CN101181373B - 丹皮有效部位药物组合物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

丹皮有效部位药物组合物、其制备方法及应用，其特征是所述药物组合物以重量百分比计，含丹皮酚10～40％、含丹皮总苷10～50％；其中，丹皮酚和丹皮总苷的总量不低于50％。其制备方法是将丹皮药材粉末或饮片加水浸泡并加热蒸馏，馏出液经冷却放置，析出结晶得丹皮酚；将蒸馏器中的丹皮水浸液过滤得滤渣和滤液，滤渣经乙醇溶液提取，提取液和滤液上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用醇洗脱，收集醇洗脱液；减压回收醇，经浓缩、干燥得丹皮总苷；丹皮酚与丹皮总苷混合，制得丹皮有效部位组合物。本发明的丹皮有效部位组合物可用于制备预防和治疗脂肪代谢性疾病及心脑血管疾病的药物。

Description

丹皮有效部位药物组合物、其制备方法及应用

                                技术领域

本发明涉及丹皮有效部位组合物及其制备方法，以及其在制备治疗或预防脂肪代谢性疾病及心脑血管疾病的药物中的应用。

                                背景技术

机体脂质代谢紊乱可引发脂肪肝、高脂血症、动脉粥样硬化等多种心脑血管疾病。脂肪肝并非临床上的一个独立性疾病，而是多种疾病和原因引起的肝内脂质，主要为甘油三酯的蓄积过多的一种病理状态，也是多种肝脏疾病发展中的常见病理过程，发病率约占平均人口的10％。虽通常被认为是一种良性及静止的病变，若其致病因子持续作用，可在较短期内发展为不可逆的肝损害，是肝硬化和肝癌的重要前期病变，也是肝功能衰竭的原因之一，体重过重和肥胖者发现脂肪肝常提示为恶性肥胖，后者与糖耐量异常、高脂血症和高血压统称为死亡四重奏，极易合并致命性心脑血管疾病。目前治疗脂肪肝的西药可分为降脂药和护肝去脂药，前者使用临床争议较大，虽能降低血脂，但保肝作用不明显；后者药物大多存在价格昂贵或疗效不显著的不足。目前中医药是治疗脂肪肝的主要手段，中药复方由于无法做到质量稳定可控、服用携带方便，故临床较多使用中成药，但现有药物品种少且疗效并不确切。

高脂血症是人体脂质代谢失常，血浆内脂质浓度超过正常范围的病症，长期高脂血症易导致动脉硬化加速，尤其是引发和加剧冠心病及脑血管疾病等。药物治疗是治疗高脂血症的最重要部分，对高胆固醇血症者，可选用还原酶抑制剂(他汀类药物)；高甘油三脂血症者，可选用烟酸类如阿西莫司(乐脂平)、贝特类如非诺贝特(力平脂)、苯扎贝特(必降脂)、吉非罗齐(诺衡)等，这些药物有一定的降脂作用，但都有较明显的毒副作用，长期服用常易导致肝功能损害。

动脉粥样硬化是动脉血管内复杂的病理变化，是缺血性心脑血管病的主要病理基础。而心脑血管病的发病率、致残率均高，是人体健康和生命的最大威胁。目前用于医治动脉粥样硬化心血管疾病的药主要是他汀类，主要的作用机理是通过抑制肝脏HMG-CoA还原酶来减少血浆中的胆固醇的生成，达到抑制动脉粥样硬化发展的目的。但是，第二代抗动脉粥样硬化他汀类药只能通过减少血浆胆固醇的生成抑制动脉粥样硬化发展，不能将已生成的胆固醇排除体外，更不能消除动脉粥样硬化斑块，使硬化的血管恢复正常。因此降脂虽然是当前防治动脉粥样硬化的基本策略，仍应重视对多重危险因素的综合控制，与其他抗动脉粥样硬化药物联合应用以及抗炎治疗等，必将是今后动脉粥样硬化防治的新趋势。

面临广阔良好的市场前景，特别是在需求量大而又暂无特效药的脂肪肝、高脂血症、动脉粥样硬化等多种心脑血管疾病治疗领域，开发有效的治疗药物有着十分重要的现实意义。

牡丹皮，别名丹皮、粉丹皮、凤丹皮等，系毛茛科植物牡丹Paeonia suffrution Andr.的干燥根皮，其主要含有丹皮酚；牡丹酚苷、牡丹皮原苷、丹皮酚新苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷等苷类，多糖和鞣质类等成分。具有清热凉血，活血化瘀之功效。现代研究证实：丹皮总苷对小鼠化学性肝损伤有保护作用，还可降低损伤组肝脏肝匀浆脂质过氧化物丙二醛的含量，提高血清和肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活力，清除体内有害自由基，增强机体抗氧化作用。

已有研究表明，丹皮酚对鹌鹑和家兔实验性动脉粥样硬化模型具有降低血清和病变局部脂质含量，改善血液流变性、抗动脉粥样硬化，抗炎、显著抑制高脂大鼠血清、主动脉及肝脏脂质过氧化反应等药理作用。

中国专利CN1418673A和CN1788753A分别提供了一种丹皮总苷的制备方法，但其所述方法制备的丹皮总苷，主要为水溶性的苷类成分，不包括丹皮的主要活性成分丹皮酚。

                                发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种质量稳定可控、制备方法简单而有利于工业化生产应用的丹皮有效部位药物组合物及其制备方法；本发明同时提供该丹皮有效部位药物组合物在制备治疗或预防脂肪代谢性疾病及心脑血管疾病的药物中的合理应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

