CN102552265A

CN102552265A - 包含表没食子儿茶素没食子酸酯与喜树碱的药物组合物

Info

Publication number: CN102552265A
Application number: CN2010106025023A
Authority: CN
Inventors: 余龙; 刘祖龙; 张明君; 朱恒锐
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明属于医药和基因工程领域，提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物。所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯和喜树碱以及药剂学上必要的辅料，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和喜树碱的摩尔比为8：1-0.5：1。本发明实验证实，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯与Camptothecin制成的组合物，或在给予Camptothecin时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Camptothecin抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。对裸鼠肝脏和肾脏基本没有毒性，且活性成分中的表没食子儿茶素没食子酸酯资源丰富，价格低廉，在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

Description

包含表没食子儿茶素没食子酸酯与喜树碱的药物组合物

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，涉及抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Camptothecin（喜树碱）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

背景技术

喜树碱，英文名：Camptothecin。CPT。化学名：4-乙基-4,12-二氧-4-羟-1H-吡喃（3`，4`，6，7）吡吲哚（1，2-6）喹啉-3，14-二酮，1H-Pyrano[34:6,7]indolizino[1,2-6]puinoline-3,14(4H,12H-)-dione,4-ethy1-4-hydroxy-(s)- 。分子式: C20H16N2O4；分子量： 348.34 ；来源：珙桐科植物喜树Camptotheca acuminata Decne的果实、叶。喜树碱为浅黄色针状结晶(甲醇-乙腈) ，分解点：264℃～267℃，[α]25D +31.3。(氯仿-甲醇) 。在紫外光下表现强烈的蓝色荧光，和酸不能生成稳定的盐。

喜树碱是一种植物抗癌药物，从中国中南、西南分布的喜树中提取得到。1976年中国化学家高怡生等合成消旋喜树碱成功。临床应用于恶性肿瘤，银屑病，治疣，急慢性白血病以及血吸虫病引起的肝脾肿大等。喜树碱对肠胃道和头颈部癌等有较好的近期疗效，但对少数病人有尿血的副作用。10-羟基喜树碱的抗癌活性超过喜树碱，对肝癌和头颈部癌也有明显疗效，而且副作用较少。剂量较大时，可引起食欲不振、恶心、呕吐、胃肠炎；可抑制骨髓，还可引起出血性膀胱炎，出现尿频,尿痛及血尿;可引起口腔粘膜感染和脱发。

茶叶( tea ,camellia sinensis) 是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨，其中20%为绿茶、78%为红茶、2%为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多，但以绿茶为人瞩目。大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。

绿茶中的主要成分为茶多酚，占茶叶干重的30%左右，茶多酚中大部分为儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯〔( - ) epigallocatechin gallate ( EGCG) 〕含量最高，占儿茶素的80%左右。EGCG分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。

到目前为止，尚未见有关EGCG与Camptothecin联合使用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Camptothecin（喜树碱）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

本发明实验证实，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Camptothecin（喜树碱）制成的组合物，或在给予Camptothecin（喜树碱）时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Camptothecin抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。

本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）Camptothecin；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和Camptothecin的摩尔比为8：1-0.5：1。

本发明中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯其分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4，可以通过市场销售途径获得。例如，本发明的EGCG购自Sigma公司，货号50299，英文全称：(−)-cis-2-(3,4,5-Trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3,5,7-triol 3-gallate, (−)-cis-3,3′,4′,5,5′,7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG；CAS号：989-51-5。MDL号：MFCD00075940。

本发明中，所述的Camptothecin通用名为喜树碱；Camptothecin是拓扑异构酶Ⅰ的抑制剂，源自Sigma公司，货号C9911 (S)-(+)-Camptothecin。其相关信息和结构式如下：

