CN113082040A - 前列腺癌治疗产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种前列腺癌治疗产品,其中所述前列腺癌治疗产品包含去乙酰毛花苷以及辅助剂,所述去乙酰毛花苷的浓度为大于或等于1mg/kg,且小于或等于10mg/kg,所述辅助剂包括医用乙醇、医用级聚乙二醇、润滑油、注射级生理盐水。本发明前列腺癌治疗产品可以降低前列腺癌细胞的活力,促进细胞凋亡,抑制细胞的增殖和侵袭,进而抑制前列腺肿瘤的生长,具有治疗去势抵抗性前列腺癌的功效。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学领域,特别涉及一种前列腺癌治疗产品。
背景技术
前列腺癌是全球男性癌症患者中第二大最常见的恶性肿瘤。目前,早期前列腺癌患者可以接受前列腺癌切除术,化学疗法和放射疗法治疗。尽管雄激素剥夺疗法是晚期前列腺癌的标准疗法,但大多数患者最终对该治疗方案有抵抗力,并且它已成为基于内分泌疗法的主要限制。因此,对于去势抵抗性前列腺癌,迫切需要更有效的药物治疗。强心苷(cardiac glycoside)是一类选择性强心作用的药物,又称强心苷或强心配糖体,在临床上用于治疗充血性心脏病。但是,目前并没有发现去乙酰毛花苷可以在体内治疗前列腺癌。
上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案,并不代表承认上述内容是现有技术。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种前列腺癌治疗产品,旨在通过去乙酰毛花苷治疗去势抵抗性前列腺癌。
为实现上述目的,本发明提出一种前列腺癌治疗产品,包含:
去乙酰毛花苷,所述去乙酰毛花苷的浓度为大于或等于1mg/kg,且小于或等于10mg/kg;以及
辅助剂,所述辅助剂包括医用乙醇、医用级聚乙二醇、润滑油、注射级生理盐水。
可选地,所述去乙酰毛花苷的浓度为大于或等于5mg/kg,且小于或等于10mg/kg。
可选地,在所述辅助剂中,所述医用乙醇的质量比为大于或等于10%,且小于或等于15%;
所述医用级聚乙二醇的质量比为大于或等于10%,且小于或等于20%;
所述润滑油的质量比为大于或等于5%,且小于或等于10%;
所述注射级生理盐水的质量比为大于或等于55%,且小于或等于75%。
可选地,所述润滑油包括大豆油、麻油或者甘油的至少一种。
可选地,所述前列腺癌治疗产品还包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、比卡鲁胺、阿比特龙、多西他赛、多西紫杉醇、米托蒽醌、雌二醇氮芥、卡巴他赛、地诺单抗、PD-1或双膦酸盐类药物的至少一种
本发明前列腺癌治疗产品包含去乙酰毛花苷以及辅助剂,所述去乙酰毛花苷的浓度为大于或等于1mg/kg,且小于或等于10mg/kg,所述辅助剂包括医用乙醇、医用级聚乙二醇、润滑油、注射级生理盐水;如此,所述辅助剂辅助去乙酰毛花苷溶解和发挥药效,1~10mg/kg的去乙酰毛花苷可以降低前列腺癌细胞的活力,促进细胞凋亡,抑制细胞的增殖和侵袭,进而抑制前列腺肿瘤的生长;这样,具有治疗去势抵抗性前列腺癌的功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为实施例二的细胞存活率结果图;
图2为实施例二的流式细胞仪检测结果图;
图3为实施例二的细胞染色结果图;
图4为实施例三的流式细胞仪检测结果图;
图5为实施例四的流式细胞仪检测结果图;
图6为实施例五的细胞染色结果图;
图7为实施例六、对比例一、对比例二的肿瘤体积变化结果图;
图8为实施例六、对比例二的肿瘤抑制率结果图;
图9为实施例六、对比例二的小鼠体重变化结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步说明。
具体实施方式
需要说明,若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述,则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外,全文中出现的“和/或”的含义为,包括三个并列的方案,以“A和/或B”为例,包括A方案,或B方案,或A和B同时满足的方案。
