KR102383875B1 - 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물 및 그 제조 방법과 용도 - Google Patents

에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물 및 그 제조 방법과 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물 및 그 제조 방법을 제공하는 바, 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 식I에 표시된 구조(R은 C1-5 알킬)를 갖는다. 본 발명에 언급된 방법은 합성 루트가 간단하고, 효과적으로 합성 시간을 절약하고 원가를 낮출 수 있으며, 조작이 간단하고 실시하기 쉬우며, 산업 생산에 적합하다. 실험에 의하면, 본 발명의 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 더욱 훌륭한 당뇨병 상처 유합 효과를 가지고, 당뇨병 상처 유합을 촉진하는 약물의 제조에 사용될 수 있다. 그리고, 본 발명은 혼합형 고지혈증 쥐에 대하여 약리 실험을 진행하는 것을 통하여, 본 발명의 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물이 에모딘보다 우수하고, 혈중 지질 강하 작용이 유의적이고 안전성이 훌륭하며, 약물 사용이 간단하고 편리하며, 원료 가격이 저렴하고 쉽게 구할 수 있으며, 운송 및 보관이 편리한 등 장점을 갖는다는 것을 실증하였다.
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Description

에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물 및 그 제조 방법과 용도
본 발명은 약물 합성과 의약 위생 분야에 관한 것이다. 특히 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물 및 그 제조 방법에 관한 것이고, 또한 해당 화합물의 당뇨병 상처 유합 촉진 및 혈중 지질 강하 중의 용도에 관한 것이다.
생활 수준이 향상됨에 따라, 사람들의 음식 구조에 변화가 발생하여, 콜레스테롤과 포화 지방산의 섭취가 유의적으로 증가된 반면, 운동량이 상대적으로 부족하여, 고지혈증의 발병률이 점차 상승하고 있다. 고지혈증은 혈중 지질 수준이 지나치게 높은 것을 가리키는 바, 예를 들면 혈청 중의 총 콜레스테롤(totalcholesteroltotal, TC)과 트리글리세라이드(triglyceride, TG) 및 저밀도 리포 단백질(low density lipoprotein, LDL-C)의 증가와 고밀도 리포 단백질(high density lipoprotein, HDL-C)의 감소는 직접 심각하게 인체의 건강에 위협을 주는 질환, 예를 들면 죽상동맥경화증, 관상 동맥 질환 등을 유발할 수 있다. 고지혈증은 또한 지방간, 간경화, 담석증, 췌장염, 말초혈관 질환, 고뇨산혈증 등 질환을 유발할 수 있다. 임상연구를 통해 밝혀진데 의하면, 대부분 돌연 심장사 환자들은 모두 관상 동맥 경화성 지질 이상을 가지고 있고, 또한 관상 동맥 경화성 지질 이상은 허혈성 심뇌혈관 사건 중에서 중요한 역할을 일으킬 가능성이 크다. 지질 대사 장애는 일 방면으로는 당 대사 장애를 가중시키고, 다른 일 방면으로는 당뇨병 대혈관 합병증 발생률 및 사망률을 유의적으로 증가시킨다.
임상에서 흔히 사용되는 혈중 지질 조정 약물을 대부분 화학 합성 제제이고, 장기간 복용하여야 하며, 여러 가지 스타틴계 약물, 예를 들면 삼바스타틴과 로바스타틴 등이 있고, 스타틴계 약물은 고지혈증을 치료하는 동시에 심뇌혈관 의외의 사건을 예방할 수 있다. 하지만 장기간 또는 큰 투여량으로 스타틴계 약물을 사용하면 간장 조직 세포 생화학 변화 또는 심장 횡문근융해증 등 엄중한 부작용이 초래되어, 장기간 사용이 제한을 받는다. 그러므로, 안전하고 효과적인 신형 혈중 지혈 조절 약물을 연구 개발하는 것은 아주 중요한 의미를 갖는다.
현재, 당뇨병은 전 인류의 건강을 위협하는 제3대 만성 비전염성 질환으로 되었다. 중국은 세계에서 당뇨병 환자가 가장 많은 나라로서, 2016년 중국 18세 및 이상 성인 샘플에서, 국제 최신 임상 진단 표준으로 진단한 당뇨병 추산 발병률은 이미 11.6%에 달했다. 그리고 당뇨병 환자 중에서, 약 30％-80％는 피부 손상 합병증이 있는 바, 주요한 증상으로는 족부 또는 하지 조직이 손상되고, 궤양, 감염, 유합되기 어려운 상처가 발생하고, 또한 당뇨병 족부 병변이라 불린다. 당뇨병 족부 병변은 당뇨병의 하나의 중요한 합병증으로서, 심하면 절단을 초래한다. 유행병학 조사 결과에 따르면, 당뇨병 환자의 하지 절단의 확률은 당뇨병이 없는 사람의 25배 이상이고, 일부 국가에서는 심지어 30초마다 한 명의 환자가 당뇨병으로 인하여 절단을 당하고 있다. 그리고, 당뇨병 족부 병변의 치료 비용과 간병 비용도 아주 비싼 바, 데이터에 따르면 주요한 허혈 증상이 없는 당뇨병 족부 병변의 제1 단계의 유합 치료 간병 비용은 약 16,000불이고, 주요한 허혈 증상이 겹친다면, 비용은 26,700불로 증가되며; 작은 하지 절단 후 유합의 치료 간병 비용은 약 43,000불이고, 주요 하지 절단 후의 치료 간병 비용은 63,100불로 증가되며; 개발도상국에서, 당뇨병 및 그 합병증을 치료하는 비용은 적어도 40%는 당뇨병 족부 병변의 치료와 간병에 사용된다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 당뇨병 족부 병변은 사회에 커다란 경제적 부담과 사회적 부담을 안겨주고 있으며, 당뇨병 상처 유합 장애의 문제는 시급히 해결하여야 한다.
당뇨병 환자 상처 유합 장애는 사람들의 일상 생활에 심각한 영향을 미치고, 당뇨병 상처 유합 장애를 효과적으로 예방하고 치료하는 것은 중요한 임상 의미를 갖는다. 현재 임상에서 사용하는 치료 방법은 일반적으로 지지적인 것으로서, 예를 들면 혈중 지혈 장애 조정, 빈혈 및 저알부민혈증 조정, 영양불량 상태 개선 등 전신 요법, 항감염 요법, 미소순환 개선, 신경 기능 개선 또는 영양 공급, 고압 산소 치료, 수술 치료 및 줄기세포 이식 등이 있는 바, 치료 비용이 비싸 대부분 환자들이 부담하기 어려울 뿐 아니라, 치료 효과도 별로 좋지 않다. 그러므로, 당뇨병 상처 유합을 촉진하는 유효 약물을 연구 및 개발하고, 당뇨병 상처의 주기 유합 과정을 앞당겨, 당뇨병 상처 유합 과정을 단축시키고, 장애율을 낮추는 것은 의학 분야의 중점 과제이다.
에모딘(1,3,8-트리히드록시-6-메틸안트라퀴논)은 대황속, 마디풀속, 갈매나무속의 근경과 센나 잎에 존재하는 주요한 유효 단체로서, 식물형 약물에 속한다. 최근에 많은 학자들이 에모딘 약리 작용 및 그 매커니즘에 대한 깊은 연구를 통하여, 에모딘이 혈중 지질 강하, 항균 항염, 항종양, 세균 증식 억제하여 면역력 향상, 간장 및 신장 보호 등 광범한 약리 작용을 갖고 있는 것을 발견하였다. 에모딘은 혈중 지질 강하 작용이 현재하고, 또한 독성과 부작용이 작다. 하지만 에모딘 생물학적 이용도가 비교적 낮아, 웅성 SD 쥐에서의 절대 생물학적 이용도가 7.5%, 자성에서 단지 5%이며, 본 발명에서 공개된 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 에모딘에 대하여 구조 수정을 진행하고, 또한 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 혈중 지질 강하 약력학 평가를 진행하여, 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르가 고지혈증을 치료하는 현저한 작용을 갖고 있고, 또한 혈중 지질 강하 작용이 동일 선량 하에 에모딘보다 훨씬 우수한 것을 발견하였다. 본 발명은 아토르바스타틴 칼슘을 주요한 대조 약물로 하는 바, 주요한 취지로는 본 발명의 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 실험 혼합 고지혈증 쥐에 대한 약리 작용을 관찰하기 위한 것이다. 그리고, 화학 수식을 거친 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 에모딘보다 더욱 훌륭한 당뇨병 상처 유합을 보여준다. 그러므로 에모딘에 대하여 수식 수정을 진행하는 것은 아주 필요하다.
종래 기술 중의 단점에 대하여, 본 발명에서는 새로운 혈중 지질 강하 및 당뇨병 상처 유합의 화합물 및 용도를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 화합물은 혈중 지질 강하 작용이 유의적이고 안전성이 훌륭하며, 약물 사용이 간단하고 편리하며, 가격이 저렴하고 운송 및 보관이 편리한 등 장점을 갖는다. 또한 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 에모딘보다 더욱 훌륭한 당뇨병 상처 유합 효과를 가지고, 당뇨병 상처 유합을 촉진하는 약물의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명은 합성 루트가 간단하고, 효과적으로 합성 시간을 절약하고 원가를 낮출 수 있으며, 조작이 간단하고 실시하기 쉬우며, 산업 생산에 적합하다.
본 발명은 하기 기술방안을 통하여 상기 목적을 구현한다.
