CN104606219A - 一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体公开了一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物，即一种小分子化合物肌苷（Inosine）的新功能。本发明通过研究发现肌苷能够提高细菌包括耐药菌对抗生素的敏感性，从而克服细菌耐药性的问题。因此，将肌苷和抗生素连用可以显著提高抗生素的杀菌作用，比现有的只用抗生素在作为抗细菌耐药性药物的应用上，具有更好的效果以及更高的安全性和操作性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物。
背景技术
病原性细菌严重危害人类身体健康和养殖业的可持续性发展。虽然采用抗生素可以有效进行防治，但抗生素的滥用和误用会导致细菌产生耐药性。细菌耐药后，对原本有效的抗生素产生耐受，导致感染难以控制。因此，采用新的方法控制细菌特别是耐药菌的感染十分重要。
一种技术方法是通过提高耐药菌对抗生素的敏感性，使得原本无效或低效的抗生素变得有效，将耐药菌杀死。因此，发现具有提高细菌对抗生素敏感性的分子，将其与抗生素一起制备成复方制剂，对控制细菌特别是耐药菌的感染十分重要。
肌苷为腺嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入体细胞，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的合成。现有技术中已公开的肌苷的作用有肌苷能活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，活化肝功能，并使处于低能缺氧状态下的组织细胞继续进行代谢，有助于受损肝细胞功能的恢复。并参与人体能量代谢与蛋白质合成。另外，肌苷能提高ATP水平并可转变为各种核苷酸。可刺激体内产生抗体，还可提高肠道对铁的吸收，活化肝功能，加速肝细胞的修复。有增强白细胞增生的作用。但是，关于肌苷能否提高抗生素清除病原菌的研究并未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供肌苷（Inosine）作为一种提高细菌对抗生素敏感的小分子代谢物，达到抑制细菌包括敏感菌、耐药菌及其持续态细菌（persister）的目的的技术方法。
本发明通过添加肌苷后，发现细菌在氨苄青霉素存在时生存率显著下降，说明肌苷可以提高细菌对氨苄青霉素的敏感性。进一步发现，添加肌苷后，敏感菌、耐药菌及其持续态细菌（persister）在用氨苄青霉素处理时生存率也明显下降，说明敏感菌、耐药菌及其持续态细菌（persister）在添加肌苷后对氨苄青霉素的敏感性都得到了提高。
试验还发现肌苷可以提高大肠埃希菌对核糖霉素、庆大霉素、氯霉素、巴洛沙星、头孢西丁酸、氨曲南、莫西沙星、头孢唑林钠的敏感性。这些结果表明，可以通过抗生素与肌苷合用来提高敏感菌、耐药菌及其持续态细菌（persister）对抗生素敏感性的方法来达到治疗耐药菌和非耐药菌的目的，尤其氨苄青霉素联合肌苷具有普遍抑制耐药菌作用。
综上所述，在抗生素中添加肌苷能够明显提高敏感菌、耐药菌及其持续态细菌（persister）对抗生素的敏感性，为耐药菌以及持续态细菌（persister）的治疗提供了一种崭新的技术方法。
由此，本发明公开并保护了肌苷在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。其可用于制备抑菌或杀菌的药物，进一步增强细菌或耐药菌对抗生素的敏感性。
同时，发明公开并保护了一种提高细菌对抗生素敏感性的方法，具体为将肌苷与抗生素联用。
所述的细菌包括但不限于为大肠埃希菌、迟钝爱德华菌、副溶血弧菌和无乳链球菌。因为这些细菌是人类和养殖动物常见的致病菌，其中无乳链球菌为革兰氏阳性菌，大肠埃希菌、迟钝爱德华菌和副溶血弧菌为革兰氏阴性菌。这些细菌可以是耐药菌，也可以是非耐药菌。这些细菌为常见的病原菌，且常见其耐药菌株，同时大肠埃希菌是研究细菌耐药的模式菌，故这些细菌为耐药和非耐药菌的较好代表菌。
所述的抗生素选自但不限于为氨苄青霉素、核糖霉素、庆大霉素、氯霉素、巴洛沙星、头孢西丁酸、氨曲南、莫西沙星、头孢唑林钠。因为氨苄青霉素为青霉素类抗生素，氨曲南、头孢西丁酸和头孢唑林钠为头孢菌类抗生素（同为β-内酰胺类抗生素）；巴洛沙星和莫西沙星为喹诺酮类抗生素；核糖霉素为氨基糖苷类抗生素；氯霉素为酰胺类抗生素。这些包括了目前临床使用的主要抗生素类型。