CAS Number: 7689-03-4

Empirical Formula (Hill Notation): C₂₀H₁₆N₂O₄

Molecular Weight: 348.35

Beilstein Registry Number: 631069

MDL number: MFCD00081076 。

本发明中，将制成的含有EGCG和Camptothecin的组合物用于肿瘤细胞（例如，肝癌细胞株SK-Hep1），结果显示，与仅使用Camptothecin相比，抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。所述组合物的使用能明显降低Camptothecin的单独使用量，其降低效果随着EGCG用量的增加而更加明显。

本发明中，将EGCG和Camptothecin的组合物用于裸鼠移植瘤模型，结果显示，与仅使用Camptothecin相比，本发明的组合物对裸鼠移植瘤生长的抑制效果显著增强，并且效果优于雷帕霉素与Camptothecin组合物。同时，检测以体重变化为指标的给药后药物的毒性效应显示，EGCG和Camptothecin联合使用时对裸鼠体重没有明显影响，并且所述的组合物对裸鼠的肝脏和肾脏基本没有毒性。

本发明中，采用所述的组合物与单独使用EGCG或者Camptothecin进行了比较试验，结果显示，所述的组合物在抑制肿瘤细胞生长方面具有明显的增效作用，而且增效作用具有EGCG和Camptothecin浓度梯度效应。本发明的实施例中列举了EGCG和Camptothecin含量摩尔比分别为3:4,1:1,8:1，2：1，5：1，4：1，1：1，3：5，等等，实验表明，在两者含量为8：1-0.5:1的范围都是有效果的。

本发明中还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，其包括步骤：在肿瘤细胞中加入EGCG和Camptothecin组合物，EGCG和Camptothecin的摩尔比为8：1-0.5:1。

所述的肿瘤细胞可以是SMMC7721、HepG2、QGY、SK-Hep1、Huh7、L02、Focus或者YY1细胞。本发明所使用的细胞均购自ATCC。

本发明的组合物，当在治疗上进行施用（给药）时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为7-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的EGCG与Camptothecin的组合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG和Camptothecin可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的EGCG与Camptothecin的组合物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，EGCG与Camptothecin的组合物可以是针剂或者片剂。

当本发明的EGCG与Camptothecin的组合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量中通常至少约50毫克EGCG/千克体重。喜树碱常规临床用量为：静脉注射：10mg以生理盐水20ml溶解后缓慢注入，每日1次；或15～20mg，隔日1次；总量140～200mg为1疗程；静脉滴注：剂量同静脉注射，以生理盐水250ml稀释后静脉滴注，总量同上；肌肉注射：每日5～10mg,140～200mg为1疗程；动脉插管：头颈部癌或肝癌治疗时，可将本品100mg溶于20ml生理盐水内由动脉插管缓慢注入，每日或隔日1次；胸腹腔注射：尽量抽出积液后，将其20～30mg用20ml生理盐水溶解后注入，可每周注射1次；膀胱内灌注：每次20mg，加生理盐水20ml,每日1次，连用3日为1周期，或每次30～40mg，加生理盐水50ml,每周2次，4周为1周期；瘤内注射：可将本品5～10mg直接注入肿瘤结节内，每日1次或隔日1次；口服：每次5mg，每日2次，用于维持治疗。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明具有下述优越性：本发明提供了一种新的含EGCG和Camptothecin的组合物。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。能明显增强Camptothecin的抗肿瘤效果，同时相对减少了Camptothecin的用量及药物成本。

由于本发明组合物中的EGCG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

具体实施方式

实施例 1 EGCG与Camptothecin的协同效果

EGCG与十种抗肝癌药物联合使用均具有协同效应，其中在SK-Hep1细胞中与Camptothecin的协同效果十分显著。本实施例进一步验证了EGCG与Camptothecin的联用效果，结果证明在一定的浓度范围内CI值均小于1，两种药物有协同作用。结果表明EGCG与Camptothecin联合使用可以提高Camptothecin的抗肿瘤效果。