일종의 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물에 있어서, 상기 화합물은 하기 식I에 표시된 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.
Figure 112020057826082-pct00001
그 중에서, R은 C1-5 알킬이다.
그 중에서, 바람직하게는, 식I에서, R은 에틸인 바, 즉 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르이고, 화학 명칭: 1,8-디히드록시-3-숙신산모노에틸기-6-메틸안트라퀴논, 분자식: C21H18O8, 분자량: 398이다.
나아가, 본 발명에서는 또한 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 바, 숙신산 무수물과 C1-5의 알카놀을 사용하여 모노알카놀 숙신산 에스테르를 합성하며; 모노알카놀 숙신산 에스테르를 다시 술폭시드 클로라이드와 반응시켜 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드계 화합물을 취득하며; 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드계 화합물을 다시 에모딘과 반응시켜 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물을 취득하는 단계가 포함된다.
구체적으로 말하면, 하기 단계에 따라 진행한다.
(1) 모노알카놀 숙신산 에스테르의 합성: 숙신산 무수물을 취하여 둥근 바닥 플라스크에 넣고, C1-5의 알카놀을 용제로 하여, 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 알카놀을 제거하여, 옅은 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 모노알카놀 숙신산 에스테르로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행하며;
(2) 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드계 화합물의 합성: 모노알카놀 숙신산 에스테르를 취하여 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 술폭시드 클로라이드를 용제로 하여, 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 술폭시드 클로라이드를 제거하여, 옅은 노란색 내지 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드계 화합물로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행하며;
(3) 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 합성: 에모딘과 알칼리를 취하여 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 디클로로메탄을 용제로 하여, 천천히 상응한 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드를 드롭 첨가하고, 실온에서 반응시키며;
(4) 탄산수소나트륨 용액으로 추출하고, 유기상을 합병시키며, 포화 식염수로 유기상을 추출하고, 유기상을 합병시키며, 무수탄산나트륨으로 건조시키고, 여과, 감압 농축시켜 취득한 조생성물은 노란색 내지 자주빛 노란색의 고체이며;
(5) 조생성물을 실리카젤 칼럼을 사용하여 크로마토그래피를 진행하고, 디클로로메탄-메탄올 혼합 용액으로 용리시켜 옅은 노란색 내지 노란색 순수 생성물을 취득하면, 바로 상응한 에모딘 숙시닐 에스테르 화합물이다.
나아가, R이 에틸, 즉 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물이 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르일 때, 상기 방법은 하기 단계에 따라 진행한다.
(1) 모노에틸 숙신산 에스테르의 합성: 숙신산 무수물을 취하여 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 에틸 알코올을 용제로 하여, 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 에틸 알코올을 제거하여, 옅은 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 모노에틸 숙신산 에스테르로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행하며;
(2) 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드의 합성: 모노에틸 숙신산 에스테르를 취하여 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 술폭시드 클로라이드를 용제로 하여, 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 술폭시드 클로라이드를 제거하여, 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행하며;
(3) 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 합성: 에모딘과 알칼리를 취하여 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 디클로로메탄을 용제로 하여, 천천히 상응한 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드를 드롭 첨가하고, 실온에서 반응시키며;
(4) 탄산수소나트륨 용액으로 추출하고, 유기상을 합병시키며, 포화 식염수로 유기상을 추출하고, 유기상을 합병시키며, 무수탄산나트륨으로 건조시키고, 여과, 감압 농축시켜 취득한 조생성물은 자주빛 노란색의 고체이며;
(5) 조생성물을 실리카젤 칼럼을 사용하여 크로마토그래피를 진행하고, 디클로로메탄-메탄올 혼합 용액으로 용리시켜 옅은 노란색 순수 생성물을 취득하면, 바로 상응한 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르이다.
바람직하게는, 상기 방법에서, 상기 (3) 단계 중의 상기 알칼리는 약한 알칼리에서 선택된다.
나아가, (1) 단계 중의 상기 가열 환류의 시간은 3-10 시간이고, 바람직하게는 4 시간이며, g:ml에 따라 계산하면, 숙신산 무수물의 질량과 에탄올의 체적비는 ＝1:10이고, 바람직하게는 1:4이며; (2) 단계 중에서 가열 환류의 시간은 1-10 시간이고, 바람직하게는 2 시간이며; 모노에틸 숙신산 에스테르와 술폭시드 클로라이드의 질량비는 1:1~1:10이고, 바람직하게는 1:4이며; (3) 단계 중에서, 상기 알칼리는 피리딘, 트릴에틸아민 또는 암모니아수이고, 바람직하게는 피리딘이며, 에모딘과 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드의 질량비는 ＝1:0.5~1이고, 바람직하게는 1:0.7이며; (5) 단계에서, 디클로로메탄-메탄올 혼합 용액 중에서, 디클로로메탄과 메탄올의 체적비는 100:1~100:4이고, 바람직하게는 100:1이다.
본 발명에서는 또한 전술한 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 당뇨병 상처 유합 촉진 약물 제조에서의 용도를 제공한다. 해당 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 바람직하게는 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르이다.
본 발명에서는 또한 일종의 약물을 제공하는 바, 여기에는 전술한 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물이 포함되는 것을 특징으로 한다. 해당 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 바람직하게는 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르이다.
구체적으로 말하면, 해당 약물은 혈중 지질 강하 약물 또는 당뇨병 상처 유합 촉진 약물일 수 있다.
나아가, 해당 약물은 제제 성형에 필요한 보조 재료를 첨가하여 크림제, 오일제, 패치제, 분말제, 스프레이제, 서방형 제제, 캡슐제, 정제, 과립제, 주사제 또는 기타 제제로 제조된다.
본 발명에서는 또한 일종의 오일제를 제공하는 바, 상기 오일제에는 전술한 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물 및 식물유가 포함되는 것을 특징으로 한다. 해당 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 바람직하게는 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르이다.
본 발명에서는 또한 일종의 상기 오일제를 제조하는 방법을 제공하는 바, 하기 단계가 포함되는 것을 특징으로 한다.
(1) 식물유를 갈색 상태로 가열시켜 멸균하고, 실온에 두어 냉각시켜 사용을 위해 준비하며;
(2) 무균 조건 하에서 제1항 또는 제2항의 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 무게를 달아 (1) 단계에서 멸균 후의 식물유에 용해시키며; 그 중에서, 바람직하게는, mg:ml로 계산하였을 때, 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 질량과 식물유의 체적비는 1-5:1이고, 더욱 바람직하게는 4:1이며;
(3) 초음파 진동을 진행하여 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르가 균일한 오일 형태 제제로 충분하게 용해되도록 하며;
(4) 멸균수로 (3) 단계에서 취득한 오일 형태 제제에 대하여 희석을 진행하고, 무균 조건 하에서 나누어 담고, 밀봉하며, 실온에서 보존하여 사용을 위해 준비하며; 그 중에서, 바람직하게는, 멸균수로 희석한 후의 오일 형태 제제에서, 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 농도는 50-150μg/mL이고, 더욱 바람직하게는 100μg/mL이다.
본 발명에서는 또한 전술한 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 혈중 지질 강하 및/또는 지방간 약물 제조에서의 용도를 제공한다. 해당 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 바람직하게는 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르이다.
구체적으로 말하면, 상기 혈중 지질 강하 약물은 혈청 중의 총 콜레스테롤(TC), 저밀도 리포 단백질(LDL-c) 및 간장 중의 총 콜레스테롤(TC)와 트리글리세라이드(TG)를 낮추는 작용을 가진다.
상기 새로운 혈중 지질 강하 화합물 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 생물체 흡수에 유리하고, 경구 투여 생물체의 약물에 대한 이용도를 향상시키는데 유리하다. 실험 혼합형 고지혈증 쥐에 대하여 약리 실험을 진행하는 것을 통하여, 본 발명의 혈중 지질 강하 화합물 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르가 유의적인 혈중 지질 강하 작용을 갖고 있고, 또한 혈중 지질 강하 작용이 유의적으로 에모딘보다 훌륭하다는 것을 실증하였다.
종래 기술에 비하여, 본 발명의 유익한 기술 효과는 하기와 같다.
1. 본 발명의 연구 성과는 효과적으로 새로운 당뇨병 상처 유합 촉진 및 혈중 지질 강하 약물 개발을 위하여 근거를 제공할 수 있고, 또한 향후의 경제 수익성이 크고, 광범한 사회적 효과를 발생할 수 있고, 응용 전망이 밝다.
2. 본 발명의 제조 루트가 실현 가능하고 또한 합리적이며, 원가가 비교적 낮고 독성 및 유해 시제 사용이 비교적 적으며, 환경에 대하여 오염을 초래하지 않고 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 총 수율이 최고로 90%에 달할 수 있고, 순도는 최고로 98% 이상에 달할 수 있으며, 대량 산업 생산에 적합하다.
3. 실험이 증명한데 의하면, 본 발명의 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 1형 당뇨병 생쥐 피부 상처 유합 속도를 유의적으로 향상시킨다.
4. 본 발명에서는 또한 일종의 당뇨병 상처 유합을 효과적으로 촉진시키는 오일제 및 그 제조 방법을 제공하는 바, 해당 오일제는 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물을 유일한 유효 성분으로 하고, 효과적으로 당뇨병 환자 피부 조직 복원과 상처 유합을 촉진시킬 수 있으며; 또한 해당 오일제는 규모화 생산으로 약물을 제조할 수 있고, 당뇨병 환자 상처 유합 지연 등 증상을 치료할 수 있다.
