CN115025236A - 一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系 - Google Patents
一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明构建了一种具有MUC1适配体并对pH具有响应性的靶向DNA四面体(MUC1‑TD),并将其作为载体研究了盐酸伊立替康(CPT‑11)和表儿茶素(EC)在癌症治疗中的联合应用。载药体系中摩尔比为MUC1‑TD:CPT‑11:EC=1:10:100。采用荧光光谱法、等温滴定量热法(ITC)和差示扫描量热法(DSC)研究了CPT‑11/EC与MUC1‑TD的相互作用。DSC实验验证了CPT‑11/EC与MUC1‑TD的结合模式。同时研究了载药MUC1‑TD的体外释放,验证了MUC1‑TD对pH的响应,也说明MUC1‑TD具有碱性条件下载药,酸性条件下释放药物的特点。体外细胞毒性研究表明,EC与CPT‑11具有协同作用,使用MUC1‑TD共加载CPT‑11+EC,对MCF‑7细胞抑制作用进一步增强。细胞摄取研究显示载药MUC1‑TD主要集中在MCF‑7细胞的细胞核内。本发明将为茶多酚与化疗药物的联合治疗来提高治疗疗效提供理论指导。
Description
技术领域
本发明属于药物领域,具体是涉及一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH 响应型靶向DNA纳米载药体系。
背景技术
癌症是人类生命和健康的最大威胁之一。目前,最常见的癌症治疗选择包括手术、放疗和化疗。在临床实践中广泛应用的化疗药物包括铂复合物、氟嘧啶、蒽环类、紫杉类和喜树碱。盐酸伊立替康(CPT-11,图1A)是喜树碱的水溶性半合成衍生物。CPT-11通过羧酸酯酶转化为其具有生物活性的代谢物7-乙基-10- 羟基喜树碱(SN-38)。CPT-11作为一种化疗药物,通过作用于拓扑异构酶I-DNA 复合物来抑制DNA链的复制,导致DNA双链断裂和细胞死亡。CPT-11适用于多种癌症的治疗,包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌和儿童肿瘤。CPT-11可作为单一治疗方法使用,也可与其他药物联合使用。例如,CPT-11 可分别与雷替曲塞、奥沙利铂和贝伐珠单抗联合可治疗食管鳞状细胞癌、结直肠癌和复发性卵巢癌。
然而,化疗药物在治疗癌症时往往会对机体造成不同程度的损害,并产生不可逆的副作用,如心脏毒性、肝毒性、肾毒性等。针对这些问题,可以采用联合治疗,以发挥协同作用,提高化疗效果。与传统的化疗药物联合相比,化疗药物与相对无毒的天然活性成分联合使用会有更好的治疗效果。这是因为天然活性成分,特别是天然多酚,可以阻断主要信号转导途径的靶点。茶多酚是绿茶中的主要活性成分,能增强化疗药物的抗肿瘤作用,逆转多药耐药,减少对正常组织的毒副作用。已有研究小组发现,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)通过自噬抑制和降低阿霉素诱导的心脏毒性,协同促进阿霉素对肝细胞癌的化疗作用。表儿茶素(EC,图1B)作为最常见的茶多酚之一,具有多种有益的生物活性,如抗氧化、抗炎、免疫调节和抗肿瘤特性。EC除了作为一种预防多种癌症的化学预防剂外,还可以与传统的化疗药物联合使用,以提高治疗效果和减少副作用。有报道称,EC可增加顺铂对肺癌细胞的细胞毒性作用,减少顺铂的副作用,保护正常细胞。
纳米技术的快速发展为靶向药物载体的开发提供了广阔的前景。在众多药物纳米载体中,基于碱基对自组装的DNA纳米结构因其结构可预测、载药量高、生物相容性好、易被细胞内化而受到广泛关注。此外,具有适配体的DNA纳米结构可以实现活性靶向药物释放。适配体可以识别具有高亲和力和特异性的靶分子,从而在靶向癌细胞中发挥作用。一种理想的适配体应该能够靶向多种癌细胞。由于粘液蛋白1(MUC1)在大多数腺癌中过度表达,针对MUC1的适配体成为首选。更有趣的是,除了主动靶向外,DNA纳米结构还可以实现智能药物释放,如针对肿瘤酸性微环境的pH响应性药物释放。i-motif结构是由质子化和非质子化胞嘧啶之间的碱基配对形成的,通过改变pH值可以调节DNA纳米结构的组装和解组装,并控制药物的释放。因此,利用带有适配体的pH响应型DNA纳米结构共负载CPT-11和EC,对提高CPT-11的抗癌疗效具有重要意义。共载药物的疗效与其与DNA纳米结构的相互作用有关。然而,迄今为止,尚无关于pH 响应的靶向DNA纳米结构共同加载CPT-11和EC的报道,更无用热力学方法指导DNA纳米结构对这两种联合药物的加载和释放的报道。
发明内容
