CN102526053A

CN102526053A - 包含表没食子儿茶素没食子酸酯与长春新碱的抑制肿瘤细胞增殖的组合物

Info

Publication number: CN102526053A
Application number: CN2010106025042A
Authority: CN
Inventors: 余龙; 张明君; 刘祖龙; 朱恒锐
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明属于医药和基因工程领域，提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物。所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯和长春新碱以及药剂学上必要的辅料，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和长春新碱的摩尔比为4000：3～4：1。本发明实验证实，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯与Vincristine制成的组合物，或在给予Vincristine时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Vincristine抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。对裸鼠肝脏和肾脏基本没有毒性，且活性成分中的表没食子儿茶素没食子酸酯资源丰富，价格低廉，在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

Description

包含表没食子儿茶素没食子酸酯与长春新碱的抑制肿瘤细胞增殖的组合物

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，涉及抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Vincristine（长春新碱）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

背景技术

长春新碱是一种双吲哚型生物碱。分子式C₄₆H₅₈N₄O₉。存在于夹竹桃科植物长春花中。甲醇中重结晶时为针状结晶。熔点211～216℃，比旋光度＋42°(氯仿)。溶于氯仿、丙酮和乙醇。其硫酸盐熔点284～285℃，－28°(甲醇) ；盐酸盐熔点244～246℃ (分解)。

长春新碱能抗癌，疗效比长春碱约高10倍，可用于治疗急性淋巴细胞性白血病，疗效较好，对其他急性白血病、何杰金氏病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤和乳腺癌也有疗效。与长春花碱（vinblastine）、泛洛洛新及泛洛洗汀等一起含在蔓长春花（Vincamajor）中的生物碱。具有使细胞分裂（有丝分裂）在中期停止的作用，这与秋水仙素相似，但其作用比秋水仙素更强。与秋水仙素一样可以与微管蛋白结合而抑制其生物活性，但结合部位不同。另外它与秋水仙素不同的是对微管蛋白以外的蛋白质如肌动蛋白及10纳米细丝蛋白等也起作用。在临床医学上作为抗癌剂之一而被应用，特别是对造血器官的肿瘤比较有效。长春碱硫酸盐可用于治疗何杰金氏病和绒毛膜上皮癌，疗效较好；对淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤、急性白血病（VP，VDLP方案中的"V"为长春新碱,D为柔红霉素,"L"为门冬酰胺酶,"P"为泼尼松）、乳腺癌、肾母细胞瘤、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤和恶性黑色素瘤等也有一定疗效。长春新碱虽然抗肿瘤作用良好，但毒副作用大，主要是神经毒性。

长春新碱制备方法：长春花粗粉加水搅拌，放置片刻，加苯冷浸，渗漉。取渗漉液加酒石酸萃取，过滤。滤液加氨水碱化，氯仿提取。氯仿液，减压回收氯仿。总生物碱加甲醇放置过夜，析晶过滤，结晶是异长春碱，滤液减压回收甲醇。纯化总生物碱加无水乙醇及5%硫酸无水乙醇溶液，放置两天析晶过滤。结晶（长春碱，长春新碱混合物）加水溶解，氨水碱化，氯仿萃取。氯仿液加无水硫酸钠脱水，浓缩，拍松，干燥，经氧化铝柱色谱，用苯，氯仿混合液洗脱，分段收集。前段蒸干加5%硫酸无水乙醇为硫酸长春碱，中段为次长春碱，后段蒸干加5%硫酸无水乙醇为硫酸长春新碱。

茶叶( tea ,camellia sinensis) 是深受人们喜爱的饮品之一。全世界每年生产大约250万吨，其中20%为绿茶、78%为红茶、2%为乌龙茶。茶叶的种类虽然很多，但以绿茶为人瞩目。大量的体外研究及动物实验证明绿茶提取物有多种生物活性和药理效应，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中与癌症的关系是研究最为广泛、也是最复杂的有意义的重要课题。

绿茶中的主要成分为茶多酚，占茶叶干重的30%左右，茶多酚中大部分为儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯〔( - ) epigallocatechin gallate ( EGCG) 〕含量最高，占儿茶素的80%左右。EGCG分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4。它是一种高效广谱无毒副作用的生物抗氧化剂，俗称没食子儿茶素没食子酸酯。没食子酸酯能有效清除引发多种疾病和衰老的体内自由基和过氧化物，提高人体免疫力，延缓衰老，具有优异的抗病毒、降血脂、保鲜、美容等效能，在医药、保健、食品、日化等行业有广泛的用途。但是绿茶提取物毕竟不是细胞毒类药物，在体外对肿瘤细胞的直接杀伤作用不明显。绿茶提取物及其主要成分不会也不能取代现有的抗肿瘤药物，其独特价值在于作为肿瘤化疗中的生化调节剂，有望增强现有抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，降低抗肿瘤药物的毒性。