5. 본 발명의 일종의 효과적으로 당뇨병 상처 유합을 효과적으로 촉진시키는 오일제는 대량 생산이 가능하고, 당뇨병 환자 상처 유합 장애 등 증상의 치료에 사용할 수 있으며, 피부 조직 상처 복원 등 효과를 발휘한다.
6. 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 유의적으로 형중 지질을 조절할 수 있는 바, 임상에서 가장 흔히 사용하는 아토르바스타틴과 최대 임상 선량에서 비교할 때, 유의적으로 혈청 TC와 LDL 및 간장의 TC와 TG를 낮출 수 있어, 안전하고 효과적인 고지혈증을 예방 및 치료하는 약물로 삼을 수 있다. 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 유의적으로 혈중 지질을 조절할 수 있고, 이것의 혈청 TC와 LDL-c 강하 효과는 동등 선량의 에모딘보다 유의적으로 훌륭하다.
7. 안정성이 좋음: 본 발명의 새로운 혈중 지질 강하 화합물 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물은 허용 선량이 크고, 유의적인 독성 및 부작용이 없다.
8. 약물 사용이 간단하고 편리하며, 사람 및 동물 경구 투여가 쉽게 흡수된다. 운송 및 보관이 편리하고, 밀봉시켜 서늘한 곳에 두면 된다.
9. 본 발명의 약물의 원료는 에모딘으로서, 완성품의 약물 형성성이 강하고, 기타 수입제 혈중 지질 강하 약물에 비하여, 가격이 싸고 가성비가 높으며, 환자들이 받아들이기 쉽다.
도1은 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 합성 루트맵.
도2는 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 2차원 핵자기공명 관련 신호 도면.
도3은 각 그룹의 생쥐 혈당 값 도면.
그 중에서, A: 당뇨병 모델을 구성한 후 각 그룹 생쥐 혈당 값; B: 약물 투여 종료 전 각 그룹 생쥐 혈당 값;
수치는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, STZ 실행 후, 혈당 수준에 의하여 모델링에 성공한 동물을 무작위로 모델 제어 그룹, 용제 제어 그룹, 양성 약물(재조합 인간 상피 세포 성장 인자) 제어 그룹, 에모딘 그룹, 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 그룹으로 나누는 바, 각 그룹에 6마리 생쥐(***: 공백 제어 그룹에 비하여, P＜0.001, n＝6)가 있다.
도4는 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 생쥐 상처 유합에 대한 영향 직관도.
도5는 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 생쥐 상처 유합율에 대한 영향 모의 곡선도.
수치는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며; *：모델 그룹과 비하여, P＜0.05이며; ###: 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 그룹과 비하여, P＜0.001, n＝4~6.
도6은 고지혈 모델 구성 후, 동물 혈청 중 TC, TG와 LDL-c의 수준 도면.
데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, *P＜0.05 vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, 공백 제어 그룹, n＝10; 고지혈증 모델 그룹, n＝10; 시험 대상 낮은 선량 그룹, n＝10; 시험 대상 중간 선량 그룹, n＝10; 시험 대상 높은 선량 그룹, n＝10; 아토르바스타틴 칼슘 그룹: 양성 대조 약물 그룹, n＝11.
도7은 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 혼합 고지혈증 쥐 혈중 지질 수준에 대한 영향 도면.
데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, *P＜0.05 vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, ***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹, #P＜0.05 vs. 고지혈증 모델 그룹, ##P＜0.01 vs. 고지혈증 모델 그룹, ###P＜0.001 vs. 고지혈증 모델 그룹; 공백 제어 그룹, n＝10; 고지혈증 모델 그룹, n＝10; 시험 대상 낮은 선량 그룹, n＝10; 시험 대상 중간 선량 그룹, n＝10; 시험 대상 높은 선량 그룹, n＝10; 아토르바스타틴 칼슘 그룹: 양성 대조 약물 그룹, n＝11.
도8은 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 혼합 고지혈증 쥐 간장 중 TC와 TG 수준에 대한 영향 도면.
데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, *P＜0.05 vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, ***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹, #P＜0.05 vs. 고지혈증 모델 그룹, ##P＜0.01 vs. 고지혈증 모델 그룹, ###P＜0.001 vs. 고지혈증 모델 그룹; 공백 제어 그룹, 고지혈증 모델 그룹, 시험 대상 낮은 선량 그룹, 시험 대상 중간 선량 그룹, 시험 대상 높은 선량 그룹과 아토르바스타틴 칼슘 그룹: 양성 대조 약물 그룹, 각 그룹 n＝5.
도9는 고지혈 모델 구성 후, 동물 혈청 중 TC와 LDL-c의 수준 도면.
데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, *P＜0.05 vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, ***P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, 공백 제어 그룹, n＝10; 고지혈증 모델 그룹, n＝10; 시험 대상(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르) 그룹, n＝10; 에모딘 그룹, n＝10; 아토르바스타틴 칼슘 그룹: 양성 대조 약물 그룹, n＝11.
도10은 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르와 에모딘이 혼합 고지혈증 쥐 혈중 지질 수준 강하 작용 비교 도면.
데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, *P＜0.05 vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, ***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹, #P＜0.05 vs. 고지혈증 모델 그룹, ##P＜0.01 vs. 고지혈증 모델 그룹, ###P＜0.001 vs. 고지혈증 모델 그룹, &P＜0.05 vs. 에모딘 그룹; 공백 제어 그룹, n＝10; 고지혈증 모델 그룹, n＝10; 시험 대상(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르) 그룹, n＝10; 에모딘 그룹, n＝10; 아토르바스타틴 칼슘 그룹: 양성 대조 약물 그룹, n＝11.
도11은 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 올레산 유도 고지질 세포 중 TC와 TG 수준에 대한 영향 도면.
데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, ***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹, #P＜0.05vs.올레산 그룹, ##P＜0.01vs.올레산 그룹, ###P＜0.001vs.올레산 그룹, 공백 제어 그룹, n = 6; 올레산 그룹, n = 6; 시험 대상 낮은 선량(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 5μmol/L) 그룹, n＝6; 시험 대상 중간 선량(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 10μmol/L) 그룹, n＝6; 시험 대상 높은 선량(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 20μmol/L) 그룹, n＝6.
아래 구체적인 실시예를 참조하여 나아가 본 발명을 설명하도록 하는 바, 본 발명의 장점과 특징이 설명을 통하여 더욱 명확하게 될 것이다. 하지만 이러한 실시예는 단지 예시적일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 당업계의 기술자들은 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 기술방안의 세부사항과 형식에 대하여 수정과 교체를 진행할 수 있으나, 이러한 수정과 교체는 모두 본 발명의 보호 범위에 속하는 것을 이해할 것이다.
실시예1 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 제조
숙신산 무수물(1.0g, 10mmol)을 취하여 10mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 에틸 알코올(3.5mL, 60mmol)을 용제로 하여, 4시간 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 에틸 알코올을 제거하여, 옅은 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 모노에틸 숙신산 에스테르(1.4g, 96%)로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행한다.
모노에틸 숙신산 에스테르(1.0g, 6.8mmol)를 취하여 10mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 술폭시드 클로라이드(4.0mL, 34.0mmol)를 용제로 하여, 2시간 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 술폭시드 클로라이드를 제거하여, 옅은 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드(1.1g, 98%)로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행한다.
에모딘(1.0g, 3.7mmol)과 피리딘(0.45g, 5.6mmol)을 취하여 10mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 디클로로메탄(3mL)을 용제로 하여, 0℃ 하에서 천천히 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드(0.7g, 4.0mmol)를 드롭 첨가하고, 실온에서 3시간 반응시킨다.
탄산수소나트륨 용액으로 추출하고(2mL×3), 유기상을 합병시키며, 포화 식염수로 유기상을 추출하고(3mL×3), 유기상을 합병시키며, 무수탄산나트륨으로 건조시키고, 여과, 감압 농축시켜 취득한 조생성물은 자주빛 노란색의 고체이다.
실리카젤 칼럼을 사용하여 크로마토그래피를 진행하고, 디클로로메탄-메탄올(v/v100:1)로 용리시켜 노란색 순수 생성물을 1.4g을 취득한다. 수율이 94.7％이고, 순도가 97％이다.
에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 합성 루트맵은 도1에 도시된 바와 같고, 그 중에서 R은 에틸이다.
실시예2 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 제조
숙신산 무수물(10g, 100mmol)을 취하여 150mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 에틸 알코올(40mL, 600mmol)을 용제로 하여, 6시간 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 에틸 알코올을 제거하여, 옅은 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 모노에틸 숙신산 에스테르(14g, 96%)로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행한다.
모노에틸 숙신산 에스테르(10g, 68mmol)를 취하여 150mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 술폭시드 클로라이드(40mL, 340mmol)를 용제로 하여, 2시간 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 술폭시드 클로라이드를 제거하여, 옅은 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드(11g, 98%)로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행한다.
에모딘(10g, 37mmol)과 트릴에틸아민(2.3g, 22mmol)을 취하여 250mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 디클로로메탄(3mL)을 용제로 하여, 0℃ 하에서 천천히 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드(7g, 40mmol)를 드롭 첨가하고, 실온에서 3시간 반응시킨다. 탄산수소나트륨 용액으로 추출하고(20mL×3), 유기상을 합병시키며, 포화 식염수로 유기상을 추출하고(30mL×3), 유기상을 합병시키며, 무수탄산나트륨으로 건조시키고, 여과, 감압 농축시켜 취득한 조생성물은 자주빛 노란색의 고체이다.