一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系,化疗药物为CPT-11,茶多酚为EC,靶向DNA纳米结构为MUC1-TD。
一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系,利用热力学方法和细胞实验确定摩尔比为MUC1-TD:CPT-11:EC=1:10:100。
一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系在癌症治疗中的应用,其特征在于共加载的茶多酚与化疗药物在肿瘤细胞内有效释放,具有协同抗癌功效。
在本发明中,我们构建了一种连接MUC1适配体的pH响应型DNA四面体 (MUC1-TD),并通过琼脂糖凝胶电泳对其进行了表征。采用荧光光谱法、等温滴定量热法(ITC)和差示扫描量热法(DSC)研究了CPT-11和EC与MUC1-TD 之间的相互作用,得到了相应的热力学参数。采用DSC实验研究了CPT-11或 EC与MUC1-TD的结合模式。同时研究了MUC1-TD共载CPT-11和EC的体外释放行为和细胞毒性。本发明将为茶多酚与化疗药物的联合治疗提高治疗疗效提供理论指导。
说明书附图
图1.(A)CPT-11、(B)EC的结构式。
图2.MUC1-TD的构建及pH对MUC1-TD结构的影响。
图3.不含MUC1适配体的DNA四面体的电泳图。由左至右分别为Marker、 10μM A、5μM A+5μM B、2μM A+2μM B+2μMD和2μM DNA四面体(pH =7.4)。
图4.MUC1-TD电泳图(pH=7.4/5.0)。由左至右分别为10μM A、5μM A+ 5μM B、2μMA+2μM B+2μM D、2μM MUC1-TD(pH=7.4)和2μM MUC1-TD(pH=5.0)。
图5.298.2K时,CPT-11与MUC1-TD(a→n:0-0.65μM)相互作用的荧光光谱(A:pH=7.4,B:pH=5.0),以及EC与MUC1-TD(a→n:0-1.04μM)相互作用的荧光光谱(C:pH=7.4,D:pH=5.0)。
图6.298.2K和pH=7.4时,(A)CPT-11和(B)EC与MUC1-TD的等温滴定量热图,MUC1-TD、CPT-11和EC的浓度分别为20μM、15μM和15μM。
图7.(A)MUC1-TD、MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系以及(B)MUC1-TD、 (MUC1-TD+EC)+CPT-11和(MUC1-TD+CPT-11)+EC三元体系的差示扫描量热图。MUC1-TD、EC和CPT-11的浓度分别为1μM、20μM和20μM。
图8.298.2K和pH=7.4条件下,(A)(MUC1-TD+EC)+CPT-11和(B) (MUC1-TD+CPT-11)+EC三元体系的荧光光谱。对于(MUC1-TD+EC)+ CPT-11,加入CPT-11的浓度a到k为0-100μM,对于(MUC1-TD+CPT-11)+EC,加入EC的浓度a到k为0-900μM。
图9.不同浓度MUC1-TD(a→n:0、1、2、3和5μM)存在时,CPT-11的荧光光谱。
图10.310.2K和(A)pH=7.4或(B)pH=5.0条件下,CPT-11(30μM)、 MUC1-TD+CPT-11(MUC1-TD:CPT-11=3μM:30μM)和MUC1-TD+CPT-11+ EC(MUC1-TD:CPT-11:EC=3μM:30μM:300μM)下的释放曲线。以及(C) MUC1-TD+CPT-11和(D)MUC1-TD+CPT-11+EC在不同pH条件下的释放曲线的比较。
图11.(A)CPT-11、EC、MUC1-TD+CPT-11以及(B)CPT-11+EC和 MUC1-TD+CPT-11+EC对MCF-7细胞的体外抑制作用。
图12.MUC1-TD+CPT-11和MUC1-TD+CPT-11+EC孵育后的MCF-7细胞的荧光显微镜图像。
实施例
1.一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系,化疗药物为CPT-11,茶多酚为EC,靶向DNA纳米结构为MUC1-TD。
一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系,利用热力学方法和细胞实验确定摩尔比为MUC1-TD:CPT-11:EC=1:10:100。
一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系在癌症治疗中的应用,共加载的茶多酚与化疗药物在肿瘤细胞内有效释放,具有协同抗癌功效。
2.实验部分