到目前为止，尚未见有关EGCG与Vincristine联合使用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，尤其涉及由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Vincristine（长春新碱）制成的抑制肿瘤细胞增殖的组合物。

本发明实验证实，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与Vincristine（长春新碱）制成的组合物，或在给予Vincristine（长春新碱）时联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯可显著提高Vincristine抑制肿瘤细胞增殖的治疗效果。

本发明所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）Vincristine；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和Vincristine的摩尔比为4000：3～4：1。

本发明中，所述的表没食子儿茶素没食子酸酯，其分子式为 C₂₂H₁₈O₁₁，分子量为458.4，可以通过市场销售途径获得。例如，本发明的EGCG购自Sigma公司，货号50299，英文全称：(?)-cis-2-(3,4,5-Trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3,5,7-triol 3-gallate, (?)-cis-3,3′,4′,5,5′,7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG；CAS号：989-51-5。MDL号：MFCD00075940。

本发明中，所述的Vincristine通用名：长春新碱；Vincristine是作用于β微管V位点的促微管解聚药。本发明的长春新碱（盐）购自Sigma公司，货号为V8388,又称为：22-Oxovincaleukoblastine sulfate salt, Leurocristine sulfate salt, VCR, Vincristine sulfate salt。其结构式和相关信息如下：

CAS Number: 2068-78-2

Empirical Formula (Hill Notation): C₄₆H₅₆N₄O₁₀ · H₂SO₄

Figure 2010106025042100002DEST_PATH_IMAGE001

Molecular Weight: 923.04

Beilstein Registry Number: 3924631

EC Number: 218-190-0

MDL number: MFCD00084729。

本发明中，将制成的含有EGCG和Vincristine的组合物用于肿瘤细胞（例如，肝癌细胞株SK-Hep1），结果显示，与仅使用Vincristine相比，抑制肿瘤细胞增殖的效果明显增强。所述组合物的使用能明显降低Vincristine的单独使用量，其降低效果随着EGCG用量的增加而更加明显。

本发明中，将EGCG和Vincristine的组合物用于裸鼠移植瘤模型，结果显示，与仅使用Vincristine相比，本发明的组合物对裸鼠移植瘤生长的抑制效果显著增强，并且效果优于雷帕霉素与Vincristine组合物。同时，检测以体重变化为指标的给药后药物的毒性效应显示，EGCG和Vincristine联合使用时对裸鼠体重没有明显影响，并且所述的组合物对裸鼠的肝脏和肾脏基本没有毒性，而雷帕霉素和Vincristine联合使用则对裸鼠的肝脏和肾脏有较高毒性。

本发明中，采用所述的组合物与单独使用EGCG或者Vincristine进行了比较试验，结果显示，所述的组合物在抑制肿瘤细胞生长方面具有明显的增效作用，而且增效作用具有EGCG和Vincristine浓度梯度效应。本发明的实施例中列举了EGCG和Vincristine含量摩尔比分别为4000:3,400:1,20:1，60：1，7.5：1，4：1，80：1， 200：1，等等，实验表明，在两者含量为4000：3～4：1的范围都具有抑制肿瘤细胞增殖生长的效果。

本发明中还提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，其包括步骤：在肿瘤细胞中加入EGCG和Vincristine组合物，EGCG和Vincristine的摩尔比为4000：3～4：1。

所述的肿瘤细胞可以是SK-Hep-1、YY1或者SMMC7721细胞。

本发明所使用的细胞均购自ATCC。

本发明的组合物，当在治疗上进行施用（给药）时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为7-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的EGCG与Vincristine的组合物为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的EGCG和Vincristine可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的EGCG与Vincristine的组合物还可与其他治疗剂一起使用。

本发明中，EGCG与Vincristine的组合物可以是针剂或者片剂。

当本发明的EGCG与Vincristine的组合物被用作药物时，可将治疗有效剂量的该药物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量中通常至少约50毫克EGCG/千克体重。Vincristine的一般用量为：注射剂：1mg；静注，一次1.4mg/㎡，每周一次，总量20~30mg为一疗程。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了一种新的含EGCG和Vincristine的组合物。该组合物可用于制备抗肿瘤药物。能明显增强Vincristine的抗肿瘤效果，同时相对减少了Vincristine的用量及药物成本。

由于本发明组合物中的EGCG是天然的茶叶提取物，而茶叶又是全世界三分之二的人口经常饮用的饮料。不仅资源丰富，价格低廉，经过了千年以上的饮用，几乎没有毒副作用。在提高肿瘤的抑制率的同时，降低了肿瘤患者的治疗成本。

具体实施方式

实施例1 EGCG与Vincristine的协同效果

在SK-hep-1细胞中，EGCG与Vincristine的协同效果比较显著。本实施例进一步验证了EGCG与Vincristine的联用效果，结果证明在一定的浓度范围内CI值均小于1，两种药物有协同作用。结果表明EGCG与Vincristine联合使用可以提高Vincristine的抗肿瘤效果。

