JP6855513B2 - 哺乳類由来細胞のリプログラミング方法 - Google Patents
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Description
神経前駆細胞の誘導能を有するリプロソームを得るために、1×106個のHDFにUltraRepro 1001(STEMON Inc.、Seoul、Republic of Korea)を用い、20KHz、1.0W/cm2の超音波刺激を5秒間、直接加えた(以下、このように刺激を受けたHDFをUHDFと称する)。2×105個のUHDFを35−mmペトリ皿に超音波処理の施された(20KHz、5.0W/cm2、10分)hNSC培地とともに1日培養した。前記UHDFを培養した培養培地から、次のようにリプロソームを分離した:培養培地を3,000×gで20分間遠心分離することで細胞デブリ及び死細胞を除去した後、上澄み液を0.22−mmのフィルター(Minisart(登録商標)Syringe Filter、Sartorius、Goettingen、Germany)に通過させた。通過して出てきた培地を、Amicon(登録商標)Ultra−15 100,000 kDa device(Millipore、Billerica、MA、USA)に入れて14,000×gで20分間遠心分離することで、リプロソーム(iExo)を濃縮した。
脂肪細胞の誘導能を有するリプロソームを得るために、1×106個のHDFにUltraRepro 1001(STEMON Inc.、Seoul、Republic of Korea)を用い、20KHz、1.0W/cm2の超音波刺激を5秒間、直接加えた。2×105個のUHDFを35−mmペトリ皿に超音波処理の施された(20KHz、5.0W/cm2、10分)幹細胞用の脂肪細胞の分化誘導培地(MesenCultTM adipogenetic Differentiation Medium、Stemcell technologes)とともに1日培養した。このようにUHDFを培養した培養培地から、実施例1と同様なリプロソームの分離プロセスを経てリプロソームを分離した。
肝細胞の誘導能を有するリプロソームを得るために、1×106個のHDFにUltraRepro 1001(STEMON Inc.、Seoul、Republic of Korea)を用い、20KHz、1.0W/cm2の超音波刺激を5秒間、直接加えた。2×105個のUHDFを35−mmペトリ皿に超音波処理の施された(20KHz、5.0W/cm2、10分)肝細胞の培養培地(HCMTM hepatocyte culture medium、Lonza)とともに1日培養した。このようにUHDFを培養した培養培地から、実施例1と同様なリプロソームの分離プロセスを経てリプロソームを分離した。
毛髪再生能を有するリプロソームを得るために、1×106個のHDFにUltraRepro 1001(STEMON Inc.、Seoul、Republic of Korea)を用い、20KHz、1.0W/cm2の超音波刺激を5秒間、直接加えた。2×105個のUHDFを35−mmペトリ皿に超音波処理の施された(20KHz、5.0W/cm2、10分)毛乳頭細胞の培養培地(Dermal Papilla cell medium、PromoCell)とともに1日培養した。このようにUHDFを培養した培養培地から、実施例1と同様なリプロソームの分離プロセスを経てリプロソームを分離した。
創傷治癒能を有するリプロソームを得るために、1×106個のHDFにUltraRepro 1001(STEMON Inc.、Seoul、Republic of Korea)を用い、20KHz、1.0W/cm2の超音波刺激を5秒間、直接加えた。2×105個のUHDFを35−mmペトリ皿に超音波処理の施された(20KHz、5.0W/cm2、10分)胚性幹細胞の培養培地(DMEM/F12、15%FBS、2mM GlutaMAX、0.1%NEAA、0.1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1mM β−メルカプトエタノール、1000 unit/mlの白血病抑制因子(LIF))とともに1日培養した。このようにUHDFを培養した培養培地から、実施例1と同様なリプロソームの分離プロセスを経てリプロソームを分離した。