本发明丹皮有效部位药物组合物的特点是含有丹皮酚和丹皮总苷，以重量百分比计，含丹皮酚10～40％、含丹皮总苷10～50％；其中，丹皮酚和丹皮总苷的总量不低于50％。

本发明丹皮有效部位药物组合物的特点也在于：

以重量百分比计，含丹皮酚20～30％、含丹皮总苷20～40％。

所述丹皮总苷的成分包括有芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹酚苷、牡丹皮原苷和丹皮酚新苷。

药物制剂为软胶囊剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、口服溶液剂、注射剂、输液剂或注射用冻干粉。

本发明丹皮有效部位药物组合物制备方法的特点是按如下步骤进行：

a.将丹皮药材粉末或饮片，加水浸泡并加热蒸馏，馏出液经冷却放置，析出结晶，得丹皮酚；将蒸馏器中的丹皮水浸液过滤，滤液和滤渣备用；

b.采用如下两种方式

方式一：取步骤a所得滤渣，按每1g滤渣加入2～20ml的水提取1～3次，每次0.5～3小时；合并提取液，与步骤a所得滤液合并，过滤；上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用醇洗脱，收集醇洗脱液；减压回收醇，浓缩、干燥，得丹皮总苷；

方式二：取步骤a所得滤渣，按每1g滤渣加入2～20ml的浓度为5％～95％的乙醇溶液提取1～3次，每次0.5～3小时；合并提取液，回收乙醇后，与步骤a所得滤液合并，过滤；上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用醇洗脱，收集醇洗脱液；减压回收醇，浓缩、干燥，得丹皮总苷；

c.丹皮酚与丹皮总苷混合，添加药物中可以接受的辅助成分，制得丹皮有效部位组合物。

本发明制备方法的特点也在于所述步骤a是按每1g丹皮药材粉末或饮片加入4～30ml的水蒸馏，收集蒸馏液；步骤b中所述大孔吸附树脂包括各种非极性、弱极性、中极性、极性的大孔吸附树脂；步骤b中所述洗脱用醇为20％～90％乙醇。

本发明丹皮有效部位药物组合物在制备以下药物中应用：

在制备治疗或预防脂肪代谢性疾病及心脑血管疾病的药物中的应用。

在制备治疗或预防脂肪肝疾病的药物中的应用。

在制备治疗或预防高脂血症和动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。

在制备治疗或预防缺血性脑血管病的药物中的应用。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

本发明的丹皮有效部位组合物，有效成分明确，主成分含量和比例相对固定，质量稳定可控，成本较低。

动物实验证明，本发明丹皮有效部位组合物对脂肪肝、高血脂、动脉粥样硬化和心脑缺血动物模型具有较强的防治作用。该有效部位组合物对脂肪肝的作用可从丹皮酚的调理脂质代谢、抗脂质过氧化反应和丹皮总苷对肝损伤保护作用而得到实验依据的支持。该有效部位组合物对高血脂和动脉粥样硬化等心脑血管疾病的作用可通过丹皮酚及丹皮总苷的调理脂质代谢、抗脂质过氧化反应、改善血液流变性、抗炎等作用途径实现。

                               附图说明

图1为本发明的有效部位组合物中丹皮酚含量测定的HPLC图谱。

图2为本发明的有效部位组合物中丹皮总苷含量测定的HPLC图谱。

本发明首先证实了丹皮有效部位组合物中各成分的协同作用，并采用多种动物模型进行研究，和已有药物作对照，表明该丹皮有效部位组合物具有治疗或预防脂质代谢性疾病及心脑血管疾病的作用。其方法和结果见试验例1～5。

本发明的丹皮有效部位组合物含量测定的方法：

丹皮酚照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(45∶55)为流动相；检测波长为274nm。理论塔板数以丹皮酚计算应不低于5000。

对照品溶液的制备精密称取丹皮酚对照品适量，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品约25mg，精密称定，至25mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取该溶液1mL，置10mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，离心，即得。

本品按干燥品计算，含丹皮酚应为10～40％。

丹皮总苷照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-异丙醇-冰醋酸(67∶173∶4∶4)为流动相；检测波长为230nm。理论塔板数以苯甲酸计算应不低于1500。

对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的芍药苷对照品适量，加5％氢氧化钠溶液制成每1mL含0.5mg的溶液；精密吸取该溶液1mL，置5mL具塞试管中，沸水浴水解2小时，冷却，移至25mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取本品约30mg，精密称定，至25mL量瓶中，加5％氢氧化钠溶液约20mL，超声5分钟，放冷，用5％氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀；精密吸取该溶液1mL，置5mL具塞试管中，沸水浴水解2小时，冷却，移至25mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，离心，即得。

本品按干燥品计算，含丹皮总苷以芍药苷(C₂₃H₂₈O₁₁)计，应为10～50％。

                              具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1丹皮有效部位组合物的制备

取丹皮药材5kg，切成饮片，放入蒸馏器中，加水20L蒸馏，收集蒸馏液8L，冷藏(0～10℃)，过夜，滤过，得丹皮酚结晶29g。将蒸馏器中的丹皮水浸液过滤，滤液放置待用。取上述滤渣，加50L水提取3次，每次1小时；合并提取液，上述滤液合并，上大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱，再用90％乙醇洗脱，收集90％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥得丹皮总苷221g。丹皮酚与丹皮总苷混合，制得丹皮有效部位组合物250g，收率为5.0％。经测定：所得丹皮有效部位组合物中含丹皮酚和丹皮总苷总量为58.3％，其中丹皮酚11.6％、丹皮总苷46.7％。

