CN102552270A

CN102552270A - 由表没食子儿茶素没食子酸酯与5-氟脲嘧啶制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物

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Publication number: CN102552270A
Application number: CN2010105965614A
Authority: CN
Inventors: 余龙; 张明君; 刘祖龙; 朱恒锐; 丁丽娅
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2010-12-20
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明属于医药和基因工程领域，提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物。所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯和5-氟脲嘧啶以及药剂学上必要的辅料，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和5-氟脲嘧啶的摩尔比为2.5∶1-0.3∶1。本发明经实验证实，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯与5-FU制成的组合物，或在给予5-FU时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高5-FU抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果；对裸鼠肝脏和肾脏基本没有毒性，且活性成分中的表没食子儿茶素没食子酸酯资源丰富，价格低廉，在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

Description

由表没食子儿茶素没食子酸酯与 5- 氟脲嘧啶制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，涉及抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与5-FU（5-氟脲嘧啶）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

背景技术

5-FU，5-Fluorouracil ，即5-氟尿嘧啶。其作用原理为：在体内先转变为5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸，后者抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制DNA的生物合成。此外，通过阻止尿嘧啶和乳清酸掺入RNA，达到抑制RNA合成的作用。本品为细胞周期特异性药，主要抑制S期细胞。其抗瘤谱较广，主要用于治疗消化道肿瘤，或较大剂量氟尿嘧啶治疗绒毛膜上皮癌。亦常用于治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌及皮肤癌等。口服吸收不规则，需采用静脉给药。吸收后分布于全身体液，肝和肿瘤组织中浓度较高，主要在肝代谢灭活，变为CO2和尿素，分别由呼气和尿液排出，t1/2为10~20min。对骨髓和消化道毒性较大，常见不良反应有：1. 恶心、食欲减退或呕吐。一般剂量多不严重。偶见口腔黏膜炎或溃疡，腹部不适或腹泻。周围血白细胞减少常见（大多在疗程开始后2～3周内达最低点，约在3～4周后恢复正常），血小板减少罕见。极少见咳嗽、气急或小脑共济失调等。 2. 长期应用可导致神经系统毒性。 3. 偶见用药后心肌缺血，可出现心绞痛和心电图的变化。如经证实心血管不良反应（心律失常，心绞痛，ST段改变）则停用。

茶叶( tea ,camellia sinensis) 是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨，其中20%为绿茶、78%为红茶、2%为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多，但以绿茶为人瞩目。大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。

绿茶中的主要成分为茶多酚，占茶叶干重的30%左右，茶多酚中大部分为儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯〔( - ) epigallocatechin gallate ( EGCG) 〕含量最高，占儿茶素的80%左右。EGCG分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。但是绿茶提取物毕竟不是细胞毒类药物，在体外对肿瘤细胞的直接杀伤作用不明显。绿茶提取物及其主要成分不会也不能取代现有的抗肿瘤药物，其独特价值在于作为肿瘤化疗中的生化调节剂，有望增强现有抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，降低抗肿瘤药物的毒性。

到目前为止，尚未见有关EGCG与5-FU联合使用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与5-FU（5-氟脲嘧啶）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

本发明实验证实，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与5-FU（5-氟脲嘧啶）制成的组合物，或在给予5-FU（5-氟脲嘧啶）时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高5-FU抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。

本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）5-FU；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和5-FU的摩尔比为2.5：1-0.3：1。

本发明中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯其分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4。例如，本发明的EGCG购自Sigma公司，货号50299，英文全称：(−)-cis-2-(3,4,5-Trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3,5,7-triol 3-gallate, (−)-cis-3,3′,4′,5,5′,7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG；CAS号：989-51-5。MDL号：MFCD00075940。

本发明中，所述的5-FU通用名：5-氟脲嘧啶；5-FU是胸苷酸合成酶抑制剂。5-FU结构式为：

。

本发明的5-FU购自Sigma公司，货号为F6627。分子式：C₄H₃FN₂O₂ _。。CAS号: 51-21-8。分子量: 130.08；EC 号: 200-085-6。MDL 号: MFCD00006018。