실리카젤 칼럼을 사용하요 크로마토그래피를 진행하고, 디클로로메탄-메탄올(v/v100:1)로 용리시켜 노란색 순수 생성물을 12.7g을 취득한다. 수율이 92.3％이고, 순도가 98％ 이상이다.
에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 합성 루트맵은 도1에 도시된 바와 같고, 그 중에서 R은 에틸이다.
실시예3 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 제조
숙신산 무수물(10g, 100mmol)을 취하여 150mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 에틸 알코올(20mL, 434mmol)을 용제로 하여, 2시간 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 에틸 알코올을 제거하여, 옅은 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 모노에틸 숙신산 에스테르(14g, 96%)로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행한다.
모노에틸 숙신산 에스테르(10g, 68mmol)를 취하여 150mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 술폭시드 클로라이드(20mL, 170mmol)를 용제로 하여, 1시간 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 술폭시드 클로라이드를 제거하여, 옅은 노란색의 오일 형태의 물질을 취득하면 바로 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드(8g, 98%)로서, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행한다.
에모딘(10g, 37mmol)과 암모니아수(1.5g, 44mmol)를 취하여 250mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 디클로로메탄(3mL)을 용제로 하여, 실온 하에서 천천히 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드(8g, 45mmol)를 드롭 첨가하고, 실온에서 계속하여 1시간 반응시킨다. 탄산수소나트륨 용액으로 추출하고(20mL×3), 유기상을 합병시키며, 포화 식염수로 유기상을 추출하고(30mL×3), 유기상을 합병시키며, 무수탄산나트륨으로 건조시키고, 여과, 감압 농축시켜 취득한 조생성물은 자주빛 노란색의 고체이다.
실리카젤 칼럼을 사용하여 크로마토그래피를 진행하고, 디클로로메탄-메탄올(v/v100:1)로 용리시켜 노란색 순수 생성물을 8g을 취득한다. 총 수율이 54.1％이고, 순도가 98％ 이상이다.
에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 합성 루트맵은 도1에 도시된 바와 같고, 그 중에서 R은 에틸이다.
실시예4 목표 화합물 구조 확인
실시예1-3에서 제조된 화합물의 구조에 대하여 확인을 진행하였는 바, 확인 결과에 의하면 해당 화합물은 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르이고, 노란색 분말이며, 메탄올에 용해되고,
Figure 112020057826082-pct00002
(c0.5, CHCl3)이다. IR(KBr, cm-1)3500(-OH), 3088(Ar-H), 2981(R-H), 1763(C＝O), 1730(C＝O), 1624(벤젠 고리), 1481(벤젠 고리). UV[nm(loge), MeOH]:278(3.37), 268(3.40). CD(nm, Δε, MeOH):212(-0.56). 1H-NMR中δ7.08(1H, d, J＝2.2Hz), 7.33(1H, d, J＝2.2Hz)는 벤젠 고리 상에서 메타 포지션에 결합된 프로톤 신호이고, δ7.39(1H, brs), 7.07(1H, brs)는 아로마틱 프로톤 신호이며, δ2.91(2H, d, J＝6.2), 2.71(2H, d, J＝6.2Hz), 4.13(2H, q, J＝7.1Hz)는 세 개의 메틸렌 프로톤 신호이고, δ2.36(3H, s), 1.22(3H, t, J＝7.1Hz)는 메틸 프로톤 신호이다. 탄소 스텍트럼은 21개 탄소 신호를 제공하는 바, 그 중에서 δ190.8, 181.0은 케노카르보닐 탄소 신호이고, δ172.0, 170.6은 에스테르 카르보닐 탄소 신호이며, 163.2, 162.0, 157.0은 벤젠 고리 상의 산소 연결 탄소 신호이다. 1H-1HCOSY 스텍트럼에서, δ2.91, 2.71에 관련 신호가 존재하고, δ4.13, 1.22 관련 신호가 존재한다. 해당 화합물의 DEPT 스텍트럼으로부터 알 수 있는 바와 같이, 구조에는 4개의 sp2 혼성 메틴 탄소 신호, 12개의 sp2 혼성 4차 탄소 신호, 3개의 sp3 혼성 메틸렌 탄소 신호, 2개의 메틸 탄소 신호가 포함된다. HMQC 스펙트럼을 통하여 그 탄화수소 신호에 대하여 할당을 진행하였다. HMBC 스펙트럼에서, δ7.08 프로톤은 163.2, 114.3의 화학적 시프트와 원격 관련이 있고, δ7.33 프로톤과 157.0, 181.0, 114.3의 탄소 신호와 원격 관련이 있으며, δ7.39의 프로톤은 δ149.5, 181.0, 113.8의 탄소 신호와 원격 관련이 있고, δ7.07의 프로톤과 δ162.2, 113.8의 탄소 신호와 원격 관련이 있다. δ2.91의 프로톤은 δ170.6의 탄소 신호와 원격 관련이 있고, δ2.71의 프로톤은 δ172.2의 탄소 신호와 원격 관련이 있으며, δ4.13의 프로톤은 δ172.2의 탄소 신호와 원격 관련이 있고, δ1.22의 프로톤은 δ60.7의 탄소 신호와 원격 관련이 있으며, 2.36의 메틸 프로톤은 121.1、149.5、116.7의 탄소 신호와 원격 관련이 있다. 상기 정보를 종합하여 해당 화합물의 구조를 하기 식I에 표시된 바와 같이 결정하며, 신호 할당은 표1에 표시된 바와 같다. 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 2차원 핵자기공명 관련 신호 도면은 도2에 도시된 바와 같다.
Figure 112020057826082-pct00003
표1. 에모딘 숙신산 에틸 에스테르 NMR 데이터(600MHz, DMSO-d6)
Figure 112020057826082-pct00004
실시예5 본 발명의 제품의 효능 테스트1
1. 약품 제조
(1) 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 오일제의 제조
① 10mg의 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르(실시예1-3에서 제조)를 달아 2.5mL의 끓인 후 냉각시킨 식물유에 용해시키며;
② 10분 동안 초음파 진동을 진행하여 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르가 충분하게 용해되도록 하며;
③ 멸균 냉각된 식물유로 이를 100μg/mL까지 희석하고, 무균 조건 하에서 나누어 담고, 밀봉하며, 실온에서 보존하여 사용을 위해 준비한다.
(2) 에모딘 오일제의 제조
① 10mg의 에모딘을 달아 2.5mL의 끓인 후 냉각시킨 식물유에 용해시키며;
② 10분 동안 초음파 진동을 진행하여 에모딘이 충분하게 용해되도록 하며;
③ 멸균 냉각된 식물유로 이를 200μg/mL까지 희석하고, 무균 조건 하에서 나누어 담고, 밀봉하며, 실온에서 보존하여 사용을 위해 준비한다.
2. 실험 방법
2.1 생쥐 당뇨병 모델의 구성
SPF 등급의 웅성 쿤밍 생쥐(18-20g)를 일반적인 유지 사료로 3-5일 적응성 사양을 진행하고, 무게를 단 후 무작위로 그룹핑을 진행하여, 공백 제어 그룹(Control)과 당뇨병 모델 그룹으로 나누고, 당뇨병 모델 그룹은 복강내 주사로 높은 선량의 STZ(스트렙토조토신, 180mg/kg)를 투여하고, 일주일 후 공복 혈당을 측정하였다. 모델 구성에 성공한 생쥐를 무작위로 5 그룹으로 나누는 바, 즉 당뇨병 모델 그룹(Model), 용제 제어 그룹(Solvent), 양성 약물(재조합 인간 상피 세포 성장 인자) 제어 그룹(EGF), 에모딘 그룹(DHS), 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 그룹(DHS-YSW)이다.
2.2 생쥐 상처 모델의 구성
각 그룹의 동물을 펜토바비탈나트륨(1％)을 사용하여 마취시키고, 등을 제모시켰다. 등 최고 위치에 5mm 스킨 펀치를 사용하여 직경이 5mm인 상처 모델을 구성하였다. Control 그룹과 Model 그룹은 아무런 약물 처리도 진행하지 않고, 용제 제어 그룹은 멸균 식물유 10μL를 떨구어 발랐으며, 양성 약물 그룹은 매일 재조합 인간 상피 세포 성장 인자 용액 10μL(2000IU/mL)를 떨구어 바르고, 나머지 각 그룹은 상처 위치에 매일 상응한 약물 10μL를 떨구어 발랐으며, 매일 1회, 연속 14일 진행하였다.
2.3 생쥐 상처 면적 검사
실험 과정에서, 매일 고정 높이 고정 초점 거리로 각 그룹 생쥐 상처 유합 상황을 촬영 기록하고, Image-Pro-Plus 소프트웨어를 사용하여 상처 면적을 측정하였으며, 각 그룹 생쥐 상처 유합 상황을 통계 분석하고, 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 당뇨병 생쥐 상처 유합 과정에 대한 영향을 평가하였다.
상처 유합율 = (제0일 상처 면적 - 제N일 상처 면적)/제0일 상처 면적 * 100％
2.4 통계학적 방법
실험 데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하고, One-wayANOVA 및 T 검정을 사용하여 각 그룹 생쥐 혈당 값을 통계 분석하며; One-wayANOVA 및 pair T 검정을 사용하여 각 그룹 생쥐 상처 유합율의 차이 변화를 통계 분석하는 바, P＜0.05는 유의적 차이가 존재한다는 것을 표시한다. 실험 결과는 모두 GraphpadPrism6.0을 사용하여 통계 및 도면 작성을 진행하였다.
