CN103495156B - 一种重组人胰岛素缓释片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人胰岛素缓释片，其包括下述重量配比的原料：知母8-12份、黄芪6-8份、茶油籽3-5份、重组人胰岛素11-15份、卵磷脂22-30份、胆固醇6-10份、胶原蛋白3-6份、维生素E0.8-1.2份、壳聚糖0.4-0.7份。具体制备方法是将原辅料先经预处理，再制备重组人胰岛素脂质体冻干粉，最后经压片成型。本发明方便糖尿病患者服用，且产品包封率高，疗效好，安全无毒，作用时间长。

Description

一种重组人胰岛素缓释片及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种重组人胰岛素缓释片及其制备方法。

背景技术

糖尿病（diabetes）是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状。糖尿病患者由于胰岛受损、功能缺失，不能够正常分泌胰岛素，胰岛素的体内合成不足，导致脂肪的合成速度明显降低，分解速度增快，最终导致血液中游离的脂肪酸含量升高。在肝脏中，线粒体将脂肪酸氧化生成了甘油三酯，甘油三酯沉积导致脂肪肝形成，或产生极低密度脂蛋白，乳糜微粒中的甘油三酯含量增高。由于糖尿病患者体内的脂蛋白酶活性明显降低，进而导致了高血脂症。高密度脂蛋白胆固醇主要负责摄取体内细胞中的胆固醇。临床研究发现，糖尿病患者体内的高密度脂蛋白胆固醇含量较低，甘油三酯含量相对较高，通过补充胰岛素可以缓解此症状。

人类应用的很大一部分胰岛素皆来源于动物。从动物脏器提取的猪、牛胰岛素受脏器来源的限制，而且由于一级结构的差异，带来免疫原性问题，并可能导致一系列的副作用。90年代至今，重组人胰岛素成功研发上市，重组人胰岛素是利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同，该品为白色或类白色的结晶性粉末，在水、乙醇和乙醚中几乎不溶，在稀盐酸和稀氢氧化钠溶液中易溶。作为临床糖尿病治疗，胰岛素仍以注射途径给药，这给病人带来极大的不便和痛苦，甚至可能出现不良反应如过敏、硬结、炎症等。研发安全有效、应用方便的胰岛素制剂一直是药学界一大热点。目前研究人员主要利用脂质体、纳米粒、微囊、微球等载体减少肠胃对胰岛素的降解和破坏，促进吸收。

脂质体是一种类似生物膜结构的双分子层微小囊泡，具有生物膜特性和药物传输能力，胰岛素以脂质体包裹方式给药有利于提高生物利用度和患者用药依从性，脂质体的内水相能保护胰岛素的结构和构象，而外部亲脂层有助于改善跨生物膜屏障吸收性能。在胰岛素脂质体中，胰岛素被包裹在脂质体内部，可抵抗蛋白酶的降解，脂质体的磷脂双分子层还可以控制胰岛素的释放，达到比较平稳的降低血糖。

制备脂质体的方法很多,且每种方法各有其特点。近年来，胰岛素载体的释药性研究已经取得了一些进展，但面临的困难仍然很多，主要是包封率较低，吸收有限，而且制剂制备方法不成熟，剂量较难控制，成本较高，以及对吸收部位的损坏乃至可能对人体脏器功能带来影响。在制备过程中若能适当地调节膜材,有机溶剂,缓冲溶液三者之间的比例,便可以获得具有较高包封率的脂质体。而包封率是指包裹在脂质体囊中药量占脂质体混悬液中药物总量的比例,衡量脂质体制剂质量好坏的最重要的指标之一,也是其能否发挥较普通制剂高效、低毒作用的关键，包封率高，则药物缓释效果佳，产品可在体内平稳释放，从而药效得以充分表达。

传统重组人胰岛素制剂单一以重组人胰岛素为主要成分，药效单薄，疗效持续性弱，患者需长期注射或服用，且长期使用后，剂量将不断增大，给患者带来较大困扰和不便。

发明内容

本发明旨在解决现有技术存在的上述不足，目的是提供一种重组人胰岛素缓释片，其组方科学，工艺严谨，包封率高，缓释效果佳，可长期有效降低糖尿病患者的空腹血糖值，对血糖、器官指数均有良好的改善。

实现上述目的的技术方案是：

一种重组人胰岛素缓释片，包括下述重量配比的原料：知母8-12份、黄芪6-8份、茶油籽3-5份、重组人胰岛素11-15份、卵磷脂22-30份、胆固醇6-10份、胶原蛋白3-6份、维生素E 0.8-1.2份、壳聚糖0.4-0.7份；

