CN107216343A - 一种利福霉素‑异烟肼杂合药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利福霉素‑异烟肼杂合药物及其制备方法，它由以下方法制备得到：将利福霉素钠酸化后与N,N‑二羟甲基叔丁胺发生环和反应合成噁嗪利福霉素，然后将噁嗪利福霉素与哌嗪和异烟肼发生缩合反应，得到利福霉素‑异烟肼杂合药物。本发明制备的利福霉素‑异烟肼杂合药物体外较稳定，不易分解且无生物活性，可多靶点给药；同时杂合药物本身具有较强的生物活性，具有与利福平相当的杀菌效果，其开发前景广阔。

Description

一种利福霉素-异烟肼杂合药物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药合成技术领域，涉及一种利福霉素-异烟肼杂合药物及其制备方法。

背景技术

利福霉素是1975年由意大利LePetti公司等发现的，他们从法国土壤中分离的地中海链丝菌产生得到利福霉素类抗菌素，分为A,B,C,D,E五种类型，其中主要成分为B，后来又在产生菌种的发酵液中发现了利福霉素O,S,SV。利福霉素类抗生素具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌，特别是耐药性金黄利福霉素类抗生素色葡萄球菌的作用都很强。对某些革兰氏阴性菌也有效，临床多与其他抗结核病药物合用治疗各型结核病和治疗耐药金黄色葡萄球菌的严重感染，还用于治疗麻风病。对细菌的作用主要为抑制细菌细胞RNA聚合酶，作用于抑制的RNA合成，它可进入细胞内起杀菌作用，对大型病毒有抑制作用。

美国的罗斯公司和施贵宝公司和西德的拜耳公司的研究人员分别独立地发现了异烟肼有极强的抗结核菌的活性。异烟肼具有杀菌力强、选择性高、副作用少的优点。它的灭菌特性在于：它可以抑制结核菌菌壁分枝菌酸成份的合成，从而使结核杆菌丧失多种能力(耐酸染色，增殖力，疏水性)而死亡，异烟肼还能与结核菌菌体辅酶结合，起到干扰脱氧核糖核酸和核糖核酸合成的作用，从而达到杀灭结核菌的目的。研究还发现异烟肼对代谢活力强的结核菌作用更强。异烟肼单用易产生耐药性，合理联合多种抗结核药物治疗结核病，可以提高疗效，降低毒性，并可延缓甚至预防结核分支杆菌耐药性的产生。

杂合药物的研究方式是将两种药物的药效结构单元拼接在一个分子中，或将两者的药效基团通过共价键兼容于一个分子中，使形成的药物或兼具两者的性质，分子中的两类化学结构各自与不同的靶标结合，强化药理作用，减少各自相应的毒副作用，或是两者取长补短，发挥各自的药理活性，协同完成治疗作用。利福霉素-异烟肼杂合药物可以同时作用于不同的受体，杂合药物的活性更强，作用位点多，具有专一性，副作用较少，不易产生耐药性，其开发前景广阔。但一般杂合药物制作方法较困难，后处理较复杂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种可用作抗生素的利福霉素-异烟肼杂合药物。这种杂合物能提高对结核杆菌的活力抑制并减少或克服它的耐药性，增强疗效。

本发明的另外一个目的是提供利福霉素-异烟肼杂合药物的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

提供一种利福霉素-异烟肼杂合药物，它由以下方法制备得到：将利福霉素钠酸化后与N,N-二羟甲基叔丁胺发生环和反应合成噁嗪利福霉素，然后将噁嗪利福霉素与哌嗪和异烟肼发生缩合反应，得到利福霉素-异烟肼杂合药物。

本发明还提供上述利福霉素-异烟肼杂合药物的制备方法，其具体步骤如下：

1)合成噁嗪利福霉素：将利福霉素钠溶于溶剂中，得到利福霉素钠溶液，加入浓硫酸对利福霉素钠进行酸化，待溶液变为深红色后升温至35-50℃，缓慢滴加N,N-二羟甲基叔丁胺，滴加完毕后继续环合反应，反应结束后冷却至室温，用冰乙酸水溶液析出沉淀物，将沉淀物过滤、水洗、干燥得到噁嗪利福霉素；

