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 심혈관 질환 모델링 및 약물 독성 검사에 이용할 수 있는 혈관화된 성숙 심실타입 심혈관 오가노이드를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 질병 모델링 및 약물 독성 검사에 적합한 혈관화된 성숙한 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 질병 모델링 및 약물 독성 검사에 적합한 혈관화된 성숙한 심혈관 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 심혈관 오가노이드 제조 방법으로 제조된 혈관화된 성숙 심실타입 심혈관 오가노이드는 종래의 구조적 및 기능적으로 미성숙한 심근세포를 포함하고 혈관 형성이 부족한 심혈관 오가노이드의 문제점을 해결할 수 있으므로, 이를 심혈관 질환의 세포 치료제, 질환 모델링 및 신약 독성평가에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 인간 다능성 줄기세포 유래 심혈관 오가노이드를 제작시 세포 응집체 형성을 위한 최적 세포 분주 밀도를 확인한 도이다.
도 2는 심혈관 오가노이드를 제작시 세포 응집체의 줄기능 및 분화능을 확인한 도이다.
도 3은 심혈관 오가노이드를 크기별로 나눈 뒤 이의 형태학적 특성을 확인한 도이다.
도 4는 상대적으로 줄기능이 높은 2일간 배양된 세포 응집체에서 분화된 CO (H-CO) 및 줄기능이 낮은 5일간 배양된 세포 응집체에서 분화된 CO (L-CO)의 분화 효율 및 심근세포 타입을 확인한 도이다.
도 5는 H-CO 및 L-CO의 챔버 형성을 확인한 도이다.
도 6 내지 8은 H-CO 및 L-CO의 구조적, 대사적 성숙도 및 심근세포 사이의 접합부를 확인한 도이다.
도 9 내지 11은 H-CO 및 L-CO의 기능적 성숙도 및 심근세포 타입별 활동전위를 분석한 도이다.
도 12 및 13은 H-CO 및 L-CO의 혈관 네트워크 형성을 확인한 도이다.
도 14는 H-CO 및 L-CO의 혈관 성숙도를 확인한 도이다.
도 15는 H-CO 및 L-CO의 심실 성숙 및 혈관 생성 분화 기전을 분석한 결과이다.
도 16은 H-CO 및 L-CO의 심실/심근 성숙 및 혈관 생성 분화 기전을 분석한 결과이다.
도 17은 유도 만능 줄기세포 유래 CO를 제작한 뒤 이의 특성을 분석한 도이다.
도 18은 유도 만능 줄기세포 유래 CO의 심근세포 성숙 및 혈관 네트워크 형성 기전을 확인한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 a) 인간 다능성 줄기세포(hPSC, human pluripotent Stem Cell)를 분주 및 배양하여 세포 응집체(CA, cell aggregate)를 형성하는 단계; b) 세포 응집체를 분화시켜 심혈관 오가노이드를 제조하는 단계; 및 c) 심혈관 오가노이드를 크기에 따라 선별하여 배양하는 단계를 포함하는 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 인간 다능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs) 또는 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPSCs, 역분화 줄기세포)일 수 있다.
일 구현예에서, 인간 다능성 줄기세포는 0.5×105개/cm2 내지 3×105개/cm2의 밀도로 분주될 수 있으며, 1×105개/cm2로 분주되는 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 단계 a)의 배양은 1 내지 3일 또는 4 내지 6일 동안 수행될 수 있으며, 1 내지 3일 동안 수행되는 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 단계 c)에서 100 내지 200 μm의 크기의 심혈관 오가노이드를 선별하여 배양할 수 있으며, 선별은 분화유도 7일 및 11일에 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 단계 b)에서 세포 응집체는: ⅰ) Rho kinase 억제제가 포함된 E8 배양액에서 배양하는 단계; ⅱ) GSK-3 억제제 포함된 RPMI1640, B27 및 인슐린을 포함하는 배양액에서 배양하는 단계; 및 ⅲ) IWP2 처리하고 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 심혈관 오가노이드로 분화될 수 있다.
일 구현예에서, 단계 a)의 배양을 1 내지 3일 동안 수행한 세포 응집체는 4 내지 6일 동안 배양한 세포 응집체에 비해 줄기능(stemness)이 높을 수 있다.
일 구현예에서, 단계 a)의 배양을 1 내지 3일 동안 수행한 세포 응집체가 분화되어 제조된 심혈관 오가노이드는 심실 타입 및 심근 타입의 심근세포를 포함할 수 있으며, 심실타입의 심혈관 오가노이드일 수 있다.
