CN102416019A

CN102416019A - 西地兰在制备抗肝癌、膀胱癌药物中的应用

Info

Publication number: CN102416019A
Application number: CN201110367815XA
Authority: CN
Inventors: 何松青; 徐庆; 陈果; 韦京辰; 杨成芳; 梁荣感; 张均智
Original assignee: Guilin Medical University
Current assignee: Guilin Medical University
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2012-04-18

Abstract

本发明公开了一种西地兰在制备抗肝癌、膀胱癌药物中的应用，它是将西地兰制成注射剂型，用于抗肝癌、膀胱癌，针剂的浓度IC₅₀为8×10^-4mmol/L。本发明在体外实验中，对肝癌与膀胱癌细胞，西地兰IC₅₀为8×10^-4mmol/L，相对于其它强心苷类药物效果更佳，相对于常用药物5氟尿嘧啶IC₅₀，1×10^-1mmol/L，西地兰的效价强度强100倍以上，在动物体内抗肿瘤实验中，西地兰对肿瘤的抑制率为34.26-48.43%，如应用方法得当，西地兰将是一种较理想的抗癌药物。

Description

西地兰在制备抗肝癌、膀胱癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及西地兰药物，具体是西地兰在制备抗肝癌、膀胱癌药物中的应用。

背景技术

癌症迄今仍是难以治愈的顽症之一。治疗癌症一般需手术切除并配合进行放、化疗 ,然而放、化疗往往在杀灭癌细胞的同时 ,也严重损毁了人体多个脏器的功能。为此 ,科学家一直在努力寻找着更好更直接且副作用较小的方法来治疗癌症。

西地兰又名毛花洋地黄甙丙、毛花甙丙，英文名Cedi-lanid，是中医常用的中药之一，通常用于治疗心衰。目前尚未有关西地兰治疗肝癌、膀胱癌的报道。

发明内容

本发明的目的是公开西地兰的一种新用途，即西地兰在制备抗肝癌、膀胱癌药物中的应用。

实现本发明目的的技术方案是：

一种西地兰的新用途，它是用于治疗肝癌或膀胱癌，即是将从毛花洋地黄叶中提取出的西地兰制成注射剂型，以治疗肝癌、膀胱癌，其使用方法和剂量如下：

（1）瘤内注射：沿瘤体长轴方向进针至瘤体远端包膜下，边缓慢退针边推注药液，推注完于瘤组织内继续停留一分钟后退出，其剂量为0.002－0.004mg/kg， 1次为一疗程；

（2）静脉滴注：以0.002－0.004mg/kg 加入500ml5%葡萄糖中缓慢静脉滴注，6-8小时滴完，每隔72小时一次，7次为一疗程，用药期间每天观察心率变化，心率低于60次/min时停药，必要时做心电图检查，如出现心脏毒性，立即停药并用药物解救；

（3）对于膀胱癌，可采用膀胱灌流方法：膀胱癌术后8小时，以0.01-0.1 mg加入生理盐水50ml,经尿管注入膀胱内，每15分钟更换体位一次，保留2-3小时后排除，每周1次，共6次，随后每2周1次共6次，最后每月1次坚持2年。

本发明所述西地兰市场有售，分子式为：C49H76O20，分子量为985.13，结构式为：

Figure DEST_PATH_827069DEST_PATH_IMAGE001

提取方法为现有技术。

经动物体外试验表明，西地兰对肝癌、膀胱癌有明显的抑制作用，在体外抗癌实验中，常用药物5氟尿嘧啶IC₅₀为1×10^-1mmol/L，西地兰为IC₅₀,8×10^-4mmol/L西地兰的效价强度比5氟尿嘧啶强100倍以上，在动物体内抗肿瘤实验中，西地兰对肿瘤的抑制率为34.26-48.43%。

本发明的优点是：用药剂量小、药价低、抗肝癌、膀胱癌效果好，局部应用毒性小，如应用方法得当，西地兰将是一种较理想的抗癌药物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：西地兰与强心苷类化合物在体外抗癌实验：

实验方法是：将人肿瘤细胞株培养于DMEM培养基（含 10%灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素），人正常肝细胞系HL-7702培养于RPMI1640 培养基（含10%灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素）。六种细胞株均置于 37℃、5%的CO₂饱和湿度培养箱中培养，两到三天换液并传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