所述的肌苷与抗生素的剂量比例按重量计为1：0.0015~300。
应用上述方法来提高细菌对抗生素的敏感性时，肌苷的使用浓度为3mg~30g/次给药。
通过本发明所公开的内容，还可制备出一种新的抑菌或杀菌剂，该剂含有抗生素和肌苷；或者一种提高抗生素对耐药菌抑菌或杀菌作用的制剂，其主要成分为肌苷和抗生素。
尽管在本发明的实施例中，所列举的细菌包括大肠埃希菌、迟钝爱德华菌、副溶血弧菌和无乳链球菌。尤其是本发明多数验证试验是以大肠埃希耐药菌作为研究对象的。但是，这些细菌并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为：第一、大肠埃希菌为研究耐药机制的模式菌。第二、上述细菌分别属于革兰氏阴性和阳性细菌，其中无乳链球菌为革兰氏阳性菌，大肠埃希菌、迟钝爱德华菌和副溶血弧菌为革兰氏阴性菌。而所有人类和养殖动物病原菌均可以按照该染色进行分类，故上述细菌具有较好的代表性。第三、细菌可以具有耐药和非耐药状态，即同一细菌的耐药和非耐药菌株，另外在特殊情况下会以persistence（持续态）这样一种处于休眠状态的细菌形式存在，在添加肌苷后亦提高了其对抗生素的敏感性。因此，根据上述原理从这些菌种可以推知到更多的菌种也适宜于本发明的理念。
本发明实施例所列举的抗生素为氨苄青霉素、核糖霉素、庆大霉素、氯霉素、巴洛沙星、头孢西丁酸、氨曲南、莫西沙星、头孢唑林钠。但同样的，这些抗生素也并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为虽然抗生素的品种数以百计，但可以根据其化学结构和抗菌机制可以分类，相似化学结构的具有相同的抗菌机制，因此不需要一一进行验证。本发明采用的抗生素包括了目前临床常用的抗生素。氨苄青霉素为青霉素类抗生素，氨曲南、头孢西丁酸和头孢唑林钠为头孢菌类抗生素（同为β-内酰胺类抗生素）；巴洛沙星和莫西沙星为喹诺酮类抗生素；核糖霉素为氨基糖苷类抗生素；氯霉素为酰胺类抗生素。因此，具有很好的抗生素代表性。领域技术人员根据本发明的理念，可以容易地推知到，临床其余多种抗生素也同样能适用于本发明所述的方法。
优选地，所述的抗生素为氨苄青霉素、核糖霉素、庆大霉素、氯霉素、巴洛沙星、头孢西丁酸、氨曲南、莫西沙星、头孢唑林钠。
附图说明
图1为肌苷提高大肠埃希氏菌K12 BW25113对氨苄青霉素的肌苷浓度效应（A）、抗生素浓度效应（B）及时间效应（C）。
图2为大肠埃希菌K12 BW25113及其氨苄青霉素耐药菌、大肠埃希菌临床多重耐药菌的persister制备（A）和肌苷提高3种菌的persister对氨苄青霉素的敏感性（B）。
图3为肌苷可提高大肠埃希菌K12 BW25113对多种抗生素的敏感性。
图4为肌苷可提高多种病原菌对氨苄青霉素的敏感性。
具体实施方式
下面通过说明书附图和具体实施例对本发明进一步具体描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
实施例1 肌苷提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性
1、细菌样本制备：挑取大肠埃希菌K12 BW25113单克隆到100mL LB液体培养基中，37 ℃、200 rpm培养16小时达饱和状态。收集20 mL菌液，8000 rpm离心5分钟，除去上清并以等体积0.85 %生理盐水洗涤菌体后，用1×M9培养基（含10 mM 乙酸盐）悬浮菌体，调节菌液的OD值为0.6, 然后分装5mL于试管中备用。
2、肌苷可提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性，且具有肌苷浓度效应：在制备的细菌样本中先加入50 μg/mL氨苄青霉素，然后加入不同浓度肌苷（0.625 mM~10 mM），37℃作用4小时后进行活菌计数，并计算不同浓度肌苷作用后的细菌生存率。计算公式为：生存率（%）=（加入肌苷的活菌数/不加肌苷的活菌数）×100%。结果（图1A）表明，对照组（即没有添加肌苷）的细菌生存率为69.97%，而添加肌苷后，随着添加浓度的升高，细菌的生存率从9.04%降低为0.09%，其杀菌效率从7倍提高至近800倍。5mM肌苷时可提高敏感性近300倍，后续相关试验选取此浓度进行。