2.1材料
所有DNA寡核苷酸链均购于生工生物技术有限公司(中国上海),纯化方法为ULTRAPAGE。盐酸伊立替康(CPT-11,质量分数≥98%)购于源叶生物技术有限公司(中国上海)。表儿茶素(EC,质量分数≥98%)购于百灵威(中国北京)。使用PBS缓冲溶液(pH=7.4,生工生物技术有限公司)制备样品溶液。人乳腺癌细胞MCF-7由普诺赛生命科技有限公司(中国武汉)提供。Milli-Q水(Millipore Elix5/Milli-Q Academic系统)用于样品制备。
2.2方法
2.2.1 pH相应型DNA四面体的构建和表征
用于组装MUC1-TD的序列如表1所示。A、B、MUC1-C和D链的粉末在使用前需要离心,使得粉末全部位于管底。向其加入适量的PBS(pH=7.4)缓冲液,振荡使其全部溶解。取4条溶解的DNA链,加入PBS(pH=7.4)稀释至所需浓度,四条DNA链的最终浓度比为1:1:1:1。稀释后的样品涡旋2min,并在 90℃下退火5min(使用计时器准确保持时间)。退火后,在冰水浴中冷却30min。
当碱性条件转化为酸性条件时,采用向碱性MUC1-TD溶液中加入盐酸的方法。首先,用PBS(pH=7.4)制备一定浓度的MUC1-TD溶液。然后在溶液中加入盐酸,调节pH=5.0。在调节pH时,使用微量pH计观测pH,同时使用水浴锅控制温度为25℃。
使用1%琼脂糖凝胶对不同pH下MUC1-TD的结构进行表征。电解液为 1×TAE缓冲液(40mM Tris,1mM Na2EDTA,pH=8.0)。凝胶用Gel Red染色,并用天能4600SF变模成像仪(中国上海)进行成像。
表1.实验中所用到的DNA序列。未配对的A和T用下划线表示,不匹配的A 和T用小写字体表示。
2.2.2 MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系的荧光光谱测量
荧光光谱在日立F-7000荧光分光光度计上测量。所有测量均在不同温度 (298.2、302.2、306.2和310.2K)和pH(7.4和5.0)下进行。MUC1-TD+CPT-11 相互作用体系中,CPT-11的浓度固定为5μM,MUC1-TD的浓度分别为0、0.05、 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60和0.65μM。 MUC1-TD+EC相互作用体系中,EC的浓度也固定为5μM,MUC1-TD的浓度则分别为0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56、0.64、0.72、0.8、0.88、 0.96和1.04μM。两个体系中MUC1-TD浓度的差异是由于两种药物与MUC1-TD 之间不同强度的相互作用所致。所有样品在测量前均在恒温水浴中孵育30min,温控精度为±0.1K。CPT-11和EC的激发波长分别为256和277nm,发射光谱范围分别为380nm~580nm和295nm~400nm。由于MUC1-TD对CPT-11和 EC荧光的内滤效应,我们记录了样品的吸收光谱,并在扣除荧光背景后,用以下公式对荧光强度进行了校正:
其中,Fcorr和Fobs分别为校正和测量的荧光强度。Aex和Aem分别为样品在激发波长和发射波长下的吸光度。
2.2.3等温滴定量热法(ITC)研究
药物与DNA的相互作用参数也可通过ITC拟合得到。在298.2K和pH 7.4 条件下,对MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系进行了ITC测量。在MUC1-TD+ CPT-11体系中,由于CPT-11的溶解度较低,我们将CPT-11加入到样品池中,将MUC1-TD加入到滴定注射器中。为了保持一致的条件,在MUC1-TD+EC 体系中,也同样将EC加入到样品池中。实验中,MUC1-TD、EC和CPT-11的浓度分别为20μM、15μM和15μM。每次滴定实验共滴定20次,每次滴定体积为2μL(第一滴为0.4μL),每次注射的时间间隔为150s。同时进行了药物滴定缓冲溶液和缓冲溶液滴定MUC1-TD实验,以在数据分析过程中扣除稀释热的影响。所有数据均采用ITC200提供的Origin 7.0软件进行处理和分析。在分析数据时,因为CPT-11和EC都在样品池中,必须选择ITC菜单中的“Ligand in the (cell)”。
2.2.4差示扫描量热法(DSC)研究