本发明提出一种前列腺癌治疗产品,包含去乙酰毛花苷以及辅助剂;所述去乙酰毛花苷的浓度为大于或等于1mg/kg,且小于或等于10mg/kg,所述辅助剂包括医用乙醇、医用级聚乙二醇、润滑油、注射级生理盐水。
在本发明实施例中,当去乙酰毛花苷的浓度小于1mg/kg时,所述去乙酰毛花苷的浓度偏低,治疗去势抵抗性前列腺癌的效果不明显。当去乙酰毛花苷的浓度大于10mg/kg时,所述去乙酰毛花苷可能会对正常的细胞和组织产生一定的损害。所述医用乙醇为医用95%乙醇。所述润滑油可以包括大豆油、麻油或者甘油的至少一种。所述注射级生理盐水为0.9%的氯化钠溶液。
本发明前列腺癌治疗产品包含去乙酰毛花苷以及辅助剂,所述去乙酰毛花苷的浓度为大于或等于1mg/kg,且小于或等于10mg/kg,所述辅助剂包括医用乙醇、医用级聚乙二醇、润滑油、注射级生理盐水;如此,所述辅助剂辅助去乙酰毛花苷溶解和发挥药效,1~10mg/kg的去乙酰毛花苷可以降低前列腺癌细胞的活力,促进细胞凋亡,抑制细胞的增殖和侵袭,进而抑制前列腺肿瘤的生长;这样,具有治疗去势抵抗性前列腺癌的功效。
可选地,所述去乙酰毛花苷的浓度为大于或等于5mg/kg,且小于或等于10mg/kg。当所述去乙酰毛花苷的浓度在5~10mg/kg范围内时,抑制去势抵抗性前列腺癌的生长增殖、治疗去势抵抗性前列腺癌的效果更好。最优地,所述去乙酰毛花苷的浓度为5mg/kg。
可选地,在所述辅助剂中,所述医用乙醇的质量比为大于或等于10%,且小于或等于15%;所述医用级聚乙二醇的质量比为大于或等于10%,且小于或等于20%;所述润滑油的质量比为大于或等于5%,且小于或等于10%;所述注射级生理盐水的质量比为大于或等于55%,且小于或等于75%。
可选地,所述前列腺癌治疗产品还包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、比卡鲁胺、阿比特龙、多西他赛、多西紫杉醇、米托蒽醌、雌二醇氮芥、卡巴他赛、地诺单抗、PD-1或双膦酸盐类药物的至少一种。上述药物属于治疗前列腺癌的临床药品,所述去乙酰毛花苷可以与上述药物配合使用,治疗去势抵抗性前列腺癌,具体可以根据不同患者或受试者的情况进行调配。
所述治疗前列腺的产品可以通过口服或者注射给药方式施用于需要治疗的患者或受试者。口服或者注射所述去乙酰毛花苷均能被人体吸收,优选注射的给药方式。
实施例一
一、细胞的增殖与传代
本发明采用人前列腺癌细胞株22RV1、PC3、DU145,在CO2浓度为5%、湿度为95%的37℃恒温CO2培养箱中进行培养,培养基为含有10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的常规1640培养基。
1、每日显微镜下观察细胞,直至生长至80~90%的饱和度,准备进行细胞传代;
2、对超净台和实验所用的物品进行30min的紫外线照射消毒;
3、移除培养液,向培养皿中加入2mL的PBS,仔细冲洗残留于培养瓶中的培养液以及细胞;
4、移除PBS,每瓶加入1.5mL含有EDTA的0.25%胰蛋白酶,静置消化2~3min;
5、显微镜下观察细胞的变化,直至细胞收缩变圆,细胞间隙增大,部分细胞脱落,加入与胰酶等量的含有血清的细胞培养基进行终止消化,巴氏吸管反复吹打,直至贴于瓶壁的细胞完全脱落;
6、将吹打下来的细胞以及胰酶培养基混合液转移至15mL离心管,1,200rpm离心3min;
7、丢弃离心管中的上清液,在离心管中加入2mL的新鲜细胞培养液,巴氏吸管反复吹打40次,使细胞重悬,形成单细胞悬液;
8、在新的培养瓶中加入9mL新鲜培养基,加入1mL重悬细胞,将培养瓶放平后左右上下轻微晃动,使细胞均匀铺满;
9、镜下观察细胞,标记细胞名称及传代时间,再次置于培养箱中继续培养。
二、细胞计数
1、将细胞计数板及盖玻片用75%酒精擦拭干净,在酒精灯火焰上左右晃动数次烘干后,将盖玻片完全覆盖在计数板上,放平,勿使盖玻片滑动;
2、按照细胞传代方法加入胰蛋白酶消化细胞,将收集的细胞转移到15mL无菌离心管中,并且进行单细胞悬液的制备;
3、移液枪吸取20μL单细胞悬液于1.5mL离心管中,与20μL台盼蓝混匀;
4、细胞技术仪计数;
5、记录细胞计数结果,计算每皿中细胞的密度。
三、细胞冻存