具体制备方法如下：

知母提取物的制备：取知母粉碎至200目，加知母质量12-16倍的质量分数为75-90%的乙醇溶液，于55-65℃提取2次，每次1-3h，合并两次提取液，过滤得知母粗提液，粗提液过D101型大孔吸附树脂柱，上样流速0.8-1.8BV/h，分别用质量分数35%、55%、65%的乙醇溶液各2.5-3.5BV洗脱，醇洗流速1.6-3.2BV/h，收集洗脱液，洗脱液经减压回收乙醇后，浓缩至药液相对密度为1.03-1.08g/ml，冷冻干燥得知母提取物；

黄芪提取物的制备：取黄芪粉碎至100目，回流提取2次，第一次加8-12倍量水提取2h，第二次加6-10倍量水提取1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩至相对密度为1.01-1.05g/ml的清膏，喷雾干燥，得黄芪提取物备用；

茶油籽提取液的制备：取茶油籽脱壳处理得茶油籽仁，于60-90℃条件下，用茶油籽仁质量5-12倍的石油醚回流提取茶油籽仁1-2h，滤过，取滤渣洗净干燥，再加入洗净干燥后的滤渣质量16-22倍的蒸馏水，于50-65℃浸提2次，每次2-3h，收集两次浸提液得茶油籽提取液备用；

磷酸盐缓冲溶液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶于900ml蒸馏水中，调PH值至7.4，加水定容至1L，即得磷酸盐缓冲溶液备用；

重组人胰岛素预处理：将重组人胰岛素溶于重组人胰岛素质量2-4倍的0.01mol/L的HCl溶液中，再加入重组人胰岛素质量6-10倍的PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，得预处理后的重组人胰岛素溶液备用；

重组人胰岛素脂质体冻干粉的制备：将卵磷脂、胆固醇、胶原蛋白、维生素E溶于432-540份的氯仿-乙醚中，得混合液备用，其中氯仿与乙醚的体积比为1:2-4；将上述混合液、预处理后的重组人胰岛素溶液、知母提取物、黄芪提取物充分混合后，水浴超声7-10min，形成稳定的W/O型乳液，将乳液置于旋转蒸发仪中24-27℃减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入26-30份PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液、壳聚糖、茶油籽提取液，在8-12℃水浴旋转孵化20-40min得孵化液，将孵化液经冷冻干燥后得重组人胰岛素脂质体冻干粉备用；

压片成型：将重组人胰岛素脂质体冻干粉粉碎至100目，加入硬脂酸镁、微粉硅胶、羟丙甲基纤维素，混合均匀，压片机压片成型，得重组人胰岛素缓释片。

上述重组人胰岛素购于通化东宝药业股份有限公司。

本发明将传统的中药制剂与重组人胰岛素相组合，经预处理、脂质体冻干粉制备、压片制成缓释片剂，方便糖尿病患者服用，且产品包封率高，疗效好，安全无毒，作用时间长。经动物试验证明可有效降低糖尿病患者的空腹血糖值，改善血糖、器官指数。

具体实施例

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以助于理解本发明的内容。

实施例1：

一种重组人胰岛素缓释片，包括下述重量配比的原料：知母9份、黄芪7份、茶油籽4份、重组人胰岛素13份、卵磷脂24份、胆固醇7份、胶原蛋白4份、维生素E 1.0份、壳聚糖0.5份；

具体制备方法如下：

知母提取物的制备：取知母粉碎至200目，加知母质量15倍的质量分数为80%的乙醇溶液，于60℃提取2次，每次2h，合并两次提取液，过滤得知母粗提液，粗提液过D101型大孔吸附树脂柱，上样流速1.4BV/h，分别用质量分数35%、55%、65%的乙醇溶液各2.9BV洗脱，醇洗流速2.4BV/h，收集洗脱液，洗脱液经减压回收乙醇后，浓缩至药液相对密度为1.05g/ml，冷冻干燥得知母提取物；

黄芪提取物的制备：取黄芪粉碎至100目，回流提取2次，第一次加10倍量水提取2h，第二次加8倍量水提取1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩至相对密度为1.03g/ml的清膏，喷雾干燥，得黄芪提取物备用；

茶油籽提取液的制备：取茶油籽脱壳处理得茶油籽仁，于75℃条件下，用茶油籽仁质量8倍的石油醚回流提取茶油籽仁1.5h，滤过，取滤渣洗净干燥，再加入洗净干燥后的滤渣质量19倍的蒸馏水，于60℃浸提2次，每次2.5h，收集两次浸提液得茶油籽提取液备用；