上述组合物，加至熔融的聚乙二醇₄₀₀₀中，滴制成滴丸剂50mg/粒，用法与用量为每次12粒，每天两次。

实施例2丹皮有效部位组合物的制备

取丹皮药材5kg，切成饮片，放入蒸馏器中，加水40L蒸馏，收集蒸馏液25L，冷藏(0～10℃)，过夜，滤过，得丹皮酚结晶67g。将蒸馏器中的丹皮水浸液过滤，滤液放置待用。取上述滤渣，加100L 50％乙醇提取1次，提取3小时；合并提取液，减压回收乙醇后与上述滤液合并，上大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱，再用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥得丹皮总苷260.5g。丹皮酚与丹皮总苷混合，制得丹皮有效部位组合物327.5g，收率为6.55％。经测定：所得丹皮有效部位组合物中含丹皮酚和丹皮总苷总量为57.3％，其中丹皮酚20.5％、丹皮总苷36.8％。

上述组合物，混悬于一定量大豆油中，加入蜂蜡助悬；另将明胶、甘油加入一定量水中，溶解。用软胶囊机制成软胶囊0.5g/粒，用法与用量为每次3粒，每天两次。

实施例3丹皮有效部位组合物的制备

取丹皮药材5kg，粉碎成粗粉，放入蒸馏器中，加水100L蒸馏，收集蒸馏液75L，冷藏(0～10℃)，过夜，滤过，得丹皮酚结晶88g。将蒸馏器中的丹皮水浸液过滤，滤液放置待用。取上述滤渣，加40L水，提取2次，每次1小时；合并提取液，并与上述滤液合并，上大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱，再用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥得丹皮总苷288g。丹皮酚与丹皮总苷混合，制得丹皮有效部位组合物376g，收率为7.54％。经测定：所得丹皮有效部位组合物中含丹皮酚和丹皮总苷总量为52.6％，其中丹皮酚23.4％、丹皮总苷29.2％。

上述组合物，加入乳糖、硬脂酸镁适量，混匀，制成薄膜包衣片剂0.3g/粒，用法与用量为每次3粒，每天两次。

实施例4丹皮有效部位组合物的制备

取丹皮药材5kg，切成饮片，放入蒸馏器中，加水150L蒸馏，收集蒸馏液100L，冷藏(0～10℃)，过夜，滤过，得丹皮酚结晶85g。将蒸馏器中的丹皮水浸液过滤，滤液放置待用。取上述滤渣，加20L 80％乙醇提取3次，每次0.5小时；合并提取液，减压回收乙醇后与上述滤液合并，上大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱，再用20％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥得丹皮总苷178g。丹皮酚与丹皮总苷混合，制得丹皮有效部位组合物263g，收率为5.26％。经测定：所得丹皮有效部位组合物中含丹皮酚和丹皮总苷总量为53.9％，其中丹皮酚32.3％、丹皮总苷21.6％。

上述组合物，加至熔融的聚乙二醇₄₀₀₀中，滴制成滴丸剂65mg/粒，用法与用量为每次12粒，每天两次。

实施例5丹皮有效部位组合物的制备

取丹皮药材5kg，切成饮片，放入蒸馏器中，加水120L蒸馏，收集蒸馏液70L，冷藏(0～10℃)，过夜，滤过，得丹皮酚结晶92g。将蒸馏器中的丹皮水浸液过滤，滤液放置待用。取上述滤渣，加30L 95％乙醇提取2次，每次1小时；合并提取液，减压回收乙醇后与上述滤液合并，上大孔吸附树脂柱层析，先用水洗脱，再用40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥得丹皮总苷149g。丹皮酚与丹皮总苷混合，制得丹皮有效部位组合物241g，收率为4.82％。经测定：所得丹皮有效部位组合物中含丹皮酚和丹皮总苷总量为50.3％，其中丹皮酚38.2％、丹皮总苷12.1％。

