CN107648253A - 一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用 - Google Patents

一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用，属于生物化学与分子生物学技术领域。本发明的数据建立在oTR对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系具有非常显著的体外增殖抑制活性，其中对白血病细胞株的药物敏感性最强的基础之上。本发明的数据以细胞分裂素oTR的基本化学结构为理论依据，oTR是一种核苷类似物，而细胞膜表面有多种分子通道，研究oTR通过哪种分子通道进入细胞，为研究其抗肿瘤作用提供了基础。

Description

一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的 应用
技术领域
本发明涉及细胞分裂素ortho-Topolin Riboside(oTR)对人白血病细胞株的抗肿瘤作用，转运体拮抗剂能逆转细胞分裂素oTR的抗肿瘤作用，属于生物化学 与分子生物学技术领域。
背景技术
白血病是一类骨髓恶性克隆性疾病，又称“血癌”，包括慢性粒细胞白血 病(Chronic myeloid leukemia),慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia)，急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)和急性髓细胞 白血病(Acutemyeloid leukemia)，目前尚不可治愈。患者的预后很大程度上取 决于所患白血病的类型及年龄。其中，急性髓细胞白血病是成年人发病率最高 的一类急性白血病，以发病快，病程发展迅速为特点。患者的完全缓解率和长 期无病生存率均较低。
目前，临床上常采用以阿糖胞苷(Ara-C)为基本化疗药物，其他药物如地 西他滨、普鲁卡因胺、阿扎胞苷等为辅联合用药的方法来治疗白血病。但是， 阿糖胞苷具有骨髓抑制，神经毒性等副作用。因此，寻找有效提高治疗效率， 毒副作用小的天然药物来治疗白血病是十分必要的。
细胞分裂素(cytokinin)是植物生长发育中一类重要的植物激素，因为被发 现促进烟草组织培养中的细胞分裂而得名。从结构上来说，细胞分裂素是由腺 嘌呤N6位置上的H被其它基团取代形成，因侧链R基的长度、不饱和度和其 它性质不同有很大差异。根据取代基的不同，细胞分裂素可以分为三类：异戊 二烯类，如异戊烯基腺嘌呤(N6-isopentenyladenosine，iPR)；糠醛衍生物，如 激动素核苷(kinetin riboside，KR)；芳香族细胞分裂素，如N6-2-苄胺羟基-9- 呋喃核糖基嘌呤(ortho-Topolin Riboside，oTR)等。
以往关于细胞分裂素的报道主要集中在调节植物生长发育的作用上，近几 年细胞分裂素对动物细胞的作用逐渐引起了研究者的关注。N6-2-苄胺羟基-9-呋 喃核糖基嘌呤(ortho-Topolin Riboside，oTR)是一种存在于黎明时杨树叶子内 合成的天然核苷类芳香族细胞分裂素。2010年根据美国国立癌症研究中心(NIC) 测试结果发现，oTR对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系(NIC60)具有非常显著的 体外增殖抑制活性，其中对白血病细胞株的药物敏感性最强(IC50≦1.7μM)。 并且通过药物体内筛选模型-中空纤维法发现oTR在体内对一些肿瘤模型小鼠无 明显的急性毒性反应，在目前已知核苷类细胞分裂素中具有较强的抗肿瘤活性， 对不同组织来源的肿瘤细胞有不同程度的抑制增殖和毒性作用。上述结果充分 表明oTR作为一种核苷类细胞分裂素具有很强的抗肿瘤临床应用潜力和临床药 用研发价值。
细胞分裂素oTR跨膜转运进入细胞的机制目前仍未见报道。作为一种核苷 类似物，oTR要穿过磷脂双分子层的细胞膜，就需要一种贯穿在细胞膜上的通 道，即腺苷转运体(adenosine transporter，AT)；另一方面，oTR是一种嘌呤衍 生物，而腺苷受体(adenosinereceptor，AR)有可能也参与oTR进入细胞的过 程。因此，研究oTR进入细胞的通道，为研究oTR的抗肿瘤作用应用潜力提供 了理论依据。
发明内容
本发明针对上述存在的问题，提供了一种细胞分裂素通过转运体引起人白 血病细胞株凋亡的应用。
本发明的技术方案：
一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用，步骤如下：
(1)细胞培养：从液氮中取出人白血病THP-1细胞冻存管，放入37℃水 浴锅中迅速融化，将细胞吸出放入离心管中，1000rpm/min离心5min，倒掉上 清，将人白血病细胞株THP-1悬浮于含有灭活胎牛血清的无菌DMEM培养液中， 置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养，细胞长至 培养瓶底面积的70％～80％传代1次；
(2)药物配制：Ara-C用无菌DMEM培养基溶解，oTR用0.1％DMSO溶 解，继续用无菌DMEM培养基将溶解好的Ara-C和oTR稀释至浓度为 1μM-300μM；拮抗剂用DMSO溶解至浓度为5mM；过滤除菌，室温保存；所 述的拮抗剂包括两类，分别为腺苷受体拮抗剂和核苷转运体拮抗剂，腺苷受体 拮抗剂包括DPCPX、SCH58261、MRS1754和MRS1191；核苷转运体拮抗剂为Dipyridamole；
(3)检测细胞形态学变化：将处于对数生长期的5×105～1×106个细胞接种 于每孔含有3ml DMEM培养液的6孔板中，设置3组实验，每组两个复孔；分 别是：第1组：空白对照组；第2组：0.3μM oTR组；第3组：1.5μM oTR组； 置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育3-5天，光 学倒置显微镜下观察细胞形态；