DSC测量在VP-DSC量热计(Microcal,GE Healthcare)上进行。MUC1-TD、 CPT-11和EC的浓度分别为1μM、20μM和20μM。测量前,所有实验样品应在真空脱气装置中搅拌并脱气5min。样品池中为MUC1-TD、MUC1-TD+ CPT-11/EC或MUC1-TD+CPT-11+EC溶液,参比池中为缓冲液。在90℃/h的扫描速率以及15~100℃的扫描温度下,对样品进行扫描。缓冲液的扫描需要重复几次,直到达到可重复的基线,基线用于校准样品结果。所有数据均使用 VP-DSC提供的Origin 7.0软件进行处理和分析。
2.2.5(MUC1-TD+EC)+CPT-11和(MUC1-TD+CPT-11)+EC三元体系的荧光光谱测量
三元体系实验中,在两种温度(298.2和310.2K)和pH 7.4条件下,测量了 (MUC1-TD+EC)+CPT-11和(MUC1-TD+CPT-11)+EC三元体系的荧光光谱。对于(MUC1-TD+EC)+CPT-11体系,首先将MUC1-TD(1.8μM)和EC(5 μM)混合,恒温孵育30min,形成MUC1-TD+EC复合物。再向MUC1-TD+ EC复合物中加入不同浓度的CPT-11,继续孵育30min后测量。加入CPT-11的浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100μM。(MUC1-TD+ CPT-11)+EC三元体系采用相同的方法进行,其中MUC1-TD和CPT-11的浓度分别为1μM和5μM,EC的浓度分别为0、50、100、200、300、400、500、600、 700、800和900μM。对于(MUC1-TD+EC)+CPT-11和(MUC1-TD+CPT-11)+ EC,样品分别在277和256nm的激发波长下进行测量,发射光谱范围分别为 295~400nm和380~580nm。
2.2.6体外释放实验
制备游离的CPT-11(30μM),MUC1-TD+CPT-11(MUC1-TD:CPT-11=3 μM:30μM)和MUC1-TD+CPT-11+EC(MUC1-TD:CPT-11:EC=3μM:30μM:300 μM)。所有样品(500μL)加入到截留分子量为3.5kDa的Mini-Pur-A-Lyzer透析管 (Sigma Aldrich)中。将透析管置于装有PBS缓冲溶液(pH=7.4/5.0,12mL)的外管中,在37℃和100rpm转速条件下孵育。酸性条件的释放中,样品在加入 Mini-Pur-A-Lyzer透析管之前,先调节到pH=5.0。
在不同时间点(0.25、0.5、1、2、4、6、9、9、12、24、36、48、60、72、 96h)收集1mL的释放介质,并将透析管转移到一个装有12mL PBS的新外管中。使用F-7000荧光光谱仪测定释放药物的荧光强度,并用标准曲线法计算药物的释放量。
2.2.7体外细胞毒性试验
细胞在温度为37℃、CO2含量为5%的HERAcell150i细胞培养箱(Thermo,美国)中进行培养。细胞培养基为含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。采用MTT法检测CPT-11、EC、CPT-11+EC、MUC1-TD +CPT-11和MUC1-TD+CPT-11+EC对MCF-7细胞的细胞毒性作用。
将MCF-7细胞(~3000个细胞/孔)接种于96孔板中,培养24h。然后将每种药物(100μL)加入到96孔板中,孵育48h。CPT-11的浓度分别为5、15、30、 60、90和120μΜ。EC的浓度分别为50、150、300、600、900和1200μΜ。在 CPT-11+EC、MUC1-TD+CPT-11和MUC1-TD+CPT-11+EC体系中, CPT-11:EC、MUC1-TD:CPT-11和MUC1-TD:CPT-11:EC的摩尔比分别为1:10、 1:10和1:10:100。孵育结束后,倒掉细胞培养基,用PBS缓冲液洗涤细胞3次,再向每个细胞孔加入100μL无血清培养基及20μL MTT(5mg/mL)。再次孵育4 h后倒掉溶液,用DMSO(150μL/孔)替换。晃动96孔板使甲臢全部溶解,用酶标仪(BioTek仪器)记录570nm处的吸光度。细胞抑制率(%)由以下公式计算:
细胞抑制率(%)=(A-B)/A×100%(2)
其中,A和B分别为对照组组和实验组的吸光度值。
通过计算两种药物的联合指数(CI),可以分析两种药物的协同、拮抗或相加效应。CI的值可由下式计算得到:
CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2 (3)
式中,(Dx)1和(Dx)2为CPT-11和EC单独产生x%生长抑制的浓度(在本研究中, x%为50%),(D)1和(D)2分别为两种共同作用产生相同效果的两种药物的浓度。 CI>1、CI=1和CI<1分别具有拮抗作用、相加作用和协同作用。
2.2.8体外细胞摄取试验
