CN113462739A - 一种检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药检测技术领域，具体涉及一种针对性的检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法和试剂盒。该方法基于细菌在M9基本培养基中不能生长的特性，使细菌利用待测物质，结合不同浓度抗生素对细菌杀灭情况不同，细菌残存情况呈现相应梯度变化，因而可以用来检测化合物提高抗生素对细菌的杀菌效率，相比较于现有的最小抑菌浓度(MIC)方法，可以准确、有效评价促进抗生素杀菌效率提高的化合物的作用；并且操作简单，结果易观察，比利用试管法来检测化合物提高抗生素对细菌的杀菌效率，具有更好的操作性。

Description

一种检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药检测技术领域。更具体地，涉及一种检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法和试剂盒。

背景技术

最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)是测量抗菌药物的抗菌活性大小的一个指标，指在体外培养细菌18至24小时后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度，并广泛用于对细菌耐药性和抗生素杀菌效率的评价中。MIC的检测原理是利用抗生素能够抑制在特定培养基中生长的细菌，通过比较细菌的数量，确定抗生素的最低抑菌浓度。实验时，加入肉眼无法看见的细菌数量：如果抗生素抑制其生长，细菌难以生长，则无法观察到细菌；如果抗生素不能抑制其生长，细菌可以生长，则可以观察到细菌；其抑制细菌至无法观察的最小抗生素浓度即为最低抑菌浓度。

如中国专利申请CN105358982A公开了一种用于快读确定细菌对抗生素的敏感性或耐药性的方法，该方法在MIC检测原理的基础上，基于对相应于该细胞壁合成抑制抗生素的剂量的细胞增大的评价，来快速确定细菌对抗生素的敏感性或耐药性。但是，基于目前常规或改进的MIC检测方法，对于促进抗生素杀菌效率提高的物质都较难测定。如新近研究发现一些生物细胞代谢物(往往指分子量小于1000的化合物)可以显着增加抗生素的杀菌作用，并且都已经通过实验证明这些生物细胞代谢物具有促进抗生素杀菌的效果，但是采用常规MIC检测方法检测时，这些生物细胞代谢物添加后，对抗生素的MIC却没有明显的影响。因此，迫切需要提供一种检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术缺少测定促进抗生素杀菌效率提高的物质方法的缺陷和不足，提供一种检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法。

本发明的目的是提供一种检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法。

本发明另一目的是提供所述检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法构建的试剂盒。

本发明另一目的是提供所述试剂盒在检测促进抗生素杀菌效率提高的物质中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

发明人在实践中发现了许多小分子细胞代谢物(分子量小于1000的化合物)可以显著增加抗生素的杀菌作用，达到协同提高杀菌效率的效果。但是当采用常规的MIC方法测定对比小分子细胞代谢物和抗生素杀菌效率及单独抗生素杀菌效率时，其效果无明显的差异。发明人经过大量的创造性研究发现，常规的MIC方法采用的是富含营养的LB培养基，细菌已经从LB培养基中获取充足的营养，往往不会利用待测的小分子细胞代谢物，所以采用常规的MIC方法无法测出小分子细胞代谢物是否可以促进抗生素杀菌效率提高。因此，本发明提供了以下专门检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法。

一种检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法，将肉眼可见的细菌、待测物质、抗生素加入M9培养基中培养作为实验组，以相同条件下未加入待测物质作为对照组；肉眼无法观察到细菌的最低抗生素浓度为最低杀菌浓度(MKC，minimum killingconcentration)，对照组最低杀菌浓度/实验组最低杀菌浓度≥2判定待测物质促进抗生素杀菌效率提高，为阳性。

本发明一种检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法，以仅能维持细菌正常生存而无法生长，组分明确且不含营养组分的M9培养基作为测定时的培养基，加入数量多的肉眼可见的细菌，测定待测物质和抗生素的最低杀菌浓度(而不是常规MIC方法中加入少量肉眼无法观察的细菌，测定其最低抑菌浓度，两者测定原理存在显著的差异)。在此培养条件下，细菌没有其他营养组分可以摄取，只能依靠添加的待测物质，细菌应用待测物质，即可体现其是否可以促进抗生素杀菌效率提高。检测时，如果抗生素杀灭全部或部分细菌，则肉眼无法观察到细菌；如果抗生素不能杀灭全部细菌，则肉眼可以观察到细菌。

