CN102552245B

CN102552245B - 含有表没食子儿茶素没食子酸酯与紫杉醇的抑制肿瘤细胞增殖的组合物

Info

Publication number: CN102552245B
Application number: CN 201010602484
Authority: CN
Inventors: 余龙; 张明君; 刘祖龙; 朱恒锐
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2030-12-23
Also published as: CN102552245A

Abstract

本发明属于医药和基因工程领域，提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物。所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯和紫杉醇以及药剂学上必要的辅料，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和紫杉醇的摩尔比为200：1-8：1。本发明实验证实，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯与Taxol制成的组合物，或在给予Taxol时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Taxol抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。对裸鼠肝脏和肾脏基本没有毒性，且活性成分中的表没食子儿茶素没食子酸酯资源丰富，价格低廉，在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

Description

含有表没食子儿茶素没食子酸酯与紫杉醇的抑制肿瘤细胞增殖的组合物

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，涉及抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Taxol（紫杉醇）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

背景技术

紫杉醇的英文名称是taxol，是从紫杉(Taxus brevifolia)的树皮中提出的一种化合物，化学名称为5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物, 也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。

紫杉醇生产工艺如下：红豆杉树皮粉碎（越细越好），８５％～９５％酒精，３５－５５℃热回流浸提三次，５０－７０℃真空减压浓缩至热测比重１．１～１．２ｇ／ｍｌ，氯仿萃取，萃取液浓缩成膏状，得紫杉醇含量１％氯仿膏，将紫杉醇含量１％氯仿膏加氯仿溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，氯仿－甲醇梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量５～８％半成品，将紫杉醇含量５～８％半成品加丙酮溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，丙酮－石油醚梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量２０～２５％半成品，用丙酮－石油醚系统结晶３～４次，抽滤，５０℃真空减压干燥，得紫杉醇含量７５～８０％半成品，１６Ｍｐａ压力层析分离，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，目标段浓缩物丙酮－石油醚结晶，抽滤，干燥，得紫杉醇含量≥９９．５％成品；去除胶质的过程为：高压硅胶层析柱层析去除胶质，同时将紫杉烷化合物分离为紫杉醇、三尖杉宁碱、７－表紫杉醇三部分。

茶叶( tea ,camellia sinensis) 是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨，其中20%为绿茶、78%为红茶、2%为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多，但以绿茶为人瞩目。大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。

绿茶中的主要成分为茶多酚，占茶叶干重的30%左右，茶多酚中大部分为儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯〔( - ) epigallocatechin gallate ( EGCG) 〕含量最高，占儿茶素的80%左右。EGCG分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。

到目前为止，尚未见有关EGCG与Taxol联合使用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Taxol（紫杉醇）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

本发明实验证实，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Taxol（紫杉醇）制成的组合物，或在给予Taxol（紫杉醇）时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Taxol抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。

本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）Taxol；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和Taxol的摩尔比为200：1-8：1。

本发明中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯其分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4，可以通过市场销售途径获得。例如，本发明的EGCG购自Sigma公司，货号50299，英文全称：(−)-cis-2-(3,4,5-Trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3,5,7-triol 3-gallate, (−)-cis-3,3′,4′,5,5′,7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG；CAS号：989-51-5。MDL号：MFCD00075940。

本发明中，所述的Taxol通用名：紫杉醇；taxol是微管稳定药。本发明的紫杉醇购自Sigma公司，货号为T7402。其相关信息如下：

CAS Number: 33069-62-4

Empirical Formula (Hill Notation): C₄₇H₅₁NO₁₄

Molecular Weight: 853.91

Beilstein Registry Number: 1420457

MDL number: MFCD00869953。

本发明中，将制成的含有EGCG和Taxol的组合物用于肿瘤细胞（例如，肝癌细胞株SK-Hep1），结果显示，与仅使用Taxol相比，抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。所述组合物的使用能明显降低Taxol的单独使用量，其降低效果随着EGCG用量的增加而更加明显。

本发明中，将EGCG和Taxol的组合物用于裸鼠移植瘤模型，结果显示，与仅使用Taxol相比，本发明的组合物对裸鼠移植瘤生长的抑制效果显著增强，并且效果优于雷帕霉素与Taxol组合物。同时，检测以体重变化为指标的给药后药物的毒性效应显示，EGCG和Taxol联合使用时对裸鼠体重没有明显影响，并且所述的组合物对裸鼠的肝脏和肾脏基本没有毒性，而雷帕霉素和Taxol联合使用则对裸鼠的肝脏和肾脏有较高毒性。

本发明中，采用所述的组合物与单独使用EGCG或者Taxol进行了比较试验，结果显示，所述的组合物在抑制肿瘤细胞生长方面具有明显的增效作用，而且增效作用具有EGCG和Taxol浓度梯度效应。本发明的实施例中列举了EGCG和Taxol含量摩尔比分别为200:3,100:1,1200:1，400：1，3000：1，1000：3，2000：1，160：1，等等，实验表明，在两者含量为6000：1-75:1的范围都是有效果的。

本发明中还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，其包括步骤：在肿瘤细胞中加入EGCG和Taxol组合物，EGCG和Taxol的摩尔比为6000：1-75:1。

所述的肿瘤细胞可以是SK-Hep-1、SMMC7721、PLC、YY1或者L02细胞。

本发明所使用的细胞均购自ATCC。

本发明的组合物，当在治疗上进行施用（给药）时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为7-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的EGCG与Taxol的组合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG和Taxol可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的EGCG与Taxol的组合物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，EGCG与Taxol的组合物可以是针剂或者片剂。