2)合成利福霉素-异烟肼杂合药物：将步骤1)所得噁嗪利福霉素溶于无水乙醇得到噁嗪利福霉素溶液，然后向所述噁嗪利福霉素溶液中加入哌嗪和异烟肼，升温至55-60℃进行缩合反应，反应结束后后处理得到福霉素-异烟肼杂合药物。

按上述方案，步骤1)所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述利福霉素钠溶液浓度为0.02-0.08g/mL。

按上述方案，步骤1)所述浓硫酸浓度为95-98％，其中硫酸与利福霉素钠摩尔比为1:2-4。

优选的是，步骤1)所述N,N-二羟甲基叔丁胺与利福霉素钠质量比为0.2-0.4:1。

按上述方案，步骤2)所述噁嗪利福霉素溶液浓度为0.03-0.08g/mL。

按上述方案，步骤2)所述噁嗪利福霉素与哌嗪和异烟肼的质量比为20-30:2-4:1。

本发明还包括包含上述的利福霉素-异烟肼杂合药物的药物组合物。

以及上述利福霉素-异烟肼杂合药物用于治疗结核病的用途。

本发明制备利福霉素-异烟肼杂合抗结核药物是以利福霉素钠为原料，合成路线如下：

利福霉素类的母核结构为27个碳的大环内酰胺，环中含一个萘环，结构式如下：

萘环上由一脂肪链分别与C-2和C-12位碳相连接，构成“安莎桥”结构。由噁嗪利福霉素S-Na盐与N,N-二羟甲基叔丁胺在溶剂二甲基酰胺(DMF)中发生环合反应生成。作为中间体，噁嗪杂环要具有足够的稳定性，才能经得起环上的加工，完成环合反应。利福霉素芳香族平面上，C-2和C-3位进行环合为六元环或五元环形成相应的安莎桥环稠合利福霉素衍生物。C-4上的羟基是不必要的，C-3及C-4位上基团的取代，有的能增强对细菌的抑制能力，有的能增强对病毒逆转录酶的抑制作用。萘环上的C-3位单取代和C-3/C-4位环合为杂环是利福霉素类化合物主要的修饰方法。C-3/C-4位可环合为五元或六元杂环，五元杂环可为噻唑环、咪唑环等，六元杂环可为吩嗪环、噁嗪环、噻嗪环和吡啶环等，其中咪唑环和噁嗪环衍生物活性较好。C-3,C-4位的同时取代，有望能达到提高对结核杆菌的活力抑制并减少或克服它的耐药性，同时希望对革兰氏阴性菌有较大的活性及在体内有极收好的效果。根据此发现，本申请人筛选出了目标化合物异烟肼对侧链上的R₁修饰后得到的杂合药物。

本发明的有益效果在于：本发明实施例制备的利福霉素-异烟肼杂合药物体外较稳定，不易分解且无生物活性，进入人体后通过人体相关酶的分解作用还原成原来的两种活性药物，在人体内分别发挥各自的药理作用，可改善药物的药学和药物动力学性质；同时杂合药物本身具有较强的生物活性，具有与利福平相当的杀菌效果，在人体内不分解，整个分子进行多靶点调节。利福霉素-异烟肼杂合药物可以同时作用于不同的受体，杂合药物的活性更强，作用位点多，具有专一性，副作用较少，能提高对结核杆菌的活力抑制并减少或克服它的耐药性，增强疗效，其开发前景广阔。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