磷酸盐缓冲溶液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶于900ml蒸馏水中，调PH值至7.4，加水定容至1L，即得磷酸盐缓冲溶液备用；

重组人胰岛素预处理：将重组人胰岛素溶于重组人胰岛素质量3倍的0.01mol/L的HCl溶液中，再加入重组人胰岛素质量8倍的PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，得预处理后的重组人胰岛素溶液备用；

重组人胰岛素脂质体冻干粉的制备：将卵磷脂、胆固醇、胶原蛋白、维生素E溶于485份的氯仿-乙醚中，得混合液备用，其中氯仿与乙醚的体积比为1:3；将上述混合液、预处理后的重组人胰岛素溶液、知母提取物、黄芪提取物充分混合后，水浴超声8min，形成稳定的W/O型乳液，将乳液置于旋转蒸发仪中25℃减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入28份PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液、壳聚糖、茶油籽提取液，在10℃水浴旋转孵化30min得孵化液，将孵化液经冷冻干燥后得重组人胰岛素脂质体冻干粉备用；

压片成型：将重组人胰岛素脂质体冻干粉粉碎至100目，加入硬脂酸镁、微粉硅胶、羟丙甲基纤维素，混合均匀，压片机压片成型，得重组人胰岛素缓释片。

实施例2

一种重组人胰岛素缓释片，包括下述重量配比的原料：知母8份、黄芪6份、茶油籽3份、重组人胰岛素11份、卵磷脂22份、胆固醇6份、胶原蛋白3份、维生素E 0.8份、壳聚糖0.4份；

具体制备方法如下：

知母提取物的制备：取知母粉碎至200目，加知母质量12倍的质量分数为75%的乙醇溶液，于55℃提取2次，每次1h，合并两次提取液，过滤得知母粗提液，粗提液过D101型大孔吸附树脂柱，上样流速0.8BV/h，分别用质量分数35%、55%、65%的乙醇溶液各2.5BV洗脱，醇洗流速1.6BV/h，收集洗脱液，洗脱液经减压回收乙醇后，浓缩至药液相对密度为1.03g/ml，冷冻干燥得知母提取物；

黄芪提取物的制备：取黄芪粉碎至100目，回流提取2次，第一次加8倍量水提取2h，第二次加6倍量水提取1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩至相对密度为1.01g/ml的清膏，喷雾干燥，得黄芪提取物备用；

茶油籽提取液的制备：取茶油籽脱壳处理得茶油籽仁，于60℃条件下，用茶油籽仁质量5倍的石油醚回流提取茶油籽仁1h，滤过，取滤渣洗净干燥，再加入洗净干燥后的滤渣质量16倍的蒸馏水，于50℃浸提2次，每次2h，收集两次浸提液得茶油籽提取液备用；

磷酸盐缓冲溶液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶于900ml蒸馏水中，调PH值至7.4，加水定容至1L，即得磷酸盐缓冲溶液备用；

重组人胰岛素预处理：将重组人胰岛素溶于重组人胰岛素质量2倍的0.01mol/L的HCl溶液中，再加入重组人胰岛素质量6倍的PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，得预处理后的重组人胰岛素溶液备用；

重组人胰岛素脂质体冻干粉的制备：将卵磷脂、胆固醇、胶原蛋白、维生素E溶于432份的氯仿-乙醚中，得混合液备用，其中氯仿与乙醚的体积比为1:2；将上述混合液、预处理后的重组人胰岛素溶液、知母提取物、黄芪提取物充分混合后，水浴超声7min，形成稳定的W/O型乳液，将乳液置于旋转蒸发仪中24℃减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入26份PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液、壳聚糖、茶油籽提取液，在8℃水浴旋转孵化20min得孵化液，将孵化液经冷冻干燥后得重组人胰岛素脂质体冻干粉备用；

压片成型：将重组人胰岛素脂质体冻干粉粉碎至100目，加入硬脂酸镁、微粉硅胶、羟丙甲基纤维素，混合均匀，压片机压片成型，得重组人胰岛素缓释片。

实施例3

一种重组人胰岛素缓释片，包括下述重量配比的原料：知母12份、黄芪8份、茶油籽5份、重组人胰岛素15份、卵磷脂30份、胆固醇10份、胶原蛋白6份、维生素E 1.2份、壳聚糖0.7份；

具体制备方法如下：

知母提取物的制备：取知母粉碎至200目，加知母质量16倍的质量分数为90%的乙醇溶液，于65℃提取2次，每次3h，合并两次提取液，过滤得知母粗提液，粗提液过D101型大孔吸附树脂柱，上样流速1.8BV/h，分别用质量分数35%、55%、65%的乙醇溶液各3.5BV洗脱，醇洗流速3.2BV/h，收集洗脱液，洗脱液经减压回收乙醇后，浓缩至药液相对密度为1.08g/ml，冷冻干燥得知母提取物；

