CN109985237A - 一种治疗结直肠癌的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗结直肠癌的药物组合物及其应用，具体涉及中药葛根芩连汤和PD‑1/PD‑L1抗体的药物组合物及其在治疗肿瘤中的应用。为了解决目前PD‑1抗体治疗肿瘤效果不佳的问题，申请人创造性的将中药古方葛根芩连汤和PD‑1抗体进行联用，实验结果表明，二者联合对于治疗肿瘤具有显著的协同作用。

Description

一种治疗结直肠癌的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及抗癌药物组合物，具体涉及中药葛根芩连汤联合PD-1/PD-L1抗体治疗结直肠癌。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一，发病率占胃肠道肿瘤的前列，随着经济发展和人民生活水平的提高，生活方式和饮食结构的改变，我国结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势。此外，结直肠癌的死亡率非常高，主要是由于频发的术后转移和对化疗药物产生的多重耐药性造成的，故而，寻找有效的治疗结直肠癌的药物已经成为临床亟待解决的重要问题。

葛根芩连汤，中医方剂名，由葛根(Radix Puerariae)、黄芩(ScutellariaeRadix)、黄连(Coptidis Rhizoma)、甘草(licorice)4味药组成。为表里双解剂，具有解表清里之功效。主治协热下利。身热下利，胸脘烦热，口干作渴，喘而汗出，舌红苔黄，脉数或促。临床常用于治疗急性肠炎、细菌性痢疾、肠伤寒、胃肠型感冒等属表证未解，里热甚者。浙江省杭州市萧山区中医院的陈慧等人曾应用葛根芩连汤治疗晚期结肠癌化疗相关性肠道湿热型腹泻，效果优于培菲康。但是，将葛根芩连汤用于治疗结直肠癌或辅助治疗结直肠癌的研究还未曾报道。

PD-1及其配体PD-L1是当前抗肿瘤研究的热点，在肿瘤的免疫治疗方面表现突出，以他们为靶点的多种抗体药物已经上市，并获得良好的抗肿瘤效果。全球上市的PD-1或PD-L1抑制剂药物中，以纳武利尤单抗(Opdivo)和派姆单抗(Keytruda)为代表，二者虽然都批准用于结直肠癌的治疗，但是在他们对结直肠癌的客观缓解率仅为30％和36％，治疗效果有待提高。

本申请为了解决目前PD-1抗体治疗结直肠癌效果不佳的问题，创造性的将中药古方葛根芩连汤和PD-1抗体进行联用，实验结果表明，二者的联合在治疗结直肠癌中具有非常好的效果。本申请提供的药物组合物克服了现有的单一药物治疗结直肠癌效果不佳的问题，具有很好的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供中药葛根芩连汤在制备治疗癌症药物中的应用。

进一步，癌症为结直肠癌。

进一步，葛根芩连汤由葛根(Radix Puerariae)、黄芩(Scutellariae Radix)、黄连(Coptidis Rhizoma)、甘草(licorice)4味药组成。

进一步，葛根芩连汤的剂型还可以选自市售的葛根芩连片、葛根芩连丸、葛根芩连注射液等不同剂型。

优选的，葛根芩连汤中各组分的重量比例为：葛根5-40克、黄连3-24克、黄芩3-24克份、甘草2-16克；更优选的，葛根芩连汤中各组分的重量比例为：葛根：黄连：黄芩：甘草＝5：3：3：2。

进一步，葛根芩连汤的有效量为0.5-15g/kg/day，优选的，葛根芩连汤的有效量为1.5-7.5g/kg/day。

本发明的目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包括中药葛根芩连汤和PD-1/PD-L1抗体。