1、选取生长状态良好的3~4代细胞进行冻存,在冻存细胞之前的24小时对细胞进行培养基的更换;
2、吸出培养瓶中的培养基,应用PBS对瓶中细胞进行冲洗,将培养瓶放平,轻柔地上下左右晃动培养瓶,小心冲洗细胞,减少残留培养基;
3、对细胞进行常规消化,待细胞完全消化,加入含有血清的1640培养基,终止消化过程,巴氏吸管反复吹打成单细胞悬液;
4、应用移液枪将吹打好的细胞悬液移入15mL离心管中进行1,200rpm离心,离心时间设定为3min;
5、移液枪移除上清液,注意保护离心管底的细胞,加入新配好的细胞冻存液,巴氏吸管吹打,使其成为单细胞悬液;
6、应用移液枪吸取1mL吹打好的细胞悬液,分装到细胞冻存管中,每管1mL;
7、冻存管壁记录冻存信息,包括冻存细胞名称、代数以及冻存日期;
8、将分装好细胞的冻存管置于程序降温盒里,做好记录,之后转移至-80℃冰箱冻存,次日转移至液氮罐中保存。
实施例二
一、去乙酰毛花苷影响前列腺癌细胞活力
1、将细胞密度为6×103个/孔的22RV1、PC3、DU145细胞接种于96孔板,100μL/孔置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中,加入100μL含药培养基培养24h;
2、分别向上述细胞中加入不同浓度的去乙酰毛花苷,所述去乙酰毛花苷的终浓度分别为0.0015μmol/L、0.0045μmol/L、0.0137μmol/L、0.041μmol/L、0.12μmol/L、0.37μmol/L、1.11μmol/L、3.33μmol/L、10μmol/L,同时设置对照组(加入等量培养液)和空白调零组;
3、每孔6个复孔,置于CO2培养箱中继续培养48h;
4、吸去培养液,每孔加入CCK8工作液100μL,培养箱孵育1.5h,酶标仪450nm测量OD值;
5、以空白组的检测结果调零校正,实验重复3次,计算细胞存活率及IC50,细胞存活率=(药物处理组OD值/对照组OD值)×100%。
检测结果请参阅图1。图1中的结果表明,细胞存活率随着去乙酰毛花苷浓度的升高而减少,22RV1、PC3、DU145细胞的IC50分别为8.841μmol/L、0.3689μmol/L、0.1782μmol/L。
二、流式检测去乙酰毛花苷对前列腺癌细胞的增殖抑制作用
1、给药培养48h后,去除1mL培养基,用新鲜完全培养基1:500稀释EDU,从10mM稀释至20μM;
2、孵育2h后,去上清,PBS洗一次;
3、收集细胞沉淀,加入1mL固定液,室温固定15min;
4、固定后,600g离心5min,去除固定液,加入1mL洗涤液,吹打均匀,400g离心5min,此洗涤步骤重复2次;
5、离心后,去除洗涤液,加入500μL通透液,室温孵育10min;
6、去除通透液,每管用1mL洗涤液洗涤细胞1次,400g离心3min;
7、根据试剂盒配制ClickAdditivesolution,每管加入0.5mL的Click反应液;
8、室温避光孵育30min;
9、400g离心3min,去除Click反应液,用洗涤液洗涤细胞2次,每次2min;
10、洗涤2次后,加入500μL洗涤液,混匀,流式上机检测,Azide488的最大激发波长是495nm,最大发射波长是579nm。
结果如图2所示,去乙酰毛花苷能明显减少22RV1、PC3、DU145细胞的增殖。
三、去乙酰毛花苷影响前列腺癌细胞的克隆形成
1、取生长至对数期的细胞铺板于6孔板中,每孔1000个细胞;
2、培养24h后,加入不同浓度的含药培养基;
3、细胞培养期间,每隔3天换细胞培养基,并在显微镜下观察细胞克隆形成的数量形态;
4、待细胞培养孔中单个细胞克隆中的细胞数达到50个,弃掉上清液,用PBS溶液温柔冲洗细胞1次;
5、将6孔板中每个细胞培养孔中加入800μL体积的4%多聚甲醛溶液固定,静置15min,弃掉废液,用PBS溶液温柔冲洗1次;
6、向每个细胞孔中加入结晶紫染液800μL,温柔摇动细胞培养板,使细胞均匀染色10min;
7、弃掉结晶紫染液,用双蒸水温柔冲洗细胞培养孔5次,室温静置晾干,用立体显微镜拍摄照片,应用ImageJ软件计算细胞克隆数目。
细胞克隆形成率(%)=(克隆形成数/细胞接种数)×100%
结果如图3所示,去乙酰毛花苷能明显减少22RV1、PC3、DU145细胞克隆形成。
