CN102552273A

CN102552273A - 含有表没食子儿茶素没食子酸酯与甲氨蝶呤的组合物

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Publication number: CN102552273A
Application number: CN2010106025019A
Authority: CN
Inventors: 余龙; 刘祖龙; 张明君; 朱恒锐
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2030-12-23
Also published as: CN102552273B

Abstract

本发明属于医药和基因工程领域，提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物。所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤以及药剂学上必要的辅料，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤的摩尔比为800：3-1.5：1。本发明实验证实，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯与Methotrexate制成的组合物，或在给予Methotrexate时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Methotrexate抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。对裸鼠肝脏和肾脏基本没有毒性，且活性成分中的表没食子儿茶素没食子酸酯资源丰富，价格低廉，在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

Description

含有表没食子儿茶素没食子酸酯与甲氨蝶呤的组合物

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，涉及抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Methotrexate（甲氨蝶呤，或者氨甲蝶呤）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

背景技术

甲氨蝶呤(氨甲蝶呤，氨甲叶酸)，英文/拉丁名称：Methotrexate，别名：氨甲叶酸，威力氨甲蝶呤，氨克生（Trexan），Amethopterin，MTX，Emthexate，FarmachemiceB.V，Farmothrex（Farmos）。甲氨蝶呤片剂为橙黄色结晶性粉末。本品在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶；在稀碱溶液中易溶，在稀盐酸中溶解。

甲氨蝶呤的适应症有：（1）全身用药治疗绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、各类急性白血并乳腺癌、肺癌、头颈部癌、消化道癌、宫颈癌及恶性淋巴瘤等。（2）动脉插管灌注对头颈部癌和肝癌有较好疗效。（3）大剂量甲氨蝶呤辅以甲酰四氢叶酸钙救援（HDMTX-CFR疗法），作为骨肉瘤、软组织肉瘤、恶性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血并乳腺癌、卵巢癌。小细胞肺癌等术后辅助化疗或晚期病变全身治疗有一定疗效。

副作用表现： 1 胃肠道反应主要为口腔炎、口唇溃疡、咽炎、恶心、呕吐、胃炎及腹泻。2 骨髓抑制主要表现为白细胞下降，对血小板亦有一定影响，严重时可出现全血下降、皮肤或内脏出血。3 大量1次应用可致血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高，或药物性肝炎，小量持久应用可致肝硬变。4 肾脏损害常见于高剂量时，出现血尿、蛋白尿、尿少、氮质血症、尿毒症等。5 还有脱发、皮炎、色素沉着及药物性肺炎等，鞘内或头颈部动脉注射剂量过大时，可出现头痛、背痛、呕吐、发热及抽搐等症状。6 妊娠早期使用可致畸胎，少数病人有月经延迟及生殖功能减退。

茶叶( tea ,camellia sinensis) 是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨，其中20%为绿茶、78%为红茶、2%为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多，但以绿茶为人瞩目。大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。

绿茶中的主要成分为茶多酚，占茶叶干重的30%左右，茶多酚中大部分为儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯〔( - ) epigallocatechin gallate ( EGCG) 〕含量最高，占儿茶素的80%左右。EGCG分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。但是绿茶提取物毕竟不是细胞毒类药物，在体外对肿瘤细胞的直接杀伤作用不明显。绿茶提取物及其主要成分不会也不能取代现有的抗肿瘤药物，其独特价值在于作为肿瘤化疗中的生化调节剂，有望增强现有抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，降低抗肿瘤药物的毒性。

到目前为止，尚未见有关EGCG与Methotrexate联合使用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Methotrexate（甲氨蝶呤）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

本发明实验证实，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Methotrexate（甲氨蝶呤）制成的组合物，或在给予Methotrexate（甲氨蝶呤）时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Methotrexate抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。

本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）Methotrexate；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和Methotrexate的摩尔比为800：3-1.5：1。

本发明中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯其分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4，可以通过市场销售途径获得。例如，本发明的EGCG购自Sigma公司，货号50299，英文全称：(?)-cis-2-(3,4,5-Trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3,5,7-triol 3-gallate, (?)-cis-3,3′,4′,5,5′,7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG；CAS号：989-51-5。MDL号：MFCD00075940。