表1

实施例2 EGCG与Vincristine有协同效应

在九种肿瘤细胞系中固定EGCG的浓度，与Vincristine联合用药。采用下述金氏公式Q值来评价联用效果。

Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)

其中，Ea+b为合并用药抑制率，Ea和Eb分别为A药和B药的抑制率；

分子代表实际测量的两药合并抑制率，分母是期待合并抑制率。

Q=0.85-1.15范围表示单纯相加，Q=1.15-2范围表示有增强，Q>2表示明显增强，Q<0.55-0.85表示有拮抗效应，Q<0.55表示明显拮抗。

结果表明， EGCG与Vincristine在特定的细胞株中均有一定的协同效果，说明EGCG在特定的细胞株中可以增强现有抗肝癌药物的抗肿瘤活性。

表2 EGCG与Vincristine的联合用药效果Q值

	Vincristine
		SMMC7721	1.079391
HepG2	0.924206
		QGY	0.932575
SK-Hep1	2.794816
		YY1	1.057959
Huh7	0.984535
		Hep3B	1.004236
Focus	0.99808
		PLC	0.960178

为了验证以上实验结果，进一步使用等比联用的方法，用CI（combination index）值来评价联用效果。CI=D₁/D_X1+D₂/D_X2+αD₁D₂/D_X1D_X2，其中D₁、D₂为两药合用时产生X效应时两药各自所需浓度，D_X1、D_X2为两药单独使用时产生X效应时两药各自浓度。α= 0为两种相互排斥性药物，α= 1为两种相互非排斥性药物。CI < 1为协同作用；CI = 1为相加作用；CI > 1为拮抗作用。在SK-Hep1细胞中，Vincristine与EGCG等比联用，结果显示，在一定的浓度范围内CI值均小于1。说明Q值和CI值评价效果一致，在SK-Hep1细胞中EGCG与Vincristine联用时均具有协同效应。

实施例3 EGCG能够增效Vincristine，降低Vincristine的用量

在SK-Hep1细胞中将0.25、0.5、0.75 μM的Vincristine分别与10、20、30、40、50 μM的EGCG联用， 0.25、0.5、0.75 μM的Vincristine与不同浓度的EGCG联用后可以达到甚至超过1 μM Vincristine单独使用的效果。根据软件统计分析，与EGCG联合使用达到半数抑制效果时所需要的Vincristine量随着EGCG量的增加而减少，并且具有浓度梯度效应。以上实验结果说明EGCG与Vincristine联合使用，可以有效的增强Vincristine的抗肿瘤效果并且降低其用量。

实施例4 EGCG对裸鼠异种移植瘤生长时对机体的毒副作用

BALB/C-nu/nu裸鼠在无特定病原体（SPF）条件下饲养4周-6周。将SK-Hep1细胞取3×10⁶注射在裸鼠的右侧腋下。瘤体形成后，对照组每天腹腔注射生理盐水；羧甲基纤维素钠组每天口服含0.5% 羧甲基纤维素钠的生理盐水；索拉非尼组剂量为60 mg/kg体重/天，口服；EGCG组剂量为25 mg/kg体重/天或50 mg/kg体重/天，腹腔注射。SK-Hep1细胞裸鼠模型共给药13天。

1， EGCG对裸鼠体重的影响

裸鼠体重的变化是化疗药物毒性的一个指标。检测SK-Hep1细胞的异种移植瘤模型中裸鼠体重的变化情况可以对药物的毒性作一个直观的评价。结果显示，25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠体重基本无影响，说明毒副作用较低；阳性对照索拉非尼对裸鼠体重也基本无影响。

2， EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的毒性

通过检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量，尿素氮（BUN）肌酐（CREA）和胆固醇（CHO1）含量，观测肝脏损伤，肾脏损伤以及心脏损伤的情况。结果显示，在SK-Hep1移植瘤模型中，索拉非尼对裸鼠肝脏、肾脏和心脏的损伤较大；而25 mg/kg EGCG和50 mg/kg EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏则基本没有毒性。

表3 EGCG对裸鼠肝脏、肾脏和心脏毒性的影响

Claims

1.一种抑制肿瘤细胞增殖的组合物，包括活性成分和药剂学上必要的辅料，其特征在于，所述的活性成分是以下物质：1）表没食子儿茶素没食子酸酯，2）长春新碱；所述的表没食子儿茶素没食子酸酯和长春新碱的摩尔比为4000：3～4：1。

2.如权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和长春新碱的摩尔比为400:1～8:1。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和长春新碱的摩尔比为200:1～20:1。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，表没食子儿茶素没食子酸酯和长春新碱的摩尔比为80:1～60:1。

5.权利要求1所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是，所述的肿瘤是肝癌。

7.一种抑制肿瘤细胞增长的方法，其特征在于，在肿瘤细胞中加入权利要求1所述组合物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是SK-Hep-1、YY1或者SMMC7721细胞。