实施例三
分别采用不同浓度的去乙酰毛花苷作用于22RV1、PC3、DU145细胞,同时设置不用药物处理的空白对照组、Annexin V单染组、PI单染组、阳性对照组及阴性对照组。收集细胞,分别加入Annexin V-FITC缓冲液和碘化丙啶(PI)染色液,用流式细胞仪检测细胞凋亡,绿色荧光为Annexin V-FITC,红色荧光为PI。晚期凋亡细胞和死亡细胞以Annexin V-FITC/PI双染色为主,在流式细胞分析图上为右上区位置,早期凋亡细胞以AnnexinV-FITC染色为主,在流式细胞分析图上为右下区位置,实验重复3次。
检测结果如图4所示,去乙酰毛花苷对前列腺癌三个细胞系22RV1、PC3、DU145都有促进凋亡的作用。
实施例四
1、收集细胞培养液到离心管内备用;
2、胰酶消化细胞;
3、1,000g离心3min,沉淀细胞,小心吸除上清,可残留约50μL左右的培养液,以避免吸走细胞;
4、加入约1mL冰浴预冷的PBS,重悬细胞,并转移至1.5mL离心管内;
5、再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可留50μL左右的PBS,以避免吸走细胞,轻轻弹击离心管管底以适当分散细胞,避免细胞成团;
6、加入1mL冰浴预冷的70%乙醇中,轻轻吹打混匀,4℃固定24h;
7、600g离心5min,沉淀细胞;
8、小心吸除上清,可留约50μL左右的70%乙醇,以避免吸走细胞;
9、加入约1mL冰浴预冷的PBS重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可留约50μL左右的PBS,以避免吸走细胞;
10、轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团;
11、每管细胞样品中加入0.5mL的PI染色液,缓慢并充分重悬细胞沉淀,37度避光温浴30min;
12、4℃放置,流式上机检测。
检测结果如图5所示,去乙酰毛花苷将前列腺癌三个细胞系22RV1、PC3、DU145的细胞周期主要阻滞在G2/M期。
实施例五
一、实验前准备工作
将Matrigel解冻后取出1mL置于4℃冰箱备用。将200μL枪头、无血清培养液,含数个Transwell的24孔细胞培养板及适当大小的操作盒置于-20℃冰箱预冷过夜。配制含0.1%的BSA的无血清培养液备用。
二、包被Matrigel基质胶
整个实验操作流程均在冰上进行,以保持低温,并随时注意温度变化。取出适量的Matrigel以无血清的细胞培养液稀释(1:8)。将稀释的Matrigel按每孔100μL均匀注入Transwell小室中,之后将整个装置移入37℃细胞培养箱直至胶凝固。
三、细胞准备
将已贴壁的22RV1、PC3、DU145细胞与不同浓度的去乙酰毛花苷在培养基(10%胎牛血清)中作用48h,0.25%胰酶消化,1,200rmp/min离心3min,弃上清,PBS洗1次。用0.1%的BSA无血清培养基悬浮2RV1、PC3及DU145细胞,用台盼兰染色计数细胞,将细胞密度调整为1×106个/mL。
四、接种细胞
取出Transwell,先在下室加入800μL的肿瘤细胞趋化因子完全培养基(含15%胎牛血清),然后将已包被好Matrigel的Transwell小心浸泡在含培养液的孔中,再把调配好的细胞悬液各取200μL,接种于已凝固的Matrigel上,随后将装置移于37℃,5%的CO2细胞培养箱中培养24h。
五、细胞染色
孵育结束后,用PBS稍稍水洗,用棉签擦去滤膜上表面未穿膜的肿瘤细胞及Matrigel。将Transwell浸泡在600μL的4%多聚甲醛中固定10min,风干后再以500μL结晶紫染色5min。自来水冲洗Transwell后,风干,显微镜下观察membrane下表面的细胞分布。
六、OD值的检测
向24孔板加入500μL的33%醋酸,将小室置于其中,浸膜,震荡10min,充分溶解,取出小室,24孔板于酶标仪上570nm测OD值,通过OD值间接反应细胞的数量。
结果如图6所示,与control组相比,给药组细胞透过Transwell膜的细胞明显减少,说明去乙酰毛花苷抑制前列腺癌细胞的侵袭。
实施例六