黄芪提取物的制备：取黄芪粉碎至100目，回流提取2次，第一次加12倍量水提取2h，第二次加10倍量水提取1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩至相对密度为1.05g/ml的清膏，喷雾干燥，得黄芪提取物备用；

茶油籽提取液的制备：取茶油籽脱壳处理得茶油籽仁，于90℃条件下，用茶油籽仁质量12倍的石油醚回流提取茶油籽仁2h，滤过，取滤渣洗净干燥，再加入洗净干燥后的滤渣质量22倍的蒸馏水，于65℃浸提2次，每次3h，收集两次浸提液得茶油籽提取液备用；

磷酸盐缓冲溶液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶于900ml蒸馏水中，调PH值至7.4，加水定容至1L，即得磷酸盐缓冲溶液备用；

重组人胰岛素预处理：将重组人胰岛素溶于重组人胰岛素质量4倍的0.01mol/L的HCl溶液中，再加入重组人胰岛素质量10倍的PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，得预处理后的重组人胰岛素溶液备用；

重组人胰岛素脂质体冻干粉的制备：将卵磷脂、胆固醇、胶原蛋白、维生素E溶于540份的氯仿-乙醚中，得混合液备用，其中氯仿与乙醚的体积比为1:4；将上述混合液、预处理后的重组人胰岛素溶液、知母提取物、黄芪提取物充分混合后，水浴超声10min，形成稳定的W/O型乳液，将乳液置于旋转蒸发仪中27℃减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入30份PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液、壳聚糖、茶油籽提取液，在12℃水浴旋转孵化40min得孵化液，将孵化液经冷冻干燥后得重组人胰岛素脂质体冻干粉备用；

压片成型：将重组人胰岛素脂质体冻干粉粉碎至100目，加入硬脂酸镁、微粉硅胶、羟丙甲基纤维素，混合均匀，压片机压片成型，得重组人胰岛素缓释片。

实施例4

一种重组人胰岛素缓释片，包括下述重量配比的原料：知母6份、黄芪4份、茶油籽2份、重组人胰岛素9份、卵磷脂20份、胆固醇5份、胶原蛋白2份、维生素E 0.5份、壳聚糖0.2份；

具体制备方法如下：

知母提取物的制备：取知母粉碎至200目，加知母质量10倍的质量分数为70%的乙醇溶液，于50℃提取2次，每次1h，合并两次提取液，过滤得知母粗提液，粗提液过D101型大孔吸附树脂柱，上样流速0.6BV/h，分别用质量分数35%、55%、65%的乙醇溶液各2.0 BV洗脱，醇洗流速1.4BV/h，收集洗脱液，洗脱液经减压回收乙醇后，浓缩至药液相对密度为1.01g/ml，冷冻干燥得知母提取物；

黄芪提取物的制备：取黄芪粉碎至100目，回流提取2次，第一次加6倍量水提取2h，第二次加5倍量水提取1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩至相对密度为1.01g/ml的清膏，喷雾干燥，得黄芪提取物备用；

茶油籽提取液的制备：取茶油籽脱壳处理得茶油籽仁，于55℃条件下，用茶油籽仁质量4倍的石油醚回流提取茶油籽仁1h，滤过，取滤渣洗净干燥，再加入洗净干燥后的滤渣质量12倍的蒸馏水，于45℃浸提2次，每次1.5h，收集两次浸提液得茶油籽提取液备用；

磷酸盐缓冲溶液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶于900ml蒸馏水中，调PH值至7.4，加水定容至1L，即得磷酸盐缓冲溶液备用；

重组人胰岛素预处理：将重组人胰岛素溶于重组人胰岛素质量1.5倍的0.01mol/L的HCl溶液中，再加入重组人胰岛素质量5倍的PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，得预处理后的重组人胰岛素溶液备用；

重组人胰岛素脂质体冻干粉的制备：将卵磷脂、胆固醇、胶原蛋白、维生素E溶于350份的氯仿-乙醚中，得混合液备用，其中氯仿与乙醚的体积比为1:1；将上述混合液、预处理后的重组人胰岛素溶液、知母提取物、黄芪提取物充分混合后，水浴超声5min，形成稳定的W/O型乳液，将乳液置于旋转蒸发仪中23℃减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入22份PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液、壳聚糖、茶油籽提取液，在7℃水浴旋转孵化20-40min得孵化液，将孵化液经冷冻干燥后得重组人胰岛素脂质体冻干粉备用；