将MCF-7细胞以1×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中,孵育24h后,去除培养基,并向细胞中加入MUC1-TD+CPT-11或MUC1-TD+CPT-11+EC,再次孵育6h。MUC1-TD、CPT-11和浓度分别为6μM、60μM和600μM。用 PBS缓冲液洗涤细胞3次后,使用4%多聚甲醛固定剂固定细胞后,细胞洗涤3 次,再用Hoechst 33258对细胞核进行染色。最后用PBS缓冲液洗涤3次,并加入100μL PBS,使用倒置荧光显微镜(IX73,Olympus,日本)进行成像。
2.2.9统计分析
所有结果均以平均±标准差(SD)表示。采用SPSS软件(SPSS 19.0,USA) 进行单因素方差分析(ANOVA)来评估显著性差异。p值<为0.05表示差异有统计学意义。
3.结果和讨论
3.1 MUC1-TD的结构和表征
MUC1-TD的构建及pH对MUC1-TD结构的影响如图2所示。用琼脂糖凝胶电泳法对MUC1-TD的结构进行了表征。在琼脂糖凝胶中,DNA分子所移动的距离与其分子量有关。分子量越大,其移动的距离就越短。我们首先合成了不含MUC1适配体的pH响应性DNA四面体,其电泳图如图3所示。相应泳道上的条带梯度明显,表明已合成了对pH有响应性的DNA四面体。在此基础上,我们合成了连接MUC1适配体的MUC1-TD,电泳图如图4所示。图4中,由左至右添加的样品分别为A、退火的A+B、退火的A+B+D、MUC1-TD(pH=7.4) 和MUC1-TD(pH=5.0)。在酸性条件下,MUC1-TD的结构会发生解链。因此,如图4所示,酸性条件下的条带是弥散的,不如碱性条件下的集中。这证实了可通过调节pH控制MUC1-TD的组装和解组装。
3.2 CPT-11/EC与MUC1-TD相互作用的荧光光谱分析
我们利用荧光光谱法研究了MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系的相互作用。 298.2K时的荧光光谱如图5所示,在MUC1-TD存在的情况下,两种药物的荧光均被猝灭,表明这两种药物与MUC1-TD存在相互作用。加入MUC1-TD后, CPT-11的发射峰没有出现红移和蓝移,但由于pH的影响,CPT-11发射峰的位置略有不同。在pH 7.4和pH 5.0时分别为436nm和430nm。EC的发射峰不受 pH的影响,但在加入MUC1-TD后,发射峰的位置发生红移,而且在酸性条件下则更为明显,这可能是由于EC和MUC1-TD的结合,改变了EC的微环境。通过比较两种pH下的荧光光谱,发现加入相同浓度的MUC1-TD后,药物在碱性条件下的荧光猝灭更明显,表明碱性条件下药物与MUC1-TD的结合能力更强。
为了进一步研究CPT-11/EC与MUC1-TD的结合,我们通过Scatchard方程拟合得到结合常数(Ka)与结合位点数(n):
式中,Cf为游离药物浓度,r为结合药物浓度与MUC1-TD总浓度的比值。以r/Cf为纵坐标,r为横坐标作图(图5中插图),Ka和n分别为斜率和截距/斜率,得到的Ka和n见表2。根据热力学数据可知,随着温度的升高,两种药物与 MUC1-TD相互作用的Ka均减小,表明相互作用过程放热,温度升高不利于反应。在相同温度下,CPT-11与MUC1-TD结合的Ka和n均大于EC,说明CPT-11与 MUC1-TD结合更强。在温度为298.2K的碱性条件下,CPT-11和EC的结合位点数分别为14.51和8.69,表明MUC1-TD具有加载CPT-11和EC的能力。
表2.荧光获得的MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系的热力学参数
吉布斯自由能变(ΔG)、焓变(ΔH)和熵变(ΔS)等热力学参数根据以下公式计算获得:
所得热力学参数如表2所示。随着温度的升高,两种药物与MUC1-TD相互作用的Ka值均减小,ΔH为负值,说明相互作用为放热作用。ΔG为负值,说明相互作用过程可自发进行。众所周知,范德华力、氢键、疏水相互作用和静电相互作用会影响药物与DNA结构之间的结合。热力学数据可以作为判断相互作用中主要驱动力的依据。据报道,负的ΔH和ΔS值是范德华力和氢键相互作用的特征。如表2所示,负的ΔH和ΔS值表明,范德华力和氢键是CPT-11与MUC1-TD相互作用的主要驱动力。在EC与MUC1-TD相互作用中,ΔH为负值,而ΔS为正值。疏水相互作用被认为对ΔS有正贡献,而氢键对ΔH有负贡献。因此,结合 EC的分子结构,推断疏水作用和氢键作用在EC与MUC1-TD结合中起主要作用。两种药物与MUC1-TD的相互作用中ΔH的绝对值大于TΔS,说明ΔH对ΔG 的贡献较大,因此,药物与MUC1-TD的结合过程为焓驱动。此外,焓驱动的结合过程也可以证明药物与MUC1-11的结合方式是嵌插结合。最后,两种药物与 MUC1-TD相互作用的热力学数据显示,CPT-11与MUC1-TD的结合强于EC。对酸性和碱性两种条件下的热力学数据进行比较,发现酸性条件下药物与 MUC1-TD的结合较弱,这可能是由于MUC1-TD在酸性条件下解链,削弱了两种药物与MUC1-TD的结合。
