CN1444935A - 表没食子儿茶素没食子酸酯在抗肿瘤药物中应用 - Google Patents

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魏东芝
刘建文
梅郁盈
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Abstract

本发明将茶中提取主要成分为表没食子儿茶素没食子酸酯((－)－epigallocatechin gallate，EGCG)应用于治疗肿瘤药物中。该提取物不仅能抑制肿瘤细胞增殖、同时具有使肿瘤细胞不易产生耐药性和提高肿瘤细胞对治疗药物的敏感性作用。本发明提出该天然提取物可作为抗肿瘤药物的增敏剂和增效剂。

Description

表没食子儿茶素没食子酸酯在抗肿瘤药物中应用
技术领域
本发明涉及表没食子儿茶素没食子酸酯的用途。
技术背景
多药抗药性(multidrug resistance，MDR)是指癌细胞接触一种抗肿瘤药物并产生抗药性的同时，对结构和作用机理不同的多种抗肿瘤药物产生交叉抗药性。肿瘤病人在经过化疗后，往往会产生多药抗药性。多药抗药性是导致肿瘤化疗失败的主要原因，也是肿瘤化疗急需解决的难题之一。多药抗药性的形成机理复杂。肿瘤细胞可通过不同途径导致MDR的产生，同时，单个MDR细胞可同时存在多种抗药性的机制。任何一种或多种机制联合作用均可导致MDR的产生。
MDR的逆转剂与抗癌药物合用，将会大幅度地提高化疗药物对MDR肿瘤的疗效。尽管许多化合物或药物具有体外逆转MDR的作用，但由于毒副作用很大，无临床应用价值。作为临床应用的MDR逆转剂的药物，至今尚未开发成功。因此，寻找低毒、不易产生MDR的物质或有效的MDR逆转物质是肿瘤化疗治疗领域急需解决的难题，也具有重要的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提高肿瘤细胞对治疗药物的敏感性和增加治疗药物效用，克服现有肿瘤治疗药物使用过程中存在MDR作用，提高治疗肿瘤的临床效果。
技术方案：
1，确立EGCG对MDR靶细胞的细胞毒性作用的参数。
用DMEM培养液稀释EGCG成10-100μg/ml。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定EGCG对MDR靶细胞的细胞毒性作用。将对数生长期MDR靶细胞104cell·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入10-100μg/ml浓度的EGCG处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜)，每孔150μl，振荡10min，是MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，计算MDR靶细胞的存活率和药物对MDR靶细胞的抑制率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定细胞的半数抑制浓度(IC50)参数。
2，用EGCG提高MDR靶细胞对治疗药物的敏感性和增加治疗药物效用，
参照上述细胞的半数抑制浓度(IC50)，将对数生长期MDR靶细胞104cell·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，先分别加入半数抑制浓度以内的EGCG处理MDR靶细胞，然后加入作为代表的抗癌药阿霉素，浓度范围为0-32μg/ml，每组平行4孔，可以提高多药抗药性癌细胞株对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的作用效果，
本发明的显著的优点和技术上的进步：
本发明提供的肿瘤化疗药物增敏剂和增效剂，克服了EGCG的传统用途，将其作为新型的肿瘤化疗药物增敏剂和增效剂，可以提高多药抗药性癌细胞株对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的作用效果，具有良好的应用前景。
附图说明图1.不同浓度EGCG不同作用时间下对药物敏感性细胞(KB-3-1)的细胞毒性图2不同浓度EGCG不同作用时间下对MDR细胞(KB-A-1)的细胞毒性图3不同浓度的三种抗癌药物对KB-3-1的细胞毒性图4不同浓度的三种抗癌药物对KB-A-1的细胞毒性图5 EGCG对KB-3-1和KB-A-1存活率的影响图6 EGCG对KB-A-1多药抗药性的逆转作用
具体实施方法
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但其并不影响本发明的保护范围：
                     实施例1
EGCG对MDR细胞(KB-A-1)和药物敏感性细胞(KB-3-1)的细胞毒性作用。
EGCG购自Sigma公司，用DMEM培养液稀释成所需浓度。采用噻唑蓝(MTT)快速比色法测定EGCG对MDR细胞(KB-A-1)和药物敏感性细胞(KB-3-1)的细胞毒性作用。将对数生长期细胞104cell·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，分别加入一定浓度的TP和EGCG处理，每浓度平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养1-4天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1 MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜)，每孔150μl，振荡10min，是MTT还原产物完全溶解，用BioRad550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，计算肿瘤细胞的存活率和药物对细胞的抑制率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定细胞的半数抑制浓度(ICS0)。实验结果如下：
       表1.不同浓度EGCG不同作用时间下对KB-3-1的抑制率
药物浓度                         抑制率(％)
(μg/ml)       24h          48h           72h           96h
   0        0±0.082      0±0.094      0±0.097      0±0.128
