CN111544479B - 一种药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药物组合物的新用途，具体为一种药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用，所述药物组合物包括舒肝宁制剂。本发明药物制剂能够有效抑制多株癌症细胞的生长，减少癌细胞的克隆数形成，诱导癌细胞死亡，阻滞癌细胞周期于S期，并且能有效抑制裸鼠移植肿瘤的生长，不影响裸鼠体重，能有效治疗癌症且毒副作用低。本发明所述中药组合物中舒肝宁制剂能选择性杀伤癌细胞，不影响正常细胞生长，且与5‑氟尿嘧啶联合使用具有协同抗肿瘤的效果(协同指数，CI＜1)。

Description

一种药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用,该药物组合物由舒肝宁制剂和5-氟尿嘧啶组成。并涉及该药物组合物中的舒肝宁制剂在制备治疗癌症药物中的应用。
背景技术
癌症是对人类生命健康危害最大的疾病之一，每年都有大量的人死于癌症。抗癌药物的研发一直是药学研究的热点。临床常用化疗药毒副作用大，严重影响了患者的身体健康和生命质量。靶向化疗药物成本高，长期应用患者经济难以担负。尤其对于三阴性乳腺癌(ER阴性，PR阴性，HER2/neu未过度表达)，由于缺乏激素受体和HER2未过度表达对针对乳腺癌的常规内分泌治疗或曲妥珠单抗等靶向疗法没有反应，而化疗便成为对该病治疗的中流砥柱。然而传统化疗毒副作用严重，从具有长期临床应用经验的中药复方中筛选毒副作用低的抗肿瘤药物具有一定的优势。由于肿瘤的异质性、耐药性等多种因素，临床上对于肿瘤的常规治疗会采用多种化疗方案。而中药多成分，多靶点的特点，对于个体化差异较大的复杂肿瘤的治疗具有一定的优势，且与传统化疗联合使用具有一定的减毒增效的潜力。
舒肝宁制剂由茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物、灵芝提取物及辅料制备而成。具有清热解毒，利湿退黄，益气扶正，保肝护肝。用于湿热黄疸，症见面目俱黄，胸肋胀满，恶心呕吐，小便黄赤，乏力，纳差，便溏；急、慢性病毒性肝炎见前述症状者。但舒肝宁目前尚无有关治疗癌症相关的报道。
5-氟尿嘧啶是临床上常用的一种化疗药物，5-氟尿嘧啶对多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、肝癌等均有一定疗效。5-氟尿嘧啶单独或与其他药物联合应用于乳腺癌和胃肠道肿瘤手术辅助治疗，且与某些其他药物联合应用常可获较高的反应率、存活率。5-氟尿嘧啶的药物副作用包括严重脱水、骨髓抑制、肝功能损害、黄疸、腹泻等等。本发明将具有保肝护肝功能的舒肝宁制剂与化疗药物5-氟尿嘧啶一起联合使用，发现二者产生协同作用，从而降低化疗药物5-氟尿嘧啶的给药剂量，达到减毒增效的目的。且目前并无5-氟尿嘧啶与舒肝宁制剂一起联合用于治疗肿瘤的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种药物组合物用于治疗癌症的应用，包括舒肝宁制剂在制备治疗癌症药物中的应用，以及舒肝宁制剂与5-氟尿嘧啶的组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
可选地，所述的癌症为肠癌、脑胶质瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、纤维肉瘤、乳腺癌。
可选地，所述癌症的细胞株为HCT116、U87-MG、HepG2、A549、A2780T、A2780T/P、786-O、HT1080、SK-BR-3、BT-549、MDA-MB-231、MDA-MB-468。
可选地，所述药物组合物还包括5-氟尿嘧啶。
可选地，所述的癌症为乳腺癌。
可选地，所述癌症的细胞株为MDA-MB-231。
可选地，所述的舒肝宁制剂包括茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物、灵芝提取物。
可选地，所述的舒肝宁制剂由以下方法制备：取茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物及灵芝提取物，加入一种或多种药学上可以接受的辅料，再按照药学领域的常规方法，制备成医药领域中可接受的剂型。