3.3 ITC研究
为了进一步验证CPT-11、EC与MUC1-TD之间的相互作用,我们利用ITC 法对MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系进行了研究。图6为CPT-11/EC与 MUC1-TD之间相互作用的ITC滴定图(pH 7.4,298.2K)。通过一类位点拟合,得到了二元体系的热力学参数,如表3所示。数据显示,CPT-11与MUC1-TD 之间的相互作用的Ka和n大于EC与MUC1-TD,说明CPT-11与MUC1-TD之间的相互作用更强。ΔH值均为负值,说明CPT-11或EC与MUC1-TD之间的相互作用为放热作用。上述结论均与荧光实验得到的结果一致。ITC实验得到的热力学参数与荧光实验得到的结果略有不同。这可能与ITC和荧光实验中使用的样品浓度和数据处理方法不同有关。
表3.ITC获得的MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系的热力学参数
3.4差示扫描量热法(DSC)研究
药物与DNA结构的结合方法主要包括嵌插结合、沟槽结合和外部静电结合。不同的结合方法对DNA结构的热稳定性有不同的影响。当结合方法为嵌插结合时,DNA结构的解链温度(Tm)会增加约5-8℃,而其他两种结合方法不会显著改变DNA结构的解链温度。MUC1-TD和载药的MUC1-TD的DSC热变性曲线如图7所示。用DSC测定的MUC1-TD和载药MUC1-TD的Tm和MUC1-TD熔融焓(ΔHm)值列于表4。MUC1-TD、MCU1-TD+EC和MCU1-TD+CPT-11的 Tm分别为73.79±0.41、79.20±0.18和80.28±0.13℃。二元系统的Tm分别增加了5.41和6.49℃,表明两种药物与MUC1-TD的结合方式为嵌插结合,药物的结合增加了MUC1-TD的热稳定性。MCU1-TD+CPT-11的Tm较大,说明CPT-11 与MUC1-TD的相互作用更强。同时对(MCU1-TD+EC)+CPT-11和(MCU1-TD+ CPT-11)+EC三元体系进行了DSC实验,Tm分别为83.62±0.35和83.22±0.27℃。与二元体系相比,三元体系的Tm更高,说明MUC1-TD在三元体系中的热稳定性更高。(MCU1-TD+EC)+CPT-11的三元体系的的Tm较大。这可能是由于 CPT-11与MUC1-TD之间的结合较强导致的。ΔHcal大小的递增顺序与Tm相同,满足以下顺序:MCU1-TD<MCU1-TD+EC<MCU1-TD+CPT-11<(MCU1-TD +CPT-11)+EC<(MCU1-TD+EC)+CPT-11。ΔHcal的增加也表明MUC1-TD热稳定性的增强。
表4.通过DSC获得的MUC1-TD与药物相互作用的热力学参数
药物与MUC1-TD的结合常数可按下式计算:
其中和Tm分别为MUC1-TD单独和在药物含量饱和的情况下的解链温度。ΔHm是MUC1-TD的熔融焓,KTm是药物在解链温度Tm下与MUC1-TD的结合常数。 L为药物的游离浓度,n为荧光数据得到的药物与MUC1-TD之间的结合位点数。
式中,K为温度T下药物与MUC1-TD的结合常数,ΔHb为DSC测定的药物与MUC1-TD的结合焓。298.2K时,用DSC测定的药物与MUC1-TD的结合常数如表4所示。在这两种药物中,CPT-11与MUC1-TD的结合常数较大。这与荧光数据一致,表明CPT-11与MUC1-TD的结合能力更强。DSC实验得到的结合常数与荧光实验得到的结果略有不同。这可能是由于在DSC和荧光实验中使用的样品浓度和数据处理方法不同所致。
3.5(MUC1-TD+EC)+CPT-11和(MUC1-TD+CPT-11)+EC三元体系的荧光光谱
在二元体系的研究中,CPT-11或EC通过嵌插结合与MUC1-TD相互作用, CPT-11与MUC1-TD之间的结合强于EC。为了比较载药顺序对MUC1-TD的影响,对(MUC1-TD+EC)+CPT-11和(MUC1-TD+CPT-11)+EC三元体系进行了荧光光谱测量,荧光光谱如图8所示。将CPT-11和EC分别加入MUC1-TD+ EC和MUC1-TD+CPT-11二元复合物中后,两种复合物的荧光继续被猝灭。这表明CPT-11或EC再次与复合物发生相互作用。因此,我们推测,虽然两种药物都通过嵌插结合与MUC1-TD相互作用,但它们与MUC1-TD的结合位点并不完全相同。当CPT-11或EC的浓度为100μM时,MUC1-TD+EC和MUC1-TD +CPT-11的荧光分别被猝灭了65.40%和15.21%,MUC1-TD+EC的荧光被猝灭更明显。这可能与CPT-11较强的相互作用有关。