上述组合物，加至熔融的聚乙二醇₄₀₀₀中，滴制成滴丸剂50mg/粒，用法与用量为每次12粒，每天两次。

试验例1丹皮有效部位组合物降低胆固醇作用研究

1.1材料：

丹皮有效部位组合物1：由实施例1制备而得，有效组合物纯度为58.3％，其中含丹皮酚11.6％、丹皮总苷46.7％；

丹皮有效部位组合物2：由实施例2制备而得，有效组合物纯度为57.3％，其中含丹皮酚20.5％、丹皮总苷36.8％；

丹皮有效部位组合物3：由实施例3制备而得，有效组合物纯度为52.6％，其中含丹皮酚23.4％、丹皮总苷29.2％；

丹皮有效部位组合物4：由实施例4制备而得，有效组合物纯度为53.9％，其中含丹皮酚32.3％、丹皮总苷21.6％；

丹皮有效部位组合物5：由实施例5制备而得，有效组合物纯度为50.3％，其中含丹皮酚38.2％、丹皮总苷12.1％；

丹皮酚：由实施例3制备而得，含丹皮酚纯度为100％；

丹皮总苷：由实施例3制备而得，含丹皮总苷纯度为38％；

75％的蛋黄乳液：取市售新鲜鸡蛋仔细剥离蛋黄外包膜后抽去蛋黄，用生理盐水配制而成。

总胆固醇的测定试剂盒：北京市福瑞生物工程公司。

实验动物：昆明种小鼠体重18～22克，雌雄兼用，安徽省医学科学研究所动物中心提供。

1.2方法

选用小鼠100只，雄性，随机分为10组：空白对照组、模型对照组、阳性对照药血脂康组(240mg/kg)、丹皮有效部位组合物1组、2组、3组、4组、5组(80mg/kg)、丹皮酚组(80mg/kg)、丹皮总苷组(80mg/kg)。每组10只，适应性地饲养2d。以上各组小鼠灌胃给药，每日一次(0.2mg/10g)连续给药6d，正常对照组及模型对照组以等量0.5％CMC-Na溶液灌胃。末次给药2h后，除空白对照组以外，其余各组动物腹腔注射75％的蛋黄乳液0.5ml/只，8h后禁食，自由饮水。12h后再灌胃给药，1h后摘眼球取血。30min后，以3000r/min离心10min，分离血清，取10μl血清用终点法试剂盒测定总胆固醇值。结果以

表示，用t检验进行统计学处理。

1.3结果

与模型组比较，各用药组均可降低血清总胆固醇水平；与单独使用丹皮酚或丹皮总苷组比较，丹皮有效部位组合物组比单独用药组表现出明显的协同作用，尤以丹皮有效部位组合物3组降脂作用最显著，见表1.1。

表1.1丹皮有效部位组合物对高脂小鼠总胆固醇的影响

组别	动物数	总胆固醇(mmol/L)
			正常组模型组血脂康组丹皮酚和丹皮总苷组合物1丹皮酚和丹皮总苷组合物2丹皮酚和丹皮总苷组合物3丹皮酚和丹皮总苷组合物4丹皮酚和丹皮总苷组合物5丹皮酚丹皮总苷	10101010101010101010	2.76±0.558.80±2.50<sup>##</sup>4.98±2.31<sup>★★</sup>4.40±1.53<sup>★★△</sup>4.37±1.70<sup>★★△</sup>4.05±1.73<sup>★★*△</sup>4.20±1.81<sup>★★△</sup>4.28±1.62<sup>★★△</sup>5.96±2.14<sup>★</sup>6.07±2.04<sup>★</sup>

与正常组相比，^##P＜0.01；与模型组相比，^★P＜0.05  ^★★P＜0.01；

与丹皮酚组相比，^*P＜0.05；与丹皮总苷组相比，^△P＜0.05

试验例2丹皮有效部位组合物对实验性脂肪肝大鼠的影响

2.1材料：

丹皮有效部位组合物：由实施例3制备而得，有效组合物纯度为52.6％，其中含丹皮酚23.4％、丹皮总苷29.2％；

脂肪剂：含猪油10％，胆固醇1.2％，胆酸钠0.2％；

四氯化碳：配制成40％的四氯化碳花生油溶液；

酒：酒精含量30％。

实验动物：普通级wistar大鼠，雄性，体重200-250g，安徽省医学科学研究所动物中心提供。

2.2方法

48只大鼠随机分为6组。正常对照组给予普通饲料喂养。模型组、丹皮有效部位组合物大、中、小剂量组以及水飞蓟宾组大鼠每天灌胃脂肪乳剂(猪油10％，胆固醇1.2％，胆酸钠0.2％)及30％酒，1mL/100g，连续8周。同时皮下注射40％四氯化碳花生油溶液，按0.3ml/100g，每周两次，3周后停注。正常组灌胃等量蒸馏水以及皮下注射等量生理盐水。每周称重1次，根据体重调节药量。

造模4周后检测血清ALT、AST及肝脏TC和TG，确定造模成功后开始给药，各给药组分别给予丹皮有效部位组合物大(40mg/kg)、中(80mg/kg)、小(160mg/kg)剂量和水飞蓟宾(23mg/kg)的0.5％CMC-Na混悬液，1mL/100g，正常组和模型组给予等量0.5％CMC-Na混悬液，连续4周。

造模8周后，禁食不禁水16h，末次给药2h后，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3000p/m离心15min，取血清-20℃保存，用于血清TC、TG、FFA、ALT、AST的检测；同时迅速取出肝脏，冰生理盐水冲洗，滤纸吸湿后称取湿重，取0.5g左右加入预冷的生理盐水，冰水中制成10％匀浆，4℃3000p/m匀浆1min制成肝匀浆，3000p/m离心15min，取上清液，用于检测肝脏FFA的含量；再取1g肝组织，4℃3000p/m匀浆1min制成肝匀浆，用氯仿∶甲醇(1∶1，V/V)9ml抽提脂质，静止12h，3000p/m离心15min，取上清液，用于检测肝脏TC、TG；另取同一部位的肝组织置于10％的甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察肝脏病理学变化。实验结果数据以

表示，应用SPSS12.0统计软件包，组间比较使用单因素方差分析。

2.3结果

2.3.1丹皮有效部位组合物对实验性脂肪肝大鼠血清ALT、AST的影响

模型组大鼠血清ALT、AST显著升高，表明模型组大鼠肝细胞受损严重；各给药组均能显著改善肝损伤，保护肝细胞，见表2.1。

表2.1丹皮有效部位组合物对实验性脂肪肝大鼠血清ALT、AST的影响

组别	剂量(mg/kg)	ALT(U/mgprot)	AST(U/mgprot)
				正常组模型组丹皮有效部位组合物水飞蓟宾	--408016023	37.17±7.04104.22±13.59<sup>##</sup>89.70±9.93<sup>★</sup>73.59±12.26<sup>★★</sup>81.80±11.51<sup>★★</sup>88.60±13.02<sup>★</sup>	59.65±4.84151.04±14.39<sup>##</sup>129.44±20.18<sup>★</sup>128.17±16.15<sup>★★</sup>126.02±12.42<sup>★★</sup>130.70±12.15<sup>★</sup>