压片成型：将重组人胰岛素脂质体冻干粉粉碎至100目，加入硬脂酸镁、微粉硅胶、羟丙甲基纤维素，混合均匀，压片机压片成型，得重组人胰岛素缓释片。

实施例5

一种重组人胰岛素缓释片，包括下述重量配比的原料：知母15份、黄芪9份、茶油籽7份、重组人胰岛素17份、卵磷脂33份、胆固醇12份、胶原蛋白7份、维生素E 1.8份、壳聚糖0.9份；

具体制备方法如下：

知母提取物的制备：取知母粉碎至200目，加知母质量18倍的质量分数为95%的乙醇溶液，于70℃提取2次，每次4h，合并两次提取液，过滤得知母粗提液，粗提液过D101型大孔吸附树脂柱，上样流速2.0BV/h，分别用质量分数35%、55%、65%的乙醇溶液各3.8BV洗脱，醇洗流速3.6BV/h，收集洗脱液，洗脱液经减压回收乙醇后，浓缩至药液相对密度为1.09g/ml，冷冻干燥得知母提取物；

黄芪提取物的制备：取黄芪粉碎至100目，回流提取2次，第一次加14倍量水提取2h，第二次加13倍量水提取1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩至相对密度为1.07g/ml的清膏，喷雾干燥，得黄芪提取物备用；

茶油籽提取液的制备：取茶油籽脱壳处理得茶油籽仁，于95℃条件下，用茶油籽仁质量14倍的石油醚回流提取茶油籽仁3h，滤过，取滤渣洗净干燥，再加入洗净干燥后的滤渣质量25倍的蒸馏水，于70℃浸提2次，每次4h，收集两次浸提液得茶油籽提取液备用；

磷酸盐缓冲溶液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶于900ml蒸馏水中，调PH值至7.4，加水定容至1L，即得磷酸盐缓冲溶液备用；

重组人胰岛素预处理：将重组人胰岛素溶于重组人胰岛素质量5倍的0.01mol/L的HCl溶液中，再加入重组人胰岛素质量12倍的PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，得预处理后的重组人胰岛素溶液备用；

重组人胰岛素脂质体冻干粉的制备：将卵磷脂、胆固醇、胶原蛋白、维生素E溶于580份的氯仿-乙醚中，得混合液备用，其中氯仿与乙醚的体积比为1:5；将上述混合液、预处理后的重组人胰岛素溶液、知母提取物、黄芪提取物充分混合后，水浴超声12min，形成稳定的W/O型乳液，将乳液置于旋转蒸发仪中29℃减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入32份PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液、壳聚糖、茶油籽提取液，在14℃水浴旋转孵化60min得孵化液，将孵化液经冷冻干燥后得重组人胰岛素脂质体冻干粉备用；

压片成型：将重组人胰岛素脂质体冻干粉粉碎至100目，加入硬脂酸镁、微粉硅胶、羟丙甲基纤维素，混合均匀，压片机压片成型，得重组人胰岛素缓释片。

对比例

一种重组人胰岛素缓释片，包括下述重量配比的原料：重组人胰岛素13份、卵磷脂24份、胆固醇7份、胶原蛋白4份、维生素E 1.0份、壳聚糖0.5份；

具体制备方法如下：

磷酸盐缓冲溶液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶于900ml蒸馏水中，调PH值至7.4，加水定容至1L，即得磷酸盐缓冲溶液备用；

重组人胰岛素预处理：将重组人胰岛素溶于重组人胰岛素质量3倍的0.01mol/L的HCl溶液中，再加入重组人胰岛素质量8倍的PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，得预处理后的重组人胰岛素溶液备用；

重组人胰岛素脂质体冻干粉的制备：将卵磷脂、胆固醇、胶原蛋白、维生素E溶于485份的氯仿-乙醚中，得混合液备用，其中氯仿与乙醚的体积比为1:3；将上述混合液、预处理后的重组人胰岛素溶液充分混合后，水浴超声8min，形成稳定的W/O型乳液，将乳液置于旋转蒸发仪中25℃减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入28份PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液、壳聚糖，在10℃水浴旋转孵化30min得孵化液，将孵化液经冷冻干燥后得重组人胰岛素脂质体冻干粉备用；