일 구현예에서, 단계 a)의 배양을 4 내지 6일 동안 수행한 세포 응집체가 분화되어 제조된 심혈관 오가노이드는 노달 타입의 심근세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 인간 다능성 줄기세포 유래 세포 응집체의 줄기능이 높을수록 심혈관 오가노이드의 심근 성숙 및 혈관 네트워크 형성이 우수한 것을 확인하였다. 구체적으로, 인간 다능성 줄기세포의 높은 줄기능을 유지하고 있는 세포 응집체로부터 생성된 심혈관 오가노이드 (H-CO, COs generated from CAs with high stemness)가 낮은 줄기능을 갖는 세포 응집체에서 생성된 심혈관 오가노이드 (L-CO, COs generated from CAs with low stemness)에 비해 심실타입으로의 분화, 구조적, 대사적 및 기능적 성숙도가 더 높은 심근세포와 혈관내피세포, 혈관주변세포, 평활근세포 및 기저막을 포함하는 성숙한 혈관 네트워크를 형성함을 확인하였다. 또한, 세포외 기질-인테그린(integrin) 상호작용을 통한 ROCK-pCofilin, LEFTY-NODAL, pVEGFR, pPDGFR 및 peNOS 경로의 활성화가 성숙한 심근세포 및 혈관을 포함하는 심혈관 오가노이드의 생성에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.
본 명세서에 기재된 "만능 줄기세포(pluripotent stem cell, PSC)"는 몸을 구성하는 어떠한 형태의 세포로도 유도 분화가 가능한 줄기세포를 의미하며, 만능 줄기세포에는 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)와 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPSCs, 역분화 줄기세포)가 포함된다. 구체적으로, 배아 줄기세포는 착상 이전 단계에 배반포(blastocyst)의 내부 세포 덩어리(inner cell mass)로부터 유도된다. 유도된 세포는 특정한 환경에서 유지되며, 무제한적인 배양 및 다능성 분화가 가능하다. 나아가, 유도 만능 줄기세포는 신체 체세포로부터 역분화되어 만들어지는 다능성 분화 세포를 의미할 수 있으며, 세포 융합, 핵 치환, 다분화성 조절 인자의 과발현과 같은 재프로그래밍(reprograming)이라는 과정을 통해 체세포를 배아 줄기세포와 매우 유사한 상태로 만들어줌으로써 형성된다. 나아가, 만능 줄기세포는 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포에 제한되는 것은 아니며, 분화 다능성 및 자기 복제능을 겸비한 세포를 모두포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게 만능 줄기세포는 포유동물의 세포, 더욱 바람직하게는 인간 유래의 만능 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에 기재된 "오가노이드 (organoid)"는 줄기세포를 이용해 최소 기능을 할 수 있도록 만든 '미니 유사 장기’로서, 3차원 구조로 만들어져 실험실에서도 실제 신체 기관과 비슷한 환경을 만들 수 있는 것이 특징이다. 즉, "오가노이드(organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 신경, 장 등의 장기와 유사한 모델을 의미한다. 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다. 상기 오가노이드 (organoid)는 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다. 2D 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있다. 이에 따라 본 발명에서 3D 오가노이드는 실제로 생체 내에서 상호 작용을 하고 있는 장기를 거의 완벽히 모사하여, 질병의 치료제 개발 및 등을 관찰할 수 있는 훌륭한 모델이 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "분화"는 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말하며, 예를 들어, 만능 줄기세포가 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포로 변하는 과정뿐 아니라 전구세포가 특정 분화형질을 발현하게 되는 것도 모두 분화에 포함될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 심혈관 오가노이드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 심혈관 오가노이드는 a) 인간 다능성 줄기세포를 분주하고 1 내지 3일 동안 배양하여 세포 응집체를 형성하는 단계; b) 세포 응집체를 분화시켜 심혈관 오가노이드를 제조하는 단계; 및 c) 심혈관 오가노이드를 크기에 따라 선별하여 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 심혈관 오가노이드는 4 내지 6일 동안 배양된 세포 응집체 유래 심혈관 오가노이드에 비해 