(4)药物处理细胞：收集对数生长期的THP-1细胞，用血球计数板进行细 胞计数，按照5×104/ml密度稀释细胞，加入含10％FBS的DMEM培养基，每 孔100μl细胞悬液接种于96孔板中；设置9组实验组及1组对照组，每组5个 复孔，分别是：第1组：空白对照组；第2组：0.1％DMSO组；第3组：0.3μΜ oTR组；第4组：1.5μΜ oTR组；第5组：15μΜ oTR组；第6组：30μΜoTR 组；第7组：0.3μΜ Ara-C组；第8组：1.5μΜ Ara-C组；第9组：15μΜ Ara-C 组；第10组：30μΜ Ara-C组；置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育4天；台盼蓝染色检测活细胞/死细胞，向细胞悬液中加入 0.4％台盼蓝溶液，使台盼蓝终浓度为0.04％，在三分钟内用血球计数板分别计 数活细胞和死细胞，记录数据；
(5)检测拮抗剂对oTR作用的影响：将处于对数生长期的5×103～5×104个 细胞接种于每孔含有100μl DMEM培养液的96孔板中，设置5组实验，分别为： 第1组：DPCPX组；第2组：SCH58261组；第3组：MRS1754组；第4组： MRS1191组；第5组：Dipyridamole组；每组再设空白对照组、拮抗剂单独作 用组、1.5μM oTR处理组以及拮抗剂与oTR联合作用组，各5个复孔；拮抗剂 的工作浓度为5μM，拮抗剂与oTR联合作用组中oTR的工作浓度为1.5μM； 置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养4天；采用 CCK-8试剂盒进行检测，每孔细胞悬液中加10μl CCK-8溶液，置于37℃，CO2培养箱中孵育2h，测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据。
本发明的有益效果：
1.本发明的数据建立在oTR对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系具有非常显著 的体外增殖抑制活性，其中对白血病细胞株的药物敏感性最强的基础之上。
2.本发明的数据以细胞分裂素oTR的基本化学结构为理论依据，oTR是一 种核苷类似物，而细胞膜表面有多种分子通道，研究oTR通过哪种分子通道进 入细胞，为研究其抗肿瘤作用提供了基础。
附图说明
图1为细胞分裂素oTR对人白血病细胞增殖的抑制作用，Ara-C为阳性对照组。
图2为不同浓度oTR处理THP-1对细胞数目和形态学的影响，上图是在20倍 放大条件下的结果图，下图是在100倍放大条件下的结果图。
图3为拮抗剂和oTR联合作用对THP-1增殖抑制的影响。3a DPCPX和oTR联 合作用对THP-1细胞增殖抑制的影响；3b SCH58261和oTR联合作用对THP-1细胞 增殖抑制的影响；3c MRS1754和oTR联合作用对THP-1细胞增殖抑制的影响；3d MRS1191和oTR联合作用对THP-1细胞增殖抑制的影响；3e Dipyridamole和oTR 联合作用对THP-1细胞增殖抑制的影响。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
本发明使用的细胞、试剂盒以及试剂：人白血病THP-1细胞株，胎牛血清， 双抗(青霉素/链霉素)，DMEM培养基，CCK-8试剂盒，细胞凋亡染色试剂盒， Ara-C和oTR，拮抗剂DPCPX、SCH58261、MRS1754、MRS1191和Dipyridamole。
实施例1
Ara-C和oTR对人急性髓细胞白血病细胞THP-1的体外增殖抑制：将复苏的 人白血病细胞THP-1培养于含有10％FBS灭活胎牛血清、1％青霉素/1％链霉素 (双抗)的无菌DMEM培养液中，置于细胞培养瓶中，在37℃，5％CO2及相对 湿度90％的培养箱中培养，细胞长至70％-80％左右传代1次。待THP-1细胞生长 状态良好，1000rpm/min离心5min，收集对数生长期的细胞，用DMEM培养基稀 释至细胞密度为5×104/ml，每孔100μl接种于96孔板中，按照实验需求，处理组 分别加入0.1％DMSO、0.3μM、1.5μM、15μM、30μM浓度的Ara-C或oTR，各5个复孔，放入培养箱中孵育3～5天。采用台盼蓝染色检测活细胞与死细胞比例， 计算细胞活性(cell viability)百分比。每孔细胞悬液中加10μl 0.4％台盼蓝溶液， 立即在倒置光学显微镜下计数，死细胞被染成淡蓝色，活细胞不被染色。记录 数据，5个复孔取平均值，结果如图 1所示，其中0.1％DMSO组为oTR母液中DMSO的浓度，由图1可见，0.1％DMSO 对THP-1细胞无明显毒性作用；同时，相同浓度的oTR和Ara-C相比，oTR对THP-1 细胞的增殖抑制作用更显著，表明oTR可以抑制人白血病细胞THP-1的增殖速率， 且这种作用随着oTR浓度的增加而增加。
实施例2
转运体拮抗剂逆转oTR对人急性髓细胞白血病细胞THP-1的体外增殖抑制： 培养生长状态良好的THP-1细胞，1000rpm/min离心5min，收集对数生长期的细 胞，用DMEM培养基稀释至细胞密度为5×104/ml，每孔100μl接种于96孔板中， 分别加入A1、A2A、A2B、A3腺苷受体拮抗剂(DPCPX、SCH58261、MRS1754、 MRS1191)以及5μM的Dipyridamole(核苷转运体拮抗剂)孵育2h后，加入1.5μM oTR，置于37℃，CO2培养箱中培养4天。采用CCK-8试剂盒进行检测，每孔细胞 悬液中加10μl CCK-8溶液，置于37℃，CO2培养箱中孵育2h，测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据。如图3所示，图a-d中的4种腺苷受体拮抗剂(DPCPX、SCH58261、MRS1754、 MRS1191)和1.5μMoTR联合作用，并没有明显影响oTR对THP-1细胞的增殖抑 制作用；图e中的Dipyridamole和oTR联合作用后，明显逆转oTR的增殖抑制作用， 细胞活性百分比从57％上升到83％。说明oTR能通过细胞膜表面的核苷转运体进 入细胞，进而引起细胞凋亡。