压片成型：将重组人胰岛素脂质体冻干粉粉碎至100目，加入硬脂酸镁、微粉硅胶、羟丙甲基纤维素，混合均匀，压片机压片成型，得重组人胰岛素缓释片。

试验例

1、包封率测定：准确移取实施例1-5、对比例中的l0mL孵化液于离心分离管中,以12000r/min的转速离心lh,取上清液待测，色谱条件：色谱柱Hypersil ODS2柱,流动相0.05mol/L硫酸盐缓冲液-乙腈 (72:28)；流速l.0mL/min；检测波长214nm；进样量20μl。包封率:=W/(W+W游)x100%，式中,W表示脂质体中包封药物量,W游表示游离药物量，结果见下表1：

     表1     包封率比较

组别	包封率（%）
		实施例1	58.41
实施例2	58.38
		实施例3	58.40
实施例4	52.05
		实施例5	53.56
对比例	48.94

 包封率是衡量脂质体制剂质量好坏的最重要的指标之一,由上表可知,实施例1-3组明显优于实施例4-5和对比例，其中实施例1包封率最佳，达58.41%。

2、实验动物

健康雄性大鼠 100只，大鼠饲养环境：保证充足的饮食饮水，定期更换洁净塑料鼠笼，室温 18～22 ℃，光照周期为明亮 、黑暗各 12 h，室内通风良好，氨浓度小于 20ppm，相对湿度为 40%～70%，适应性饲养一周以适应环境。

糖尿病大鼠建模

（1）0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液的配制

A液：柠檬酸（FW：210.14）2.1g溶于100 ml 蒸馏水；

B液：柠檬酸钠（FW：294.10）2.94g溶于100 ml 蒸馏水；

用时各取 A、B 液 50 ml 混合，调节 pH = 4.2 - 4.5,剩余 A、B液4 ℃冰箱存放。

（2）链脲佐菌素溶液（STZ）的配制

快速分装 STZ 粉末1g于小管（干燥、避光），溶于经高压灭菌（120 ℃，20 min）pH = 4.2 的柠檬酸缓冲液中，浓度为 1%，冰浴低温保存。

（3）大鼠糖尿病建模

大鼠建模前12小时禁食不禁水，一次性腹腔注射60 mg/kg pH = 4.2的无菌1% STZ 柠檬酸钠缓冲液，正常组大鼠按各自体重注射相同剂量0.1mol/L 的柠檬酸钠缓冲液。三天后，实验大鼠采血前5小时禁食不禁水，通过尾静脉采血测定空腹血糖值，半定量法测定尿糖，以 FPG ≥16.7mmol/L、尿糖 ≥ +++，并且出现糖尿病典型临床症状“三高一少”的大鼠为造模成功。

造模成功的大鼠被随机分为 7组，每组 9 只，分别为空白组、实施例1-5组、对比例组。再设一组健康对照组，该组由9只健康大鼠组成，空白组和健康对照组按体重每日5ml/Kg蒸馏水灌胃，其他组按体重每日200mg/Kg实施例1-5、对比例制备的重组人胰岛素缓释片灌胃。连续灌胃45天。每隔 15 d，所有大鼠禁食不禁水 5 h，尾静脉采血，离心 (3000 r/min, 10min)，分离血清，葡萄糖氧化酶试剂盒法测空腹血糖值（FPG），记录大鼠血糖变化。45天时，计算实验前后大鼠空腹血糖降低百分率。

血糖降低百分率=（灌胃前血糖值-灌胃45d血糖值）/ 灌胃前血糖值 × 100%

连续灌胃45d后，禁食禁水5h，尾静脉取血，离心取血清，测定血清中甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）和总胆固醇（TC）的含量；取血后，将各组大鼠处死，解剖取肝、脾、肾和胰腺 4 种器官，立即称重，并计算器官质量与体重之比，器官质量（g）/ 体重（kg），即器官系数，实验结果见表2、表3、表4、表5：

        表2   大鼠实验前后体重变化情况

组别	实验前体重（g）	实验后体重（g）	体重增重率（%）
				健康对照组	221.8±12.3	491.5±6.7	121.6
空白组	221.1±10.2	231.7±13.3	4.8
				实施例1	220.7±11.5	384.9±12.4	74.4
实施例2	220.9±9.8	385.0±15.2	74.3
				实施例3	221.3±12.1	385.1±8.6	74.0
实施例4	221.2±10.4	344.9±11.5	55.9
				实施例5	220.6±14.7	349.0±5.6	58.2
对比例	220.9±11.9	308.16±8.3	39.5

 如表2所示，与健康对照组相比，实施例1-5组和空白组的体重增重率都有不同程度的降低，其中空白组尤其显著，实施例1组增重率达74.4%，明显优于实施例4-5组、对比例组和空白组。