CD31, vWF, EFNB2, EPHB4, PROX1, PDGFRα, PDGFRβ, CALPONIN1, COL1A, COL3A1, COL4A1, COL4A2, α-SMA, LAMA5, LAMB1, ITGA3, ITGB1, ITGB3, ITGB4, PITX1, PITX3, FGFR4, LaminA, FN1, ROCK1, LIMK1, pFAK, pPDGFRα, pLIMK, pCofilin, VEGFR2, pVEGFR2 또는 peNOS의 발현이 증가될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 심혈관 오가노이드는 혈관화된 성숙한 심실타입 심혈관 오가노이드일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 심혈관 오가노이드는 박동하는 심혈관 오가노이드일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 심혈관 오가노이드는 심근세포가 구조적 성숙 및 기능적으로 성숙한 오가노이드일 수 있으며, 구조적 성숙은 고도화/조직화된 삽입된 디스크와 미토콘드리아의 성숙을 포함하고, 기능적 성숙은 심실 타입 박동특성과 활동전위를 가지는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 심혈관 오가노이드는 성숙 혈관 네트워크를 포함할 수 있으며, 혈관 네트워크는 혈관내피세포, 혈관주변세포, 혈관평활근세포 및 기저막 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 심혈관 오가노이드로의 분화를 유도할 때, 세포 응집체의 크기보다는 세포가 가지는 줄기능이 WNT 신호 유도를 통해 심혈관 오가노이드를 생성하는 데 중요한 것을 확인하였으며, 미분화된 줄기능이 높은 세포 응집체를 통해 성숙한 심혈관 오가노이드를 유도함으로써 세포외 기질, 심장 구성 요소 세포 및 가용성 인자를 포함하는 적절한 미세 환경이 시험관 내에서 형성될 수 있음을 확인하였다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 심혈관 오가노이드와 약물을 반응시키는 단계; 약물 반응이 끝난 심혈관 오가노이드를 세척하는 단계; 세척된 심혈관 오가노이드를 배양하는 단계; 반응, 세척 및 배양하는 단계를 영상으로 촬영하는 단계; 촬영된 영상을 수득하는 단계; 및 수득된 영상을 분석하는 단계를 포함하는, 심혈관 오가노이드를 이용한 약물 독성 평가 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 심혈관 오가노이드 생성을 위한 최적 세포 분주 밀도 결정
인간 다능성 줄기세포 유래 심혈관 오가노이드 제조를 위한 세포 응집체를 형성 최적 조건을 결정하기 위해, 세포 분주 밀도를 확인하였다. 구체적으로, 서로 다른 수의 인간 배아 줄기세포 (각각 0.25, 0.5, 1, 2, 3 및 4 × 106개)를 메타크릴레이트 코팅된 6-웰 배양 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 그 결과, 2 내지 3 × 106개의 분주 밀도는 응집체끼리 집합되는 현상을 확인하였으며, 0.25 내지 0.5 × 106개의 분주 밀도는 응집체가 잘 형성되지 않는 것을 확인하였다 (도 1). 따라서, 심혈관 오가노이드(cardiovascular organoids, CO) 제조시 세포 응집체 형성을 위한 최적 세포 분주 밀도를 1 × 105개/cm2로 결정하였다.
실시예 2. 인간 다능성 줄기세포 유래 심혈관 오가노이드 제조
2-1. CO 제조 및 줄기능 및 삼배엽으로의 자발적인 분화 확인
매트리젤(matrigel)과 DMEM/F12를 1:100의 부피비를 이루도록 혼합한 뒤, 세포 배양 플레이트에 처리하여 상온의 조건 하에서 최소 한 시간 이상 코팅한 후, 코팅된 세포 배양 플레이트에 인간 배아 줄기세포를 Essential 8TM배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하고, 세포가 플레이트에서 60% 정도 자랐을 때 계대배양하였다. 계대배양 첫날에는 Thiazovivin을 2 μM 농도로 첨가하여 세포 생존율을 증가시켰다. 계대배양 동안에는 배지를 매일 교체하였다. 이 후, 배양된 상기 인간 배야 줄기세포를 Accutase를 이용하여 단일세포로 분리하였다. 이를 상기 실시예 1에서 최적 세포 분주 밀도로 확인된 1 × 105개/cm2의 밀도로 메타크릴레이트 코팅된 6-웰 배양 플레이트에 분주한 뒤, 1일부터 5일 동안 Essential 8TM 배지에서 배양하여 세포 응집체를 형성하고 (배양 첫날에는 Thiazovivin를 2 μM 농도로 첨가하여 세포 생존율을 증가시킴), 세포 응집체의 CO로의 분화 유도를 위해, RPMI/B27 마이너스 인슐린 배지에서 GSK3β 억제제인 6 μM CHIR99021를 첨가하여 48시간 동안 처리하였다. 분화유도 2일에는 WNT 억제제인 RPMI/B27 마이너스 인슐린 배지에서 2 μM IWP2를 첨가하여 48시간 동안 처리하였다. 분화유도 4일 및 5일에 RPMI/B27 마이너스 인슐린 배지로 교체하였다. 분화유도 7일에는 RPM/B27 마이너스 비타민 A로 배지를 교체한 후 같은 배지로 2일 간격으로 교체하여 배양함으로써 심혈관 오가노이드를 제조하였다. 이 때, 세포 응집체가 형성되는 기간 동안 줄기능 및 삼배엽으로의 자발적인 분화를 확인하기 위해, 세포 응집체의 형태 변화, 직경의 변화 및 세포 수 변화를 관찰하였다 (도 2A). 또한, 세포 계통 마커의 유전자 발현 패턴을 조사하였다.