进一步，PD-1/PD-L1抗体选自市售或临床试验中的PD-1/PD-L1抗体中的一种或几种。例如，Opdivo(Nivolumab)，Keytruda(Pembrolizumab)，Tecentriq(Atezolizumab)，Imfinzi(Durvalumab)，Bavencio(Avelumab)，拓益(特瑞普利单抗)、达伯舒(信迪利单抗)、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗等，进口PD-1/PD-L1抗体的使用剂量一般为2mg/kg-4mg/kg(患者体重)，或者2mg/kg-3mg/kg(患者体重)，如Opdivo药的使用方法是3mg/kg，2周1次；或者固定剂量，240mg/次，2周1次；国产PD-1/PD-L1抗体的使用剂量一般为1mg/kg-10mg/kg(患者体重)，或者固定剂量200-400mg/次，2周1次。

进一步，葛根芩连汤剂型还可以选自市售的葛根芩连片、葛根芩连丸、葛根芩连注射液等不同剂型。

进一步，葛根芩连汤中各组分的重量比例为：葛根5-40克、黄连3-24克、黄芩3-24克份、甘草2-16克；更优选的，葛根芩连汤中各组分的重量比例为：葛根：黄连：黄芩：甘草＝5：3：3：2。

进一步，药物组合物为有效量的中药葛根芩连汤和PD-1/PD-L1抗体的组合。

优选的，有效量的中药葛根芩连汤和PD-1/PD-L1抗体质量比为13-3000：1-5。更优选的，有效量的中药葛根芩连汤和PD-1/PD-L1抗体质量比为13-1000：1。

本发明涉及的药物组合物中的中药葛根芩连汤和PD-1/PD-L1抗体可以在同一种制剂单元中或分别在不同的规格制剂单元中。

进一步，药物组合物还包括任选的药学上可接受的辅料。

“药学上可接受的辅料”是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。在本发明提供的药物中添加的药学上可接受的辅料，能够起到赋形、充当载体或提高稳定性的作用，此外，还具有增溶、助溶或缓控释等重要功能。

典型但非限制性的药学上可接受的辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂或释放阻滞剂中的一种或多种。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。

本发明涉及的药物组合物中的活性化合物的剂量水平取决于具体化合物的活性、给药途径、待治疗疾病的严重程度以及待治疗患者的情况和前病史。

本发明涉及的药物组合物的剂型可以是药学上可接受的任意一种剂型，包括但不限于粉剂、注射剂、胶囊、片剂、缓释剂、口服液。

本发明涉及的药物组合物的给药途径可以是一种或多种任何可能的途径，根据患者状况和其他重要参数，这些途径包括口服、注射、呼吸道、皮肤、直肠和经黏膜。

本发明还提供了包含中药葛根芩连汤和PD-1/PD-L1抗体的药物组合物和说明书的药盒。

进一步，所述药盒还可以包括施用药物所需的工具，所述工具可以是注射器、插管等。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法是将前面所述的第一活性化合物和第二活性化合物联合施用到需要治疗的对象中，其中第一活性化合物和第二活性化合物可以同时施用到需要治疗的个体中，也可以分别施用到需要治疗的个体中，还可以依次施用到需要治疗的个体中，例如先施用第一活性化合物，间隔一定时间再施用第二活性化合物；也可以先施用第二活性化合物，间隔一定时间再施用第一活性化合物。

本发明的联合用药物的施用对象包括哺乳动物或所述哺乳动物的肿瘤细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。所述对象可以是罹患肿瘤的患者，或者为罹患肿瘤的患者的离体肿瘤细胞。

本发明的目的在于提供上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

在上述药物组合物中，中药葛根芩连可作为PD-1/PD-L1抗体的增效剂，增强PD-1/PD-L1抗体的抗肿瘤效果，故而，适用于PD-1/PD-L1抗体的肿瘤均可使用葛根芩连汤增强其效果。