可选地，所述的舒肝宁制剂包括茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物、灵芝提取物，所述的药物组合物由以下方法制备：取5-氟尿嘧啶、茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物及灵芝提取物，加入一种或多种药学上可以接受的辅料，再按照药学领域的常规方法，制备成医药领域中可接受的剂型。
可选地，所述剂型为注射制剂或胶囊、片剂、滴丸剂、颗粒剂、冻干剂。
可选地，所述的舒肝宁制剂由以下方法制备：茵陈提取物4g、栀子提取物3g、黄芩苷22g、板蓝根提取物5g及灵芝提取物3.5g，可制成1000mL舒肝宁注射液。取黄芩苷加注射用水适量混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；其余茵陈提取物等四味，分别加注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5—8.0，加注射用水至规定量1000mL，滤过，灌封，灭菌，即得。
可选地，所述药物组合物包括5-氟尿嘧啶48.78g,舒肝宁注射液1000mL。
可选地，所述的舒肝宁制剂购买自贵州瑞和制药有限公司(20190420)。
可选地，所述药物组合物还包括5-氟尿嘧啶购买自Sigma(F6627)。
本发明具有如下有益效果：
本发明中药组合物中舒肝宁制剂能够有效抑制多株癌症细胞的生长，减少癌细胞的克隆数形成，诱导癌细胞死亡，阻滞癌细胞周期于S期，并且能有效抑制裸鼠移植肿瘤的生长，能有效治疗癌症。
本发明舒肝宁制剂不影响多株正常细胞生长，在有效抑制肿瘤生长的同时并不影响裸鼠体重。
本发明的另一药物组合物由舒肝宁制剂与5-氟尿嘧啶组成，二者联合使用具有协同抗肿瘤的效果(协同指数,CI＜1)，在有效杀伤肿瘤细胞的同时，降低了化疗药物的使用量，从而降低化疗药的毒副作用。
与现有技术相比，本发明药物组合物之一的舒肝宁制剂能选择性杀伤癌细胞，其毒副作用低，能有效抑制多种肿瘤细胞生长，即可用于治疗癌症。舒肝宁制剂与5-氟尿嘧啶一起组成组合物可协同治疗肿瘤，抗癌效果优于单独使用5-氟尿嘧啶，即达到了减毒增效的目的。
附图说明
图1舒肝宁制剂抑制癌细胞MDA-MB-231增值具有浓度效应和时间效应
图2舒肝宁制剂不影响正常肝细胞Lo2的增值
图3舒肝宁制剂选择性抑制癌细胞克隆数形成
图4流式细胞仪评价舒肝宁制剂促进癌细胞死亡具有浓度效应和时间效应
图5流式细胞仪评价舒肝宁制剂阻滞癌细胞生长周期具有浓度效应
图6舒肝宁制剂与5-氟尿嘧啶具有协同作用
图7流式细胞仪评价舒肝宁制剂与5-氟尿嘧啶协同促进癌细胞死亡
图8舒肝宁制剂与5-氟尿嘧啶协同阻滞细胞周期
图9舒肝宁制剂不影响移植瘤裸鼠的体重
图10舒肝宁制剂抑制裸鼠移植瘤的生长
具体实施方式
如背景技术所述，目前尚无舒肝宁单独使用或与5-氟尿嘧啶联合使用治疗癌症的相关报道。
本发明的目的是提供一种舒肝宁制剂的新用途，具体为舒肝宁制剂在制备治疗癌症药物中的应用。本发明进一步提供一种由舒肝宁制剂与5-氟尿嘧啶组成的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
可选地，所述的癌症为肠癌、脑胶质瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、纤维肉瘤、乳腺癌。
可选地，所述癌症的细胞株为HCT116、U87-MG、HepG2、A549、A2780T、A2780T/P、786-O、HT1080、SK-BR-3、BT-549、MDA-MB-231、MDA-MB-468。
可选地，所述药物组合物还包括5-氟尿嘧啶。
可选地，所述的癌症为乳腺癌。
可选地，所述癌症的细胞株为MDA-MB-231。
可选地，所述的舒肝宁制剂包括茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物、灵芝提取物。
可选地，所述的舒肝宁制剂由以下方法制备：取茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物及灵芝提取物，加入一种或多种药学上可以接受的辅料，再按照药学领域的常规方法，制备成医药领域中可接受的剂型。