Claims (1)

1.一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)细胞培养：从液氮中取出人白血病THP-1细胞冻存管，放入37℃水浴锅中迅速融化，将细胞吸出放入离心管中，1000rpm/min离心5min，倒掉上清，将人白血病细胞株THP-1悬浮于含有灭活胎牛血清的无菌DMEM培养液中，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养，细胞长至培养瓶底面积的70％～80％传代1次；
(2)药物配制：Ara-C用无菌DMEM培养基溶解，oTR用0.1％DMSO溶解，继续用无菌DMEM培养基将溶解好的Ara-C和oTR稀释至浓度为1μM-300μM；拮抗剂用DMSO溶解至浓度为5mM；过滤除菌，室温保存；所述的拮抗剂包括两类，分别为腺苷受体拮抗剂和核苷转运体拮抗剂，腺苷受体拮抗剂包括DPCPX、SCH58261、MRS1754和MRS1191；核苷转运体拮抗剂为Dipyridamole；
(3)检测细胞形态学变化：将处于对数生长期的5×105～1×106个细胞接种于每孔含有3ml DMEM培养液的6孔板中，设置3组实验，每组两个复孔；分别是：第1组：空白对照组；第2组：0.3μM oTR组；第3组：1.5μM oTR组；置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育3-5天，光学倒置显微镜下观察细胞形态；
(4)药物处理细胞：收集对数生长期的THP-1细胞，用血球计数板进行细胞计数，按照5×104/ml密度稀释细胞，加入含10％FBS的DMEM培养基，每孔100μl细胞悬液接种于96孔板中；设置9组实验组及1组对照组，每组5个复孔，分别是：第1组：空白对照组；第2组：0.1％DMSO组；第3组：0.3μΜ oTR组；第4组：1.5μΜ oTR组；第5组：15μΜ oTR组；第6组：30μΜoTR组；第7组：0.3μΜ Ara-C组；第8组：1.5μΜ Ara-C组；第9组：15μΜ Ara-C组；第10组：30μΜAra-C组；置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育4天；台盼蓝染色检测活细胞/死细胞，向细胞悬液中加入0.4％台盼蓝溶液，使台盼蓝终浓度为0.04％，在三分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，记录数据；
(5)检测拮抗剂对oTR作用的影响：将处于对数生长期的5×103～5×104个细胞接种于每孔含有100μl DMEM培养液的96孔板中，设置5组实验，分别为：第1组：DPCPX组；第2组：SCH58261组；第3组：MRS1754组；第4组：MRS1191组；第5组：Dipyridamole组；每组再设空白对照组、拮抗剂单独作用组、1.5μM oTR处理组以及拮抗剂与oTR联合作用组，各5个复孔；拮抗剂的工作浓度为5μM，拮抗剂与oTR联合作用组中oTR的工作浓度为1.5μM；置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养4天；采用CCK-8试剂盒进行检测，每孔细胞悬液中加10μl CCK-8溶液，置于37℃，CO2培养箱中孵育2h，测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据。
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