CN102363044B - 靶向线粒体的三种蒽醌类物质作为鼻咽癌放射增敏剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了三种具有蒽醌类物质的结构特征，以线粒体为靶点而发挥放射增敏作用的化合物，1，8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9，10蒽醌、1，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌和1，3，8-三甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌。这些化合物可聚集在细胞的线粒体上，对鼻咽癌CNE-1细胞具有一定生长抑制作用。当采用无细胞毒浓度的这些化合物与低剂量射线联合应用时，能增加鼻咽癌细胞对射线的敏感性，降低细胞线粒体跨膜电位，促使线粒体嵴发生肿胀，产生空泡化，出现细胞胀亡特征，从而提高放射治疗的效果。
Description
技术领域
本发明涉及三种蒽醌化合物以及这些化合物作为经线粒体介导的鼻咽癌放射增敏剂的新用途。
背景技术
鼻咽癌是我国南方地区的高发肿瘤之一，大约70％的鼻咽癌患者在治疗过程中需要用放射治疗，约有40％的患者可以用放疗根治。放射治疗在鼻咽癌治疗中的作用和地位日益突出。但由于肿瘤细胞的生物学特性及局部微环境等因素往往导致放疗疗效不尽如人意，100％接受放疗的患者需要放射增敏的辅助治疗。近年来尽管放疗技术不断提高，但鼻咽癌患者最好的5年生存率仍停留在30％～50％，放疗后的局部复发率亦高达30％～40％。复发主要与首次治疗后的残存肿瘤有关，与肿瘤细胞缺氧状态下对射线不敏感或抗拒有关。
近十几年来，肿瘤放射治疗增敏药物的研究和临床应用总体上进展缓慢，这是因为肿瘤乏氧细胞对放射治疗的抗拒性和肿瘤的侵袭性确切的分子生物学机理仍不明确，以及放射治疗增敏药物选择性和靶向性较差所致。线粒体是细胞有氧呼吸的基地和细胞能量储存的重要场所，其基因、蛋白组的状态可能影响肿瘤的治疗效果。有文献表明：线粒体DNA缺失能降低细胞对射线的敏感性，细胞的辐射敏感性需要线粒体及多种DNA聚合酶的参与。因此线粒体功能异常和线粒体DNA的缺失有可能成为放射损伤的敏感指标和放射增敏药物的靶点。目前以线粒体为靶点的放射增敏剂，未见报道。
在本发明之前，已有文献报道1，8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9，10蒽醌、1，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌和1，3，8-三甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌具有抑制多种肿瘤细胞的生长增殖能力，如口腔癌、子宫内膜癌和乳腺癌等。但这三种化合物作为经线粒体介导的鼻咽癌放射增敏剂，未见文献报道。
发明内容
本发明目的：提供三种具有蒽醌类物质的结构特征，以线粒体为靶点而发挥放射增敏作用的化合物，这些化合物通过与射线联合使用，实现在不增加辐射剂量的前题下，提高鼻咽癌放射治疗的疗效。
本发明的技术方案是：
本发明首先从多种天然植物中分离纯化出一系列具有生物还原性的药物结构特征的化合物，并针对放射增敏活性进行结构修饰，发现其中的三种蒽醌类化合物对鼻咽癌细胞具有较好放疗增敏作用。细胞学实验表明，在无细胞毒作用浓度下，三种蒽醌化合物可聚集在细胞的线粒体上，与射线联合使用，可促使线粒体脊肿胀和空泡化，引起线粒体跨膜电位下降，细胞发生胀亡，显著增强2Gy射线对鼻咽癌细胞的杀伤作用。而如果单用射线治疗，要达到相同的治疗作用，需要很高的照射剂量，而高剂量射线可导致严重的机体损伤。
具有以线粒体为靶点的三种蒽醌化合物为：
1、1，8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9，10蒽醌，分子结构式为：
2、1，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌，分子结构式为：
3、1，3，8-三甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌，分子结构式为：