当本发明的EGCG与Taxol的组合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量中通常至少约50毫克EGCG/千克体重。一般临床使用紫杉醇的程序如下：

1.先询问病人有无过敏史，并查看白细胞及血小板的数据。有过敏史者及白细胞／血小板低下者应慎用。

2.由于此药可引起过敏反应，在给药12小时和6小时前服用地塞米松20mg，给药前30～60分钟给予苯海拉明50mg口服及西咪替丁300mg静脉注射。

3.常用紫杉醇的剂量为135～175mg／m2，应先将注射液加于生理盐水或5％葡萄糖液500～1000ml中，需用玻璃瓶或聚乙烯输液器，应用特制的胶管及0.22μm的微孔膜滤过。

4.滴注开始后每15分钟应测血压、心率、呼吸一次，注意有无过敏反应。

5.一般滴注3小时。

6.注药后每周应检查血像至少2次，3～4周后视情况可再重复。

当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了一种新的含EGCG和Taxol的组合物。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。能明显增强Taxol的抗肿瘤效果，同时相对减少了Taxol的用量及药物成本。

由于本发明组合物中的EGCG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

具体实施方式

实施例 1 EGCG与Taxol的协同效果

在SK-hep-1细胞中，EGCG与Taxol的协同效果比较显著。本实施例进一步验证了EGCG与Taxol的联用效果，结果证明在一定的浓度范围内CI值均小于1，两种药物有协同作用。结果表明EGCG与Taxol联合使用可以提高Taxol的抗肿瘤效果。

表1

实施例 2 EGCG与Taxol有协同效应

在五种肿瘤细胞系中固定EGCG的浓度，与Taxol联合用药。采用下述金氏公式Q值来评价联用效果。

Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)

其中，Ea+b为合并用药抑制率，Ea和Eb分别为A药和B药的抑制率；

分子代表实际测量的两药合并抑制率，分母是期待合并抑制率。

Q=0.85-1.15范围表示单纯相加，Q=1.15-2范围表示有增强，Q>2表示明显增强，Q<0.55-0.85表示有拮抗效应，Q<0.55表示明显拮抗。

结果表明， EGCG与Taxol在特定的细胞株中均有一定的协同效果，说明EGCG在特定的细胞株中可以增强现有抗肝癌药物的抗肿瘤活性。

表 2 EGCG 与 Taxol 的联合用药效果 Q 值

	taxol
		SMMC7721	1.004207
SK-Hep1	1.290446
		YY1	1.145883
L02	1.085117
		PLC	1.023046

为了验证以上实验结果，进一步使用等比联用的方法，用CI（combination index）值来评价联用效果。CI=D₁/D_X1+D₂/D_X2+αD₁D₂/D_X1D_X2，其中D₁、D₂为两药合用时产生X效应时两药各自所需浓度，D_X1、D_X2为两药单独使用时产生X效应时两药各自浓度。α= 0为两种相互排斥性药物，α= 1为两种相互非排斥性药物。CI < 1为协同作用；CI = 1为相加作用；CI > 1为拮抗作用。在SK-Hep1细胞中，Taxol与EGCG等比联用，结果显示，在一定的浓度范围内CI值均小于1。说明Q值和CI值评价效果一致，在SK-Hep1细胞中EGCG与Taxol联用时均具有协同效应。

实施例 3 EGCG对裸鼠异种移植瘤生长时对机体的毒副作用

BALB/C-nu/nu裸鼠在无特定病原体（SPF）条件下饲养4周-6周。将SK-Hep1细胞取3×10⁶注射在裸鼠的右侧腋下。瘤体形成后，对照组每天腹腔注射生理盐水；羧甲基纤维素钠组每天口服含0.5% 羧甲基纤维素钠的生理盐水；索拉非尼组剂量为60 mg/kg体重/天，口服；EGCG组剂量为25 mg/kg体重/天或50 mg/kg体重/天，腹腔注射。SK-Hep1细胞裸鼠模型共给药13天。

1， EGCG对裸鼠体重的影响

裸鼠体重的变化是化疗药物毒性的一个指标。检测SK-Hep1细胞的异种移植瘤模型中裸鼠体重的变化情况可以对药物的毒性作一个直观的评价。结果显示，25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠体重基本无影响，说明毒副作用较低；阳性对照索拉非尼对裸鼠体重也基本无影响。

2， EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的毒性

通过检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量，尿素氮（BUN）肌酐（CREA）和胆固醇（CHO1）含量，观测肝脏损伤，肾脏损伤以及心脏损伤的情况。结果显示，在SK-Hep1移植瘤模型中，索拉非尼对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的损伤较大；而25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏则基本没有毒性。

表 3 EGCG 对裸鼠肝脏、肾脏和心脏毒性的影响

Claims

1.一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）紫杉醇；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和紫杉醇的摩尔比为6000：1～75：1。

2.如权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和紫杉醇的摩尔比为3000:1～100:1。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和紫杉醇的摩尔比为2000:1～160:1。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和紫杉醇的摩尔比为1200:1～400:1。

5.权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述的肿瘤是肝癌。

7.一种用于制备用于在体外抑制肿瘤细胞增长的药物的方法，其特征在于，在体外培养的肿瘤细胞中加入权利要求1所述组合物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是SK-Hep-1、SMMC7721、PLC、YY1或者L02细胞。