CN103315993A

CN103315993A - 二氢杨梅素在制备抑制阿霉素心脏毒性药物中的应用

Info

Publication number: CN103315993A
Application number: CN2013102494302A
Authority: CN
Inventors: 何俏军; 杨波; 罗沛华; 翁勤洁; 杨晓春; 赵玉勤
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-06-22
Filing date: 2013-06-22
Publication date: 2013-09-25

Abstract

本发明提供二氢杨梅素组合物在制备抑制阿霉素心脏毒性药物中的应用，所述组合物由二氢杨梅素和阿霉素组成；本发明经体内、外实验研究证明，二氢杨梅素能抑制阿霉素激活的线粒体膜电位依赖的细胞凋亡，从而降低阿霉素心脏毒性引起的致死性，本发明对阿霉素所诱导的心脏毒性有显著的保护效果。本发明可以用于预防和减轻阿霉素诱导的心脏毒性，具有临床实用性。

Description

二氢杨梅素在制备抑制阿霉素心脏毒性药物中的应用

技术领域

本发明涉及天然植物提取物二氢杨梅素与抗肿瘤药物阿霉素联合使用时，能减轻阿霉素造成的心脏毒性作用。这种保护作用是通过二氢杨梅素抑制阿霉素激活的线粒体膜电位依赖的细胞凋亡实现的。

背景技术

阿霉素（adriamycin，ADR）属蒽环类抗肿瘤抗生素，具有抗瘤谱广，抗瘤作用强等特点，在临床上广泛用于治疗急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤。但是，与大多数抗肿瘤药物相同，ADR不良反应较多，最严重的是心脏毒性，不仅影响了患者的生存质量，而且严重限制了ADR的临床应用。目前已知的阿霉素造成心脏毒性的作用机制是阿霉素能够诱导自由基的大量产生，而心脏比其他组织缺乏清除自由基的酶（超超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶），其抗氧化作用较弱，因此而容易导致的严重的致死性心脏毒性作用。目前唯一批准应用于临床的抗阿霉素心脏毒性保护剂右丙亚胺，因其对阿霉素的抗肿瘤效应有潜在影响和加重血小板减少和中性粒细胞减少。对于右丙亚胺的临床应用策略，目前仍存在较大争议。因此，开发基于新作用机制的心脏毒性保护剂对阿霉素的临床应用具有非常重要的现实意义。

藤茶又称显齿蛇葡萄，是民间的传统用药，曾被广泛用于治疗皮肤病、骨髓炎、急性淋巴炎等感染性疾病。二氢杨梅素为葡萄属植物藤茶的提取物，其中主要活性成分为黄酮类化合物，此类物质具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种功效。二氢杨梅素广泛应用于治疗呼吸道感染、酒精中毒的中成药制剂。但至今尚没有其在对阿霉素所致心脏毒性的保护作用方面的报道。

发明内容

本发明的目的是提供天然植物提取物二氢杨梅素组合物在制备抑制阿霉素心脏毒性药物中的应用，所述组合物由二氢杨梅素和阿霉素组成，阿霉素与二氢杨梅素组合物在体外大鼠原代心肌细胞中按剂量比为1：100、1：50、1:25、1：12.5、1：6.25、 1：3.125组合，即25或50 mM二氢杨梅素预处理24小时，再分别与0.5、1、2、4、8 mM的阿霉素作用48小时。阿霉素与二氢杨梅素组合物在体内模型ICR小鼠上按剂量比为1∶25、1:12.5、1∶6.25组合，即二氢杨梅素125mg/kg/天、250mg/kg/天或500 mg/kg/天给予4天，再给予阿霉素20mg/kg/天4天。

所述二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）的化学名(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮，分子量320.25，分子式C₁₅H₁₂O₈。