本发明中，将制成的含有EGCG和5-FU的组合物用于肿瘤细胞（例如，肝癌细胞株SK-Hep1），结果显示，与仅使用5-FU相比，抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。所述组合物的使用能明显降低5-FU的单独使用量，其降低效果随着EGCG用量的增加而更加明显。

本发明中，将EGCG和5-FU的组合物用于裸鼠移植瘤模型，结果显示，与仅使用5-FU相比，本发明的组合物对裸鼠移植瘤生长的抑制效果显著增强，并且效果优于雷帕霉素与5-FU组合物。同时，检测以体重变化为指标的给药后药物的毒性效应显示，EGCG和5-FU联合使用时对裸鼠体重没有明显影响，并且所述的组合物对裸鼠的肝脏和肾脏基本没有毒性，而雷帕霉素和5-FU联合使用则对裸鼠的肝脏和肾脏有较高毒性。

本发明中，采用所述的组合物与单独使用EGCG或者5-FU进行了比较试验，结果显示，所述的组合物在抑制肿瘤细胞生长方面具有明显的增效作用，而且增效作用具有EGCG和5-FU浓度梯度效应。本发明的实施例中列举了EGCG和5-FU含量摩尔比分别为2:1,0.5:1,1:1，等等，实验表明，在两者含量为2.5：1-0.3:1的范围都是有效果的。

本发明中还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，其包括步骤：在肿瘤细胞中加入EGCG和5-FU组合物，EGCG和5-FU的摩尔比为2.5：1-0.3:1。

所述的肿瘤细胞可以是L02 细胞。

本发明所使用的细胞均够自ATCC。

本发明的组合物，当在治疗上进行施用（给药）时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为7-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的EGCG与5-FU的组合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG和5-FU可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的EGCG与5-FU的组合物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，EGCG与5-FU的组合物可以是针剂或者片剂。

当本发明的EGCG与5-FU的组合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量中通常至少约50毫克EGCG/千克体重。5-氟尿嘧啶作静脉注射或静脉滴注所用剂量相差甚大。单药静脉注射剂量一般为按体重一日10～20mg/kg,连用5～10日，每疗程5～7克（甚至10克）。若为静脉滴注，通常按体表面积一日300～500mg/m2，连用3～5天，每次静脉滴注时间不得少于6～8小时；静脉滴注时可用输液泵连续给药维持24小时。用于原发性或转移性肝癌，多采用动脉插管注药。腹腔内注射按体表面积一次500～600mg/m2。每周1次，2～4次为1疗程。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了一种新的含EGCG和5-FU的组合物。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。能明显增强5-FU的抗肿瘤效果，同时相对减少了5-FU的用量及药物成本。本发明组合物中的EGCG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

具体实施方式

实施例 1 EGCG与5-FU的协同效果

EGCG与十种抗肝癌药物联合使用均具有协同效应，其中在L02细胞中与5-FU的协同效果比较显著。本实施例进一步验证了EGCG与5-FU的联用效果，结果证明在一定的浓度范围内CI值均小于1，两种药物有协同作用。结果表明EGCG与5-FU联合使用可以提高5-FU的抗肿瘤效果。

表1

实施例 2 EGCG与5-FU有协同效应

在十种肝癌细胞系中固定EGCG的浓度，与5-FU联合用药。采用下述金氏公式Q值来评价联用效果。

Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)