그 결과, 배양 1 - 5일 차의 세포 응집체의 평균 직경은 각각 32.6 및 72.1, 102.2, 135.2 및 156.2 μm로 나타나, 시간 경과에 따라 평균 직경이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2B). 또한, 세포 계통 마커의 유전자 발현 패턴을 조사한 결과, 다능성 마커 (OCT4 및 NANOG)는 시간이 지남에 따라 점차 감소하였고, 외배엽 마커 (OTX 및 ZIC), 중배엽 마커 (MESP1 및 T) 및 내배엽 마커 (CXCR4 및 AFP)는 증가하는 것을 확인하였다 (도 2C). 또한, 2일 및 5일간 배양된 세포 응집체의 세포 수는 각각 166.6 및 418.1개임을 확인하였다 (도 2D 내지 E).
2-2. 균일한 크기의 심혈관 오가노이드 선별
상기 실시예 2-1의 분화유도 7일 및 11일에 심혈관 오가노이드를 메시(mesh) 크기 100 μm와 200 μm의 스트레이너를 사용하여 < 100 μm, 100 - 200 μm 및 > 200 μm의 크기로 선별하여 군을 나눈 뒤 각각 30일까지 배양하여 특성을 확인하였다 (도 3A). 그 결과, 배양 7일째에 < 100 μm, 100 - 200 μm 및 > 200 μm의 각 군의 CO의 평균 직경은 각각 80.1 μm, 152.4 μm 및 279.7 μm로 나타났으며, 평균 개수는 각각 22.1, 42.0 및 6.8개로 나타났다 (도 3A 및 B). 배양 30일째, 박동하는 인간 배아 줄기세포 유래 심혈관 오가노이드의 각 군 (< 100 μm, 100 - 200 μm 및 > 200 μm)의 평균 백분율은 각각 27.5%, 65.0% 및 7.5%로 나타났다 (도 3D).
2-3. 심혈관 오가노이드의 분화 효율, 심근세포 타입 및 특성 확인
상기 실시예 2-1에서 상대적으로 줄기능이 높은 2일간 배양된 세포 응집체 및 줄기능이 낮은 5일간 배양된 세포 응집체를 통해 각각 분화된 인간 다능성 줄기세포 유래 심혈관 오가노이드 (100 - 200 μm 크기로 선별한 심혈관 오가노이드)를 각각 H-CO (초기 세포 응집체 유래 CO) 및 L-CO (후기 세포 응집체 유래 CO)라고 명명하고, 이의 분화 효율, 심근 타입 및 구조를 확인하였다. H-CO 및 L-CO의 평균 박동 백분율을 분화 10일부터 30일까지 조사한 결과, 점차 비율이 증가하는 것으로 나타났으며, 분화 10일 및 15일에 L-CO보다 H-CO의 박동율이 더 높은 것으로 나타났고, 분화 20일 및 30일에는 유사한 것으로 나타났다 (도 4D). 또한, 중합효소연쇄반응, 웨스턴블롯 및 면역형광염색법으로 H-CO 및 L-CO의 심근세포의 타입을 확인한 결과, H-CO에서 심실타입 심근세포 마커인 MLC2v 및 심방타입 심근세포 마커인 MLC2a의 발현이 증가하였으나, L-CO에서는 노달타입 심근세포 마커인 TBX18의 발현이 증가하는 것으로 나타나 (도 4E 내지 G), H-CO가 주로 심실 유사 및 심방 유사 심근세포로 구성되고, L-CO는 노달타입의 심근세포로 구성된 것을 알 수 있다. 아울러, 심장의 특이적 구조인 챔버의 형성을 확인한 결과, H-CO가 L-CO에 비해서 마이크로 챔버의 형성이 증가하는 것으로 나타났다 (도 5A 및 B).