二氢杨梅素保护阿霉素引起的心脏毒性的作用机制是：二氢杨梅素抑制阿霉素激活的线粒体膜电位依赖的细胞凋亡，从而降低阿霉素心脏毒性引起的致死性。

二氢杨梅素与阿霉素联合用药是指药学上可接受的辅料制备的口服固体制剂、口服液体制剂、注射液、冻干粉针剂、大输液剂型、贴剂、软膏剂、凝胶剂、软胶囊剂或栓剂。

本发明经体内、外实验研究证明，二氢杨梅素对阿霉素所诱导的心脏毒性有显著的保护效果。二氢杨梅素可以用于预防和减轻阿霉素诱导的心脏毒性，从而扩大阿霉素的临床应用。

本发明的意义在于提供了一种有效的抗阿霉素心脏毒性的保护剂，从而扩大其临床应用范围，减轻肿瘤患者由于阿霉素使用带来的心脏毒性作用。同时提供了一种全新的心脏毒性保护机制，二氢杨梅素通过抑制阿霉素激活的线粒体膜电位依赖的细胞凋亡，从而降低阿霉素心脏毒性引起的致死性，为临床应用提供了理论依据。

附图说明

图1是体重方面DMY对ADR小鼠心脏毒性的保护作用。

图2是存活率方面DMY对ADR小鼠心脏毒性的保护作用。

图3是DMY逆转ADR降低大鼠原代心肌细胞的线粒体膜电位。

图4是DMY逆转ADR对Bcl-2家族蛋白的影响。

图5是DMY逆转ADR引起心肌细胞凋亡。

图6是DMY降低ADR引起的caspase激活。

具体实施方式

本发明通过二氢杨梅素与阿霉素联合应用达到保护阿霉素心脏毒性的目的。在细胞水平上，二氢杨梅素能显著逆转由阿霉素抑制的大鼠原代心肌细胞生长。在动物水平上，二氢杨梅素能显著逆转由阿霉素心脏毒性所致的动物死亡。二氢杨梅素保护阿霉素引起的心脏毒性的作用机制是：二氢杨梅素抑制阿霉素激活的线粒体膜电位依赖的细胞凋亡，从而降低阿霉素心脏毒性引起的致死性。

实施例1：

大鼠原代心肌细胞接种于96孔板，设置空白对照组，阿霉素（ADR）单用组和二氢杨梅素（DMY）预处理组。每个组设置5个ADR浓度梯度，2倍稀释。每个浓度三复孔。待细胞贴壁后，二氢杨梅素（DMY）预处理组加入DMY在培养箱中培养24小时。然后加入不同浓度ADR，在培养箱中继续培养48小时后，加入5 mg/ml 的MTT溶液，再孵育4小时，然后吸弃液体加入DMSO将甲瓒完全溶解后用酶标仪测定其在570 nm处测定吸光度。结果发现，0.5、1、2、4和8 mM ADR作用后，大鼠原代心肌细胞生长发生剂量依赖的抑制，而DMY 25和50 mM预处理后，显示出明显的逆转ADR增殖抑制的作用，细胞活力与对应的ADR单用组相比有显著性差异，具体结果如表1所示。说明DMY在体外能显著减轻ADR导致的心肌细胞生长抑制。

Figure 2013102494302100002DEST_PATH_IMAGE002

实施例2：

48只ICR雄性小鼠，随机分成4组，分别为空白对照组、阿霉素模型组和三个DMY预处理组各12只。空白对照组给予等量生理盐水；阿霉素模型组连续四天生理盐水灌胃，第四天腹腔注射20 mg/kg阿霉素。DMY预处理组分别给予125 mg/kg、250 mg/kg、500 mg/kg DMY，连续灌胃给药四天，第四天给药30min后腹腔注射20 mg/kg阿霉素。每天称量小鼠体重并记录小鼠死亡时间。结果发现，500 mg/kg二氢杨梅素预处理组小鼠存活时间明显比模型组长，并且体重的减轻比模型组明显缓解。结果参见图1，图2。