注：与空白组相比^##P＜0.01；与模型组相比^★P＜0.05，^★★P＜0.01

2.3.2丹皮有效部位组合物对实验性脂肪肝大鼠肝脏TC、TG和FFA的影响

模型组大鼠肝脏TC、TG和FFA显著升高，表明模型组肝脏TC、TG和FFA代谢异常。丹皮有效部位组合物80mg/kg和160mg/kg对TC、TG和FFA均有不同程度改善作用，丹皮有效部位组合物40mg/kg对TG也有明显降低作用，见表2.2。

表2.2丹皮有效部位组合物对实验性脂肪肝大鼠肝脏TC、TG和FFA的影响

组别	剂量(mg/kg)	TC(mmol/L)	TG(mmol/L)	FFA(umol/gprot)
					正常组模型组丹皮有效部位组合物水飞蓟宾	--408016023	2.35±0.303.31±0.32<sup>##</sup>3.02±0.452.89±0.41<sup>★</sup>2.78±0.43<sup>★</sup>2.90±0.24<sup>★</sup>	2.06±0.325.52±1.60<sup>##</sup>3.46±0.78<sup>★★</sup>2.95±0.68<sup>★★</sup>2.92±0.46<sup>★★</sup>3.08±0.26<sup>★★</sup>	49.15±9.4478.10±7.35<sup>##</sup>67.79±23.3659.16±12.14<sup>★★</sup>47.51±7.03<sup>★★</sup>64.40±20.31

注：与空白组相比^##P＜0.01；与模型组相比^★P＜0.05，^★★P＜0.01

2.3.3丹皮有效部位组合物对肝组织病理形态影响

肉眼观察：正常组肝脏颜色鲜红，大小无异常，而模型组大鼠肝脏明显肿大，并呈黄褐色，触之有油腻感；各给药组大鼠的肝脏肿大程度均有不同程度减轻，色泽较红。

组织病理形态观察：正常组的肝细胞内几乎无脂滴分布，肝窦清晰可见，肝索排列整齐。模型组大鼠肝脏均出现重度肝细胞脂肪变性，肝细胞增大，胞浆内脂滴大而多被染成橘红色，肝窦受压变窄，肝索排列紊乱；各给药组脂变肝细胞数目明显减少，胞浆内脂滴减少。

2.4结论

丹皮有效部位组合物可不同程度降低血清ALT、AST，改善肝损伤，保护肝细胞；降低肝脏TG、TC、FFA含量，减少肝脏脂质沉积；对肝脏病理形态学异常有明显改善作用。

试验例3丹皮有效部位组合物对实验性高脂血症大鼠的影响

3.1材料：

丹皮有效部位组合物：由实施例3制备而得，有效组合物纯度为52.6％，其中含丹皮酚23.4％、丹皮总苷29.2％；

血脂康胶囊：北京北大维信生物科技有限公司产品；

胆固醇：上海医药集团特种试剂公司；

猪胆盐：上海求精生生化试剂有限公司；

TC试剂盒、TG试剂盒、HDL试剂盒、LDL试剂盒：均为奥斯生物工程有限公司生产。

实验动物：普通级wistar大鼠，雄性，体重200-250g，安徽省医学科学研究所动物中心提供。

3.2方法

取正常大鼠8只为空白对照组，其余40只大鼠随机均分成5组，每组8只，依次为模型对照组、丹皮有效部位组合物大、中、小剂量组；丹皮酚组、丹皮总苷组以及阳性药(血脂康)对照组。采用高脂乳剂(胆固醇10％，猪油20％，猪胆盐2％，丙基硫氧嘧啶1％)造模，各组大鼠每天每只按10ml.Kg^-1灌胃，连续20天。造模同时空白、模型对照以等容量0.5％CMC-Na溶液灌胃，阳性对照组(血脂康67.5mg.Kg^-1)、丹皮有效部位组合物大(40mg/kg)、中(80mg/kg)、小(160mg/kg)剂量灌胃给药，给药容量为10ml.Kg^-1。各组动物于给药后第20天禁食12h，称重，经心脏取血，分离血清，测定TC、TG、HDL、LDL、VLDL的含量。

3.3结果

模型组大鼠血清TC、TG和LDL、VLDL的含量显著升高，HDL降低，表明模型组血脂代谢异常。丹皮有效部位组合物不同剂量组对血清TC、TG、LDL、VLDL有不同程度改善作用，但对HDL的作用不明显，见表3.1和表3.2。

表3.1丹皮有效部位组合物对血清脂质含量的影响

组别	剂量(mgg/g)	TC(mmol.L<sup>-1</sup>)	TG(mmol.L<sup>-1</sup>)
				正常组模型组丹皮有效部位组合物血脂康	--408016067.5	1.06±0.2022.38±4.62<sup>##</sup>15.36±2.19<sup>★★</sup>10.14±1.81<sup>★★</sup>5.21±3.08<sup>★★</sup>13.57±5.36<sup>★★</sup>	0.35±0.100.81±0.24<sup>#</sup>0.53±0.20<sup>★</sup>0.56±0.18<sup>★</sup>0.42±0.09<sup>★</sup>0.51±0.21<sup>★</sup>