本发明的优点是：1，8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9，10蒽醌、1，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌和1，3，8-三甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌可聚集在细胞的线粒体上，经体外抗肿瘤实验结果发现这些化合物对鼻咽癌CNE-1细胞具有一定生长抑制作用。当采用无细胞毒浓度的这些化合物与低剂量射线联合应用时，能增加鼻咽癌细胞对射线的敏感性，降低细胞线粒体跨膜电位，促使线粒体嵴发生肿胀，产生空泡化，出现细胞胀亡特征，从而提高放射治疗的效果。
附图说明
图1——激光共聚焦显微镜观察本发明三种蒽醌化合物在鼻咽癌细胞的线粒体上聚集图像(A为1，8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9，10蒽醌；B为1，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌；C为1，3，8-三甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌)。
图2——透射电子显微镜观察本发明的三种蒽醌化合物联合射线引起鼻咽癌细胞胀亡示意图(A为空白对照组；B为10mg.L-11，8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9，10蒽醌+2Gy；C为10mg.L-11，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌+2Gy；D为10mg.L-11，3，8-三甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌+2Gy)。
图3——透射电子显微镜观察本发明三种蒽醌化合物联合射线引起的鼻咽癌细胞线粒体嵴肿胀和空泡化示意图(A为空白对照组；B为10mg.L-11，8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9，10蒽醌+2Gy；C为10mg.L-11，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌+2Gy；D为10mg.L-11，3，8-三甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌+2Gy)。
图4——激光共聚焦显微镜观察本发明三种蒽醌化合物联合射线降低鼻咽癌细胞线粒体的跨膜电位示意图(A为对照组；B为2Gy照射组；C为10mg.L-11，8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9，10蒽醌+2Gy；D为10mg.L-11，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌+2Gy，E为10mg.L-11，3，8-三甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌+2Gy)。
具体实施方式
1、三种蒽醌化合物对鼻咽癌细胞生长抑制作用：
分别取对数生长期的鼻咽癌细胞CNE-1，胰酶消化混悬均匀，调整细胞浓度为1×105/ml，加入96孔板，每孔100μl，37℃5％CO2培养箱培养过夜，实验组分别加入含不同浓度的蒽醌化合物，各组设3个平行孔，空白对照加入等量体积的PBS。继续培养24h后，每孔加入5mg/ml MTT 20μl，37℃，5％CO2培养箱孵育4h后，弃上清，加入200μl二甲基亚砜，在490nm处测定吸光度A值。按下列公式求出生长抑制率(IR)，由IR对浓度作图，求出半数抑制浓度IC50。结果见表1。
表1 蒽醌化合物对鼻咽癌细胞CNE-1生长抑制作用
生长抑制率小于10％对应的化合物浓度称为无细胞毒作用的浓度。本发明所采用的各种化合物的浓度为5-10mg.L-1，其相应的抑制率均小于10％。
2、三种蒽醌化合物放射增敏比：
取对数生长期的鼻咽癌CNE-1细胞，胰酶消化，计数。照射剂量分别为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，根据照射剂量分别接种不同的细胞数，照射剂量为0、2、4Gy组接种细胞500个/mL，照射剂量为6和8Gy组接种细胞700个/mL。