神経前駆細胞の誘導能を有するリプロソームの分泌を誘導するために、実施例1に基づいてHDFを超音波刺激に露出した後(UNDF)、超音波処理を施したヒト神経幹細胞培地(hNSC培地)で1日培養した。1日に掛けて培養した後、エキソソーム特異的マーカーであるCD63を用い、NHDFに比べてUHDFに多量の小胞体が誘導されたことを確認した(図1b)。UHDFを培養した培地内の誘導されたエキソソーム(iExo)とNHDFから分泌されたエキソソーム(nExo)とを実験例1のリプロソームの分離方法で分離した結果、透過電子顕微鏡の画像に示すように、いずれも一般的なエキソソームの小胞性構造を有していることが観察された(図1a)。ナノ粒子の追跡分析の結果、iExoの粒子のサイズは、約50〜200nmの範囲に分布しており、平均で155.6±4.2nmであった(図1c)。50〜200nmのサイズのiExoは9×108個であり、nExoよりも3.2倍高い数値であった(図1d)。このような結果は、HDFに超音波を加えることでエキソソームを効率的に誘導することができることを示す。このようなiExoの分泌量は、超音波処理を施した後、培養時点を基準に1日目に最も量が多く、時間の経過とともに減少する傾向を示したが、それでも分析した1、3、5日目の分泌量のいずれにおいてもnExoより高いことが確認された(図1e)。
リプロソームによる神経表現型の方向への細胞リプログラミングの誘導可不可を確認するために、本発明の発明者らは、iExoがHDF内へ伝達されるかを確認した。iExoを親油性のトレーサーであるDiD(DiD−labeled iExo)で標識した後、HDFに処理してから1日培養した。DiDで標識されたiExoを、iExo処理済みのHDFの細胞から確認することができた(図3c、左側のパネル)。さらに、iExo内部のリプログラミング因子が伝達されているか否かを確認するために、完全なHDFをCy5.5標識済みのpoly(A)27で標識した後、UHDFを製造するプロセスを経て、poly(A)27−Cy5.5を含むエキソソーム(Cy5.5−exo)が誘導されるようにした。HDFをCy5.5−exoを含むiExoで処理し、1日培養した後、Cy5.5−exoがHDFの細胞質から観察された(図3cの右側のパネル)。興味深いことに、Pax6の発現の増加は、iExoを処理したHDFから処理後の24時間後に誘導されており、これは、リプロソームがHDF内へ高効率で伝達され、入ることを意味する。
リプロソームによる迅速な細胞リプログラミングが行われるメカニズムを解明するために、本発明の発明者らは、細胞のストレスによる遺伝子発現の後成的調節に注目した。興味深いことに、iExoには、ヒストン修飾とMAPK(mitogen−activated protein kinase)経路関連遺伝子に関連するmRNA及びタンパク質が含まれていた(図4a)。次に、iExoが標的細胞のMAPKのシグナル伝達経路を刺激することで、クロマチンリモデリングを誘導することができるか否かを確認した。ウェスタンブロッティング及び流動細胞分析の結果、iExoを処理した1日後から、HDFではp38、Erk、及びMsk1の発現が急激に増加した(図4b、c)。また、MAPKのシグナル伝達経路のp38及びErkの阻害剤であるSB203580及び/またはU0126をiExo−HDFに処理した場合には、各標的タンパク質及び前記シグナル伝達経路の下流(downstream)タンパク質であるMsk1と、Sox1、Sox2、Pax6、及びNestinとなどのNPC特異的遺伝子及びタンパク質の発現が有意に減少することが確認された(図4d)。このような結果は、リプロソームがクロマチンリモデリングを介して急速にrNPCを誘導するために、MAPKのシグナル伝達システムが重要なメカニズムとして働くことを示す。さらに、iExoの処理後、3日目のHDFの核において、局部クロマチン密度及びヒストン修飾に示された変化を追跡した。局部クロマチン密度は、GFP(green fluorescent protein)で標識されたH2Bタンパク質(H2B−GFP)をトランスフェクションさせることで確認した。iExoの処理後、時間の経過に伴ってH2B−GFP分布が広がる様相が示された(図4e)。また、HP1α(heterochromatin protein 1 α)の核内の発現及び阻害性ヒストン修飾であるH3K27me3が減少し、iExo処理後、時間経過に伴って活性化ヒストン修飾であるH3K4me324がHDFにおいて増加した(図4f)。特に、神経発生関連遺伝子のDNAメチル化プロファイルを確認したところ、メチル化が減少していることが分かった(図4g)。前記のような結果は、リプロソームが、MAPKのシグナル伝達システムの活性化及びクロマチンリモデリングのみならず、いくつかの後成的調節子を介してNPCと類似の細胞への迅速なリプログラミングを誘導することを示す。