现有的报道显示，PD-1/PD-L1抗体可治疗各种肿瘤。如文章“PD-1/PD-L1抑制剂在肿瘤免疫治疗中的研究进展”中指出的，PD-1/PD-L1抗体在治疗黑色素瘤、肺癌、胃/胃食管结合部癌、结直肠癌、胰腺癌、头颈部肿瘤等，文章“PD-1/PD-L在淋巴瘤中的研究进展”中指出的，PD-1/PD-L1抗体在治疗淋巴瘤，文章“PD-1抑制剂纳武利尤单抗治疗晚期肾癌的新进展”，文章“PD-1/PD-L1在治疗三阴性乳腺癌中的研究进展”，文章“膀胱尿路上皮癌PD-1/PD-L抑制剂的治疗进展”，文章“抗PD-1/PD-L1免疫治疗在子宫内膜癌中的研究和应用”，文章“PD-1/PD-L1与IDO抑制剂在原发性肝细胞肝癌免疫治疗中的研究进展”，文章“抗PD-1/PD-L1治疗在头颈部肿瘤的研究进展”，文章“PD-1/PD-L1在宫颈癌中的基础研究进展”，文章“以PD-1/PD-L1为靶点的肺癌免疫治疗临床研究进展”，文章“程序性死亡受体-1/配体-1在软组织肉瘤中的研究进展”，文章“PD-1/PD-L通路在食管癌中的表达及临床意义的研究进展”，文章“免疫检查点PD-1/PD-L1在卵巢癌诊治及预后方面的应用进展”等等。

故而，本发明药物组合物治疗的肿瘤包括但不限于：癌，例如膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌)、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系的造血性肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burkett淋巴瘤；骨髓系的造血性肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病；多发性骨髓瘤；间质细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、着色性干皮病、角质黄瘤(keratoxanthoma)、甲状腺囊癌和卡波西肉瘤。

本发明的目的在于提供中药葛根芩连汤和PD-1抗体组成的药物组合物在制备IL-2促进剂中的应用。

中药葛根芩连汤和PD-1抗体组成的药物组合物促进IL-2在肿瘤组织或细胞中的表达。

本发明的目的在于提供中药葛根芩连汤和PD-1抗体组成的药物组合物在制备IFN-γ促进剂中的应用。

中药葛根芩连汤和PD-1抗体组成的药物组合物促进IFN-γ在肿瘤组织或细胞中的表达。

本文“有效量”是指无毒性但足够量的提供所需的作用的药物或药剂。在本发明的联合治疗中，联合用药物中一种成分的“有效量”是指该化合物在和其他成分联合应用时有效提供所需效应的量。“有效量”会因受试对象的不同而不同，依据年龄和个体的一般情况，特定的活性药物等等。因此，不可能总是一定精确的“有效量”，然而，任何个体病例中合适的“有效量”可以由本领域的普通技术人员应用常规的实验方法来测定。

本文术语“治疗”指的是减缓、干扰、停止、减轻、阻碍、减少或逆转现有症状、障碍、病症或疾病的进展或严重程度。

本发明的优势在于：通过体内动物实验证明，中药葛根芩连汤和PD-1抗体的联合应用对于治疗肿瘤具有显著的协同作用，为以后的抗肿瘤研究提供了新的策略。此外，本发明发现，中药葛根芩连汤和PD-1抗体的联合能够促进抗肿瘤细胞因子IL-2、干扰素IFN-γ的表达，即中药葛根芩连汤可作为PD-1抗体的增效剂，增强PD-1抗体的抗肿瘤效果。

附图说明

图1是各组肿瘤大小照片图；

图2是各组肿瘤大小统计图；

图3是各组肿瘤生长抑制率结果图；

图4是肿瘤组织中IL-17，IL-2，IL-6，TGF-β，IFN-γ，PD-1，CD8+T，CD4+T含量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1葛根芩连汤的制备

葛根芩连汤的四种中草药成分购买于石家庄乐仁堂，并由两名有经验的药师进行鉴定。按照5：3：3：2的比例，葛根20g，黄连12g，黄芩12g，甘草8g。每一种成分均按临床剂量准确称重，与75％的医用乙醇混合并浸泡过夜，提纯。得到的提取物减压浓缩成浸膏，并蒸发烘干。萃取物最后被粉碎为干膏粉。