이를 통해, 인간 다능성 줄기세포 유래 심장 발생 및 심장 조직 모사 마이크로 심실타입의 심혈관 오가노이드를 제조한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. CO의 구조적, 대사적 성숙도 및 심근세포 사이의 접합부 확인
상기 실시예 2에서 제조한 성숙 심실타입의 심혈관 오가노이드의 구조적 성숙도를 평가하기 위해, 30일째에 투과전자현미경을 통해서 근절(sarcomere) 및 미토콘드리아의 미세 구조를 조사하였다. 그 결과, H-CO에서 L-CO에 비해 더 뚜렷한 Z-선(Z-line), 배열된 미토콘드리아 및 조직화된 근절이 관찰되었고, H-CO에서 근절의 평균 길이 (1.6 μm 대 1.1 μm) 및 너비(1.4 μm 대 0.6 μm)가 L-CO에 비해 증가하는 것으로 나타났다 (도 6A 내지 C 및 도 7). 또한, 심장 수축 및 이온 채널 신호전달을 담당하는 T-세관(T-tubule) 형성은 L-CO에 비해 H-CO에서 더 증가한 것으로 나타났다 (도 6A). 또한, 면역형광염색법을 이용하여 CAV3+ 및 JPH2+인 심근이 L-CO보다 H-CO에서 더 균일하고 높게 발현되었으며. cTnT, cTnI, CAV3 및 JPH2의 유전자 및 단백질 발현은 L-CO보다 H-CO에서 현저하게 높게 나타났다 (도 6D 내지 F). 또한, 대사 에너지를 조절하는 미토콘드리아의 성숙도를 평가를 위해 투과전자현미경을 이용하여 미토콘드리아의 구조를 확인한 결과, L-CO에 비해 H-CO에서 미토콘드리아의 구조가 더 발달한 것으로 나타났으며 (도 6G), 미토콘드리아의 수, 크기 및 크리스타(crista) 형성이 H-CO에서 L-CO에 비해유의적으로 더 증가한 것으로 나타났다 (도 6H 내지 J). 미토콘드리아의 활성을 확인하기 위하여 미토트래커(mitotracker) 활성을 분석한 결과, L-CO에 비해 H-CO에서 더 증가함을 확인하였다 (도 6K 및 J). H-CO 및 L-CO에서 대사 활성 마커의 발현을 중합효소연쇄반응 및 웨스턴 블롯을 통해 비교 분석한 결과, 대사 활성 마커인 PGC1α, CPT1β 및 TFAM 발현이 H-CO에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다 (도 6M 및 N). 또한, L-CO와 달리 H-CO에서 부착연접(adherence junction), 간극연접(gap junction) 및 데스모솜(desmosome)을 포함하는 고도화/조직화된 삽입된 디스크(intercalated disc)가 확인되었다 (도 8A). 아울러, 면역형광염색법 분석을 통해 갭 접합 마커인 Cx43의 발현을 확인한 결과, Cx43가 H-CO에서는 심근세포 접합부에서 고르게 발현되는 반면, L-CO에서는 부분적으로 발현되는 것을 확인하였고 (도 8B), Cx43의 유전자 및 단백질의 발현 또한 H-CO에서 L-CO보다 증가하는 것으로 나타났다 (도 8C 및 D).
이를 통해, 본 발명의 체내 심장 발생 모사 전략을 통해 구축한 심혈관 오가노이드가 미토콘드리아의 구조적 및 기능적으로 성숙하고 조직화 및 배열된 근육조직이 형성된 것을 확인하였다.
실시예 4. CO의 기능적 성숙도 및 심근세포 타입별 활동전위 분석
상기 실시예 2에서 제조한 심혈관 오가노이드의 기능적 평가를 위해, 심장 박동성 평가 및 전기생리적 반응성 평가를 진행하고 이미징 분석 및 그래프 분석을 수행한 결과, H-CO는 L-CO에 비해 박동 패턴이 크고 느린 반면, L-CO는 박동 패턴이 작고, 빠른 것으로 나타났다 (도 9A 및 B, 도 10). 또한, H-CO에서 최대박동 사이의 기간(peak to peak duration) 및 박동지속기간(contraction relaxation duration)이 증가하는 것을 확인하였다 (도 9E 및 F). 반면, 분당 심근세포 박동수(beat per minute)는 L-CO에서 증가하는 것을 확인하였다 (도 9D). 또한, H-CO는 모두 심실세포 타입의 심근세포로 분화한 반면, L-CO는 심실타입, 심방타입 및 노달타입의 심근세포가 모두 포함되어 있는 것으로 나타났다 (도 9G 및 H). 아울러, H-CO는 L-CO에 비해 진동수가 낮고, 심장조기 박동이 높은 것을 확인하였다 (도 9 I 내지 K, 도 11).