为了探究复合物在三元体系中的结合,我们以复合物MUC1-TD+ CPT-11/EC为主体,以药物EC/CPT-11/为客体,并假设荧光强度与主体的自由浓度成正比,然后根据一类位点模型计算Ka和n。基于朗格缪尔结合理论,一类位点模型符合以下方程:
Ct=Cf+Cb=Cf+nΘMt (10)
式中,Θ为被占用位点与总位点的比率,F和F0分别为复合物MUC1-TD+ CPT-11/EC存在或不存在药物EC/CPT-11时的荧光强度。Ct、Cf、Cb分别为药物的总浓度、游离浓度和结合浓度。Mt为药物载体MUC1-TD的浓度。根据公式,给定Ct和Mt,Cf则是Ka和n的函数。因此,采用MATLAB软件的非线性最小二乘回归程序,可根据测量的荧光强度得到Ka和n。通过MATLAB拟合得到的 Ka和n见表5。与MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系相比,三元体系的Ka和n值明显较小。这可能是因为两种药物与MUC1-TD之间的结合模式为嵌插结合。当复合物形成时,先加入的药物占据了结合位点,削弱了后加入药物与复合物的结合。(MUC1-TD+EC)+CPT-11的Ka和n大于(MUC1-TD+CPT-11)+EC,表明CPT-11与(MUC1-TD+EC)之间有更强的相互作用。这也表明CPT-11与 MUC1-TD有较强的结合,后加入的EC对MUC1-TD+CPT-11没有太大的影响。通过比较两种温度下的数据,三元体系的Ka值均随温度的升高而减小,表明与二元体系相同,三元体系的结合仍然为放热过程。
表5.(MUC1-TD+CPT-11)+EC和(MUC1-TD+EC)+CPT-11三元体系的热力学参数
3.7负载药物的体外释放
除可加载药物外,药物载体还应具有在一定条件下控制药物释放的特性。因此,我们进行了载药MUC1-TD的体外释放实验。根据荧光实验得到的热力学参数,我们可以根据一类位点模型计算出药物载体的载药量。根据公式(9)和(10),在Mt和Ct恒定的情况下,可以根据已知的Ka和n来确定药物结合百分比Cb/Ct。 298.2K时,当MUC1-TD浓度为1μM,CPT-11和EC浓度为15μM时,两种药物的结合百分比分别为74.43%和63.31%。对比结果表明,MUC1-TD对CPT-11 具有更高的载药能力。当CPT-11和MUC1-TD的浓度分别为30μM和3μM时,由荧光数据得到的Cb/Ct值为95.35%。这说明所添加的药物几乎完全与 MUC1-TD结合。为了验证MUC1-TD对药物的加载情况,我们测量了不同浓度 MUC1-TD存在下CPT-11的荧光强度。如图9所示,加入不同浓度的MUC1-TD 后,CPT-11的荧光被猝灭,当MUC1-TD的浓度为3μM时,药物的荧光几乎完全猝灭。此外,当MUC1-TD的浓度进一步增加时,荧光强度几乎没有变化,说明几乎所有的CPT-11(30μM)都与MUC1-TD(3μM)结合。这表明基于热力学参数计算的药物结合比对药物加载量的确定具有重要指导意义。在黑暗室温条件下,将CPT-11(30μM)和MUC1-TD(3μM)的混合物搅拌12h,制备载药的 MUC1-TD。CPT-11在不同条件下的释放曲线如图10所示。游离的CPT-11在不同pH的PBS中迅速释放,当释放时间为36h时,CPT-11几乎完全释放。当CPT-11 被加载到MUC1-TD中后释放率显著降低,在pH 7.4和pH 5.0下的最大释放率分别为53.68%和75.81%。CPT-11在酸性条件下的释放速率明显高于碱性条件下,表明pH影响CPT-11的释放。这是由于MUC1-TD的结构在酸性条件下解链,使更多的药物被释放。这一特征也表明了MUC1-TD具有在碱性条件下载药、在酸性条件下释放药物的优点。由于细胞毒性实验结果表明EC对癌细胞的细胞毒性远小于CPT-11,因此未考察加载EC单药的MUC1-TD的释放效果。对于CPT-11 和EC联合加载到MUC1-TD中的三元体系,结合CPT-11与EC的半数抑制浓度,选取CPT-11与EC的浓度比为1:10。在有EC存在的情况下,CPT-11在释放速率略有增加,这可能是由于EC的存在削弱了CPT-11与MUC1-TD的结合。然而酸性条件下释放速率增加的不明显,这可能是由于MUC1-TD解链,削弱了两种药物与MUC1-TD的结合。