合成噁嗪利福霉素：在100mL三口瓶中装入利福霉素钠1.00g(0.0014mol),加入20mLN,N-二甲基甲酰胺将其溶解，放入搅拌用的磁子，常温下搅拌30分钟，待充分溶解后，加入0.072g浓硫酸(95％)(0.0007mol)酸化，常温下搅拌30分钟，反应液由深蓝色变成深红色，然后升温至35-50℃，缓缓滴加N,N-二羟甲基叔丁胺0.352g(0.0026mol)，滴毕后，反应液由深红色变为深蓝色，继续保温反应2小时(用薄层层析硅胶板跟踪反应)，反应结束后冷却至室温，向反应液中加入滴加了2滴冰乙酸的水溶液200mL，间歇搅拌，有大量蓝色沉淀析出，静置过夜，过滤，适量水洗，干燥后即可得到蓝色固体物质1.03g(0.0013mol)，即噁嗪利福霉素；

合成利福霉素-异烟肼杂合药物：将步骤1)所得噁嗪利福霉素用20mL无水乙醇溶解，得到噁嗪利福霉素溶液，在100mL三口瓶中装入噁嗪利福霉素溶液和0.13g(0.0015mol)哌嗪与0.039g异烟肼，升温至55-60℃，反应液由深蓝色变为红棕色，保温反应3小时，反应结束后(用薄层层析硅胶板跟踪反应)，在旋转蒸发仪中于45℃下将溶剂乙醇旋干，得到砖红色固体物质，即利福霉素-异烟肼杂合药物。

将本实施例制备的利福霉素-异烟肼杂合药物在室温、干燥避光条件下放置一个月，用红外进行结构检测，发现其结构没有发生改变，说明其稳定性良好。

实施例2

测试实施例1所得利福霉素-异烟肼杂合药物的性能：

活性测试

为了初步测定利福霉素-异烟肼杂合药物是否具有抑菌活性，随机选择了7株临床分离株标本及1株HR37V标准株，通过MIC药敏试验来进行初步的测试，若具有抗菌活性则进行进一步的活性测试研究。

药敏试验的细菌：随机抽出8株临床分离株标本：13041820敏感株(S)，13040832耐药R(R)，13040902耐药HR(DR)，13041817耐药HRS(MDR)，13040946耐药HRS(MDR)，13042311耐药HRESOfx(XDR)，13062939全耐药HRESKmPasPto(NTM)，13070223全耐药HRESKmPasPto(NTM)及HR37V标准株。

培养条件:在无菌96孔板中每孔加7H9培养基100μL，在玻璃磨菌器底部加入2滴10％Tween-80生理盐水及临床分离的2～3周菌龄的新鲜培养物，研磨至呈乳酪样，用生理盐水稀释成1号麦氏比浊管的浊度(1mg/mL)，用7H9培养基1:20倍稀释后1～12孔每孔接种100μL菌液，用无菌膜封板，放入湿盒内，置于37℃温箱中培养5d，第6天加入过滤除菌0.1g/L刃天青显色液30μL，继续温育24h后观察结果。

仪器设备：电子天平(精度0.1mg)，容量瓶，移液管，玻璃烧杯，电热恒温培养箱(DNP-9082BS-Ⅲ)，无菌96孔版，20-200排枪及一次性无菌耗材等。

试验药剂：95％高效液相色谱纯的实施例1制备的利福霉素-异烟肼杂合药物和购买的含量98％的利福平(郑州民众制药厂，含量>98％)。

对照药剂：用不含抗结核药原液的7H9培养基作空白对照。

其他试剂：国药集团化学试剂有限公司分析纯级的DMSO，10％Tween-80生理盐水，无菌去离子水。

剂量设置：分别称取利福霉素-异烟肼杂合药物和利福平原药50mg，用DMSO溶解后，在50mL的容量瓶用DMSO定容，配成1mg/mL浓度的药液。

试验方法：

把利福霉素-异烟肼杂合药物和利福平原药配好的1mg/mL浓度的药液，灭菌后，用无菌膜密封起来备用。

显色法MIC测定：

(1)在无菌96孔板(1～12孔)中每孔加7H9培养基100μL，第1孔加适当稀释的抗结核药原液100μL，对倍连续稀释至第12孔。各孔药物最终浓度:利福平128～0.06μg/mL，利福霉素-异烟肼杂合药物128～0.06μg/mL。