MTT法检测抗癌药物对肿瘤细胞增殖活性的效应，取对数生长期的细胞，以1×10⁴/ml的密度接种于 96 孔板，每孔 180μl。试验设阴性对照组（PBS）、阳性对照组（5-FU）(终浓度为10^-1mmol/L)、不同浓度（2×10^-2，4×10^-3，8×10^-4，1.6×10^-4，3.2×10^-5mmol/L）的药物组，每组设 5 个复孔，37℃、5%CO₂饱和湿度孵箱内培养过夜，分别加入药物溶液20μl(终浓度为2×10^-2，4×10^-3，8×10^-4，1.6×10^-4，3.2×10^-5mmol/L),加入药物后培养 48h,每孔加入MTT液（5mg/ml）20μl,培养 4h后，吸弃培养液，每孔加入 150μl DMSO，轻度振荡 10min,溶解结晶，置酶标仪 490nm波长处测OD值，按下列公式计算细胞生长抑制率：

细胞生长抑制率（%）=[1-(药物处理组/阴性对照组)]×100%。

药物处理组：含有细胞的培养基、MTT、药物

阴性对照组：含有细胞的培养基、MTT、PBS

空白组：不含细胞和药物的培养基、MTT，实验重复 3 次。

强心苷类化合物体外抗人肝癌细胞（HepG2）作用结果见表1、表2

表1：三种强心苷对HepG2细胞增殖的影响（ X±SD，n=5）

药物	浓度（mmol/L）	OD值	抑制率（%）
				PBS	—	0.839±0.16	0
洋地黄毒甙	2×10^-2	0.694±0.09	17.31
					4×10^-3	0.823±0.04	1.91
	8×10^-4	0.700±0.08	16.85
					1.6×10^-4	0.779±0.11	7.13
	3.2×10^-5	0.620±0.11	26.15
				地高辛	2×10^-2	0.821±0.15	2.12
	4×10^-3	0.744±0.04	11.28
					8×10^-4	0.834±0.10	0.57
	1.6×10^-4	0.853±0.06	-1.64
					3.2×10^-5	0.742±0.10	11.59
西地兰	2×10^-2	0.345±0.04*	58.59
					4×10^-3	0.313±0.05*	62.72
	8×10^-4	0.429±0.04*	48.82
					1.6×10^-4	0.498±0.06	40.67
	3.2×10^-5	0.728±0.11	13.23
				5Fu	10^-1	0.36±0.03	57.26

注：*P<0.05与PBS对照组比较

表2 西地体外兰对正常肝细胞HL-7702增殖的影响

药物	浓度	OD值	抑制率（%）
				PBS	—	0.571±0.10	0
西地兰	2×10-2	0.447±0.06	21.6188
					4×10-3	0.625±0.07	-9.49544
	8×10-4	0.650±0.10	-13.9103
					1.6×10-4	0.612±0.10	-7.14786
	3.2×10-5	0.663±0.04	-16.2228
				5Fu	10-1	0.310±0.05*	45.655

结论：西地兰在体外对肝癌细胞有较强的抑制作用，对正常肝细胞毒性较低。

实施例2：强心苷类化合物体外抗人膀胱癌细胞（HepG2）实验

实验方法同实施例1

强心苷类化合物体外抗人膀胱癌细胞（HepG2）作用结果见表3

表3：三种强心苷对T24细胞增殖的影响（X±SD，n=5）

药物	浓度（mmol/L）	OD值	抑制率（%）
				PBS	—	0.5762±0.02	0
洋地黄毒甙	2×10^-2	0.443±0.04	23.11
					4×10^-3	0.723±0.04	-25.44
	8×10^-4	0.734±0.05	-27.38
					1.6×10^-4	0.696±0.03	-20.86
	3.2×10^-5	0.688±0.02	-19.43
				地高辛	2×10^-2	0.244±0.01*	57.61
	4×10^-3	0.525±0.04	8.92
					8×10^-4	0.670±0.08	-16.27
	1.6×10^-4	0.633±0.03	-9.82298
					3.2×10^-5	0.695±0.08	-20.65
西地兰	2×10^-2	0.239±0.01*	58.62
					4×10^-3	0.224±0.01*	61.19
	8×10^-4	0.291±0.07*	49.53
					1.6×10^-4	0.507±0.07	11.97
	3.2×10^-5	0.747±0.25	-29.60
				5Fu	10^-1	0.293±0.02	49.08

注：*P<0.05与PBS对照组比较

结论：西地兰在体外对膀胱癌细胞有较强的抑制作用。

实施例3 西地兰对细胞Na＋/K＋-ATPase活性的影响

取对数生长期的HepG2细胞与HL-7702细胞按 1×10⁵/ml的密度接种于 6 孔培养板中，每孔1.8ml，于 37℃、5%CO₂的培养箱中培养过夜后，将培养液吸出，加入终浓度为2×10^-2，4×10^-3，8×10^-4，1.6×10^-4，3.2×10^-5mmol/L的西地兰0.2ml，阴性对照组加入0.2ml的PBS。作用6h后，吸出所有孔中培养基，并用NS洗涤两遍，离心，弃上清，留下层细胞，每孔细胞各加入1mlNS制备成含10⁶个细胞的悬液，用超声破碎器破碎（200-300w,90-100次，3秒运作，3秒停止），准备好的细胞按《钠钾ATP酶测定试剂盒》说明书进行操作。同时将未离心的细胞悬液用考马斯亮蓝试剂测定组织蛋白：