3、肌苷提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性具有抗生素浓度依赖性：为了解在不同抗生素浓度时肌苷提高大肠埃希菌敏感性的情况，以20、40和80 μg/mL共3个浓度的氨苄青霉素和5mM 肌苷处理细菌，4h后分别进行活菌计数，结果（图1B）发现，在加入肌苷前提下，随着加入氨苄青霉素浓度的升高，其对细菌杀菌效率的提高越显著。具体情况是：添加肌苷后，在20μg/mL氨苄青霉素时，对细菌的杀菌效率提高了7.04倍（生存率由未添加的89.78%下降到添加后的12.76%），在50μg/mL氨苄青霉素时，对细菌的杀菌效率提高了248倍（生存率由未添加的67.12%下降到添加后的0.27%），在80μg/mL氨苄青霉素时，对细菌的杀菌效率提高了近600倍（生存率由未添加的33%下降到添加后的0.06%）。
4、肌苷提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性具有时间依赖性：在制备的细菌样本中添加5 mM肌苷和50 μg/mL氨苄青霉素，37℃作用8小时。每2小时进行活菌计数，并计算不同时间肌苷作用后的生存率。计算公式为：生存率（%）=（加入肌苷后在某个时间点的活菌数/不加肌苷在此时间点的活菌数）×100%。结果（图1C）发现，在仅添加氨苄青霉素不添加肌苷时，其活菌数在2小时仅下降了12.4%（生存率为87.6%），随后随着时间延长活菌数逐渐减少，8小时时生存率降为67.16%。而当在添加氨苄青霉素同时加入肌苷后，从2小时开始活菌数就明显下降（生存率为5.4%），随着时间的延长活菌数就越少。特别在4小时及以上时间时，添加肌苷后，细菌杀菌效率可提高260~700倍。
实施例2 肌苷提高持续态细菌（persister）对氨苄青霉素的敏感性
Persister是一类处于休眠状态的细菌，其生长速率低，能够耐受抗生素处理。
1、E.coli K12 BW25113对氨苄青霉素耐药菌株的筛选：用两倍稀释法检测大肠杆菌敏感菌(Escherichia coli K12 BW25113)对氨苄青霉素的最小抑菌浓度（MIC）。将105菌落形成单位/毫升的起始菌在含1/2MIC氨苄青霉素的培养基中连续培养10代，测定所获单克隆的最小抑菌浓度。结果发现，选择出的菌株对氨苄青霉素的最小抑菌浓度为16μg/mL，是敏感菌株最低抑菌浓度（6.25μg/mL）的64倍，说明获得了耐药大肠杆菌菌株，命名为AMP-R。
2、Persister制备：挑取大肠埃希菌K12 BW25113，AMP-R和临床获得的大肠埃希菌多重耐药菌Y17单克隆于LB培养基中培养过夜，用1.25~80μg/mL氧氟沙星分别处理3种菌的饱和菌液各4小时，测定活菌数，并计算细菌生存率。如果在某一抗生素浓度以后的生存率达到稳定，表明此时剩余的细菌就是persister，此时的抗生素浓度即为制备persister的浓度。从结果（图2A）可以看出，3种菌的persister制备浓度依次为2.5，5和5 μg/mL。
分别用2.5、5和5μg/mL氧氟沙星制备上述3种菌的persister，将菌液OD值调节为0.6，分装5毫升于试管中备用。
3、肌苷提高persister对氨苄青霉素的敏感性：将第2步制备的persister样本在不加和加氨苄青霉素（BW25113，AMP-R，Y17 的persisters的氨苄青霉素浓度分别为1.2、1.6、1.6mg/mL）的前提下，分别加入和不加肌苷（5mM），37 ℃处理4 小时，进行活菌计数，并计算生存率。结果（图2B）发现，仅仅添加氨苄青霉素不能杀死persisters，在添加氨苄青霉素同时加入肌苷则能明显提高persisters对氨苄青霉素的敏感性。本研究加入的5 mM 肌苷能提高BW25113、AMP-R和Y17敏感性分别为300、100和32倍。
实施例3肌苷可提高大肠埃希菌对多种抗生素的敏感性