实施例3：

大鼠原代心肌细胞经二氢杨梅素预处理后，然后在ADR作用后48小时收集细胞。JC-1是一种阳离子染料，可在细胞中聚集于线粒体内，形成多聚体，发红色荧光；而当线粒体膜电位被破坏，JC-1就不能聚集到线粒体中，而是以单体的形式存在于胞质中，此时JC-1发绿色荧光。根据这个特性，我们采用JC-1染色结合流式细胞术来测定细胞线粒体膜电位的变化。结果如图3 所示，溶剂对照组32.6±5.8%心肌细胞呈现绿色荧光，2 mM ADR作用48小时后，52.6±6.2%心肌细胞呈现绿色荧光（即膜电位降低），而二氢杨梅素50 mM预处理后，35.5±7.8%心肌细胞呈现绿色荧光，细胞内线粒体膜电位基本恢复到正常水平。

实施例4：

线粒体膜电位由位于线粒体膜上的Bcl-2家族调控。。Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族重要的成员。Bcl-2属于抑凋亡蛋白，它可以抑制PT孔的开放；而Bax属于促凋亡蛋白，它可以促进PT孔的开放，因此它们的比例决定了PT孔的开放，从而最终影响细胞凋亡。因此我们提取总蛋白Wentern blot检测蛋白表达水平，结果显示（参见图4），2 mM ADR作用于心肌细胞48 小时后，Bax蛋白表达水平显著上调，Bcl-2略有下调，因此Bax/Bcl-2的比例总体呈上升的趋势，进而可以促使PT孔的开放，而心肌细胞经过50 mM DMY预处理24小时，ADR继续作用48 小时后，Bax/Bcl-2的比例与阿霉素单用组相比呈下降的趋势，与线粒体膜电位的变化一致。由此说明，二氢杨梅素可通过影响Bcl-2蛋白家族减少阿霉素引起的线粒体膜PT孔的开放，起到保护心肌细胞的作用。

实施例5：

细胞凋亡进程中一个重要的特征性指标是细胞核内产生凋亡小体。各组细胞经过药物作用后，DAPI法对细胞核进行染色，显微镜下观察发现，2 mM ADR作用大鼠原代心肌细胞48小时，心肌细胞细胞核固缩加剧，核内产生大量凋亡小体（见图5）。而心肌细胞经过50 mM 二氢杨梅素预处理24小时，ADR继续作用48小时后，细胞核固缩及凋亡小体产生明显减少。另外，50 mM二氢杨梅素单独作用细胞72 小时并不会引起心肌细胞核形态的改变。说明二氢杨梅素可以降低阿霉素作用诱导的大鼠原代心肌细胞的凋亡，起到拮抗ADR损伤大鼠原代心肌细胞的作用。

实施例6：

在多数情况下，细胞凋亡均与caspase蛋白家族有密切的联系，caspase级联反应激活之后便可导致细胞凋亡的发生。通过Western Blot我们发现，2 mM ADR作用心肌细胞 48h可使细胞内 PARP、caspase 3和caspase 8的水平下降，并产生裂解片断（cleaved caspase 3和cleaved PARP）；而心肌细胞经过50 mM DMY预处理24小时，ADR继续作用48小时后，caspase激活明显减少（参见图6）。以上的结果证明二氢杨梅素可以明显抑制阿霉素引起的大鼠原代心肌细胞的凋亡。

Claims

1.一种二氢杨梅素组合物在制备抑制阿霉素心脏毒性药物中的应用，所述二氢杨梅素的化学名(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮，其特征在于，所述组合物由二氢杨梅素和阿霉素组成，阿霉素与二氢杨梅素组合物按剂量比为1：100、1：50、1:25、1：12.5、1：6.25、 1：3.125组合，所述应用是25或50 mM二氢杨梅素预处理24小时，再分别与0.5、1、2、4、8 mM的阿霉素作用48小时。

2.根据权利要求1所述的一种二氢杨梅素组合物在制备抑制阿霉素心脏毒性药物中的应用，其特征在于，阿霉素与二氢杨梅素组合物按剂量比为1∶25、1:12.5、1∶6.25组合，所述应用是二氢杨梅素125mg/kg/天、250mg/kg/天或500 mg/kg/天给予4天，再给予阿霉素20mg/kg/天4天。

3.根据权利要求1所述的一种二氢杨梅素组合物在制备抑制阿霉素心脏毒性药物中的应用，其特征在于，所述药物剂型为液体制剂或固体制剂。