   10       7.40±0.095   10.19±0.093  21.54±0.184  32.45±0.119
   20       30.86±0.106  34.50±0.147  42.02±0.136  44.12±0.151
   30       43.70±0.127  46.18±0.136  50.06±0.105  69.15±0.137
   40       49.49±0.108  52.53±0.153  61.32±0.139  74.81±0.158
   50       52.32±0.117  56.36±0.129  68.38±0.144  82.79±0.154
   60       54.05±0.135  63.64±0.191  68.91±0.154  83.33±0.088
   70       55.86±0.118  64.07±0.138  70.25±0.182  86.40±0.173
IC50(μ               41.43           36.50         27.49          26.80
 g/ml)
        表2.不同浓度EGCG不同作用时间下对KB-A-1的抑制率
EGCG浓度                    抑制率(％)
(μg/ml)     24h           48h           72h          96h
  0       0±0.099      0±0.166      0±0.091      0±0.164
  10      2.77±0.184   4.85±0.125   5.33±0.155   5.78±0.145
  20      3.46±0.192   11.19±0.085  32.03±0.109  33.07±0.137
  30      15.67±0.135  24.62±0.166  41.35±0.116  52.89±0.111
  40      16.23±0.146  37.90±0.122  52.84±0.147  65.92±0.158
  50      18.1±0.132   42.74±0.172  55.21±0.144  67.97±0.126
  60      26.68±0.055  51.45±0.178  63.03±0.059  80.32±0.142
  IC50(μ     158.42         59.97          32.66           27.89
  g/ml)
以上实施例说明，EGCG均具有良好的杀灭肿瘤细胞的作用，不论是对多药抗药性细胞还是药物敏感细胞都可产生相同的抑制效果，而且这利抑制效果还具有剂量依赖性，并随着作用时间的延长而程度加深效果加强。
                    实施例2
EGCG与传统的肿瘤化疗药物耐药倍数比较。
采用MTT法(具体实验操作参照实施例1)考察三种临床上较为常用的抗癌药物阿霉素、秋水仙素和长春花碱不同浓度一定作用时间下(三天)对KB-3-1和KB-A-1的细胞毒性，以药物的不同浓度和细胞的存活率作图，确定细胞的半数抑制浓度，计算耐药倍数(resistance factor，RF＝IC50(KB-A-1)/IC50(KB-3-1))，并将EGCG相同作用时间下与这三种传统的肿瘤化疗药物耐药倍数进行比较。实验结果见图3、图4、图5及下表：
     表3 EGCG与传统的肿瘤化疗药物耐药倍数比较
IC50(ng/ml)          Dox       Col      Vin      EGCG
KB-3-1                69.48     6.89     37.89    27490
KB-A-1                8320      770      2610     32660
Resistance factor     119.75    111.76   68.88    1.19
以上实施例说明，KB-A-1细胞具有非常明显的抗药性而KB-3-1对药物的反应却非常敏感。Ng数量级浓度的药物即可起到杀灭KB-3-1的作用，但要达对KB-A-1到同样的抑制效果药物浓度却要至少提高70倍。与之相比较的EGCG，不同浓度的EGCG相同作用时间下对敏感型细胞株和抗药型细胞株的影响趋势基本一致。将EGCG不同作用时间下对敏感型细胞株和抗药型细胞株的半数抑制浓度对比，发现它们对两细胞株的抑制效果无太大区别，说明EGCG对癌细胞的抑制效果在敏感型菌株和抗药型菌株都能收到良好的效果，说明在不产生耐药性方面优于传统药物。
                          实施例3：
EGCG对阿霉素抗癌效果的影响：
将对数生长期细胞104cell·ml-1接种于96孔培养板，每孔0.2ml，先分别加入40μg/ml 10μg/ml EGCG处理，然后加入阿霉素，浓度范围为0-32μg/ml，每组平行4孔，对照组加等量体积的培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养培养3天，实验终止前4小时每孔加入5mg·ml-1 MTT 10μl，培养结束后每孔加入0.04N DMSO(二甲基亚砜)，每孔150μl，振荡10min，是MTT还原产物完全溶解，用BioRad 550型酶标仪，以550nm为实验波长，655nm为参照波长测定其吸收度，求出半数抑制浓度(IC50)，计算逆转倍数(reversal index.RI)。实验结果见图6。
从图6可以看出：经过10μg/ml的EGCG处理后，耐药细胞株KB-A-1对阿霉素的IC50从10.35μg/ml降到了5.45μg/ml逆转倍数分别达到了1.90。经过无细胞毒性的EGCG与阿霉素共同作用后，细胞的存活率由单独使用阿霉素的55.77％分别下降到40.31％，而且这种增敏作用非常明显而且不是经过累加作用得到的。由此可以得出：茶类提取物质具有提高多药抗药性细胞株对抗癌药物敏感性的作用，即可以逆转多药抗药性。

Claims (1)

1、表没食子儿茶素没食子酸酯在抗肿瘤药物中应用，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯作为抗肿瘤药物的增敏剂和增效剂。
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