本发明中，所述的Methotrexate通用名：甲氨蝶呤；Methotrexate是DNA、RNA合成抑制剂，源于Sigma公司，货号M9299 ，又称为: 4-Amino-10-methylfolic acid hydrate, L-4-Amino-N10-methylpteroylglutamic acid hydrate, L-Amethopterin hydrate, Antifolan hydrate, MTX hydrate, Methotrexate hydrate, Methylaminopterin hydrate。相关信息和结构式如下：

CAS Number: 133073-73-1

Figure 2010106025019100002DEST_PATH_IMAGE001

Empirical Formula (Hill Notation): C20H22N8O5 · xH2O

Molecular Weight: 454.44 (anhydrous basis)

MDL number: MFCD00150847 。

本发明中，将制成的含有EGCG和Methotrexate的组合物用于肿瘤细胞（例如，肝癌细胞株SK-Hep1），结果显示，与仅使用Methotrexate相比，抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。所述组合物的使用能明显降低Methotrexate的单独使用量，其降低效果随着EGCG用量的增加而更加明显。

本发明中，将EGCG和Methotrexate的组合物用于裸鼠移植瘤模型，结果显示，与仅使用Methotrexate相比，本发明的组合物对裸鼠移植瘤生长的抑制效果显著增强，并且效果优于雷帕霉素与Methotrexate组合物。同时，检测以体重变化为指标的给药后药物的毒性效应显示，EGCG和Methotrexate联合使用时对裸鼠体重没有明显影响，并且所述的组合物对裸鼠的肝脏和肾脏基本没有毒性，而雷帕霉素和Methotrexate联合使用则对裸鼠的肝脏和肾脏有较高毒性。

本发明中，采用所述的组合物与单独使用EGCG或者Methotrexate进行了比较试验，结果显示，所述的组合物在抑制肿瘤细胞生长方面具有明显的增效作用，而且增效作用具有EGCG和Methotrexate浓度梯度效应。本发明的实施例中列举了EGCG和Methotrexate含量摩尔比分别为80:3，8:1，60:1， 20：1，160：1，800：3，80：1，1.5：1，等等，实验表明，在两者含量为200：1-8:1的范围都是有效果的。

本发明中还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，其包括步骤：在肿瘤细胞中加入EGCG和Methotrexate组合物，EGCG和Methotrexate的摩尔比为800：3-1.5:1。

所述的肿瘤细胞可以是SK-Hep1或者HepG2细胞。

本发明所使用的细胞均购自ATCC。

本发明的组合物，当在治疗上进行施用（给药）时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为7-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的EGCG与Methotrexate的组合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG和Methotrexate可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的EGCG与Methotrexate的组合物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，EGCG与Methotrexate的组合物可以是针剂或者片剂。

当本发明的EGCG与Methotrexate的组合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量中通常至少约50毫克EGCG/千克体重。

甲氨蝶呤的常规用药剂量如下：

1 治疗白血病通常成人口服2.5mg～10mg/日，总量约50mg～150mg。儿童1.5mg～5mg/日。

2 治疗绒毛膜上皮癌等 10mg～20mg/日，肌注或口服，亦可作静滴，连用5～10日，疗程量为80mg～100mg。

3 治疗头颈部癌或妇科癌 10mg～20mg/次，动脉插管给药，每日或隔日1次，7～10次为1疗程。

4 治疗一般实体瘤肝、肾功能正常者，30mg～50mg/次，静注，5～10日1次，5～10次为1疗程；也可每次0.4mg/kg，静注，每周2次。

5 解救疗法先静注长春新碱1mg～2mg/次，半小时后，用甲氨蝶呤1g～5g/m 2，静滴6小时。4～6小时后开始肌注甲酰四氢叶酸钙，6mg～12mg(～15mg)/次，以后每6小时肌注1次，用到72小时。依情况可每月用药1次。

当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的优越性是：提供了一种新的含EGCG和Methotrexate的组合物。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。能明显增强Methotrexate的抗肿瘤效果，同时相对减少了Methotrexate的用量及药物成本。由于本发明组合物中的EGCG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

具体实施方式

实施例1 EGCG与Methotrexate的协同效果

在SK-hep-1细胞中，EGCG与Methotrexate的协同效果比较显著。本实施例进一步验证了EGCG与Methotrexate的联用效果，结果证明在一定的浓度范围内CI值均小于1，两种药物有协同作用。结果表明EGCG与Methotrexate联合使用可以提高Methotrexate的抗肿瘤效果。

表1

实施例2 EGCG与Methotrexate有协同效应

在十种肿瘤细胞系中固定EGCG的浓度，与Methotrexate联合用药。采用下述金氏公式Q值来评价联用效果：Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)