3 실험 결과
3.1 각 그룹 동물 혈당
결과는 도3에 도시된 바와 같으며, 도3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 높은 선량 STZ를 투여한 후, 당뇨병 모델 그룹, 용제 제어 그룹, 양성 약물 제어 그룹(재조합 인간 상피 세포 성장 인자, EGF), 에모딘 그룹, 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 그룹 생쥐 혈당 값은 공백 제어 그룹에 비하여 모두 유의적으로 증가하였다(***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹에 비함). 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 생쥐 상처 유합 실험을 진행하는 과정에서, 공백 제어 그룹을 제외하고, 기타 각 그룹의 생쥐는 모두 고혈당 상태에 처한다.
3.2 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 당뇨병 생쥐 상처 유합에 대한 영향
결과는 도4, 5로부터 알 수 있는 바, 공백 제어 그룹과 비하여, 당뇨병 모델 그룹 생쥐 상처 유합 속도가 비교적 느리고, 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 그룹은 당뇨병 모델 그룹, 용제 제어 그룹 및 에모딘 그룹의 생쥐에 비하여, 상초 유합 속도가 유의적으로 향상되고, 또한 통계학적 차이가 존재한다(*P＜0.05 vs. 모델 그룹과 비함; ###P＜0.001 vs. 에모딘 그룹; ###P＜0.001 vs. 용제 제어 그룹). 해당 결과는 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르가 효과적으로 당뇨병 생쥐 상처 유합 속도를 향상시키고, 용제 및 에모딘에 대하여 치료 효과가 좋고, 효능이 안정적이고 유의적이라는 것을 설명한다.
실시예6 본 발명의 제품의 효능 테스트1
1. 실험 재료
실험 동물: 61 마리의 체중이 균일한 쥐
시험 대상: 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르(실시예1-3에서 제조)
고지질 사료: 유지 사료에 20.0％의 자당, 15.0％의 돼지 기름, 1.2％의 콜레스테롤, 0.2％의 콜산 나트륨, 적당량의 카세인, 인산 수소 칼슘, 돌 가루 등을 첨가하였다. 조지방 외, 모델 사료의 수분, 조단백질, 조지방, 조섬유, 조회분, 칼슘, 인은 모두 유지 사료의 국가 표준에 도달하여야 한다. 사료는 청결 등급이고, 진공 포장이며, 상온에 보관한다.
2. 실험 원리
콜레스테롤, 자당, 돼지 기름, 콜산 나트륨이 포함된 고지질 사료로 쥐를 사양하면 지질 대사 장애의 쥐 모델을 형성할 수 있고, 이어 쥐에게 약물을 투여하면, 시험 대상의 고지혈증에 대한 영향을 검사할 수 있고, 또한 시험 대상의 쥐의 지질 흡수, 지방 단백질 형성, 지질의 분해 또는 배설에 대해 미치는 영향을 판단할 수 있다.
혼합형 고지혈증 쥐 모델의 판단: 모델링 기간이 끝난 후, 고지혈증 모델 그룹과 공백 제어 그룹을 비교하면, 혈청 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤 또는 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 높아졌고, 차이가 유의성을 가지기 때문에, 모델이 구성된 것으로 판단한다.
3. 실험 방법
3.1 동물 그룹핑
제1차 무작위 그룹핑: 동물이 접수된 후, 5~7일 적응성 사양을 진행하고, 사육 기간에 쥐에 대하여 외관, 일반 상태 관찰을 진행하여, 검사에 합격된 쥐만이 본 실험에 도입될 수 있다. 적응기가 종료된 후, 쥐의 체중을 달고, 쥐를 무작위로 공백 제어 그룹(10 마리)와 고지질 모델 그룹(51 마리)로 나누었다.
제2차 무작위 그룹핑: 쥐 고지혈증 모델 구성이 종료된 후, 쥐 혈중 지질을 검사하여, 고지질 모델 그룹을 무작위로 5개 그룹으로 나누는 바, 양성 약물 그룹이 한 그룹에 11마리이고, 기타 각 그룹은 그룹마다 10마리로서, 각각 고지혈증 모델 그룹, 시험 대상 낮은 선량 그룹(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 10mg/kg·d-1), 시험 대상 중간 선량 그룹(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 20mg/kg·d-1), 시험 대상 높은 선량 그룹(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 40mg/kg·d-1), 양성 제어 약물 그룹(아토르바스타틴 칼슘 그룹 10mg/kg·d-1)이다.
3.2 혼합 고지혈증 모델 구성기
각 그룹 동물 약물 투여 및 음식 상황은 표2에 표시된 바와 같고, 실험 각 그룹에서, 공백 제어 그룹의 쥐는 유지 사료를 급식시켜 사양하고, 기타 5개 그룹의 쥐는 고지질 사료를 급식시켜 사양하며, 2주 후 쥐 혈청 중의 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, 저밀도 리포 단백질과 고밀도 리포 단백질의 수준을 측정하였다. 매주 1회 체중을 단다.
고지혈증 모델 그룹에 고지질 사료를 2주 급식시킨 후, 공백 제어 그룹과 고지질 모델 그룹의 쥐에 대하여 금식을 시키지 않고 꼬리 끝 채혈을 진행하고, 채혈 후 혈청을 분리하여, 혈청 TC, TG, LDL-C와 HDL-C 수준을 측정하였다. TC, TG와 LDL-C 수준에 의하여 고지질 모델 그룹을 무작위로 5개 그룹으로 나누고, 그룹핑 후 고지혈증 모델 그룹, 시험 대상 낮은 선량 그룹, 시험 대상 중간 선량 그룹, 시험 대상 높은 선량 그룹, 양성 제어 약물 그룹(아토르바스타틴 칼슘 그룹)을 공백 제어 그룹과 TC, TG, LDL-C와 HDL-C를 비교한다.
고지혈증 모델 그룹 및 각 약물 투여 그룹과 공백 제어 그룹을 비교하여 쥐 혈중 지질의 변환 상황을 관찰한 결과는 표3과 도6에 도시된 바와 같으며, 혼합 고지혈 모델 구성 종료 후, 고지혈증 모델 그룹 및 각 약 물 투여 그룹 쥐와 공백 그룹 쥐를 비교하면, 쥐 혈청 중의 총 콜레스테롤(***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹), 트리글리세라이드(***P＜0.00 1vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, *P＜0.05 vs. 공백 제어 그룹)과 저밀도 리포 단백질(***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹)은 모두 유의적으로 증가하고, 모두 통계학적 차이가 존재하며, 또한 각 약물 투여 그룹 간에는 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드와 저밀도 리포 단백질이 유의적인 차이가 존재하지 않고, 혼합 고지혈증 모델 구성에 성공하였음을 판단할 수 있다.
표2. 각 그룹 동물 약물 투여 및 음식 상황
Figure 112020057826082-pct00005
표3. 고지혈 모델 구성 후, 동물 혈청 중 TC, TG, LDL-c 및 HDL-c의 수준
Figure 112020057826082-pct00006
주: 데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, *P＜0.05 vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, 공백 제어 그룹, n＝10; 고지혈증 모델 그룹, n＝10; 시험 대상 낮은 선량 그룹, n＝10; 시험 대상 중간 선량 그룹, n＝10; 시험 대상 높은 선량 그룹, n＝10; 아토르바스타틴 칼슘 그룹: 양성 대조 약물 그룹, n＝11.
3.3 약물 투여 주기
성분 그룹핑의 시험 대상 높은, 중간, 낮은 선량 그룹 및 양성 제어 약물 그룹(아토르바스타틴 칼슘 그룹)의 쥐에 대하여 매일 위내 투여로 약물을 투여하고, 공백 제어 그룹 및 고지혈증 모델 그룹은 상대적인 선량의 라이소자임을 투여한다. 각 그룹의 약물 투여량은 표2에 표시된 바와 같다.
사료 급식량이 불변하고, 매주 1회 체중을 달며, 약물 투여 2주 후 꼬리 끝 채혈을 진행하고, 간장을 취하여, 쥐 혈청 중의 TC, TG, LDL-C와 HDL-C의 수준과 간장 중의 TC와 TG의 수준을 측정하고, 시험 대상의 쥐 혈청 중의 TC, TG, LDL-C 및 HDL-C와 간장 중의 TC 및 TG에 대한 영향을 관찰한다.
3.4 관찰기
실험 과정에 일반적인 활력 징후 관찰을 진행한다.
3.5 주요 검사 지표
(1) 체중: 매주 1회 측정한다.
(2) 혈청 TC, TG, LDL-C 및 HDL-C 수준, 고지질 모델 구성 후 및 약물 투여 2주 후 각각 1회 검사한다.
(3) 샘플링 후, 간장 TC와 TG 수준을 측정한다.