表3  对大鼠空腹血糖的影响

组别	实验前空腹血糖（mmol/L）	实验后空腹血糖（mmol/L）	降低率（%）
				健康对照组	5.42±0.38	5.38±0.24	0.74
空白组	23.96±2.04	35.87±0.34	-49.71
				实施例1	24.13±0.51	12.07±0.19	49.98
实施例2	26.50±0.46	13.27±1.29	49.92
				实施例3	24.82±0.26	12.44±0.31	49.88
实施例4	25.39±0.35	17.58±1.07	30.76
				实施例5	26.47±0.27	16.27±0.33	38.53
对比例	25.54±0.36	18.71±0.27	26.74

 由表3可知，实施例1-5组与空白组比较，空腹血糖值有不同程度的降低，其中实施例1降低效果最为明显。实施例1-3工艺参数有所差异但均在范围内，而实施例4-5在范围外，对比例与实施例的差异在于配方、工艺不同，可见本发明配方、工艺及参数配伍科学，三者统一协调，方可使药效达到最优。

表4  灌胃45d后产品对大鼠血脂的影响

组别	TG（mmol/L）	TC（mmol/L）	HDL（mmol/L）
				健康对照组	1.241±0.223	1.739±0.157	1.192±0.201
空白组	2.263±0.186	2.434±0.312	0.395±0.018
				实施例1	1.250±0.074	1.746±0.248	1.007±0.113
实施例2	1.256±0.181	1.752±0.157	0.998±0.054
				实施例3	1.255±0.215	1.760±0.058	0.987±0.016
实施例4	1.538±0.034	1.932±0.121	0.637±0.025
				实施例5	1.559±0.068	1.963±0.092	0.611±0.027
对比例	1.827±0.101	2.082±0.135	0.524±0.031

由表4可知，与健康对照组相比较，空白组的甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL）含量下降，证明了糖尿病大鼠的脂代谢出现紊乱迹象。实施例1-5、对比例与空白组相比较，脂代谢紊乱情况有明显好转，其中实施例1-3优于实施例4-5和对比例，且实施例1效果最优，对比例与实施例1的差异在于配方，有效成分单一的为重组人胰岛素，可见传统中药和重组人胰岛素想联合，可使药效最大化。

表5  灌胃45d后产品对大鼠器官系数的影响

组别	肝脏指数	脾脏指数	肾脏指数	胰腺指数
					健康对照组	2.28±0.05	0.49±0.02	0.56±0.05	0.58±0.11
空白组	4.11±0.22	0.32±0.04	1.09±0.01	0.23±0.09
					实施例1	2.57±0.04	0.45±0.02	0.64±0.03	0.49±0.03
实施例2	2.62±0.17	0.44±0.04	0.66±0.05	0.44±0.04
					实施例3	2.59±0.12	0.45±0.03	0.65±0.02	0.46±0.02
实施例4	3.01±0.06	0.40±0.08	0.78±0.03	0.35±0.04
					实施例5	3.12±0.24	0.36±0.05	0.74±0.06	0.33±0.02
对比例	3.57±0.36	0.34±0.04	0.90±0.01	0.28±0.05

如上表所示，空白组的肝脏指数，肾脏指数较健康组有显著性上升（P＜0.05），脾脏指数和胰腺指数与正常组比较出现显著性降低（P＜0.05）。实施例1-5和对比例对糖尿病大鼠的器官指数具有不同程度的改善，其中实施例1效果最优，可见实施例1的配方、工艺及工艺参数组合效果最优，有利于产品药效的实现。

Claims (2)

1.一种重组人胰岛素缓释片，其特征在于：包括下述重量配比的原料：知母8-12份、黄芪6-8份、茶油籽3-5份、重组人胰岛素11-15份、卵磷脂22-30份、胆固醇6-10份、胶原蛋白3-6份、维生素E 0.8-1.2份、壳聚糖0.4-0.7份；

具体制备方法为：

知母提取物的制备：取知母粉碎至200目，加知母质量12-16倍的质量分数为75-90%的乙醇溶液，于55-65℃提取2次，每次1-3h，合并两次提取液，过滤得知母粗提液，粗提液过D101型大孔吸附树脂柱，上样流速0.8-1.8BV/h，分别用质量分数35%、55%、65%的乙醇溶液各2.5-3.5BV洗脱，醇洗流速1.6-3.2BV/h，收集洗脱液，洗脱液经减压回收乙醇后，浓缩至药液相对密度为1.03-1.08g/ml，冷冻干燥得知母提取物；

黄芪提取物的制备：取黄芪粉碎至100目，回流提取2次，第一次加8-12倍量水提取2h，第二次加6-10倍量水提取1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩至相对密度为1.01-1.05g/ml的清膏，喷雾干燥，得黄芪提取物备用；