另外，需要说明的是本发明建立的方法与目前检测最低杀菌浓度(minimumbactericidal concentration，MBC)的方法并不相同。MBC是指能够杀灭培养基内细菌(即杀死99.9％供试微生物)的最低浓度，其往往是在采用微量肉汤稀释酶标板法测定MIC的基础上，对最低抑菌浓度以下的孔点板进行活菌计数，加入的细菌数量和采用的培养基与MIC测定一致，因此，与本申请的原理和方法均不相同。

进一步地，所述培养的条件为选择细菌的最适生长温度，孵育8～24小时。

更进一步地，所述肉眼可见的细菌计数为5×10⁶CFU～4×10⁷CFU。

进一步地，所述细菌包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌和所述细菌的耐药菌。

更进一步地，所述抗生素为裂解细菌的杀菌型抗生素，而非抑制细菌生长型抗生素。

优选地，所述抗生素包括青霉类抗生素、头孢类抗生素、碳青霉烯类抗生素；所述抗生素可以裂解杀死细菌。

优选地，所述青霉类抗生素包括但不限于氨苄青霉素、阿莫西林或替莫西林。

优选地，所述头孢类抗生素包括但不限于头孢唑林、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟、头孢匹罗、头孢噻肟或头孢克肟。

优选地，所述碳青霉烯类抗生素包括但不限于美罗培南。

进一步地，所述待测物质为生物活性小分子，分子量小于1000。如氨基酸、葡萄糖、果糖和丙酮酸等。

进一步地，所述M9培养基由选择Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NH₄Cl、NaCl、K₂HPO₄、KH₂PO₄和(NH₄)₂SO₄中两种以上盐与水制成。

另外的，本发明还提供了一种所述检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法构建的试剂盒。

另外的，本发明还提供了所述试剂盒在检测、筛选促进抗生素杀菌效率提高的物质中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明首创性地提供了一种针对性的检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法，基于细菌在M9基本培养基中不能生长的特性，使细菌利用待测物质，结合不同浓度抗生素对细菌杀灭情况不同，细菌残存情况呈现相应梯度变化，因而可以用来检测化合物提高抗生素对细菌的杀菌效率，相比较于现有的最小抑菌浓度(MIC)方法，可以准确、有效评价促进抗生素杀菌效率提高的化合物的作用；并且操作简单，结果易观察，比利用试管法来检测化合物提高抗生素对细菌的杀菌效率，具有更好的操作性。

附图说明

图1为实施例1中谷氨酰胺可提高临床耐药大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性实验数据统计图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法的建立

1.1谷氨酰胺可提高临床耐药大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性

1、实验方法

细菌样本制备：挑取20株临床耐药大肠埃希菌单克隆到100毫升LB液体培养基中，37℃200rpm培养16小时达饱和状态；收集20毫升菌液，8,000rpm离心5min后弃去上清；以等体积0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用含10mM醋酸盐的M9(17.1g Na₂HPO₄·12H₂O，3gKH₂PO₄、1g NH₄Cl、0.5g NaCl溶解于1L超纯水中灭菌)基本培养基悬浮菌体，调菌液OD值为0.5，然后分别分装5毫升于试管中备用。

将制备好的每株细菌样本分成2组，一组加入氨苄青霉素(AMP)200微克/毫升，另一组在加入氨苄青霉素同时再添加20mM谷氨酰胺(Glutamine,Gln)。37℃200rpm孵育4小时后，取100微升菌液稀释进行平板活菌计数。

2、实验结果

结果参见图1，由图可见，添加谷氨酰胺后，这20株临床耐药大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性均得到了显著性提高，其提高倍数为13～205倍，细菌的生存率显著降低。