rNPCが有する神経細胞への分化能を評価するために、rNPCがニューロン、星状細胞、及び乏突起膠細胞のような神経系に分化することができるか否かを確認した。5日目のrNPCスフェロイドを、近年発表された神経分化プロトコルに基づいてゼラチンコートされた培養プレートに培養した。神経分化から4週間後、分化した細胞において、Map2とTuj1(ニューロンのマーカー)、Gfap(星状細胞のマーカー)、及びO4(乏突起膠細胞のマーカー)の発現が確認された(図5a)。Map2、Tuj1、Gfap、及びS100b(星状細胞のマーカー)、Mbp(乏突起膠細胞のマーカー)、and Oligo1(乏突起膠細胞のマーカー)のqRT−PCR分析の結果からもまた、rNPCが成功的に神経細胞へと分化したことが示された。次に、rNPCから派生したニューロンの機能的特性を、全細胞パッチクランプ記録を介して確認した。まず、カリウムイオンチャンネル(EAG1、Kv4.3、及びKv7.2)及びナトリウムイオンチャンネル(Nav1.3、Nav1.6、及びNav1.7)に関する遺伝子発現が、rNPCからニューロンに分化した後、大きく増加したことが確認された。電流クランプの際に、NPCから派生したニューロンでは、内向きナトリウム電流及び外向きカリウム電流を確認することができた(図5b)。また、ナトリウムイオンチャンネルの遮断剤であるTTX(tetrodotoxin)により、rNPCから派生したニューロンにおいてナトリウム電流が阻害されることが観察された。rNPCから派生したニューロンは、電流クランプに反応して活動電位を誘発した(図5c)。前記のような結果は、rNPCが多能性(multipotency)を有しており、in vitroにおいてニューロン、星状細胞、及び乏突起膠細胞に効果的に分化したことを示す。
実施例2の脂肪細胞の誘導能を有するリプロソーム誘導方法により培養したUHDFを、CD63エキソソームのマーカーに対する免疫蛍光染色によって分析した結果(このとき、対照染色は、核染色剤であるDAPIとする)、多量のエキソソームが生成されており(図6a)、前記マーカーと褐色脂肪細胞のマーカーであるUCP1の免疫蛍光染色の結果、分泌されるエキソソームでUCP1が発現していることが分かった(図6b)。実施例2の脂肪細胞の誘導能を有するリプロソームの製造方法によって取得したリプロソームの形を、Nanosight及びTEM(transmission electron microscopy)を用いて分析した結果、正常な形態のエキソソームの形が観察され(図6c)、前記リプロソームに対するRNA−Seq分析の結果、褐色脂肪細胞に関連するmRNA及びmicroRNAと脂質合成に関連するmRNAとが対照群に比べて大きく増加したことが分かった(図6d)。総合すると、実施例2のリプロソームの製造方法により、HDFから脂肪細胞の誘導能を有するリプロソームが成功的に誘導、取得されたことを確認できる。
実施例2のrBAの製造方法によって製造されたrBAを、脂肪細胞から多量発見される脂肪滴を確認できるAdipoRedで染色した結果(このとき、対照染色は、核染色剤であるDAPIとする)、AdipoRedが陰性である対照群に比べて明らかな陽性を示した(図7の上段パネル)。前記rBAを褐色脂肪細胞のマーカーであるUCP1で免疫蛍光染色した結果(このとき、対照染色は、核染色剤であるDAPIとヒトミトコンドリア抗体であるHuMitoとする)、同様に、陰性である対照群に比べて明らかな陽性を示した(図7の下段パネル)。前記のような結果は、実施例2の製造方法により製造されたリプロソーム及びこれを用いたrBAの製造方法により、HDFをrBAにリプログラミングすることができることを示している。