4. 실험 데이터 및 결과
4.1 데이터 처리
분산 분석을 사용하나, 분산 분석의 과정에 따라 우선 분산 동차 테스트를 진행하여야 하고, 동차가 균일하면, F값을 계산하는 바, 36F값＜0.05, 결론: 각 그룹 평균 간의 차이에는 유의성이 존재하지 않으며; F값≥0.05, P≤0.05, 다수의 실험 그룹과 하나의 제어 그룹 간 평균을 쌍으로 비교하는 방법을 사용하여 통계를 진행하며; 비정규 또는 동차가 균일하지 않은 데이터에 대해서는 적당한 변수 전환을 진행하고, 정규 또는 동차 균일 요구를 만족시킨 후, 전환된 후의 데이터를 사용하여 통계를 진행하며; 변수 전환 후 여전히 정규 또는 동차 균일 목적에 도달하지 못한 것에 대해서는 순위합 검정을 사용하여 통계를 진행한다.
4.2 동물 실험 결과 판단
혈중 지질 강하 기능 결과 판단: 고지혈증 모델 제어 그룹과 공백 제어 그룹을 비교하면, 혈청 트리글리세라이드가 높아지고, 혈청 총 콜레스테롤이 높아지거나 또는 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 높아졌고, 차이에 모두 유의성을 가지기 때문에, 모델이 구성된 것으로 판단한다.
(1) 각 선량 그룹과 모델 제어 그룹을 비교하면, 임의의 선량 그룹 혈청 총 콜레스테롤 또는 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 낮아지고, 또한 임의의 선량 그룹 혈청 트리글리세라이드가 낮아지며, 차이에 모두 유의성을 가지고, 아울러 각 선량 그룹 혈청 고밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 유의적으로 모델 제어 그룹보다 낮지 않기 때문에, 해당 시험 샘플의 혈중 지질 강하 기능 동물 실험 결과가 양성이라고 판단한다.
(2) 각 선량 그룹과 모델 제어 그룹을 비교하면, 임의의 선량 그룹 혈청 총 콜레스테롤 또는 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 낮아지고, 차이에 모두 유의성을 가지며, 아울러 각 선량 그룹 혈청 트리글리세라이드가 모델 제어 그룹보다 유의적으로 높지 않고, 각 선량 그룹 혈청 고밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 유의적으로 모델 제어 그룹보다 낮지 않기 때문에, 해당 시험 샘플의 콜레스테롤 강하 기능 동물 실험 결과가 양성이라고 판단한다.
(3) 각 선량 그룹과 모델 제어 그룹을 비교하면, 임의의 선량 그룹 혈청 트리글리세라이드가 낮아지고, 차이에 모두 유의성을 가지며, 아울러 각 선량 그룹 혈청 총 콜레스테롤 및 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 모델 제어 그룹보다 유의적으로 높지 않고, 혈청 고밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 유의적으로 모델 제어 그룹보다 낮지 않기 때문에, 해당 시험 샘플의 트리글리세라이드 강하 기능 동물 실험 결과가 양성이라고 판단한다.
4.3 실험 결과
결과는 표4와 도7에 표시된 바와 같고, 약물 투여 2주 후, 혼합 고지혈증 모델 그룹 쥐는 공백 제어 그룹 쥐와 비교하여 혈청 중 총 콜레스테롤(***P＜0.001 vs. 공백 제에 그룹), 트리글리세라이드(***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹), 저밀도 리포 단백질(***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹) 수준이 유의적으로 증가하기 때문에, 모델 구성에 성공한 것으로 판단한다. 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 낮은, 중간, 높은 선량과 아토르바스타틴 칼슘은 고지혈증 쥐 혈청 중의 TC(#P＜0.05 vs. 고지혈증 그룹)와 LDL-c(#P＜0.05 vs. 고지혈증 그룹)를 유의적으로 낮출 수 있으며; 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 높은 선량과 아토르바스타틴 칼슘은 고지혈증 쥐 혈청 중의 TG(###P＜0.001 vs. 고지혈증 그룹)를 유의적으로 낮출 수 있다.
표4. 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 혼합 고지혈증 쥐 혈중 지질 수준에 대한 영향
Figure 112020057826082-pct00007
주: 데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, *P＜0.05vs.공백 대조 그룹, **P＜0.01vs.공백 대조 그룹, ***P＜0.001vs.공백 대조 그룹, #P＜0.05 vs. 고지혈증 모델 그룹, ##P＜0.01 vs. 고지혈증 모델 그룹, ###P＜0.001 vs. 고지혈증 모델 그룹; 공백 대조 그룹, n＝10; 고지혈증 모델 그룹, n＝10; 시험 대상 낮은 선량 그룹, n＝10; 시험 대상 중간 선량 그룹, n＝10; 시험 대상 높은 선량 그룹, n＝10; 아토르바스타틴 칼슘 그룹: 양성 대조 약물 그룹, n＝11.
결과는 표5와 도8에 표시된 바와 같고, 약물 투여 2주 후, 혼합 고지혈증 모델 그룹 쥐는 공백 제어 그룹 쥐와 비교하여 간장 중 총 콜레스테롤(***P＜0.001 vs. 공백 제에 그룹)과 트리글리세라이드(***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹) 수준이 유의적으로 증가하기 때문에, 모델 구성에 성공한 것으로 판단한다. 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 낮은, 중간, 높은 선량과 아토르바스타틴 칼슘은 고지혈증 쥐 혈청 중의 TC(#P＜0.05 vs. 고지혈증 모델 그룹)와 TG(##P＜0.01 vs. 고지혈증 모델 그룹)를 유의적으로 낮출 수 있고, 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르는 훌륭한 혈중 지질 강하 및 간장 보호 작용을 보여주기 때문에, 지방간의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
표5. 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 혼합 고지혈증 쥐 간장 중 TC와 TG 수준에 대한 영향
Figure 112020057826082-pct00008
주: 데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, *P＜0.05 vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, ***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹, #P＜0.05 vs. 고지혈증 모델 그룹, ##P＜0.01 vs. 고지혈증 모델 그룹, ###P＜0.001 vs. 고지혈증 모델 그룹; 공백 제어 그룹; 고지혈증 모델 그룹; 시험 대상 낮은 선량 그룹; 시험 대상 중간 선량 그룹; 시험 대상 높은 선량 그룹; 아토르바스타틴 칼슘 그룹: 양성 대조 약물 그룹, n＝5.
실시예7 본 발명의 제품의 효능 테스트3
1. 실험 재료
실험 동물: 51 마리의 체중이 균일한 쥐
시험 대상: 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르(실시예1-3에서 제조)
고지질 사료: 유지 사료에 20.0％의 자당, 15％의 돼지 기름, 1.2％의 콜레스테롤, 0.2％의 콜산 나트륨, 적당량의 카세인, 인산 수소 칼슘, 돌 가루 등을 첨가하였다. 조지방 외, 모델 사료의 수분, 조단백질, 조지방, 조섬유, 조회분, 칼슘, 인은 모두 유지 사료의 국가 표준에 도달하여야 한다. 사료는 청결 등급이고, 진공 포장이며, 상온에 보관한다.
2. 실험 원리
콜레스테롤, 자당, 돼지 기름, 콜산 나트륨이 포함된 고지질 사료로 쥐를 사양하면 지질 대사 장애의 쥐 모델을 형성할 수 있고, 이어 쥐에게 약물을 투여하면, 시험 대상의 고지혈증에 대한 영향을 검사할 수 있고, 또한 시험 대상의 쥐의 지질 흡수, 지방 단백질 형성, 지질의 분해 또는 배설에 대해 미치는 영향을 판단할 수 있다.
혼합형 고지혈증 쥐 모델의 판단: 모델링 기간이 끝난 후, 고지혈증 모델 그룹과 공백 제어 그룹을 비교하면, 혈청 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤 또는 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 높아졌고, 차이가 유의성을 가지기 때문에, 모델이 구성된 것으로 판단한다.
3. 실험 방법
3.1 동물 그룹핑
제1차 무작위 그룹핑: 동물이 접수된 후, 5~7일 적응성 사양을 진행하고, 사육 기간에 쥐에 대하여 외관, 일반 상태 관찰을 진행하여, 검사에 합격된 쥐만이 본 실험에 도입될 수 있다. 적응기가 종료된 후, 쥐의 체중을 달고, 쥐를 무작위로 공백 제어 그룹(10 마리)과 고지질 모델 그룹(41 마리)로 나누었다.
제2차 무작위 그룹핑: 쥐 고지혈증 모델 구성이 종료된 후, 쥐 혈중 지질을 검사하여, 고지질 모델 그룹을 무작위로 4개 그룹으로 나누는 바, 양성 약물 그룹이 한 그룹에 11마리이고, 기타 각 그룹은 그룹마다 10마리로서, 각각 고지혈증 모델 그룹, 시험 대상(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 20mg/kg·d-1) 그룹, 에모딘(20mg/kg·d-1) 그룹, 양성 제어 약물 그룹(아토르바스타틴 칼슘 그룹 10mg/kg·d-1)이다.
3.2 혼합 고지혈증 모델 구성기
각 그룹 동물 약물 투여 및 음식 상황은 표6에 표시된 바와 같고, 실험 각 그룹에서, 공백 제어 그룹의 쥐는 유지 사료를 급식시켜 사양하고, 기타 4개 그룹의 쥐는 고지질 사료를 급식시켜 사양하며, 2주 후 쥐 혈청 중의 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, 저밀도 리포 단백질과 고밀도 리포 단백질의 수준을 측정하였다. 매주 1회 체중을 단다.