选择完全没有细胞毒作用浓度的三种蒽醌化合物为放射增敏实验组、安卡胶囊实验组、单纯照射组及空白对照组。每组细胞平行分为三批。三种化合物和安卡胶囊作用细胞24h后，各组细胞均给予照射剂量分别为0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy。照射后所有培养液更换成无药物的培养液，将细胞移入CO2培养箱，37℃、5％CO2环境下静置培养，每日观察。
培养10天后，培养瓶中出现肉眼可见的集落，弃去培养液，PBS小心清洗两遍，加甲醇固定15分钟，弃去固定液，姬姆萨染色40min，洗去染色液，室温下空气干燥。计数50个细胞以上的集落数。
根据下列公式，计算细胞克隆形成率(plating efficiency，PE)和存活分数(survival fraction，SF)。
PE＝(克隆数/细胞接种数)×100％
SF＝某一剂量照射实验组的克隆形成率/空白对照组的克隆形成率
绘制细胞存活曲线，以照射剂量为横坐标，存活分数为纵坐标，使用多靶单击模型拟合细胞存活曲线，并计算出D0值(细胞存活曲线的直线部分下降63％所需的剂量)。根据D0值求出放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)SER＝单纯照射组D0/放射增敏实验组D0。
放射增敏作用的大小通常使用增敏比来表示，其数值越大，增敏效果越好。本发明的三种化合物其放射增敏比与临床上已使用的放射增敏剂安卡胶囊结果相似，结果见表2。
[0029]表2 蒽醌化合物对鼻咽癌细胞CNE-1放射增敏比
3、三种蒽醌化合物在细胞中的分布
取对数生长期的鼻咽癌细胞CNE-1，胰酶消化混悬均匀，调整细胞浓度为1×105/ml，加入激光共聚焦专用培养皿中。37℃5％CO2培养箱培养24小时，将本发明的三种蒽醌化合物配制成5mg.L-1的溶液，加入到细胞中孵育6小时，激光共聚焦显微镜下可见三种蒽醌化合物均具有自发荧光，可以在细胞胞浆的线粒体上聚集，其自发荧光见附图1。
4、三种蒽醌化合物联合射线对鼻咽癌细胞超微结构的影响
采用无细胞毒作用浓度(10mg.L-1)的三种蒽醌化合物作用鼻咽癌细胞24h后，给予2Gy射线照射，16h后细胞用PBS漂洗细胞表面三次，0.5％胰酶消化，细胞离心成团后，加入4℃预冷的3％戊二醛，在4℃固定过夜，弃去固定剂，用PBS浸洗2次，用4℃预冷的1％锇酸固定1h，然后用PBS浸洗2次，经丙酮、醋酸异戊酯脱水，系列梯度酒精脱水，包埋剂包埋，半超薄切片，透射电镜下观察。电镜下可见细胞体积增大，细胞内线粒体肿胀，线粒体脊呈现不完整脊肿胀，细胞胞质发生空泡化，表现为细胞胀亡形态学改变，见附图2、附图3。
5、三种蒽醌化合物对鼻咽癌细胞线粒体跨膜电位的影响
荧光染料罗丹明123(Rh123)是一种可对活细胞线粒体染色的细胞染色试剂。当线粒体膜电位存在的时候Rh123可透过细胞膜且在活细胞的线粒体内聚集，并发出黄绿色荧光。而当膜电位下降的时候，聚集的罗丹明123就减少，从而发光强度降低。无细胞毒作用浓度(10mg.L-1)的三种蒽醌化合物作用鼻咽癌细胞24h后，给予2Gy射线照射，16h后细胞用PBS洗3次，加入5mg.L-1的罗丹明123，避光37℃孵育30min，弃掉罗丹明123残液，用PBS反复洗涤3次，采用激光共聚焦显微镜扫描，荧光强度用image puls 6.0软件分析，结果列于表3和附图4。
表3 蒽醌化合物对鼻咽癌细胞线粒体跨膜电位的影响
从表3和附图4结果可见，经三种蒽醌化合物联合射线处理后的鼻咽癌细胞，与空白组、单独照射组及单独用药组比较，细胞的平均荧光强度明显下降，说明三种蒽醌化合物能降低鼻咽癌细胞的线粒体跨膜电位。
本发明解决了目前临床上使用的放疗增敏剂无选择性和靶向性的缺陷。加入小剂量的无细胞毒浓度的三种蒽醌化合物即可显著增强2Gy射线对鼻咽癌细胞的抑制作用，扩大了这些化合物的应用范围。
Claims (1)
1.靶向线粒体的三种蒽醌类化合物作为制备鼻咽癌放射增敏剂的用途，其特征在于三种蒽醌类化合物是指：1，8-二羟基-3-乙酰基-6-甲基-9，10蒽醌；1，8-二羟基-3-甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌；1,3,8-三甲氧基-6-甲基-9，10蒽醌。
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