이를 통해, 본 발명의 체내 심장 발생 모사 방법을 통해 구축한 심혈관 오가노이드가 기능적으로도 성숙한 심실타입으로 분화되었음을 확인하였다.
실시예 5. CO의 혈관 네트워크 형성 평가
상기 실시예 2에서 제조한 심혈관 오가노이드의 혈관 네트워크 형성을 평가하기 위해, 구조적 분석 및 혈관 관련 유전자 발현을 확인하였다. 그 결과, TIE2 및 CD117은 L-CO에서 더 증가한 반면, CD31, vWF, 및 혈관 타입별 유형 마커인 EFNB2, EPHB4 및 PROX1은 L-CO에 비해 H-CO에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다 (도 12A 내지 C). 또한, 면역형광염색법을 통해 H-CO에서 cTnT 및 CD31의 발현이 L-CO에 비해 증가하는 것을 확인하였고, 정량적 평가를 통해 혈관 면적, 접합 밀도 및 평균 혈관 길이도 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다 (도 12D 내지 G). 또한, H-CO에서 CD31+ 및 vWF+의 공동 발현된 부분이 증가하는 것이 관찰되었고, 혈관내피세포의 끝세포(tip cell) 및 발현 혈관 신생(sprouting angiogenesis)을 포함한 복잡한 혈관 네트워크가 형성된 거을 확인하였다 (도 12H 및 I). 또한, 면역형광염색법 및 투과전자현미경을 통해 H-CO에서 혈관 내강(lumen)이 생성되었음을 확인하였다 (도 12J 및 K). 아울러, 심근세포 및 혈관내피세포를 제외한 심장을 구성하는 세포 중 하나인 섬유아세포의 생성을 면역형광염색법 및 유전자 발현분석을 통해 확인한 결과, H-CO 및 L-CO에서는 차이가 없는 것으로 나타났다 (도 13).
실시예 6. CO의 혈관 성숙도 평가
상기 실시예 2에서 제조한 심혈관 오가노이드의 혈관 성숙도를 평가하기 위해, 혈관을 구성하는 다양한 세포의 형성을 평가한 결과, CD31의 발현이 나타나는 주변부로 혈관주변세포 마커인 PDGFRβ 및 혈관평활근세포 마커인 αSMA가 발현되는 것을 확인하였다 (도 14A 및 B). 또한, 투과전자현미경을 통해 혈관의 내강 형성, 밀착연접 및 기저막으로 형성된 층이 확인되었다 (도 14C). 아울러, H-CO 및 L-CO의 혈관화 관련 유전자 및 단백질의 발현을 비교 분석한 결과, PDGFRβ, CALPONIN1, COL4A1, COL4A2 및 α-SMA의 발현이 L-CO에 비해 H-CO에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다 (도 14D 및 E).
이를 통해, 혈관내피세포를 공배양 하거나, 외인성 혈관 유도 인자를 처리하지 않고 심장 발생을 모사하는 본 발명의 자가조립화 심장 모사 방법을 통해 혈관화된 심장 오가노이드를 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. 마이크로 심혈관 오가노이드의 심실 성숙 및 혈관 생성 분화 기전 분석
본 발명의 심혈관 오가노이드의 심근세포 성숙 및 혈관 네트워크 형성에 관여하는 유전자 신호 기전 경로를 확인하기 위해, H-CO 및 L-CO의 분화유도 후 5일, 15일 및 25일에 관련 전사체를 분석하였다 (도 15A 및 B). GO 분석 결과, 심실세포 성숙에 관여하는 유전자 및 혈관 네트워크 형성과 관련된 유전자의 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 15C). 또한, 히트맵(heatmap) 분석 결과, 심실, 심근 및 심장의 구조적 성숙, 대사 성숙, 심장세포 접합, 심장 전도 및 칼슘 채널 활성, 혈관 발달, 혈관 형태 형성, 및 혈관 내강화가 15일 및 25일에 H-CO에서 L-CO보다 증가하는 것으로 나타났다 (도 15D 및 E). 또한, GO(gene ontology) 분석을 통해 심근 성숙 및 혈관 생성의 주요 신호 기전 경로 분석한 결과, 세포외 기질, 인테그린 신호 경로, 국소부착, TGFβ에 대한 반응 및 혈관 신생에 대한 유전자 신호 기전 경로가H-CO에서 L-CO에 비해 증가하는 것으로 나타난 반면 (도 15F), 신경계 발달, 세포 주기 및 DNA 복제에 대한 유전자 신호 기전 경로는 감소되는 것으로 나타났다 (도 15G). 또한, 히트맵을 통해 분석된 주요 유전자 신호 기전 경로의 관련 유전자 발현은 15일 및 25일에 H-CO에서 L-CO에 비해 증가하는 것으로 나타났다 (도 15H). 또한, 유전자 네트워크 분석(network analysis)을 통해 심실세포 성숙과 혈관 네트워크 형성 사이에 세포외 기질, 인테그린, 국소부착, TGFβ 신호전달 및 혈관 신생의 분자 네트워크가 공유됨을 확인하였다 (도 15I). 이에, 해당 신호 경로를 RNA-Seq 및 중합효소연쇄반응 분석을 통해 해당 신호 경로를 추가로 검증한 결과, RNA-Seq 결과에서, 세포외 기질 유전자, 인테그린 유전자, TGFβ 신호전달 및 혈관 신생 유전자의 발현이 15일 및 25일에 H-CO가 L-CO에 비해 증가하였으며 (도 16A), RNA-Seq 분석을 통해 선별된 유전자 중 세포외 기질 유전자 (COL3A1, LAMA5, LAMB1), 인테그린 유전자(ITGA3), TGFβ 신호전달 경로 유전자 (PITX1 및 PITX3) 및 혈관 신생 유전자 (FGFR4)가 L-CO에 비해 H-CO에서 증가하는 것을 중합효소연쇄반응 분석을 통해 확인하였다 (도 16B).