可选地，所述的舒肝宁制剂包括茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物、灵芝提取物，所述的药物组合物由以下方法制备：取5-氟尿嘧啶、茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物及灵芝提取物，加入一种或多种药学上可以接受的辅料，再按照药学领域的常规方法，制备成医药领域中可接受的剂型。
可选地，所述剂型为注射制剂或胶囊、片剂、滴丸剂、颗粒剂、冻干剂。
可选地，所述的舒肝宁制剂由以下方法制备：茵陈提取物4g、栀子提取物3g、黄芩苷22g、板蓝根提取物5g及灵芝提取物3.5g，可制成1000mL舒肝宁注射液。取黄芩苷加注射用水适量混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；其余茵陈提取物等四味，分别加注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5—8.0，加注射用水至规定量1000mL，滤过，灌封，灭菌，即得。
可选地，所述药物组合物包括5-氟尿嘧啶48.78g,舒肝宁注射液1000mL。
可选地，所述的舒肝宁制剂购买自贵州瑞和制药有限公司(20190420)。
可选地，所述药物组合物还包括5-氟尿嘧啶购买自Sigma(F6627)。
为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，以下通过实施例来具体阐述本发明。
实例1
舒肝宁制剂购自瑞和制药有限公司的舒肝宁注射液(20190420)，5-氟尿嘧啶(Sigma，F6627)。
实验中磺酰罗丹明染色法评价细胞增殖实验，舒肝宁制剂用RPMI 1640培养基(Gibco)按梯度稀释，配制成100μg/mL，36μg/mL，10μg/mL，3.16μg/mL，1μg/mL的不同浓度。
克隆形成数实验，舒肝宁制剂用RPMI 1640培养基(Gibco)按梯度稀释，配制成37.56μg/mL，9.39μg/mL，2.34μg/mL的不同浓度。
流式细胞仪评价细胞死亡实验实验，舒肝宁制剂用RPMI 1640培养基(Gibco)按梯度稀释，配制成150.12μg/mL，37.56μg/mL，9.39μg/mL的不同浓度。流式细胞仪评价细胞周期实验，舒肝宁制剂用RPMI 1640培养基(Gibco)按梯度稀释，配制成37.56μg/mL，9.39μg/mL，2.35μg/mL的不同浓度。
协同指数评价实验，取舒肝宁制剂用RPMI 1640培养基(Gibco)配制成舒肝宁为37.56μg/mL，18.78μg/mL，9.39μg/mL，4.70μg/mL，2.35μg/mL的不同浓度；取5-氟尿嘧啶，用RPMI 1640培养基(Gibco)配制成5-氟尿嘧啶为150.00μM，75.00μM，37.50μM，18.75μM，9.38μM的不同浓度；分别各取舒肝宁制剂与5-氟尿嘧啶，用RPMI 1640培养基(Gibco)配制成舒肝宁浓度为37.56μg/mL+5-氟尿嘧啶浓度150.00μM，舒肝宁浓度18.78μg/mL+5-氟尿嘧啶浓度75.00μM,舒肝宁浓度9.39μg/mL+5-氟尿嘧啶37.50μM，舒肝宁浓度4.70μg/mL+5-氟尿嘧啶浓度18.75μM,舒肝宁浓度2.35μg/mL+5-氟尿嘧啶浓度9.38μM的不同浓度组合。
流式细胞仪评价协同实验，取舒肝宁制剂和5-氟尿嘧啶，分别用RPMI 1640培养基(Gibco)配制成舒肝宁为37.56μg/mL的浓度；5-氟尿嘧啶浓度为375μM的浓度；舒肝宁浓度为37.56μg/mL及5-氟尿嘧啶浓度为375μM的组合。
药理实验
仪器及试剂
磺酰罗丹明(购自Meryer,3520-42-1),结晶紫(购自Sigma，C0775-25G)，酶标仪(Molecular Devices)，Annexin-V-FITC/PI(BD Pharmingen，5506419)，DNA染液(CycleTEST plus DNA reagent kit，Becton Dickinson),流式细胞仪(BD Bioscience)。
一、采用SRB染色法评价舒肝宁制剂对人癌症细胞株的生长抑制作用