其中，Ea+b为合并用药抑制率，Ea和Eb分别为A药和B药的抑制率；

分子代表实际测量的两药合并抑制率，分母是期待合并抑制率。

Q=0.85-1.15范围表示单纯相加，Q=1.15-2范围表示有增强，Q>2表示明显增强，Q<0.55-0.85表示有拮抗效应，Q<0.55表示明显拮抗。

结果表明， EGCG与Methotrexate在特定的细胞株中均有一定的协同效果，说明EGCG在特定的细胞株中可以增强现有抗肝癌药物的抗肿瘤活性。

表2 EGCG与Methotrexate的联合用药效果Q值

	Methotrexate
		SMMC7721	0.965077
HepG2	1.172513
		QGY	1.22044
SK-Hep1	1.243271
		YY1	1.107715
Huh7	0.906952
		Hep3B	1.054881
L02	0.6813
		Focus	1.007199
PLC	1.086984

为了验证以上实验结果，进一步使用等比联用的方法，用CI（combination index）值来评价联用效果。CI=D₁/D_X1+D₂/D_X2+αD₁D₂/D_X1D_X2，其中D₁、D₂为两药合用时产生X效应时两药各自所需浓度，D_X1、D_X2为两药单独使用时产生X效应时两药各自浓度。α= 0为两种相互排斥性药物，α= 1为两种相互非排斥性药物。CI < 1为协同作用；CI = 1为相加作用；CI > 1为拮抗作用。在SK-Hep1细胞中，Methotrexate与EGCG等比联用，结果显示，在一定的浓度范围内CI值均小于1。说明Q值和CI值评价效果一致，在SK-Hep1细胞中EGCG与Methotrexate联用时均具有协同效应。

实施例3 EGCG能够增效Methotrexate，降低Methotrexate的用量

在SK-Hep1细胞中将0.25、0.5、0.75 μM的Methotrexate分别与10、20、30、40、50 μM的EGCG联用， 0.25、0.5、0.75 μM的Methotrexate与不同浓度的EGCG联用后可以达到甚至超过1 μM Methotrexate单独使用的效果。根据软件统计分析，与EGCG联合使用达到半数抑制效果时所需要的Methotrexate量随着EGCG量的增加而减少，并且具有浓度梯度效应。以上实验结果说明EGCG与Methotrexate联合使用，可以有效的增强Methotrexate的抗肿瘤效果并且降低其用量。

实施例4 EGCG对裸鼠异种移植瘤生长时对机体的毒副作用

BALB/C-nu/nu裸鼠在无特定病原体（SPF）条件下饲养4周-6周。将SK-Hep1细胞取3×10⁶注射在裸鼠的右侧腋下。瘤体形成后，对照组每天腹腔注射生理盐水；羧甲基纤维素钠组每天口服含0.5% 羧甲基纤维素钠的生理盐水；索拉非尼组剂量为60 mg/kg体重/天，口服；EGCG组剂量为25 mg/kg体重/天或50 mg/kg体重/天，腹腔注射。SK-Hep1细胞裸鼠模型共给药13天；QGY-7701细胞裸鼠模型共给药15天。

1， EGCG对裸鼠体重的影响

裸鼠体重的变化是化疗药物毒性的一个指标。检测SK-Hep1细胞的异种移植瘤模型中裸鼠体重的变化情况可以对药物的毒性作一个直观的评价。结果显示，25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠体重基本无影响，说明毒副作用较低；阳性对照索拉非尼对裸鼠体重也基本无影响。

2， EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的毒性

通过检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量，尿素氮（BUN）肌酐（CREA）和胆固醇（CHO1）含量，观测肝脏损伤，肾脏损伤以及心脏损伤的情况。结果显示，在SK-Hep1移植瘤模型中，索拉非尼对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的损伤较大；而25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏则基本没有毒性。

表3 EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏毒性的影响

Figure 2010106025019100002DEST_PATH_IMAGE003

Claims

1.一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）甲氨蝶呤；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤的摩尔比为800：3～1.5：1。

2.如权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤的摩尔比为160:1～2:1。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤的摩尔比为80:1～8:1。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和甲氨蝶呤的摩尔比为80:3～20:1。

5.权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述的肿瘤是肝癌。

7.一种抑制肿瘤细胞增长的方法，其特征在于，在肿瘤细胞中加入权利要求1所述组合物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是SK-Hep-1或者HepG2细胞。