注：与空白组相比^##P＜0.01；与模型组相比^★P＜0.05，^★★P＜0.01

表3.2丹皮有效部位组合物对血清脂蛋白含量的影响

组别	剂量(mg/kg)	LDL(mmol.L<sup>-1</sup>)	VLDL(mmol.L<sup>-1</sup>)	HDL(mmol.L<sup>-1</sup>)
					正常组模型组丹皮有效部位组合物血脂康	--408016067.5	0.197±0.15918.741±3.135<sup>##</sup>4.350±2.723<sup>★★</sup>4.465±2.392<sup>★★</sup>3.466±1.941<sup>★★</sup>8.359±1.852<sup>★★</sup>	0.398±0.0782.020±1.208<sup>##</sup>0.435±0.302<sup>★★</sup>0.368±0.183<sup>★★</sup>0.381±0.075<sup>★★</sup>0.340±0.180<sup>★★</sup>	1.716±0.4450.471±0.106<sup>##</sup>0.667±0.3700.665±0.3470.740±0.5140.606±0.234

注：与空白组相比^##P＜0.01；与模型组相比^★P＜0.05，^★★P＜0.01

3.4结论

丹皮有效部位组合物可不同程度降低实验性高脂血症大鼠血清TC、TG和LDL、VLDL的含量，但对HDL的改善作用不明显。

试验例4丹皮有效部位组合物对实验性动脉粥样硬化家兔的影响

4.1材料：

丹皮有效部位组合物：由实施例3制备而得，有效组合物纯度为52.6％，其中含丹皮酚23.4％、丹皮总苷29.2％；

血脂康胶囊：北京北大维信生物科技有限公司产品；

胆固醇：上海医药集团特种试剂公司；

猪胆盐：上海求精生生化试剂有限公司；

TC试剂盒、TG试剂盒、HDL试剂盒、LDL试剂盒：均为奥斯生物工程有限公司生产。

实验动物：健康日本大耳白兔，雄性，体重2～2.5Kg，由安徽医科大学实验动物中心提供。

4.2方法

采用高脂饲料(配方(％)：面粉84，麸皮4，骨粉和贝粉6，胆固醇1，猪油5，猪胆盐0.05)喂养，各组家兔每天每只进食总量相等，限制为120g，共造模12周。

取正常家兔6只为空白对照组，其余采用高脂饮食造模12周，待造模成功后，取模型家兔随机均分成5组，每组6只，依次为模型对照组、丹皮有效部位组合物大、中、小剂量组以及阳性药(血脂康)对照组。空白、模型对照以等容量0.5％CMC-Na溶液灌胃，阳性对照组(血脂康67.5mg.Kg^-1)、丹皮有效部位组合物大(40mg/kg)、中(80mg/kg)、小(160mg/kg)剂量灌胃给药，给药容量为10ml.Kg^-1，连续给药6周，其间每隔2周称重一次，以调整给药剂量。

各组动物于给药开始后第6周末(实验第18周末)，禁食12h，称重，经心脏取血，分离血清，测定TC、TG、HDL、LDL、VLDL的含量。处死家兔，取出主动脉，将其上得脂肪组织剔除，并与背侧面纵行切开。

4.2.1肉眼观察：家兔主动脉，腹主动脉色泽，形态等，平铺于滤纸上，进行肉眼分级，采用等级序值法计算出每组粥样斑块的平均等级序值，然后进行统计分析。并将主动脉硬化斑块进行照相观察，用自动图象分析仪测定主动脉内膜总面积，斑块面积及两者百分比即百分率法。0级：无病变；I级：病变占1％～25％；II级：病变占26％～50％；III级：病变占51％～75％；IV级：病变占76％～100％。

4.2.2光镜观察：取相同的动脉段，用10％中性福尔马林固定，常规石蜡包埋、连续切片，HE染色，光镜检查，并定量观测内膜及中膜厚度的比值：在10×10倍放大下，用1/10mm目镜测微尺观测内膜及中膜厚度，算出厚度平均值。

4.3结果

4.3.1丹皮有效部位组合物对血清脂质和脂蛋白含量的影响

与空白组比较，模型对照组家兔血清TC、TG、LDL、VLDL均显著增高。与模型组比较，丹皮有效部位组合物能不同程度降低家兔血清TC、TG、LDL、VLDL的水平，但各药物对HDL水平均无明显影响，见表4.1和表4.2。

表4.1丹皮有效部位组合物对血清脂质含量的影响

组别	剂量(mg/kg)	TC(mmol.L<sup>-1</sup>)	TG(mmol.L<sup>-1</sup>)
				正常组模型组丹皮有效部位组合物血脂康	--408016067.5	1.07±0.2017.29±6.02<sup>##</sup>12.16±4.195.14±2.16<sup>★★</sup>4.25±3.18<sup>★★</sup>5.36±2.19<sup>★★</sup>	0.43±0.101.04±0.35<sup>#</sup>0.64±0.21<sup>★</sup>0.63±0.19<sup>★</sup>0.52±0.23<sup>★★</sup>0.58±0.20<sup>★</sup>