1.方法：处于生长对数期的细胞，以1×104浓度种于96孔板中。试验分为空白对照组、舒肝宁给药组。细胞培养24h后，对于空白组，加1640培养基；给药组加舒肝宁浓度为100μg/mL，36μg/mL，10μg/mL，3.16μg/mL，1μg/mL的培养基。培养48h后，加入浓度50％(m/v)的TCA，于4℃固定1h，用水冲去TCA，加入100μL SRB，放置10min，用1％(v/v)HAC冲洗掉磺酰罗丹明(sulforhodamine B，SRB)染色法，晾干，加200μL 10mM Tris base溶液(pH 10.5)，利用酶标仪(Molecular Devices)测定吸光值(波长515nm)，并根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设3个重复孔。细胞存活率(％)＝ΔOD药物处理/ΔOD空白对照×100。
2.结果：如表一所示，舒肝宁对人癌症细胞株HCT116、U87-MG、HepG2、A549、A2780T、A2780T/P、786-O、HT1080、SK-BR-3、BT-549、MDA-MB-231、MDA-MB-468等的生长具有显著的抑制作用。该化合物抑制人癌症细胞株HCT116、U87-MG、HepG2、A549、A2780T、A2780T/P、786-O、HT1080、SK-BR-3、BT-549、MDA-MB-231、MDA-MB-468等生长的IC50值见表一。
表一舒肝宁对不同癌细胞的半数致死量
二、采用SRB法评价舒肝宁制剂对人癌症细胞株的生长抑制作用的浓度效应与时间效应
1.方法：处于生长对数期的细胞：人癌症细胞株MDA-MB-231(购买自中国科学院细胞库)以1×104浓度种于96孔板中。试验分为空白对照组、舒肝宁给药组。细胞培养24h后，对于空白组，加1640培养基；给药组加舒肝宁浓度为100μg/mL，36μg/mL，10μg/mL，3.16μg/mL，1μg/mL的培养基。分别培养24h、48h、72h后，加入浓度50％(m/v)的TCA，于4℃固定1h，用水冲去TCA，加入100μL SRB，放置10min，用1％(v/v)HAC冲洗掉SRB，晾干，加200μL10mMTris base溶液(pH 10.5)利用酶标仪(Molecular Devices)测定吸光值(波长515nm)，并根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设3个重复孔。细胞存活率(％)＝ΔOD药物处理/ΔOD空白对照×100。
2.结果：见说明书附图，图1所示，舒肝宁对人癌症细胞株MDA-MB-231生长的抑制作用具有明显浓度效应和时间效应。给药72h的舒肝宁(100μg/mL)与舒肝宁(36μg/mL)相比，具有显著性差异(p＜0.01)；舒肝宁(100μg/mL)对癌细胞生长抑制分别作用24h、48h、72h，抑制效果随着作用时间不同而具有显著性差异(P＜0.01)。
三、采用SRB法评价舒肝宁制剂对正常细胞株的作用
1.方法：处于生长对数期的细胞：人正常细胞株乳腺上皮细胞MCF-10A，正常肝细胞Lo2，正常纤维细胞WPMY-1，以及小鼠胚胎细胞MEF。上述细胞以1×104浓度种于96孔板中。试验分为空白对照组、舒肝宁给药组。细胞培养24h后，对于空白组，加1640培养基；给药组加舒肝宁浓度为100μg/mL，36μg/mL，10μg/mL，3.16μg/mL，1μg/mL的培养基。培养48h后，加入浓度50％(m/v)的TCA，于4℃固定1h，用水冲去TCA，加入100μL SRB，放置10min，用1％(v/v)HAC冲洗掉SRB，晾干，加200μL 10mM Tris base溶液(pH 10.5)，利用酶标仪(Molecular Devices)测定吸光值(波长515nm)，并根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设3个重复孔。细胞存活率(％)＝ΔOD药物处理/ΔOD空白对照×100。
2.结果：如表二所示，舒肝宁对人正常细胞株MCF-10A、Lo2、WPMY-1以及小鼠胚胎细胞MEF的生长没有抑制作用。该化合物抑制正常细胞的IC50值大于100μg/mL。
表二舒肝宁对正常细胞的影响
四、采用SRB法评价舒肝宁制剂对人正常肝细胞生长作用的浓度效应与时间效应