根据临床用药剂量确定给药剂量，并按照小鼠所占人体的体表面积率估算，葛根芩连汤的3种浓度分别是Low-GQD:0.3g/kg/day，Middle-GQD:1.5g/kg/day，High-GQD:7.5g/kg/d。为了使葛根芩连汤提取的干膏粉能更好的溶于溶剂中，使用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，对葛根芩连汤干膏粉进行准确称重，然后将其悬浮在0.5％CMC-Na中，按照低中高剂量浓度分别为0.03g/ml、0.15g/ml、0.75g/ml。

实施例2药物组合物治疗结直肠癌

1.实验主要材料

BABL/c小鼠，河北医科大学实验动物中心；葛根，黄连，黄芩，甘草，购自石家庄乐仁堂(石家庄，中国)；anti-mouse PD-1(CD279)，Bio X Cell；Mouse IL-17 ELISA kit，Mouse IL-2 ELISA kit，Mouse IL-6 ELISA kit，Mouse TGF-βELISA kit，Mouse IFN-γELISA kit，联科生物；Mouse Programmed Death 1(PD-1)ELISA Kit，Mouse T-cellsurface glycoprotein CD4(CD4)ELISA Kit，Mouse T-cell surface glycoproteinCD8alpha chain(CD8A)ELISA Kit，华美生物。葛根芩连汤制备同实施例1。

2.动物分组

96只SPF级BABL/c小鼠，雄性，5周龄，20g左右。适应性饲养7天后，将小鼠随机分为ABCDEFGH八组，每组12只。具体分组如下：

A组中药低剂量(GQD)+PD-1；

B组中药中剂量(GQD)+PD-1；

C组中药高剂量(GQD)+PD-1；

D组中药低剂量(GQD)；

E组中药中剂量(GQD)；

F组中药高剂量(GQD)；

G组PD-1单抗组；

H组空白组。

3.实验方法：

ABCDEF组每日给予单纯中药灌胃，GH组给予相同剂量的0.5％CMC-Na灌胃，共10天。

自第17天小鼠左侧腋下接种肿瘤。CT26结直肠癌细胞系，调整浓度1×10⁷个/mL，接种量为0.25mL/小鼠，皮下移植瘤。

第23天(即接种瘤细胞后第7天)，测量肿瘤大小。游标卡尺测量肿瘤的最长径及最短径，体积＝1/2长径×短径²，体积大约生长至50mm³时，开始给予PD-1抗体治疗。ABCG组腹腔注射PD-1抗体，0.25mg/小鼠/次，每间隔3天一次，共5次，其余组腹腔注射相同剂量的PBS，期间ABCDEF各组每天不间断中药灌胃治疗，GH组同时给予0.5％CMC-Na灌胃。成瘤后，每组给药成分及剂量见表1。分别于接种肿瘤当天(默认为肿瘤大小为0)，接种肿瘤后第7天、第10天、第13天、第16天、第19天、第22天测量肿瘤大小。

计算小鼠肿瘤生长抑制率，公式如下：肿瘤生长抑制率(％)＝(1-治疗组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)×100。随后眼球取血处死小鼠。同时取小鼠肿瘤组织，液氮速冻后放于-80℃冰箱备用。

表1.小鼠给药成分及剂量

4.实验结果

肿瘤大小测量结果：测量肿瘤大小见表2、图1和图2。结果显示，中药葛根芩连汤(GQD)联合PD-1抗体对小鼠结直肠癌有抑制作用。中药低剂量GQD和PD-1抗体联用抗肿瘤效果好于中剂量和中药高剂量葛根芩连汤和PD-1抗体的抗肿瘤效果，更好于单独使用葛根芩连汤治疗或PD-1抗体治疗。单独使用中药治疗结直肠癌时，治疗效果与使用剂量上呈现一定程度的剂量依赖。