注：与空白组相比^##P＜0.01；与模型组相比^★P＜0.05，^★★P＜0.01

表4.2丹皮有效部位组合物对血清脂蛋白含量的影响

组别	剂量(mg/kg)	LDL(mmol.L<sup>-1</sup>)	VLDL(mmol.L<sup>-1</sup>)	HDL(mmol.L<sup>-1</sup>)
					正常组模型组丹皮有效部位组合物血脂康	--408016067.5	0.20±0.1616.67±3.14<sup>##</sup>10.65±4.36<sup>★</sup>8.34±2.92<sup>★★</sup>6.57±2.09<sup>★★</sup>10.36±3.26<sup>★</sup>	0.41±0.162.35±1.30<sup>##</sup>0.98±0.31<sup>★</sup>0.69±0.23<sup>★</sup>0.37±0.29<sup>★★</sup>0.37±0.20	1.58±0.200.72±0.45<sup>##</sup>0.76±0.320.85±0.230.93±0.300.90±0.31

注：与空白组相比^##P＜0.01；与模型组相比^★P＜0.05，^★★P＜0.01

4.3.3丹皮有效部位组合物对主动脉病理形态学的影响

肉眼观察：空白对照组主动脉内壁光滑，未见脂质斑点、脂质条纹及粥样斑块。模型对照组主动脉弓至腹主动脉处具有明显的粥样斑块。斑块几乎覆盖整条主动脉，尤其主动脉弓处斑块色黄且明显隆起。

血脂康组、丹皮有效部位组合物大、中、小剂量组和丹皮酚组主动脉弓处有粥样斑块，腹主动脉处粥样斑块少，与模型组比较，且斑块所占覆盖面积小且斑块较薄。各组主动脉斑块面积百分率见下表。模型组粥样斑块面积百分率最大，各给药组均能显著缩小动脉斑块面积，见表4.3。

表4.3丹皮有效部位组合物对主动脉斑块面积百分率影响

组别	剂量(mg/kg)	主动脉斑块面积百分率(％)
			正常组模型组丹皮有效部位组合物血脂康	--408016067.5	0.0±0.065.4±9.1<sup>##</sup>49.9±9.5<sup>★</sup>45.6±10.1<sup>★</sup>43.9±8.6<sup>★★</sup>44.0±5.6<sup>★★</sup>

注：与空白组相比^##P＜0.01；与模型组相比^★P＜0.05，^★★P＜0.01

4.4结论

丹皮有效部位组合物对实验性动脉粥样硬化家兔血清TC、TG、LDL、VLDL水平有不同程度的改善作用，但对HDL含量影响不大；显著降低主动脉斑块面积百分率，表明可抑制主动脉斑块的形成。

试验例5丹皮有效部位组合物对心、脑缺血大鼠的影响

5.1材料：

丹皮有效部位组合物：由实施例3制备而得，有效组合物纯度为52.6％，其中含丹皮酚23.4％、丹皮总苷29.2％；

心脑舒通胶囊：由吉林敖东兆南药业股份有限公司提供；

实验动物：雄性SD大鼠，雄性，体重250～20g，由安徽医科大学实验动物中心提供。

5.2方法：

5.2.1丹皮有效部位组合物对心肌梗死大鼠的影响

动物模型复制：用3％戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠。行气管插管，小动物呼吸机室内空气通气，频率90次/min，潮气量3-4mL。持续监测心电图变化。胸部去毛、消毒，沿左锁骨中线纵行切开皮肤，在第4肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，用穿有5-0缝合线的3/8弯针钩绕左冠状动脉前降支主干后，把心脏放回胸腔，结扎冠脉，迅速缝合胸壁，停止人工呼吸，清除呼吸道分泌物，缝合关闭气管，20h后处死。结扎10min心电图ST段没有变化者淘汰。

动物分组及给药方法：60只大鼠随机均分为假手术组、模型组、丹皮有效部位组合物大(40mg/kg)、中(80mg/kg)、小(160mg/kg)剂量以及阳性药(心脑舒通30mg/kg)对照组。按照模型制作方法进行造模，并于造模前灌服相应剂量的药物(1ml/100g)7天。

处死大鼠，切除心脏，放置-4℃冰箱30min后取出。从心尖向心底方向将心脏均匀切为4片，将其置于pH7.4、1％的TTC溶液中，并放于37℃水箱孵化20min。10％甲醛固定。拍照，用图像分析仪分析梗死面积占左心室的百分比。

5.2.2丹皮有效部位组合物对大鼠大脑中动脉结扎脑缺血模型的影响

48只大鼠随机均分成假手术组、模型组、丹皮有效部位组合物大(160mg.Kg^-1)、中(80mg.Kg^-1)、小(40mg.Kg^-1)剂量组以及阳性(阳性药：心脑舒通)对照组。各组分别灌服0.5％CMC-Na溶液或相应的药物(1ml/100g)，一天一次，连续给药7天，末次给药1h大鼠乙醉麻醉，颈部正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉(CCA)，缝合肌肉皮肤后，右侧位固定。在右耳和右眼外眦连线中点处切开皮肤，分离颞肌暴露颧突及颞骨，在颧突的头端1～2mm处，开一3×3mm的骨窗，暴露大脑中动脉(MCA)，将MCA灼断，缝合切口。MAC灼断后48h时处死动物，取右大脑半球称重后置大鼠石英脑模中，按石英脑模上刻度均匀切成10片，将脑片置于0.2％NBT中，37℃温育30min，仔细挖取并称重未被染成蓝色的白色梗塞组织。