1.方法：处于生长对数期的细胞：人正常肝细胞Lo2以1×104浓度种于96孔板中。试验分为空白对照组、舒肝宁给药组。细胞培养24h后，对于空白组，加1640培养基；给药组加舒肝宁浓度为100μg/mL，36μg/mL，10μg/mL，3.16μg/mL，1μg/mL的培养基。分别培养24h、48h、72h后，加入浓度50％(m/v)的TCA，于4℃固定1h，用水冲去TCA，加入100μL SRB，放置10min，用1％(v/v)HAC冲洗掉SRB，晾干，加200μL 10mM Tris base溶液(pH 10.5)，利用酶标仪(Molecular Devices)测定吸光值(波长515nm)，并根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设3个重复孔。细胞存活率(％)＝ΔOD药物处理/ΔOD空白对照×100。
2.结果：见说明书附图。如图2所示，舒肝宁对人正常肝细胞生长不影响，不受浓度效应和时间效应影响,不具有显著性差异(p＞0.05)。
五、采用克隆数形成统计实验评价舒肝宁制剂对人癌症细胞株生长抑制的作用
1.方法：人癌症细胞HepG2、Lo2、MDA-MB-231、MDA-MB-468以2000/孔浓度种于6孔板中，实验设为对照组和舒肝宁药物处理组。细胞培养24h后，给对照组加1640培养基；于给药组加舒肝宁浓度为37.56μg/mL，9.39μg/mL，2.34μg/mL的培养基，培养7-10天。细胞用0.2％(w/v)的结晶紫染色10min后，统计克隆数。
2.结果：见说明书附图。如图3所示，舒肝宁对人癌症细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468及HepG2的克隆形成具有显著的抑制作用，舒肝宁浓度为37.56μg/mL的给药组与对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)。舒肝宁对正常肝细胞Lo2的克隆形成无影响(P＞0.05)。
六、采用流式细胞仪评价舒肝宁制剂促进癌症细胞死亡的作用
1.方法：处于生长对数期的细胞：人癌症细胞MDA-MB-231以15×104浓度种于6孔板中。试验分为空白对照组、舒肝宁给药组。细胞培养24h后，对于空白组，加1640培养基；给药组加含舒肝宁浓度为150.12μg/mL，37.56μg/mL，9.39μg/mL的培养基。分别培养24h、48h、72h后，收集细胞，离心(300g，5min)，弃上清，加入3mL PBS，吹匀细胞，离心(300g，5min)，弃上清，加入100μL Binding缓冲液，各加入5μL Annexin-V-FITC/PI(BD Pharmingen，5506419)，避光染色20min，用流式细胞仪检测细胞凋亡,统计不同凋亡阶段细胞。
2.结果：如图4所示，舒肝宁制剂明显促进人癌症细胞株MDA-MB-231发生晚期凋亡或坏死，主要集中于Q2区域，流式细胞仪评价舒肝宁促进癌细胞死亡具有浓度效应与时间效应。加药24h，舒肝宁不同剂量组(150.12μg/mL，37.56μg/mL，9.39μg/mL)之间有显著性差异(p＜0.001)；舒肝宁(37.56μg/mL)作用不同时间(6h，12h，24h)，随着作用时间增加而具有显著性差异(P＜0.01)。
七、采用流式细胞仪评价舒肝宁制剂对细胞周期分布的影响
1.方法：处于生长对数期的细胞：人癌症细胞MDA-MB-231以20×104浓度种于6孔板中。试验分为空白对照组、舒肝宁给药组。细胞培养24h后，对于空白组，加1640培养基；给药组加舒肝宁浓度为37.56μg/mL，9.39μg/mL，2.35μg/mL的培养基。培养48h后，收集细胞，离心(300g，5min)，弃上清。加入3mL PBS，吹匀细胞，离心(300g，5min)，弃上清。加入用PBS稀释的70％(v/v)的乙醇于-40℃固定2h，离心(300g，5min)，弃上清。加入3mL PBS，吹匀细胞，离心(300g，5min)，弃上清。加入500μL DNA染液(Cycle TEST plus DNA reagent kit，Becton Dickinson)。避光染色15min，用流式细胞仪(BD Bioscience)检测细胞周期,统计不同细胞周期分布。
2.结果：见说明书附图。如图5所示，舒肝宁(37.5μg/mL)明显阻滞人癌症细胞株MDA-MB-231细胞周期于S期，其中G1期降低，S期增加，具有显著性差异(p＜0.01)。