表1

实施例 2 EGCG与Camptothecin有协同效应

在十种肝癌细胞系中固定EGCG的浓度，与Camptothecin联合用药。采用下述金氏公式Q值来评价联用效果。

Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)

其中，Ea+b为合并用药抑制率，Ea和Eb分别为A药和B药的抑制率；

分子代表实际测量的两药合并抑制率，分母是期待合并抑制率。

Q=0.85-1.15范围表示单纯相加，Q=1.15-2范围表示有增强，Q>2表示明显增强，Q<0.55-0.85表示有拮抗效应，Q<0.55表示明显拮抗。

结果表明， EGCG与Camptothecin在特定的细胞株中均有一定的协同效果，说明EGCG在特定的细胞株中可以增强现有抗肝癌药物的抗肿瘤活性。

表 2 EGCG 与 Camptothecin 的联合用药效果 Q 值

	Camptothecin
		SMMC7721	1.016715
HepG2	1.023021
		QGY	1.078673
SK-Hep1	1.349844
		YY1	1.150362
Huh7	1.048795
		Hep3B	0.998516
L02	1.077555
		Focus	1.001779
PLC	0.989803

为了验证以上实验结果，进一步使用等比联用的方法，用CI（combination index）值来评价联用效果。CI=D₁/D_X1+D₂/D_X2+αD₁D₂/D_X1D_X2，其中D₁、D₂为两药合用时产生X效应时两药各自所需浓度，D_X1、D_X2为两药单独使用时产生X效应时两药各自浓度。α= 0为两种相互排斥性药物，α= 1为两种相互非排斥性药物。CI < 1为协同作用；CI = 1为相加作用；CI > 1为拮抗作用。在SK-Hep1细胞中，Camptothecin与EGCG等比联用，结果显示，在一定的浓度范围内CI值均小于1。说明Q值和CI值评价效果一致，在SK-Hep1细胞中EGCG与Camptothecin联用时均具有协同效应。

实施例 3 EGCG对裸鼠异种移植瘤生长时对机体的毒副作用

BALB/C-nu/nu裸鼠在无特定病原体（SPF）条件下饲养4周-6周。将SMMC7721细胞或QGY-7701细胞取3×10⁶注射在裸鼠的右侧腋下。瘤体形成后，对照组每天腹腔注射生理盐水；羧甲基纤维素钠组每天口服含0.5% 羧甲基纤维素钠的生理盐水；索拉非尼组剂量为60 mg/kg体重/天，口服；EGCG组剂量为25 mg/kg体重/天或50 mg/kg体重/天，腹腔注射。SMMC7721细胞裸鼠模型共给药13天；QGY-7701细胞裸鼠模型共给药15天。

1， EGCG对裸鼠体重的影响

裸鼠体重的变化是化疗药物毒性的一个指标。检测SMMC7721细胞和QGY-7701细胞的异种移植瘤模型中裸鼠体重的变化情况可以对药物的毒性作一个直观的评价。结果显示，25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠体重基本无影响，说明毒副作用较低；阳性对照索拉非尼对裸鼠体重也基本无影响。

2， EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的毒性

通过检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量，尿素氮（BUN）肌酐（CREA）和胆固醇（CHO1）含量，观测肝脏损伤，肾脏损伤以及心脏损伤的情况。结果显示，在SMMC7721移植瘤模型中，索拉非尼对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的损伤较大；而25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏则基本没有毒性。

表 3 EGCG 对裸鼠肝脏、肾脏和心脏毒性的影响

Claims

1.一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）喜树碱；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和喜树碱的摩尔比为8：1～0.5：1。

2.如权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和喜树碱的摩尔比为5:1～1:1。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和喜树碱的摩尔比为4:1～2:1。

4.权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征是，所述的肿瘤是肝癌。

6.一种抑制肿瘤细胞增长的方法，其特征在于，在肿瘤细胞中加入权利要求1所述组合物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是SMMC7721、HepG2、QGY、SK-Hep1、Huh7、L02、Focus或者YY1细胞。