(2)在玻璃磨菌器底部加入2滴10％Tween-80生理盐水及临床分离的2～3周菌龄的新鲜培养物，研磨至呈乳酪样，用生理盐水稀释成1号麦氏比浊管的浊度(1mg/mL)，用7H9培养基1:20倍稀释后1～8孔每孔接种100μL。空白孔为培养基对照。

(3)用无菌膜封板，放入湿盒内，37℃培养5d，第6天加入过滤除菌0.1g/L刃天青显色液30μL至第12孔，继续温育24h，如空白孔(未加药物)变成粉红色，则加同量刃天青显色液至其他各孔，24h后记录颜色变化。如空白孔仍为蓝色，分别在第7、9天观察。颜色从蓝色变为粉色即预示细菌生长。

试验结果分析：

以不加抗结核药原液的培养基为对照组，随着时间推移，观察培养基的显色情况，培养基的显色情况反映了不同种结核杆菌的生长情况，进一步说明了药物对结核杆菌的抑菌活性。

上述实验经10天培养后观察出现如下表1所示的结果：

表1

表格中共选择了8个菌株作为样本。从A～K作128～0.06μg/mL 12个浓度对倍稀释，1为利福霉素-异烟肼杂合药物64μg/mL，2为利福平64μg/mL，R为耐药，S为敏感，L空白对照为7H9培养基。

由表1中数据显示，对于本次实验选取的七种临床菌株和一种标准菌株，实施例1制备的利福霉素-异烟肼杂合药物取得了与利福平相当的杀菌效果。并且其具备杂合药物的优势，能够实现多靶点给药，可以同时作用于不同的受体、或作用于一个受体的不同结合位点、或作用于两个不同的酶、一个酶和一个受体等。总之，杂合药物活性更强，作用位点多，具有专一性，副作用较少，不易产生耐药性等特点。

Claims (9)

1.一种利福霉素-异烟肼杂合药物，其特征在于，它由以下方法制备得到：将利福霉素钠酸化后与N,N-二羟甲基叔丁胺发生环和反应合成噁嗪利福霉素，然后将噁嗪利福霉素与哌嗪和异烟肼发生缩合反应，得到利福霉素-异烟肼杂合药物。

2.一种权利要求1所述利福霉素-异烟肼杂合药物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)合成噁嗪利福霉素：将利福霉素钠溶于溶剂中，得到利福霉素钠溶液，加入浓硫酸对利福霉素钠进行酸化，待溶液变为深红色后升温至35-50℃，缓慢滴加N,N-二羟甲基叔丁胺，滴加完毕后继续环合反应，反应结束后冷却至室温，用冰乙酸水溶液析出沉淀物，将沉淀物过滤、水洗、干燥得到噁嗪利福霉素；

2)合成利福霉素-异烟肼杂合药物：将步骤1)所得噁嗪利福霉素溶于无水乙醇得到噁嗪利福霉素溶液，然后向所述噁嗪利福霉素溶液中加入哌嗪和异烟肼，升温至55-60℃进行缩合反应，反应结束后后处理得到福霉素-异烟肼杂合药物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述利福霉素钠溶液浓度为0.02-0.08g/mL。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述浓硫酸浓度为95-98％，其中硫酸与利福霉素钠摩尔比为1:2-4。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述N,N-二羟甲基叔丁胺与利福霉素钠质量比为0.2-0.4:1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述噁嗪利福霉素溶液浓度为0.03-0.08g/mL。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述噁嗪利福霉素与哌嗪和异烟肼的质量比为20-30:2-4:1。

8.一种包含权利要求1所述的利福霉素-异烟肼杂合药物的药物组合物。

9.权利要求1所述利福霉素-异烟肼杂合药物用于治疗结核病的用途。