八、采用磺酰罗丹明染色法评价药物组合物协同抑制人癌细胞增值的作用
1.方法：处于生长对数期的细胞：人癌症细胞MDA-MB-231以1×104浓度种于96孔板中。试验分为空白对照组、舒肝宁给药组、5-氟尿嘧啶给药组、舒肝宁与5-氟尿嘧啶联合给药组。细胞培养24h后，对于空白组，加1640培养基；舒肝宁给药组加舒肝宁浓度为37.56μg/mL，18.78μg/mL，9.39μg/mL，4.70μg/mL，2.35μg/mL的培养基；5-氟尿嘧啶给药组加5-氟尿嘧啶浓度为150.00μM，75.00μM，37.50μM，18.75μM，9.38μM的培养基；舒肝宁与5-氟尿嘧啶联合给药组，分别加舒肝宁浓度为37.56μg/mL+5-氟尿嘧啶浓度150.00μM，舒肝宁浓度18.78μg/mL+5-氟尿嘧啶浓度75.00μM,舒肝宁浓度9.39μg/mL+5-氟尿嘧啶37.50μM，舒肝宁浓度4.70μg/mL+5-氟尿嘧啶浓度18.75μM,舒肝宁浓度2.35μg/mL+5-氟尿嘧啶浓度9.38μM的培养基。培养48h后，加入浓度50％(m/v)的TCA，于4℃固定1h，用水冲去TCA，加入100μLSRB，放置10min，用1％(v/v)HAC冲洗掉SRB，晾干，加200μL 10mM Tris base溶液(pH10.5)，利用酶标仪(Molecular Devices)测定吸光值(波长515nm)，并根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设3个重复孔。细胞存活率(％)＝ΔOD药物处理/ΔOD空白对照×100。计算两种药物联合使用的协同指数(combination index，CI)。
2.结果：见说明书附图。如图6所示，舒肝宁抑制癌细胞增值与5-氟尿嘧啶具有协同作用(协同指数，CI＜1)。
九、采用流式细胞仪评价药物组合物协同促进人癌细胞死亡的作用
1.方法：处于生长对数期的细胞：人癌症细胞MDA-MB-231以20×104浓度种于6孔板中。试验分为空白对照组、舒肝宁给药组、5-氟尿嘧啶给药组、舒肝宁+5-氟尿嘧啶给药组。细胞培养24h后，对于空白组，加1640培养基；舒肝宁给药组加舒肝宁浓度为37.56μg/mL的培养基；5-氟尿嘧啶给药组加5-氟尿嘧啶浓度为375μM的培养基；舒肝宁+5-氟尿嘧啶给药组加舒肝宁浓度为37.56μg/mL及5-氟尿嘧啶浓度为375μM的培养基。培养48h后，收集细胞，离心(300g，5min)，弃上清。加入3mL PBS，吹匀细胞，离心(300g，5min)，弃上清，加入100μL Binding缓冲液，各加入5μL Annexin-V-FITC/PI(BD Pharmingen，5506419)，避光染色20min，用流式细胞仪检测细胞凋亡,统计不同凋亡阶段细胞。
2.结果：见说明书附图。如图7所示，舒肝宁与5-氟尿嘧啶促进人癌症细胞株MDA-MB-231死亡具有协同作用，联合给药组(5-氟尿嘧啶与舒肝宁制剂)与5-氟尿嘧啶单独给药组相比具有显著性差异(P＜0.05)。
十、采用流式细胞仪评价药物组合物协同阻滞细胞周期分布的作用
1.方法：处于生长对数期的细胞：人癌症细胞MDA-MB-231以20×104浓度种于6孔板中。试验分为空白对照组、舒肝宁给药组、5-氟尿嘧啶给药组、舒肝宁+5-氟尿嘧啶联合给药组。细胞培养24h后，对于空白组，加1640培养基；舒肝宁给药组加舒肝宁浓度为37.56μg/mL的培养基；5-氟尿嘧啶给药组加5-氟尿嘧啶浓度为375μM的培养基；舒肝宁+5-氟尿嘧啶给药组加舒肝宁浓度为37.56μg/mL及5-氟尿嘧啶浓度为375μM的培养基。培养48h后，收集细胞，离心(300g，5min)，弃上清。加入3mL PBS，吹匀细胞，离心(300g，5min)，弃上清。加入用PBS稀释的70％(v/v)的乙醇于-40℃固定2h，离心(300g，5min)，弃上清。加入3mL PBS，吹匀细胞，离心(300g，5min)，弃上清。加入500μL DNA染液(Cycle TEST plus DNA reagentkit，Becton Dickinson)。避光染色15min，用流式细胞仪(BD Bioscience)检测细胞周期,统计不同细胞周期分布。