고지혈증 모델 그룹에 고지질 사료를 2주 급식시킨 후, 공백 제어 그룹과 고지질 모델 그룹의 쥐에 대하여 금식을 시키지 않고 꼬리 끝 채혈을 진행하고, 채혈 후 혈청을 분리하여, 혈청 TC, TG, LDL-C와 HDL-C 수준을 측정하였다. TC, TG와 LDL-C 수준에 의하여 고지질 모델 그룹을 무작위로 4개 그룹으로 나누고, 그룹핑 후 고지혈증 모델 그룹, 시험 대상(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 20mg/kg·d-1) 그룹, 에모딘(20mg/kg·d-1) 그룹과 양성 제어 약물 그룹(아토르바스타틴 칼슘 그룹 10mg/kg·d-1)을 공백 제어 그룹과 TC, TG, LDL-C와 HDL-C를 비교한다.
고지혈증 모델 그룹 및 각 약물 투여 그룹과 공백 제어 그룹을 비교하여 쥐 혈중 지질의 변환 상황을 관찰한 결과는 도9와 표7에 도시된 바와 같으며, 혼합 고지혈 모델 구성 종료 후, 고지혈증 모델 그룹 및 각 약 물 투여 그룹 쥐와 공백 그룹 쥐를 비교하면, 쥐 혈청 중의 총 콜레스테롤(***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹)과 저밀도 리포 단백질(**P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, ***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹)은 모두 유의적으로 증가하고, 모두 통계학적 차이가 존재하며, 또한 각 약물 투여 그룹 간에는 총 콜레스테롤과 저밀도 리포 단백질이 유의적인 차이가 존재하지 않고, 혼합 고지혈증 모델 구성에 성공하였음을 판단할 수 있다.
표6. 각 그룹 동물 약물 투여 및 음식 상황
Figure 112020057826082-pct00009
표7. 모델링 후 쥐 혈중 지질 상황
Figure 112020057826082-pct00010
주: 데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, *P ＜0.05 vs. 공백 제어 그룹, **P＜0.01 vs. 공백 제어 그룹, ***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹, 공백 제어 그룹, n＝10; 고지혈증 모델 그룹, n＝10; 시험 대상(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르) 그룹, n＝10; 에모딘 그룹, n＝10; 아토르바스타틴 칼슘 그룹, n＝11.
3.3 약물 투여 주기
성분 그룹핑의 시험 대상(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르) 그룹, 에모딘 그룹 및 양성 제어 약물 그룹(아토르바스타틴 칼슘 그룹)의 쥐에 대하여 매일 위내 투여로 약물을 투여하고, 공백 제어 그룹 및 고지혈증 모델 그룹은 상대적인 선량의 라이소자임을 투여한다. 각 그룹의 약물 투여량은 표6에 표시된 바와 같다.
사료 급식량이 불변하고, 매주 1회 체중을 달며, 약물 투여 2주 후 꼬리 끝 채혈을 진행하고, 시험 대상의 쥐 혈청 중의 TC, TG, LDL-C 및 HDL-C에 대한 영향을 관찰한다.
3.4 관찰기
실험 과정에 일반적인 활력 징후 관찰을 진행한다.
3.5 주요 검사 지표
(1) 체중: 매주 1회 측정한다.
(2) 혈청 TC, TG, LDL-C 및 HDL-C 수준, 고지질 모델 구성 후 및 약물 투여 2주 후 각각 1회 검사한다.
4. 실험 데이터 및 결과
4.1 데이터 처리
분산 분석을 사용하나, 분산 분석의 과정에 따라 우선 분산 동차 테스트를 진행하여야 하고, 동차가 균일하면, F값을 계산하는 바, 36F값＜0.05, 결론: 각 그룹 평균 간의 차이에는 유의성이 존재하지 않으며; F값≥0.05, P≤0.05, 다수의 실험 그룹과 하나의 제어 그룹 간 평균을 쌍으로 비교하는 방법을 사용하여 통계를 진행하며; 비정규 또는 동차가 균일하지 않은 데이터에 대해서는 적당한 변수 전환을 진행하고, 정규 또는 동차 균일 요구를 만족시킨 후, 전환된 후의 데이터를 사용하여 통계를 진행하며; 변수 전환 후 여전히 정규 또는 동차 균일 목적에 도달하지 못한 것에 대해서는 순위합 검정을 사용하여 통계를 진행한다.
4.2 동물 실험 결과 판단
혈중 지질 강하 기능 결과 판단: 고지혈증 모델 제어 그룹과 공백 제어 그룹을 비교하면, 혈청 트리글리세라이드가 높아지고, 혈청 총 콜레스테롤이 높아지거나 또는 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 높아졌고, 차이에 모두 유의성을 가지기 때문에, 모델이 구성된 것으로 판단한다.
(1) 시험 대상 그룹과 모델 제어 그룹을 비교하면, 시험 대상 그룹 혈청 총 콜레스테롤 또는 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 낮아지고, 또한 시험 대상 그룹 혈청 트리글리세라이드가 낮아지며, 차이에 모두 유의성을 가지고, 아울러 시험 대상 그룹 혈청 고밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 유의적으로 모델 제어 그룹보다 낮지 않기 때문에, 해당 시험 샘플의 혈중 지질 강하 기능 동물 실험 결과가 양성이라고 판단한다.
(2) 시험 대상 그룹과 모델 제어 그룹을 비교하면, 시험 대상 그룹 혈청 총 콜레스테롤 또는 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 낮아지고, 차이에 모두 유의성을 가지며, 아울러 시험 대상 그룹 혈청 트리글리세라이드가 모델 제어 그룹보다 유의적으로 높지 않고, 시험 대상 그룹 혈청 고밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 유의적으로 모델 제어 그룹보다 낮지 않기 때문에, 해당 시험 샘플의 콜레스테롤 강하 기능 동물 실험 결과가 양성이라고 판단한다.
(3) 시험 대상 그룹과 모델 제어 그룹을 비교하면, 시험 대상 그룹 혈청 트리글리세라이드가 낮아지고, 차이에 모두 유의성을 가지며, 아울러 시험 대상 그룹 혈청 총 콜레스테롤 및 저밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 모델 제어 그룹보다 유의적으로 높지 않고, 혈청 고밀도 리포 단백질 콜레스테롤이 유의적으로 모델 제어 그룹보다 낮지 않기 때문에, 해당 시험 샘플의 트리글리세라이드 강하 기능 동물 실험 결과가 양성이라고 판단한다.
4.3 실험 결과
결과는 도10에 표시된 바와 같고, 약물 투여 2주 후, 혼합 고지혈증 모델 그룹 쥐는 공백 제어 그룹 쥐와 비교하여 혈청 중 총 콜레스테롤(***P＜0.001 vs. 공백 제에 그룹)과 저밀도 리포 단백질(***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹) 수준이 유의적으로 증가하기 때문에, 모델 구성에 성공한 것으로 판단한다. 시험 대상(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 20mg/kg·d-1)은 고지혈증 쥐 혈청 중의 TC(#P＜0.05 vs. 고지혈증 그룹)와 LDL-c(#P＜0.05 vs. 고지혈증 그룹)를 유의적으로 낮출 수 있고, 또한 동등한 선량의 에모딘(20mg/kg·d-1)에 비하여 시험 대상(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 20mg/kg·d-1)이 쥐 혈청 중의 총 콜레스테롤(&P＜0.05 vs. 에모딘 그룹)과 저밀도 리포 단백질(&P＜0.05 vs. 에모딘 그룹)을 낮추는 작용은 에모딘보다 유의적으로 높다.
실시예8 본 발명의 제품의 효능 테스트4
1. 실험 재료
실험 세포: HepG2 세포 라인
시험 대상: 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르(실시예1-3에서 제조)
2. 실험 원리
배양된 HepG2세포에 올레산을 첨가하여 세포 고지질 모델을 유도 제조하고, 이어 세포 시험 대상 약물을 투여하여, 시험 대상의 세포 지질 수준에 대한 영향을 검사할 수 있다.
3. 실험 방법
3.1 세포 그룹핑
세포 융합도가 80% 정도에 도달하였을 때, 정상 그룹을 제외하고 기타 그룹에는 모두 200μmol/L의 올레산을 첨가하며, 그 후 5개 그룹으로 나누는 바, 정상 그룹, 올레산 유도 고지질 그룹, 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 낮은 선량 그룹(5μmol/L), 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 중간 선량 그룹(10μmol/L)과 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 높은 선량 그룹(20μmol/L)이다. 24 시간 후, 세포 TC와 TG 수준을 검사한다.
3.2 검사 방법
3.2.1 세포 수집
0.25％의 트립신을 사용하여 소화시켜 세포 현탁액을 제조하고, 1000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하며, 상청액을 버리고 세포 침전을 남기며, PBS로 1~2회 세척하고, 마찬가지로 1000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하고, 상청액을 버리고 세포 침전을 남긴다.
3.2.2 세포 분열
200μl의 2％의 TritonX-100을 첨가하여, 30분 동안 용해시킨다.
3.2.3 측정 방법
우선 Beyotime kit를 사용하여 샘플의 단백질 농도를 측정한다. 그 후 96-well plate에 250μl의 작업액을 첨가하고, 빈 웰에 2.5μl의 증류수를 첨가하며, 교정 웰에 2.5μl의 교정액을 첨가하고, 샘플 웰에 2.5μl의 샘플을 첨가하며, 37℃ 하에서 10분 동안 인큐베이팅하고, 510 nm microplate reader를 사용하여 OD값을 측정한다.