実施例3の肝細胞の誘導能を有するリプロソーム誘導方法により培養したUHDFを、CD63エキソソームのマーカーに対する免疫蛍光染色によって分析した結果(このとき、対照染色は、核染色剤であるDAPIとする)、多量のエキソソームが生成されており(図8a)、前記マーカーと肝細胞のマーカーであるHNF1aの免疫蛍光染色の結果、分泌されるエキソソームでHNF1aが発現していることが分かった(図8b)。実施例3の肝細胞の誘導能を有するリプロソームの製造方法によって取得したリプロソームの形を、Nanosight及びTEM(transmission electron microscopy)を用いて分析した結果、正常な形態のエキソソームの形が観察され(図8c)、前記リプロソームに対するRNA−Seq分析の結果、肝細胞に関連するmRNA及びmicroRNAが対照群に比べて大きく増加したことが分かった(図8d)。総合すると、実施例2のリプロソームの製造方法により、HDFから脂肪細胞の誘導能を有するリプロソームが生成、分泌されたことを確認できる。
実施例3のrHの製造方法によって製造されたrHを、肝細胞のマーカーであるAFP、HNF4a、CK18、及びALBで免疫蛍光染色した結果(このとき、対照染色は、核染色剤であるDAPIとする)、明らかな陽性を示した(図9)。前記のような結果は、実施例3の製造方法により製造されたリプロソーム及びこれを用いたrHの製造方法により、HDFをrHにリプログラミングすることができることを示している。
実施例4の毛髪再生能を有するリプロソーム誘導方法により培養したUHDFを、CD63エキソソームのマーカーに対する免疫蛍光染色によって分析した結果(このとき、対照染色は、核染色剤であるDAPIとする)、多量のエキソソームが生成されており(図10b)、前記マーカーと毛髪再生に重要なマーカーであるShh(Sonic hedgehog)の免疫蛍光染色の結果、分泌されるエキソソームでShhが発現していることが分かった(図10c)。実施例4の毛髪再生能を有するリプロソームの製造方法によって取得したリプロソームの形を、Nanosight及びTEM(transmission electron microscopy)を用いて分析した結果、正常な形態のエキソソームの形が観察され(図10a)、前記リプロソームに対するRNA−Seq分析の結果、毛髪の再生に関連する毛髪組織の発生、発毛の促進、Jak−Statのシグナル伝達システム及びWntのシグナル伝達システムのmRNA及びmicroRNAが対照群に比べて大きく増加したことが分かった(図10d)。総合すると、実施例4のリプロソームの製造方法により、HDFから毛髪再生能を有するリプロソームが成功的に誘導されたことを確認できる。
実施例4の毛髪再生能を有するリプロソームの製造方法に基づいて取得したリプロソームを脂質マーカーであるDiDで染色した後、ヌードマウス及び対照群であるC57マウスの表皮に塗布した結果、リプロソームが毛穴内に浸透したことが分かった(図11a−b、対照染色は、核染色剤であるDAPIとする)。背側(dorsal side)の毛髪を除去したC57マウス及びヌードマウスの皮膚に、D−PBS培養液に希釈したリプロソームを1×109、1×1010、及び1×1011個/mlの濃度でそれぞれ塗布し、1週間及び2週間後に、それぞれその効果を確認したところ、ヌードマウスの場合は、リプロソームを処理していない群では、目視で毛髪が観察されないのに対し、リプロソームを処理した群の場合、1週目から複数の毛髪が伸びていることが確認され、C57マウスは、対照群に比べて、複数の毛髪が長く伸びていることが確認された(図13a−b)。リプロソームを2週間処理した群は、対照群に比べて毛髪が3倍以上長く伸び、H&E染色の結果、リプロソームを処理した皮膚から毛包を示す濃い紫の染色部分が複数観察され(図12a−b)、皮膚層の全体、特に皮下組織(subcutis)において、対照群に比べてはるかに多い数の毛包が確認されており(図12c−d)、毛髪生成が促進されたことを組織レベルでも確認することができた。また、リプロソーム処理群は、対照群に比べて毛包細胞の再生に関連するタンパク質であるβ−Catenin、Shh、及びKi67の発現が増加したことを組織の免疫蛍光染色によって確認し(図10c−d)、発毛促進因子であるShh、β−Catenin、KRT−25、VCAN、Gli1、Lef1、Pct1、Tyrp1、Tyr、Mitf、及びDCTのmRNA発現が増加し、発毛抑制因子であるSfrp4及びDKKのmRNA発現が減少したことをqRT−PCRにより確認した(図11e−f)。総合すると、毛髪再生能を有するリプロソームは、実験例9に基づくin vitroの実験で予測されたように、in vivoにおいても、毛髪の再生に優れた効果を示すことを意味する。