2.结果：见说明书附图。如图8所示，舒肝宁与5-氟尿嘧啶单独给药组都会明显阻滞人癌症细胞株MDA-MB-231细胞周期于S期，二者联合使用具有协同阻滞癌细胞于S期的效果，5-氟尿嘧啶与舒肝宁制剂联合给药组与5-氟尿嘧啶单独给药组相比具有显著性差异(P＜0.05)。
十一、采用小鼠移植瘤模型实验来评价舒肝宁制剂对癌症的抑制作用
1.方法:6周龄的雌性裸鼠，于臀部皮下注射100μL，悬浮于PBS中的人癌症细胞MDA-MB-231(2×106)。一周后，舒肝宁以112.5mg/kg剂量灌胃，于每周灌胃一次，并每周用游标卡尺测量裸鼠的肿瘤体积:体积＝(宽度2×长度)/2。称量裸鼠的体重。
2.结果：见说明书附图，如图9所示，灌胃60天后统计，舒肝宁对裸鼠体重没有影响。见说明书附图，如图10所示，舒肝宁对人癌症细胞株MDA-MB-231的裸鼠移植瘤模型具有显著的抑制作用，与模型对照组比较，肿瘤体积具有显著性差异(P＜0.05)。进一步证明了舒肝宁治疗癌症的有效性和安全性。
结论：本发明中舒肝宁制剂能够有效抑制多株癌症细胞的生长，减少癌细胞克隆数的形成，诱导癌细胞死亡，阻滞癌细胞周期于S期，并且能有效抑制裸鼠移植肿瘤的生长，不影响裸鼠体重，能有效治疗癌症。本发明不影响正常细胞生长，且舒肝宁制剂与5-氟尿嘧啶联合使用具有协同抗肿瘤的效果(协同指数,CI＜1)。
与现有技术相比，本发明所述药物组合物中舒肝宁制剂能选择性杀伤癌细胞，其毒副作用低，可用于治疗癌症，且与5-氟尿嘧啶一起组合可协同抗肿瘤，抗癌效果优于单独使用5-氟尿嘧啶,从而降低5-氟尿嘧啶使用剂量，达到减毒增效的目的。

Claims (4)

1.一种药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物由舒肝宁制剂组成，所述的癌症为乳腺癌；所述的舒肝宁制剂为舒肝宁注射液，所述的舒肝宁注射液由茵陈提取物4g、栀子提取物3g、黄芩苷22g、板蓝根提取物5g及灵芝提取物3.5g组成，具体制备方法如下：取黄芩苷加注射用水适量混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；取茵陈提取物、栀子提取物、板蓝根提取物及灵芝提取物，分别加注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5—8.0，加注射用水至规定量1000mL，滤过，灌封，灭菌，即制成1000mL舒肝宁注射液；给药浓度为10μg/ml-100μg/ml。
2.如权利要求1所述的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用，其特征在于，所述的乳腺癌细胞株为MDA-MB-231和/或MDA-MB-468。
3.一种药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物由1000ml舒肝宁制剂和48.78g 5-氟尿嘧啶组成，所述的癌症为乳腺癌；所述的舒肝宁制剂为舒肝宁注射液，所述的舒肝宁注射液由茵陈提取物4g、栀子提取物3g、黄芩苷22g、板蓝根提取物5g及灵芝提取物3.5g组成，具体制备方法如下：取黄芩苷加注射用水适量混悬，加10％氢氧化钠溶液使溶解；取茵陈提取物、栀子提取物、板蓝根提取物及灵芝提取物，分别加注射用水溶解，混匀，加0.2％活性炭，搅匀，煮沸15分钟，滤过，用10％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5—8.0，加注射用水至规定量1000mL，滤过，灌封，灭菌，即制成1000mL舒肝宁注射液；所述的舒肝宁制剂的给药浓度为37.56μg/ml，所述的5-氟尿嘧啶的给药浓度为375μM。
4.如权利要求3所述的药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用，其特征在于，所述的乳腺癌细胞株为MDA-MB-231和/或MDA-MB-468。
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中医药防治肿瘤患者化疗肝损害研究进展;杨振等;《中西医结合肝病杂志》;20171231;第27卷(第02期);126-128，附录1 *

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