为了进一步研究其释放动力学机制,我们采用三种不同的释放模型对 CPT-11的释放曲线进行拟合:
其中,Mt为t时刻释放的药物量,M∞为Mini-Pur-A-Lyzer透析管中的原始药物量。Mt/M∞为t时药物释放量的百分比,K0、K1和KH是不同模型下的释放速率常数。表6中列出了不同动力学模型的相关系数(R2)及速率常数。比较R2值可以看出游离CPT-11的释放遵循一级释放模型,而MUC1-TD加载的CPT-11的释放遵循Higuchi释放模型。与游离药物相比,二元体系与三元体系中药物的释放速率明显变小,说明MUC1-TD加载的CPT-11具有较好的缓释效果。酸性条件下的释放速率较快,再次验证了MUC1-TD对pH的响应。
表6.不同动力学模型的释放速率常数和相关系数
3.8体外细胞毒性实验
本实验采用MTT法检测游离药物和MUC1-TD加载的药物对MCF-7细胞的体外细胞毒性。图11A示出了游离CPT-11、EC和MUC1-TD+CPT-11复合物对 MCF-7细胞的细胞毒性。游离CPT-11和EC对MCF-7细胞的半数抑制浓度(IC50) 分别为59.55μM和772.25μM。当CPT-11加载到MUC1-TD中时,IC50下降至 36.96μM,表明MUC1-TD良好的靶向能力增强了其对MCF-7细胞的细胞毒性。如图11B所示,当EC和CPT-11共同作用于MCF-7细胞时,其细胞毒性明显强于CPT-11单药。计算得到两种药物的CI值为0.85,说明两种药物对MCF-7细胞有协同作用,EC的存在增加了CPT-11对癌细胞的生长抑制作用。因此,茶多酚与化疗药物联合使用可能在提高治疗疗效方面发挥重要作用。
3.9体外细胞摄取
为了研究细胞对载药MUC1-TD的摄取情况,我们进行了体外细胞摄取实验。使用Hoechst 33258染色后,细胞核呈蓝色荧光。CPT-11和EC在MCF-7细胞中显示出明显的绿色荧光。如图12所示,加入药物并孵育6h后,CPT-11的绿色荧光主要集中在MCF-7细胞的细胞核位置,表明MUC1适配体可以靶向MCF-7细胞,并在药物传递到细胞核过程中发挥作用。在EC存在的情况下,药物在细胞核位置的荧光强度更强,说明EC的存在增加了药物摄取效率,这也再次证实了 CPT-11与EC的协同作用。
结论
在本研究中,我们构建了一种具有MUC1适配体的pH响应型DNA四面体 (MUC1-TD),并用琼脂糖凝胶电泳对其进行了表征。用荧光光谱法测定了 MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系在不同pH值下相互作用的热力学参数。结果表明,CPT-11和EC能自发地与MUC1-TD结合,结合过程为焓驱动。CPT-11与 MUC1-TD的相互作用强于EC。CPT-11与MUC1-TD相互作用的主要驱动力是范德华力和氢键。而疏水作用和氢键作用在EC与MUC1-TD的结合中起主要作用。在酸性条件下,药物与MUC1-TD的相互作用减弱,证实了MUC1-TD结构对pH的响应,即在酸性条件下MUC1-TD发生解链。通过ITC和DSC进一步研究了MUC1-TD+CPT-11/EC二元体系的相互作用,实验结果与荧光实验一致。 DSC实验结果表明CPT-11和EC与MUC1-TD的结合方式为嵌插结合。三元体系的荧光光谱表明EC的存在削弱了CPT-11与MUC1-TD的相互作用。体外释放研究中,MUC1-TD加载的CPT-11在酸性条件下释放速度明显快于碱性条件,证实了MUC1-TD对pH的响应,也说明MUC1-TD具有在碱性条件下载药,酸性条件下释放药物的特点。体外细胞毒性研究表明,MUC1-TD加载的CPT-11 的细胞毒性强于游离的CPT-11,并且EC与CPT-11具有协同作用,当EC作为辅助药物时,载药MUC1-TD的细胞毒性进一步增强。细胞摄取研究显示载药 MUC1-TD主要集中在MCF-7细胞的细胞核内。
Claims (3)
1.一种加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系,包括化疗药物CPT-11、茶多酚和靶向DNA纳米结构MUC1-TD,其特征在于,所述茶多酚为EC,三种物质的摩尔比为MUC1-TD:CPT-11:EC=1:10:100。
2.如权利要求1所述的加载化疗药物-茶多酚联合药物的pH响应型靶向DNA纳米载药体系,其特征在于,所述MUC1-TD为连接MUC1适配体的pH响应型DNA四面体。
3.一种基于热力学指导的加载化疗-光疗联合药物的DNA纳米载药体系在癌症治疗中的应用。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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