5.3结果

5.3.1丹皮有效部位组合物对大鼠心肌梗死面积的影响

模型组的梗死面积占左室面积高达51.25％，用药后梗死面积均缩小，但以丹皮有效部位组合物80mg/kg、160mg/kg以及、心脑舒通组明显，见表5.1。

表5.1丹皮有效部位组合物对大鼠心肌梗死面积的影响

组别	动物数	剂量(mg/kg)	梗死区面积/左室面积(％)
				假手术组模型组丹皮有效部位组合物心脑舒通	101010101010	--408016030	0±051.25±12.53<sup>##</sup>41.40±18.2929.30±13.82<sup>★★</sup>19.30±10.51<sup>★★</sup>24.30±16.21<sup>★★</sup>

与空白组相比^##P＜0.01；与模型组相比，^★★P＜0.01，^★P＜0.05。

5.3.2丹皮有效部位组合物对MCAO致大鼠脑梗塞组织重量的影响

模型组的梗塞脑组织重量百分比达38％，用药后脑组织重量百分比均明显缩小，见表5.2。

表5.2丹皮有效部位组合物对大鼠脑梗塞组织重量的影响

组别	剂量(mg/kg)	梗塞脑组织重量百分比(％)
			假手术组模型组丹皮有效部位组合物心脑舒通	--160804030	0±038.0±7.2<sup>##</sup>15.2±6.3<sup>★★</sup>22.5±7.4<sup>★★</sup>28.1±10.7<sup>★</sup>24.9±8.8<sup>★★</sup>

与假手术组比，^##P＜0.01；与模型组相比，^★★P＜0.01，^★P＜0.05

5.3.3病理组织学

假手术组大鼠脑组织神经细胞和神经胶质细胞正常，核膜清楚，核仁明显。毛细血管和小血管管腔较窄或呈一实性条索，神经细胞、毛细血管和小血管周围有一道空隙。缺血模型对照组的大鼠脑组织神经细胞胞浆和胞核浓缩，染色加深，细胞体积缩小，轴突和树突形状变得不规则，神经细胞及毛细血管、小血管周围的间隙增宽，间质疏松，神经胶质细胞肿胀，其胞浆透亮区加大。丹皮有效部位组合物三个不同剂量组的脑组织的上述病理组织形态学变化均有不同程度减轻，尤以80、160mg/kg二组脑组织的病理形态学变化有显著的改善，心脑舒通30mg/kg亦有一定效果。

5.4结论

丹皮有效部位组合物可缩小大鼠心肌梗死面积；减轻MCAO致大鼠脑梗塞组织重量及病理形态学异常。

Claims (9)

1.丹皮有效部位药物组合物，其特征是含有丹皮酚和丹皮总苷，以重量百分比计，含丹皮酚10～40％、含丹皮总苷以芍药苷计为10～50％；其中，丹皮酚和丹皮总苷的总量不低于50％；所述含丹皮总苷以芍药苷计为10～50％是以芍药苷作为对照品，以高效液相色谱法进行测定所得。

2.根据权利要求1所述的丹皮有效部位药物组合物，其特征是，以重量百分比计，含丹皮酚20～30％、含丹皮总苷以芍药苷计为20～40％。

3.根据权利要求1或2所述的丹皮有效部位药物组合物，其特征是所述的丹皮总苷的成分包括有芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹酚苷、牡丹皮原苷和丹皮酚新苷。

4.根据权利要求1或2所述的丹皮有效部位药物组合物，其药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、口服溶液剂、注射剂或输液剂。

5.权利要求1或2所述丹皮有效部位药物组合物的制备方法，其特征是按如下步骤进行：

a.将丹皮药材粉末或饮片，加水浸泡并加热蒸馏，馏出液经冷却放置，析出结晶，得丹皮酚；将蒸馏器中的丹皮水浸液过滤，滤液和滤渣备用；

b.采用如下两种方式之一

方式一：取步骤a所得滤渣，按每1g滤渣加入2～20ml的水提取1～3次，每次0.5～3小时；合并提取液，与步骤a所得滤液合并，过滤；上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用醇洗脱，收集醇洗脱液；减压回收醇，浓缩、干燥，得丹皮总苷；

方式二：取步骤a所得滤渣，按每1g滤渣加入2～20ml的浓度为5％～95％的乙醇溶液提取1～3次，每次0.5～3小时；合并提取液，回收乙醇后，与步骤a所得滤液合并，过滤；上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用醇洗脱，收集醇洗脱液；减压回收醇，浓缩、干燥，得丹皮总苷；

c.丹皮酚与丹皮总苷混合，添加药物中可以接受的辅助成分，制得丹皮有效部位组合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是所述步骤a是按每1g丹皮药材粉末或饮片加入4～30ml的水蒸馏，收集蒸馏液；步骤b中所述大孔吸附树脂包括各种非极性、弱极性、中极性、极性的大孔吸附树脂；步骤b中方式一和方式二中所述洗脱用醇为20％～90％乙醇。

7.权利要求1或2所述丹皮有效部位药物组合物在制备治疗和预防心脑缺血性心脑血管疾病的药物中的应用。

8.权利要求1或2所述丹皮有效部位药物组合物在制备治疗或预防脂肪肝疾病的药物中的应用。

9.权利要求1或2所述丹皮有效部位药物组合物在制备治疗或预防高脂血症或在制备治疗和预防动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。

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