茶油籽提取液的制备：取茶油籽脱壳处理得茶油籽仁，于60-90℃条件下，用茶油籽仁质量5-12倍的石油醚回流提取茶油籽仁1-2h，滤过，取滤渣洗净干燥，再加入洗净干燥后的滤渣质量16-22倍的蒸馏水，于50-65℃浸提2次，每次2-3h，收集两次浸提液得茶油籽提取液备用；

磷酸盐缓冲溶液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶于900ml蒸馏水中，调PH值至7.4，加水定容至1L，即得磷酸盐缓冲溶液备用；

重组人胰岛素预处理：将重组人胰岛素溶于重组人胰岛素质量2-4倍的0.01mol/L的HCl溶液中，再加入重组人胰岛素质量6-10倍的PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，得预处理后的重组人胰岛素溶液备用；

重组人胰岛素脂质体冻干粉的制备：将卵磷脂、胆固醇、胶原蛋白、维生素E溶于432-540份的氯仿-乙醚中，得混合液备用，其中氯仿与乙醚的体积比为1:2-4；将上述混合液、预处理后的重组人胰岛素溶液、知母提取物、黄芪提取物充分混合后，水浴超声7-10min，形成稳定的W/O型乳液，将乳液置于旋转蒸发仪中24-27℃减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入26-30份PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液、壳聚糖、茶油籽提取液，在8-12℃水浴旋转孵化20-40min得孵化液，将孵化液经冷冻干燥后得重组人胰岛素脂质体冻干粉备用；

压片成型：将重组人胰岛素脂质体冻干粉粉碎至100目，加入硬脂酸镁、微粉硅胶、羟丙甲基纤维素，混合均匀，压片机压片成型，得重组人胰岛素缓释片。

2.一种重组人胰岛素缓释片，其特征在于：包括下述重量配比的原料：知母9份、黄芪7份、茶油籽4份、重组人胰岛素13份、卵磷脂24份、胆固醇7份、胶原蛋白4份、维生素E 1.0份、壳聚糖0.5份；

具体制备方法为：

知母提取物的制备：取知母粉碎至200目，加知母质量15倍的质量分数为80%的乙醇溶液，于60℃提取2次，每次2h，合并两次提取液，过滤得知母粗提液，粗提液过D101型大孔吸附树脂柱，上样流速1.4BV/h，分别用质量分数35%、55%、65%的乙醇溶液各2.9BV洗脱，醇洗流速2.4BV/h，收集洗脱液，洗脱液经减压回收乙醇后，浓缩至药液相对密度为1.05g/ml，冷冻干燥得知母提取物；

黄芪提取物的制备：取黄芪粉碎至100目，回流提取2次，第一次加10倍量水提取2h，第二次加8倍量水提取1.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩至相对密度为1.03g/ml的清膏，喷雾干燥，得黄芪提取物备用；

茶油籽提取液的制备：取茶油籽脱壳处理得茶油籽仁，于75℃条件下，用茶油籽仁质量8倍的石油醚回流提取茶油籽仁1.5h，滤过，取滤渣洗净干燥，再加入洗净干燥后的滤渣质量19倍的蒸馏水，于60℃浸提2次，每次2.5h，收集两次浸提液得茶油籽提取液备用；

磷酸盐缓冲溶液：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠3.63g、磷酸二氢钾0.24g，溶于900ml蒸馏水中，调PH值至7.4，加水定容至1L，即得磷酸盐缓冲溶液备用；

重组人胰岛素预处理：将重组人胰岛素溶于重组人胰岛素质量3倍的0.01mol/L的HCl溶液中，再加入重组人胰岛素质量8倍的PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，得预处理后的重组人胰岛素溶液备用；

重组人胰岛素脂质体冻干粉的制备：将卵磷脂、胆固醇、胶原蛋白、维生素E溶于485份的氯仿-乙醚中，得混合液备用，其中氯仿与乙醚的体积比为1:3；将上述混合液、预处理后的重组人胰岛素溶液、知母提取物、黄芪提取物充分混合后，水浴超声8min，形成稳定的W/O型乳液，将乳液置于旋转蒸发仪中25℃减压除去溶剂，旋转形成胶态后，加入28份PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液、壳聚糖、茶油籽提取液，在10℃水浴旋转孵化30min得孵化液，将孵化液经冷冻干燥后得重组人胰岛素脂质体冻干粉备用；

压片成型：将重组人胰岛素脂质体冻干粉粉碎至100目，加入硬脂酸镁、微粉硅胶、羟丙甲基纤维素，混合均匀，压片机压片成型，得重组人胰岛素缓释片。