실시예 8. CO에서 심근 성숙 및 혈관 네트워크 형성 관련 신호 기전 분석
상기 실시예 7에서 전사체 로파일링을 통해 선별한 유전자의 단백질 발현을 웨스턴블롯을 통하여 검증하였다. 그 결과, 세포외 기질 관련 단백질 (COL1A, LaminA 및 FN1) 및 인테그린 관련 단백질 (ITGB1, ITGB3 및 ITGB4)은 15일 및 25일에 L-CO에 비해 H-CO에서 현저하게 증가하였으며 (도 16C), Rho 관련 단백질 키나아제인 ROCK1, pFAK 및 LIMK1 발현이 L-CO에 비해 H-CO에서 15일 및 25일에 증가하였다. 반면, pLIMK는 25일째에만 증가하는 것으로 나타났다. 또한, pCofilin은 L-CO에 비해 H-CO에서 15일 및 25일째 모두 증가했지만, pRAC 및 pMLC는 차이가 없는 것을 확인하였다 (도 16D). 이러한 결과는 세포외 기질-인테그린을 통한 ROCK1-pFAK-pLIMK-pCofilin 경로의 활성화가 심근세포의 성숙에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 또한, TGFβ 슈퍼 패밀리(superfamily)에 속하며 포유류의 심장 발달에서 좌우 비대칭을 조절하는 것으로 알려진 LEFTY 및 NODAL 신호의 좌-우 신호 경로의 다운스트림인 PITX2는 H-CO와 L-CO에서 발현 차이가 없는 것으로 나타났으며, pSMAD1/5는 검출되지 않았다 (도 16E). 또한, 전사체 프로파일링 분석을 통해 선별한 혈관 네트워크 형성에 관여하는 신호전달 경로 유전자를 웨스턴블롯으로 분석한 결과, 15일 및 25일에 H-CO에서 PDGFRα, PDGFRβ, VEGFR2, pPDGFRα, pVEGFR2 및 peNOS 발현이 L-CO에 비해 증가하였다. 또한, HIF2A 발현은 25일에 증가하였다 (도 16F).
결론적으로, ROCK-pFAK-pLIMK-pCofilin, LEFTY-NODAL, pPDGFRα, pPDGFRβ, pVEGFR 및 peNOS의 신호전달 경로가 세포외 기질-인테그린 상호작용에 의해 활성화되고 혈관화된 심장 오가노이드에서 심근세포의 성숙 및 혈관 네트워크 형성에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.
실시예 9. 유도 만능 줄기세포 유래 CO 제조 및 분석
본 발명의 심혈관 오가노이드의 구축법이 인간 배아 줄기세포뿐만 아니라, 인간유도 만능 줄기세포에서도 동일한 심혈관 오가노이드를 생성하는지 확인하기 위해, 인간 유도 만능 줄기세포를 이용하여 상기 실시예 2의 방법으로 심혈관 오가노이드를 제조하고 심근세포, 혈관내피세포 및 섬유아세포와 같은 심장 구성세포로의 분화 및 성숙도를 분석하고, H-CO와 L-CO를 형광면역염색법을 통하여 MLC2v+, CD31+ 및 FSP-1+의 세포 비율을 조사하였다.