3.2.4 계산 공식
콜레스테롤 함량 = (샘풀 OD값 - 공백 OD값)/(교정 OD값 - 공백 OD값)*5.17/측정하고자 하는 샘플 단백질 농도
트리글리세라이드 함량 = (샘풀 OD값 - 공백 OD값)/(교정 OD값 - 공백 OD값)*2.26/측정하고자 하는 샘플 단백질 농도
4. 실험 데이터 및 결과
4.1 데이터 처리
분산 분석을 사용하나, 분산 분석의 과정에 따라 우선 분산 동차 테스트를 진행하여야 하고, 동차가 균일하면, F값을 계산하는 바, 36F값＜0.05, 결론: 각 그룹 평균 간의 차이에는 유의성이 존재하지 않으며; F값≥0.05, P≤0.05, 다수의 실험 그룹과 하나의 제어 그룹 간 평균을 쌍으로 비교하는 방법을 사용하여 통계를 진행하며; 비정규 또는 동차가 균일하지 않은 데이터에 대해서는 적당한 변수 전환을 진행하고, 정규 또는 동차 균일 요구를 만족시킨 후, 전환된 후의 데이터를 사용하여 통계를 진행하며; 변수 전환 후 여전히 정규 또는 동차 균일 목적에 도달하지 못한 것에 대해서는 순위합 검정을 사용하여 통계를 진행한다.
4.2 실험 결과
에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 올레산 유도 고지질 세포 중의 TC와 TG 수준에 대한 영향은 표8과 도11에 도시된 바와 같으며, 해당 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 올레산 유도 고지질 그룹 세포는 공백 제어 그룹 세포와 비교하여 총 콜레스테롤(***P＜0.001 vs. 공백 제에 그룹)과 트리글리세라이드(***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹) 수준이 유의적으로 증가하기 때문에, 모델 구성에 성공한 것으로 판단한다. 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 낮은, 중간, 높은 선량은 올레산 유도 고지질 세포의 TC(###P＜0.001 vs. 올레산 그룹)와 TG(#P＜0.05 vs. 올레산 그룹)를 유의적으로 낮출 수 있다.
표8. 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 올레산 유도 고지질 세포 중 TC와 TG 수준에 대한 영향
Figure 112020057826082-pct00011
비고: 데이터는 평균치 ± 표준 오차로 표시하며, ***P＜0.001 vs. 공백 제어 그룹, #P＜0.05vs.올레산 그룹, ##P＜0.01vs.올레산 그룹, ###P＜0.001vs.올레산 그룹, 공백 제어 그룹, n = 6; 올레산 그룹, n = 6; 시험 대상 낮은 선량(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 5μmol/L) 그룹, n＝6; 시험 대상 중간 선량(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 10μmol/L) 그룹, n＝6; 시험 대상 높은 선량(에모딘 숙시닐 에틸 에스테르 20μmol/L) 그룹, n＝6.
이상에서는 본 발명을 특정의 실시예에 대해서 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 실시예만 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이하의 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상의 요지를 벗어나지 않는 범위에서 얼마든지 다양하게 변경하여 실시할 수 있을 것이다.

Claims (14)

  1. 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물에 있어서, 상기 화합물은 하기 식I에 표시된 구조를 가지며,
    Figure 112020057826082-pct00012

    그 중에서, R은 C1-5 알킬인 것을 특징으로 하는 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 식I에서, R은 에틸인 것을 특징으로 하는 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물.
  3. 제1항의 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 숙신산 무수물과 C1-5의 알카놀을 사용하여 모노알카놀 숙신산 에스테르를 합성하며; 모노알카놀 숙신산 에스테르를 다시 술폭시드 클로라이드와 반응시켜 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드계 화합물을 취득하며; 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드계 화합물을 다시 에모딘과 반응시켜 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물을 취득하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 하기 단계에 따라 진행하는 것으로서,
    (1) 모노알카놀 숙신산 에스테르의 합성: C1-5의 알카놀을 용제로 하여, 숙신산 무수물을 첨가하여 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 알카놀을 제거하여, 모노알카놀 숙신산 에스테르를 취득하는 바, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행하며;
    (2) 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드계 화합물의 합성: 술폭시드 클로라이드를 용제로 하여, 모노알카놀 숙신산 에스테르를 첨가하여 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 술폭시드 클로라이드를 제거하여, 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드계 화합물을 취득하는 바, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행하며;
    (3) 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 합성: 에모딘과 알칼리를 취하여 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 디클로로메탄을 용제로 하여, 천천히 숙신산 모노알카놀 에스테르 아실 클로라이드를 드롭 첨가하고, 실온에서 반응시키며;
    (4) 탄산수소나트륨 용액으로 추출하고, 유기상을 합병시키며, 포화 식염수로 유기상을 추출하고, 유기상을 합병시키며, 무수탄산나트륨으로 건조시키고, 여과, 감압 농축시켜 조생성물을 취득하며;
    (5) 조생성물을 실리카젤 칼럼을 사용하여 크로마토그래피를 진행하고, 디클로로메탄-메탄올 혼합 용액으로 용리시켜 에모딘 숙시닐 에스테르를 취득하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, R이 에틸일 때, 하기 단계에 따라 진행하는 것으로서,
    (1) 모노에틸 숙신산 에스테르의 합성: 에틸 알코올을 용제로 하여, 숙신산 무수물을 첨가하여 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 에틸 알코올을 제거하여, 모노에틸 숙신산 에스테르를 취득하는 바, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행하며;
    (2) 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드의 합성: 술폭시드 클로라이드를 용제로 하여, 모노에틸 숙신산 에스테르를 첨가하여 가열 환류시키고, 감압 증류시켜 과량의 술폭시드 클로라이드를 제거하여, 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드를 취득하는 바, 해당 생성물을 분리시키지 않고 직접 다음 단계 반응을 진행하며;
    (3) 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르의 합성: 에모딘과 알칼리를 취하여 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 디클로로메탄을 용제로 하여, 천천히 상응한 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드를 드롭 첨가하고, 실온에서 반응시키며;
    (4) 탄산수소나트륨 용액으로 추출하고, 유기상을 합병시키며, 포화 식염수로 유기상을 추출하고, 유기상을 합병시키며, 무수탄산나트륨으로 건조시키고, 여과, 감압 농축시켜 조생성물을 취득하며;
    (5) 조생성물을 실리카젤 칼럼을 사용하여 크로마토그래피를 진행하고, 디클로로메탄-메탄올 혼합 용액으로 용리시켜 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르를 취득하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 (3) 단계 중의 상기 알칼리는 약한 알칼리에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제5항에 있어서, (1) 단계 중의 상기 가열 환류의 시간은 3-10 시간이거나, 또는 4 시간이며, g:ml에 따라 계산하면, 숙신산 무수물의 질량과 에탄올의 체적비는 1:10이거나, 또는 1:4이며; (2) 단계 중에서 가열 시간은 1-10 시간이거나, 또는 2 시간이며; 모노에틸 숙신산 에스테르와 술폭시드 클로라이드의 질량비는 1:1~1:10이거나, 또는 1:4이며; (3) 단계 중에서, 상기 알칼리는 피리딘, 트릴에틸아민 또는 암모니아수이거나, 또는 피리딘이며, 에모딘과 숙신산 모노에틸 에스테르 아실 클로라이드의 질량비는 1:0.5~1이거나, 또는 1:0.7이며; (5) 단계에서, 디클로로메탄-메탄올 혼합 용액 중에서, 디클로로메탄과 메탄올의 체적비는 100:1~100:4이거나, 또는 100:1인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 약물에 있어서, 제1항 또는 제2항의 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물이 포함되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 상처 유합 촉진용 약물.
  10. 제9항에 있어서, 해당 약물은 제제 성형에 필요한 보조 재료를 첨가하여 크림제, 오일제, 패치제, 분말제, 스프레이제, 서방형 제제, 캡슐제, 정제, 과립제, 주사제 또는 기타 제제로 제조되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 상처 유합 촉진용 약물.
  11. 오일제에 있어서, 상기 오일제에는 제1항 또는 제2항의 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물 및 식물유가 포함되는 것을 특징으로 하는 오일제.
  12. 제11항의 상기 오일제의 제조 방법에 있어서, 하기 단계가 포함되는 바, 즉
    (1) 식물유를 갈색 상태로 가열시켜 멸균하고, 실온에 두어 냉각시켜 사용을 위해 준비하며;
    (2) 무균 조건 하에서 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 무게를 달아 (1) 단계에서 멸균 후의 식물유에 용해시키며; 그 중에서, mg:ml로 계산하였을 때, 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 질량과 식물유의 체적비는 1-5:1이거나, 또는 4:1이며;
    (3) 초음파 진동을 진행하여 에모딘 숙시닐 에틸 에스테르가 균일한 오일 형태 제제로 충분하게 용해되도록 하며;
    (4) 멸균수로 (3) 단계에서 취득한 오일 형태 제제에 대하여 희석을 진행하고, 무균 조건 하에서 나누어 담고, 밀봉하며, 실온에서 보존하여 사용을 위해 준비하며; 그 중에서, 멸균수로 희석한 후의 오일 형태 제제에서, 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물의 농도는 50-150μg/mL이거나, 또는 100μg/mL인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 제1항 또는 제2항의 상기 에모딘 숙시닐 에스테르계 화합물을 포함하는 혈중 지질 강하 및 지방간 중 적어도 하나의 예방 또는 치료용 약물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약물은 혈청 중의 총 콜레스테롤(TC), 저밀도 리포 단백질(LDL-c) 및 간장 중의 총 콜레스테롤(TC)과 트리글리세라이드(TG)를 낮추는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 약물.

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