其中，Ea+b为合并用药抑制率，Ea和Eb分别为A药和B药的抑制率；

分子代表实际测量的两药合并抑制率，分母是期待合并抑制率。

Q=0.85-1.15范围表示单纯相加，Q=1.15-2范围表示有增强，Q>2表示明显增强，Q<0.55-0.85表示有拮抗效应，Q<0.55表示明显拮抗。

结果表明， EGCG与5-FU在特定的细胞株中均有一定的协同效果，说明EGCG在特定的细胞株中可以增强现有抗肝癌药物的抗肿瘤活性。

表 2 EGCG 与 5-FU 的联合用药效果 Q 值

	5-FU
		SMMC7721	1.064901
HepG2	1.052661
		QGY	0.996265
SK-Hep1	0.843538
		YY1	0.971577
Huh7	0.945711
		Hep3B	0.8712
L02	2.268788
		Focus	0.90242
PLC	1.111761

为了验证以上实验结果，进一步使用等比联用的方法，用CI（combination index）值来评价联用效果。CI=D₁/D_X1+D₂/D_X2+αD₁D₂/D_X1D_X2，其中D₁、D₂为两药合用时产生X效应时两药各自所需浓度，D_X1、D_X2为两药单独使用时产生X效应时两药各自浓度。α= 0为两种相互排斥性药物，α= 1为两种相互非排斥性药物。CI < 1为协同作用；CI = 1为相加作用；CI > 1为拮抗作用。在L02细胞中，5-FU与EGCG等比联用，结果显示，在一定的浓度范围内CI值均小于1。说明Q值和CI值评价效果一致，在L02细胞中EGCG与5-FU联用时均具有协同效应。

实施例 3 EGCG能够增效5-FU，降低5-FU的用量

在L02细胞中将10、20、40 μM的5-FU分别与10、20、30 μM的EGCG联用，10、20、40 μM的5-FU与不同浓度的EGCG联用后可以达到甚至超过50 μM 5-FU单独使用的效果。根据软件统计分析，与EGCG联合使用达到半数抑制效果时所需要的5-FU量随着EGCG量的增加而减少，并且具有浓度梯度效应。以上实验结果说明EGCG与5-FU联合使用，可以有效的增强5-FU的抗肿瘤效果并且降低其用量。

实施例 4 EGCG对裸鼠异种移植瘤生长时对机体的毒副作用

BALB/C-nu/nu裸鼠在无特定病原体（SPF）条件下饲养4周-6周。将SMMC7721细胞取3×10⁶注射在裸鼠的右侧腋下。瘤体形成后，对照组每天腹腔注射生理盐水；羧甲基纤维素钠组每天口服含0.5% 羧甲基纤维素钠的生理盐水；索拉非尼组剂量为60 mg/kg体重/天，口服；EGCG组剂量为25 mg/kg体重/天或50 mg/kg体重/天，腹腔注射。SMMC7721细胞裸鼠模型共给药13天。

1， EGCG对裸鼠体重的影响

裸鼠体重的变化是化疗药物毒性的一个指标。检测SMMC7721细胞的异种移植瘤模型中裸鼠体重的变化情况可以对药物的毒性作一个直观的评价。结果显示，25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠体重基本无影响，说明毒副作用较低；阳性对照索拉非尼对裸鼠体重也基本无影响。

2， EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的毒性

通过检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量，尿素氮（BUN）肌酐（CREA）和胆固醇（CHO1）含量，观测肝脏损伤，肾脏损伤以及心脏损伤的情况。结果显示，在SMMC7721移植瘤模型中，索拉非尼对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的损伤较大；而25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏则基本没有毒性。

表 3 EGCG 对裸鼠肝脏、肾脏和心脏毒性的影响

Claims

1.一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）5-氟脲嘧啶；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和5-氟脲嘧啶的摩尔比为2.5：1～0.3：1。

2.如权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，其特征在于，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯其分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4。

3.如权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，其特征在于，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和5-氟脲嘧啶的摩尔比为2:1～0.3:1。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和5-氟脲嘧啶的摩尔比为2:1～0.5:1。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和5-氟脲嘧啶的摩尔比为1:1。

6.权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是，所述的肿瘤是肝癌。

8.一种抑制肿瘤细胞增长的方法，其特征在于，在肿瘤细胞中加入权利要求1所述组合物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是L02 细胞。