表2每组样本肿瘤大小

小鼠肿瘤生长抑制率结果见表3和图3。肿瘤生长抑制率结果显示，单独使用中药葛根芩连汤时，低剂量、中剂量和高剂量对肿瘤生长的抑制率在第22天分别为-2.45、6.12和26.84，单独使用PD-1抗体时，对肿瘤生长的抑制率在第22天为48.22。中药葛根芩连汤和PD-1抗体联用对肿瘤生长的抑制率的效果要远远好于单独治疗效果，尤其是低剂量葛根芩连汤和PD-1抗体的联用，对肿瘤生长抑制率高达70.53％。

表3小鼠肿瘤生长抑制率

分组	D7	D10	D13	D16	D19	D22
							A	40.33	53.57	63.00	71.96	73.09	70.53
B	65.61	55.85	59.66	62.81	63.08	60.42
							C	39.42	44.57	49.82	57.63	60.60	61.10
D	20.84	22.07	-5.70	-6.58	5.64	-2.45
							E	24.41	38.42	22.96	10.64	14.62	6.12
F	47.80	49.44	40.37	26.43	41.10	26.84
							G	38.96	56.31	42.10	35.39	37.50	48.22

实施例3用药后小鼠肿瘤组织IL-17，IL-2，IL-6，TGF-β，IFN-γ，PD-1，CD8+T，CD4+T含量

根据实施例2的实验结果，选取A、D、G、H四组，ELISA法检测组织中IL-17，IL-2，IL-6，TGF-β，IFN-γ，PD-1，CD8+T，CD4+T细胞含量。取适量组织，用9倍匀浆介质研磨，然后将研磨液3000-4000r/min，离心10min，取上清制备成10％的组织匀浆，放4℃冰箱，待测。

检测小鼠肿瘤组织中IL-17，IL-2，IL-6，TGF-β，IFN-γ，PD-1，CD8+T，CD4+T含量，结果如图4所示。药物组合物能显著提高IL-2、IFN-γ的表达，降低PD-1的表达。

IL-2是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性，是近年用于肿瘤治疗的一种重要生物制剂，目前重组IL-2已用于临床治疗肿瘤以及感染性疾病等，相比对照组，虽然单独使用葛根芩连汤、PD-1抗体都能提高肿瘤组织中IL-2的表达量，但是二者的联用能进一步促进IL-2的表达。

IFN-γ具有抗病毒，抗肿瘤和免疫调控的作用，相比对照组，单独使用葛根芩连汤不能提高肿瘤组织中IFN-γ的表达，单独使用PD-1抗体和二者的联用能提高肿瘤组织中IFN-γ的表达，并且二者的联用有明显的叠加效果。

Claims (10)

1.中药葛根芩连汤在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，葛根芩连汤由葛根、黄芩、黄连、甘草组成，葛根芩连汤的剂型还可以选自市售的葛根芩连片、葛根芩连丸、葛根芩连注射液。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，葛根芩连汤中各组分的重量比例为：葛根5-40克、黄连3-24克、黄芩3-24克、甘草2-16克；更优选的，葛根芩连汤中各组分的重量比例为：葛根：黄连：黄芩：甘草＝5：3：3：2。

4.一种药物组合物，所述药物组合物包括PD-1/PD-L1抗体和权利要求1-3任意一项中的葛根芩连汤。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，PD-1/PD-L1抗体选自市售或临床试验中的PD-1/PD-L1抗体中的一种或几种。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，葛根芩连汤和PD-1/PD-L1抗体质量比为13-3000：1-5；优选的，葛根芩连汤和PD-1/PD-L1抗体的质量比为13-1000：1。

7.权利要求4-6任意一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，肿瘤为下列肿瘤或癌中的一种或几种：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌；淋巴系的造血性肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burkett淋巴瘤；骨髓系的造血性肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病；多发性骨髓瘤；间质细胞来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、着色性干皮病、角质黄瘤(keratoxanthoma)、甲状腺囊癌和卡波西肉瘤。

9.权利要求4-6任意一项所述的药物组合物在制备IL-2促进剂中的应用。

10.权利要求4-6任意一项所述的药物组合物在制备IFN-γ促进剂中的应用。