胰酶消化培养至对数期的细胞,1,200rpm离心5min,PBS洗3遍,尽量除去PBS,分别收集22RV1细胞。以冰PBS:基质胶=1:1的比例稀释高浓度基质胶,用稀释的基质胶调整细胞的密度,使得裸鼠接种22RV1细胞的密度为5×106~1×107个/只/200μL。接种部位:裸鼠右侧腋下。待移植瘤体积长至100mm3,将裸鼠随机分组,每天腹腔注射给药,给药剂量:去乙酰毛花苷分别为1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、10mg/kg、医用乙醇为15%、医用级聚乙二醇为20%、甘油为10%、注射级生理盐水为55%。一周给药5天,隔2天称取裸鼠体重,记录肿瘤体积,共给药19天。
如图7至图9所示,去乙酰毛花苷在剂量为1~10mg之间时,均能抑制肿瘤的生长。其中,在剂量为5~10mg范围内的抑制作用更加明显,且5mg/kg的肿瘤抑制率达到79%,效果最显著。同时,小鼠在实验期间无显著或观察到的毒副作用反应。
对比例一
胰酶消化培养至对数期的细胞,1,200rpm离心5min,PBS洗3遍,尽量除去PBS,分别收集22RV1细胞。以冰PBS:基质胶=1:1的比例稀释高浓度基质胶,用稀释的基质胶调整细胞的密度,使得裸鼠接种22RV1细胞的密度为5×106~1×107个/只/200μL。接种部位:裸鼠右侧腋下。待移植瘤体积长至100mm3,将裸鼠随机分组,每天腹腔注射给药,给药剂量为:去乙酰毛花苷0.5mg/kg、医用乙醇15%、医用级聚乙二醇20%、甘油10%、注射级生理盐水55%。一周给药5天,隔2天称取裸鼠体重,记录肿瘤体积,共给药19天。
如图7所示,去乙酰毛花苷的剂量为0.5mg时,相比5mg和10mg,抑制肿瘤生长的作用不明显。
对比例二
胰酶消化培养至对数期的细胞,1,200rpm离心5min,PBS洗3遍,尽量除去PBS,分别收集22RV1细胞。以冰PBS:基质胶=1:1的比例稀释高浓度基质胶,用稀释的基质胶调整细胞的密度,使得裸鼠接种22RV1细胞的密度为5×106~1×107个/只/200μL。接种部位:裸鼠右侧腋下。待移植瘤体积长至100mm3,将裸鼠随机分组,每天腹腔注射给药,给药剂量为:去乙酰毛花苷20mg/kg、医用乙醇15%、医用级聚乙二醇20%、甘油10%、注射级生理盐水55%。一周给药5天,隔2天称取裸鼠体重,记录肿瘤体积,共给药19天。
如图7至图9所示,去乙酰毛花苷的剂量为20mg时,抑制肿瘤生长的作用不明显(相比5mg和10mg),并且也出现了小鼠体重下降等毒副作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是在本发明的发明构思下,利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换,或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种前列腺癌治疗产品,其特征在于,包含:
去乙酰毛花苷,所述去乙酰毛花苷的浓度为大于或等于1mg/kg,且小于或等于10mg/kg;以及辅助剂,所述辅助剂包括医用乙醇、医用级聚乙二醇、润滑油、注射级生理盐水。
2.如权利要求1所述的前列腺癌治疗产品,其特征在于,所述去乙酰毛花苷的浓度为大于或等于5mg/kg,且小于或等于10mg/kg。
3.如权利要求1所述的前列腺癌治疗产品,其特征在于,在所述辅助剂中,所述医用乙醇的质量比为大于或等于10%,且小于或等于15%;
所述医用级聚乙二醇的质量比为大于或等于10%,且小于或等于20%;
所述润滑油的质量比为大于或等于5%,且小于或等于10%;
所述注射级生理盐水的质量比为大于或等于55%,且小于或等于75%。
4.如权利要求3所述的前列腺癌治疗产品,其特征在于,所述润滑油包括大豆油、麻油或者甘油的至少一种。
5.如权利要求1所述的前列腺癌治疗产品,其特征在于,所述前列腺癌治疗产品还包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、比卡鲁胺、阿比特龙、多西他赛、多西紫杉醇、米托蒽醌、雌二醇氮芥、卡巴他赛、地诺单抗、PD-1或双膦酸盐类药物的至少一种。
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