그 결과, MLC2v+ 심근세포 및 CD31+ 혈관내피세포의 비율은 L-CO보다 H-CO에서 증가한 반면, FSP-1+ 섬유아세포의 비율은 H-CO 및 L-CO에서 유사한 것으로 나타났다 (도 17A). 또한, MLC2v 및 MLC2a의 발현은 L-CO보다 H-CO에서 증가하였으며, TBX18 발현은 L-CO에 비해 H-CO에서 증가하였다 (도 17B). 또한, cTnT, cTnI, CAV3, JPH2, CPT1β 및 Cx43와 같은 심장 분화, 성숙 및 대사 관련 유전자의 발현이 L-CO에 비해 H-CO에서 증가된 것을 확인하였다 (도 17C 내지 E). 또한, CD31, vWF, PDGFRβ, αSMA 및 COL4A1 등 혈관 네트워크 형성을 위한 유전자의 발현이 L-CO에 비해 H-CO에서 증가된 것을 확인하였다 (도 17F). FSP-1의 발현은 H-CO와 L-CO에서 차이가 없었다 (도 17G). 따라서 본 발명에서 확립한 성숙한 심혈관 오가노이드 분화 프로토콜이 인간 배아 줄기세포뿐만이 아니라, 인간 유도 만능 줄기세포에도 보편적으로 적용 가능함을 확인하였다.
본 발명은 ROCK-pFAK-pLIMK-pCofilin, LEFTY-NODAL, pPDGFRα, pPDGFRβ, pVEGFR 및 peNOS 신호전달 경로가 세포외 기질-인테그린 상호작용에 의해 활성화되고 인간 다능성 줄기세포 유래 혈관화된 심장 오가노이드에서 심근세포의 성숙 및 혈관 네트워크 형성을 유도하는 것을 확인하였다 (도 18).

Claims (12)

  1. a) 인간 다능성 줄기세포를 분주 및 배양하여 세포 응집체를 형성하는 단계;
    b) 세포 응집체를 분화시켜 심혈관 오가노이드를 제조하는 단계; 및
    c) 심혈관 오가노이드를 크기에 따라 선별하여 배양하는 단계를 포함하는 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 인간 다능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs) 또는 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPSCs, 역분화 줄기세포)인, 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 0.5×105개/cm2 내지 3×105개/cm2의 밀도로 분주되는, 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 단계 a)의 배양은 1 내지 3일 또는 4 내지 6일 동안 수행되는, 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 단계 c)에서 100 내지 200 μm의 크기의 오가노이드를 선별하여 배양하는, 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 단계 b)에서 세포 응집체는:
    ⅰ) Rho kinase 억제제가 포함된 E8 배양액에서 배양하는 단계;
    ⅱ) GSK-3 억제제 포함된 RPMI1640, B27 및 인슐린을 포함하는 배양액에서 배양하는 단계; 및
    ⅲ) IWP2 처리하고 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 심혈관 오가노이드로 분화되는, 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 단계 a)의 배양을 1 내지 3일 동안 수행한 세포 응집체가 분화되어 제조된 심혈관 오가노이드는 심실 타입의 심근세포를 포함하는, 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 단계 a)의 배양을 4 내지 6일 동안 수행한 세포 응집체가 분화되어 제조된 심혈관 오가노이드는 노달 타입의 심근세포를 포함하는, 심혈관 오가노이드를 제조하는 방법.
  9. 제 1항의 방법으로 제조된 심혈관 오가노이드.
  10. 제 9항에 있어서,
    a) 인간 다능성 줄기세포를 분주하고 1 내지 3일 동안 배양하여 세포 응집체를 형성하는 단계;
    b) 세포 응집체를 분화시켜 심혈관 오가노이드를 제조하는 단계; 및
    c) 심혈관 오가노이드를 크기에 따라 선별하여 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 심혈관 오가노이드.
  11. 제 10항에 있어서, 4 내지 6일 동안 배양된 세포 응집체 유래 심혈관 오가노이드에 비해 CD31, vWF, EFNB2, EPHB4, PROX1, PDGFRα, PDGFRβ, CALPONIN1, COL1A, COL3A1, COL4A1, COL4A2, α-SMA, LAMA5, LAMB1, ITGA3, ITGB1, ITGB3, ITGB4, PITX1, PITX3, FGFR4, LaminA, FN1, ROCK1, LIMK1, pFAK, pPDGFRα, pLIMK, pCofilin, VEGFR2, pVEGFR2 또는 peNOS의 발현이 증가되는, 심혈관 오가노이드.
  12. 제 9항에 있어서, 혈관화된 성숙한 심실타입 심혈관 오가노이드인, 심혈관 오가노이드.

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