细胞中ATP酶活力(U/mgprot)= (测定管OD值-对照管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度（0.02μmol/ml）×6×7.8/匀浆蛋白含量（mgprot/ml）

西地兰对HepG2细胞与HL-7702细胞Na^＋/K^＋-ATPase活性影响

经过Na^＋/K^＋-ATPase活性检测，结果表明西地兰可抑制 HepG2细胞Na^＋/K^＋-ATPase活性，并有一定的剂量依赖性。西地兰浓度为2×10^-2 mmol/L，4×10^-3mmol/L及8×10^-4mmol/L时，对Na^＋/K^＋-ATPase活性有抑制作用，与PBS组比较，有显著性差异（P<0.05）；随着时间的增加，西地兰对Na^＋/K^＋-ATPase活性抑制作用增强，具有显著性差异（P<0.05）（见表4）。相同五个浓度的西地兰作用于HL-7702细胞，与PBS组比较无著性差异（P＞0.05），表明西地兰对HL-7702细胞Na^＋/K^＋-ATPase没有明显影响

表4 西地兰对人肝癌细胞HepG2细胞Na ^＋ /K ^＋ -ATPase活性的影响（X±SD，n=3）

药物	浓度mmol/L	Na^＋/K^＋-ATPase活性（U/mgprot）
			PBS组	—	7.94±2.70
西地兰	2×10^-2	2.96±0.21*
				4×10^-3	2.22±0.16*
	8×10^-4mmol/L	4.53±0.81*
				1.6×10^-4mmol/L	4.27±2.00

注：*P<0.05与PBS组比较

实施例4：体内抗肿瘤实验

（1）荷瘤动物模型（小鼠肝癌皮下移植瘤）的建立

于无菌条件下抽取H22腹水瘤小鼠的腹水, NS稀释后,1000rpm/min离心5min,洗涤细胞2次,调整H22细胞浓度为5×10⁶/mL,于小鼠右腋部行皮下无菌接种,接种量为每只0.2mL(1×10⁶个细胞)。7d后，挑选实体瘤长至直径0.2~0.5cm的30只用于动物实验。

（2）实验动物分组及处理

随机分为三组，西地兰（2mg/Kg）组，西地兰 (1mg/Kg)组以及对照组（PBS组）。均采用瘤内注射，即沿瘤体长轴方向进针至瘤体远端包膜下，边缓慢退针边推注药液，推注完于瘤组织内继续停留一分钟后退出 ( 待瘤体内压力降低 )，尽量减少药液外溢，每天一次，共7天。

（3）统计方法

按公式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm³）=长×宽² ×1/2，绘制肿瘤生长曲线。并于末次给药后次日处死小鼠，称取体重后，剥瘤称重，计算抑瘤率（inhibition rate, IR），IR (%) =（对照组均瘤重－给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。应用 SPSS 17.0软件对所有数据进行统计学处理，结果以均数±标准差表示，两组间均数比较用 t 检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为有显著性差异。实验结果见表5

表5西地兰对小鼠皮下种植性肿瘤的影响

组别	剂量（mg/kg）	动物数量（n）	肿瘤重量（g）	抑瘤率（%）
					PBS组	--	10	1.45±1.32	--
西地兰	2	10	0.75±0.32	48.43*
					西地兰	1	10	0.96±0.54	34.26

注：*P<0.05与PBS组相比较

结论：西地兰瘤内注射对对小鼠人肝癌细胞皮下种植瘤有明显抑制作用。

本发明试验表明，强心苷类药物西地兰在体内外有较强选择性的抗癌作用，对人肝癌细胞系HepG2、人膀胱癌细胞系T24抑制率为IC₅₀为8×10^-4mmol/L，其作用强度为常用抗癌药物5-氟尿嘧啶的10倍，而剂量为2×10^-2mmol/L时，对人正常人肝细胞系HL-7702的抑制率仅为22%。西地兰抗癌作用机理可能与其选择性抑制癌细胞Na^＋/K^＋-ATP酶，致细胞内钙离子浓度增加引起细胞凋亡及阻滞细胞周期G1期有关。

本发明所述西地兰还可用于治疗口腔粘膜癌和喉癌。

Claims

1.西地兰在制备抗肝癌、膀胱癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的西地兰在制备抗肝癌、膀胱癌药物中的应用，其特征是：将西地兰制成注射剂型。