将制备的细菌样本添加2.5 mM 肌苷和8种抗生素（每种抗生素浓度分别为：核糖霉素1、2、4 μg/mL，庆大霉素0.5、1、1.5μg/mL，氯霉素100、200、400μg/mL，巴洛沙星0.4、0.8、1.2μg/mL，头孢西丁酸1.56、3.125、6.25μg/mL，氨曲南3.125、6.25、12.5μg/mL，莫西沙星0.1、0.2、0.3μg/mL，头孢唑林钠3.125、6.25、12.5μg/mL），37℃处理4小时进行活菌计数，并计算生存率。结果（图3）发现，添加肌苷后大肠埃希菌对不同浓度核糖霉素敏感性分别提高3、5和6倍，对不同浓度庆大霉素敏感性分别提高1.3、2.6和8倍，对不同浓度氯霉敏感性分别提高1.2、1.3和1.8倍，对不同浓度巴洛沙星敏感性分别提高2、3和10倍，对不同浓度头孢西丁酸敏感性分别提高4、5和6倍，对不同浓度氨曲南敏感性提高均为1.5倍，对不同浓度莫西沙星敏感性分别提高2、9和12倍，对不同浓度头孢唑林钠敏感性分别提高7、25和50倍。这些结果表明肌苷可提高大肠埃希菌对多种抗生素敏感性。
实施例4肌苷提高多种病原菌对氨苄青霉素的敏感性
1、多种病原菌对氨苄青霉素最低抑菌浓度的测定：用两倍稀释法检测大肠埃希菌K12 BW25113、大肠埃希菌K12、迟缓爱德华氏菌ATCC15947、迟缓爱德华氏菌EIB202、副溶血弧菌和无乳链球菌对氨苄青霉素的最小抑菌浓度（MIC）结果见下表1。
表1. 病原菌对氨苄青霉素的最低抑菌浓度
| 编号 | 菌株 | MIC(μg/mL) |
| A | 大肠埃希菌K12 BW25113 | 6.25 |
| B | 大肠埃希菌K12 | 5 |
| C | 爱德华氏菌 EIB202 | 12.5 |
| D | 爱德华氏菌 ATCC15947 | 5 |
| E | 副溶血弧菌 | 150 |
| F | 无乳链球菌 | 150 |
2、肌苷提高多种病原菌对氨苄青霉素的敏感性：将上述6种细菌按照实施例1的第1步制备实验用细菌样本。根据测定的不同细菌对氨苄青霉素的最低抑菌浓度，添加相应4MIC 的氨苄青霉素和2.5 mM 肌苷，37℃作用细菌，4小时后统计活菌数，并计算生存率。结果（图4）发现，在氨苄青霉素存在前提下，添加肌苷后，大肠埃希菌K12 BW25113对氨苄青霉素的敏感性提高了100倍（生存率由未添加肌苷的57.7%下降为添加肌苷的0.58%），大肠埃希菌K12对氨苄青霉素的敏感性提高了11倍（生存率由未添加肌苷的88%下降为添加肌苷的7.22%），迟缓爱德华氏菌 ATCC15947对氨苄青霉素的敏感性提高了近60倍（生存率由未添加肌苷的83.87%下降为添加肌苷的1.49%），迟缓爱德华氏菌EIB202对氨苄青霉素的敏感性提高了40倍（生存率由未添加肌苷的91.7%下降为添加肌苷的2.24%），副溶血弧菌对氨苄青霉素的敏感性提高了近90倍（生存率由未添加肌苷的86.87%下降为添加肌苷的0.96%），无乳链球菌对氨苄青霉素的敏感性提高了3倍（生存率由未添加肌苷的98.12%下降为添加肌苷的40.94%）。这些结果表明，在氨苄青霉素存在时，添加肌苷能明显促进所有菌对氨苄青霉素的敏感性。
Claims (8)
1.肌苷在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。
2.一种抑菌或杀菌的药物，其特征在于，含有抗生素和肌苷。
3.一种提高细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，将肌苷与抗生素联用。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的细菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、迟钝爱德华菌、乙型溶血性链球菌、绿脓杆菌或弧菌。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的细菌为敏感菌、耐药菌及其持续态细菌。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的肌苷与抗生素的剂量比例按重量计为1：0.0015~300。
7.根据权利要求3或4或6所述的方法，其特征在于，所述的抗生素选自氨苄青霉素、核糖霉素、庆大霉素、氯霉素、巴洛沙星、头孢西丁酸、氨曲南、莫西沙星或头孢唑林钠。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的肌苷的使用量为3mg~30g/次给药。
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