実施例5の組織再生能を有するリプロソームの製造方法により培養したUHDFを、CD63エキソソームのマーカーに対する免疫蛍光染色によって分析した結果(このとき、対照染色は、核染色剤であるDAPIとする)、多量のエキソソームが生成されていることが分かった(図14a)。前記細胞の培養液から分離したエキソソーム(リプロソーム)をqRT−PCRを用いて分析した結果、創傷治癒に関連する細胞外基質(extracellular matrix)に関する遺伝子であるCollagen 1α(Col1α)、Collagen 3α(Col3α)、及びElastin(ELN)と、細胞増殖に関する遺伝子であるProliferating cell nuclear antigen(PCNA)、N−Cadherin、及びCyclin−D1となどの発現が、対照群から分離したエキソソームに比べて高くなっていることが分かった(図14b)。また、RNA−seqの結果、リプロソームでは、nExoに比べて創傷治癒に関する遺伝子が多く発現していることが分かった(図14c)。
実施例5の組織再生能を有するリプロソームの製造方法により製造したリプロソームをHDFで処理し、これに対してリプロソームの濃度による効果を確認した。まず、細胞増殖効果を関連マーカーであるKi67に対する免疫蛍光染色によって分析した結果、実験群は、対照群に比べて前記マーカーの発現がより高く、特に5×1011/ml及び10×1011/mlの濃度のリプロソームで処理したとき、より優れた効果が示されることが分かり、細胞数がより多く増加することが確認された(図15a−b)。次に、前記HDFをプレートに満杯に培養した後、20μl yellow tipで線を引いて細胞間の距離を離隔してからリプロソームを処理して培養するwound healing assayを行い、この結果、リプロソーム処理群において、空き領域が相対的に迅速に埋まることが示されており(図15c−d)、対照群の細胞移動率が高いことを確認できた。
超音波で刺激していないHDF(NHDF)を、2mM GlutaMAXTM−I Supplement(Gibco)、6U/ml heparin(Sigma−Aldrich)、及び200μM ascorbic acid(Sigma−Aldrich)で含むhNSC培地(StemPro(登録商標)NSC SFM、Gibco)、もしくは繊維芽細胞培地(10%fetal bovine serum(Gibco)及び1%penicillin/streptomycin(Gibco)を含むDMEM(Gibco))に培養した。前記NHDFを培養した培養培地からエキソソーム(nExo)を分離する際には、実施例1のリプロソームの分離方法と同様のプロセスを経た。
1×105のHDFを35−mmペトリ皿にシードし、1日培養した後、培地を比較例1に基づいて取得したエキソソームを含む培地に変えて、5日間培養した。このとき、エキソソームを含む培地は、各実験群と一致させ、rNPC、rBA、及びrHの対照群に対して、それぞれhNSC培地、幹細胞の脂肪細胞の分化誘導培地、及び肝細胞の培養培地を使用しており、培養培地は、2日ごとに交換した。
Claims (18)
- 哺乳類由来細胞のリプログラミングを誘導するリプロソームを含む組成物を第1の培養培地に混入するステップと、
前記混入された培地から哺乳類由来第1の細胞を培養するステップと、
前記培養後、第2の細胞を収得するステップと、を備える
哺乳類由来細胞をリプログラミングする方法であって、
前記リプロソームは哺乳類由来細胞に超音波刺激を与え、細胞のない培養培地に超音波刺激を与えるステップと、
前記超音波刺激された細胞と前記超音波刺激された培養培地とを混合した混合物を一定時間培養するステップと、
前記培養後の混合物を遠心分離して上澄み液を取得するステップと、
前記上澄み液をフィルターでろ過し、ろ液を取得するステップと、
前記ろ液を濃縮するステップと、を備える製造方法で製造され、
前記リプロソームは、直径が50〜200nmであり、前記組成物中に10 7 〜10 15 個/mlの濃度で含まれ、
前記リプロソーム中の全RNAに対して、小型RNA(small RNA)の割合が40%以上であり、前記小型RNAにおいて、マイクロRNA(miRNA)の割合が40%以上であり、
前記混入された培地は第2の細胞が維持かつ増幅することができる培養培地であり、
前記リプロソームは、クロマチンリモデリング(chromatin remodeling)に関与する遺伝子のRNAを含み、前記遺伝子は、MAPK(mitogen−activated protein kinase)のシグナル伝達システム上のリン酸化酵素の遺伝子と、ヒストン修飾活性を有する遺伝子とを含む
ことを特徴とする方法。 - 前記MAPKのシグナル伝達システム上のリン酸化酵素の遺伝子は、BRAF、MAP2K3、MAP3K10、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K7、MAPK12、RPS6KA4(MSK2)、TAOK1、及びTAOK2で構成された群から少なくとも1つ以上選択される
請求項1に記載の方法。 - 前記ヒストン修飾活性を有する遺伝子は、ASH1L、CREBBP、DOT1L、EP300、GTF3C1、KAT2A、KAT6B、KDM1A、KDM3B、KDM6A、KMT2A、KMT2E、NCOA3、NSD1、SETD1A、及びSETD2で構成された群から少なくとも1つ以上選択される
請求項1に記載の方法。 - 前記哺乳類由来細胞は、哺乳類由来の繊維芽細胞または哺乳類由来器官内の組織細胞である
請求項1に記載の方法。 - 前記細胞のない培養培地は、胚性幹細胞培地、神経幹細胞培地、心臓幹細胞培地、毛乳頭細胞培地、間葉系幹細胞培地、骨形成培地、筋形成培地、造血幹細胞培地、ニューロン(neuron)培地、星状細胞培地、乏突起膠細胞培地、肝細胞(hepatocyte)培地、脂肪細胞培地、筋肉細胞培地、血管内皮細胞培地、膵臓β細胞培地、または心筋細胞培地である
請求項1に記載の方法。 - 前記細胞のない培養培地は、神経幹細胞培地、毛乳頭細胞培地、肝細胞(hepatocyte)培地、または、脂肪細胞培地である
請求項1に記載の方法。 - 前記細胞に与えられる超音波刺激は、10〜30KHz、0.5〜3W/cm2において1〜10秒に掛けて行われる
請求項1に記載の方法。 - 前記培養培地に与えられる超音波刺激は、10〜30KHz、1〜20W/cm2において1〜20分に掛けて行われる
請求項1に記載の方法。 - 前記超音波刺激された細胞と前記超音波刺激された培養培地とを混合した混合物を一定時間培養するステップは、1〜10日に掛けて行われる
請求項1に記載の方法。 - 前記上澄み液をフィルターでろ過し、ろ液を取得するステップは、前記上澄み液をフィルターでろ過する前に、4℃以下で7日〜1ヶ月に掛けて保管するステップをさらに備える
請求項1に記載の方法。 - 前記哺乳類由来第1の細胞は、哺乳類由来の繊維芽細胞または哺乳類由来器官内の組織細胞である
請求項1に記載の方法。 - 前記第2の細胞は、万能性(pluripotency)以下の分化能を有する細胞である
請求項1に記載の方法。 - 前記第2の細胞は、胚性幹細胞、神経幹細胞、心臓幹細胞、毛乳頭細胞、間葉系幹細胞、または、造血幹細胞である
請求項1に記載の方法。 - 前記第2の細胞は、神経幹細胞、ニューロン(neuron)、星状細胞、乏突起膠細胞、肝細胞(hepatocyte)、脂肪細胞、毛包細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、角質細胞、膵臓β細胞、または、心筋細胞である
請求項1に記載の方法。 - 前記第2の細胞は、前記哺乳類由来第1の細胞とは異なる種類である
請求項1に記載の方法。 - 前記哺乳類由来第1の培養培地は、前記細胞のない培養培地と同じである
請求項1に記載の方法。 - 前記第2の細胞は、幹細胞、始原細胞(progenitor cell)、または、前駆細胞(precursor cell)であり、前記哺乳類由来第1の細胞を培養するステップは、1〜6日に掛けて行われる
請求項1に記載の方法。 - 前記第2の細胞は、ニューロン(neuron)、星状細胞、乏突起膠細胞、肝細胞(hepatocyte)、脂肪細胞、毛包細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、角質細胞、膵臓β細胞、または、心筋細胞であり、前記哺乳類由来第1の細胞を培養するステップは、10日〜60日に掛けて行われる
請求項1に記載の方法。
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