1.2采用常规MIC方法测定添加谷氨酰胺后氨苄青霉素对细菌的杀菌效率

1、实验方法

挑取临床耐药大肠埃希菌单克隆于5mL LB培养基中，37℃过夜培养，然后1:100(v/v)接种于新5mL LB培养基中，培养至OD600为0.5后，用LB培养基1:100进行稀释；预先在96孔微孔板中加入100μL含有20mM谷氨酰胺的倍比稀释氨苄青霉素的LB培养基，以无谷氨酰胺的倍比稀释氨苄青霉素的LB培养基作为对照组，然后加入10μL(约10⁵CFU)细菌至每孔中，各菌株三次生物学重复。37℃培养16h左右后，用肉眼观察细菌的生长情况，细菌不能生长的最小浓度即为最低抑菌浓度(MIC)；分别记录单独加入抗生素后细菌不生长孔的抗生素浓度(MIC_抗生素)，加入谷氨酰胺和抗生素后细菌不生长孔的抗生素浓度(MIC_{抗生素+Gln})，然后用MIC_抗生素除以MIC_{抗生素+Gln}，作为为添加谷氨酰胺后氨苄青霉素对细菌的杀菌倍数。上述实验检测结果的杀菌倍数在1～2之间，发明人在相应MIC浓度的基础上进行1/3浓度抗生素的稀释，同上方法再次进行MIC测定。

2、实验结果

结果参见表1，由表可见，加入谷氨酰胺后，每株临床耐药大肠埃希菌MIC_{抗生素+Gln}除以MIC_抗生素的倍数仍然在1～2之间。

表1常规MIC方法测定添加谷氨酰胺后氨苄青霉素对细菌的杀菌效率

注：AMP浓度单位为mg/mL，glutamine浓度为20mM。

根据MIC的判断标准：等于或大于4倍为阳性，等于2倍为阳性候选，小于2倍为阴性；谷氨酰胺的阳性率为0％，阳性候选率为25％。但是，实施例1.1的结果表明，添加谷氨酰胺后，20株临床耐药大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性均得到了显著性提高，而根据1.2的实验结果，MIC_抗生素除以MIC_{抗生素+Gln}的倍数却为15株小于2倍和5株等于2倍，其实验结果相互矛盾。这些结果说明采用常规的MIC无法测定出添加谷氨酰胺是否可以提高氨苄青霉素对细菌的杀菌效率。

1.3用M9培养基稀释酶标板法检测谷氨酰胺促进抗生素杀菌效率

1、实验方法

细菌在LB培养基中过夜培养，以8,000rpm离心5min收集细菌，用无菌盐水冲洗三次后，加入含10mM醋酸盐的M9(17.1g Na₂HPO₄·12H₂O，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5g NaCl溶解于1L超纯水中灭菌)培养基稀释至OD600＝1.0备用；在96孔微孔板中加入100μL含有20mM谷氨酰胺的倍比稀释氨苄青霉素的M9培养基作为实验组，以无谷氨酰胺的倍比稀释氨苄青霉素的M9培养基作为对照组，然后每个孔中加入100μL(含有1×10⁷CFU)细菌，混匀后37℃孵育8小时，用肉眼观察微孔中细菌的存留情况；进行三次生物学重复。

由于本发明方法采用的是M9培养基，细菌在此培养基中不会生长，加入高浓度肉眼可见的细菌后，因为不同微孔中抗生素浓度不同，其杀灭细菌的能力各异，因而微孔中细菌残存情况就应呈现相应梯度变化。如果微孔中没有细菌残存，其对应加入的抗生素浓度即为将细菌全部杀灭的抗生素浓度。将肉眼无法观察到的最低抗生素浓度命名为最低杀菌浓度(minimum killing concentration,MKC)。

分别记录单独加入抗生素后无细菌残存微孔的抗生素浓度(MKC_抗生素)，加入谷氨酰胺和抗生素后无细菌残存微孔的抗生素浓度(MKC_{抗生素+Gln})，然后用MKC_抗生素除以MKC_{抗生素+Gln}，即为添加谷氨酰胺后氨苄青霉素对细菌的杀菌倍数。理论上，如果化合物提高了细菌对氨苄青霉素的敏感性，那么添加化合物后无存留细菌微孔的抗生素浓度MKC_{抗生素+Gln}应该小于单加抗生素无存留细菌微孔中的抗生素浓度MKC_抗生素；且增加的倍数越大，表明该物质提高细菌对氨苄青霉素杀菌效率越显著。

2、实验结果

结果参见表2，由表可见，加入谷氨酰胺后，临床耐药大肠埃希菌MKC_抗生素除以MKC_{抗生素+Gln}的倍数大于4的菌株有16株，倍数为2的细菌有1株，倍数为1的细菌有3株。如果按4倍表明耐药性和杀菌效率改变为指标，那么添加谷氨酰胺后耐药性和杀菌效率发生变化的菌株占80％，即阳性率为80％；实际上倍数为2的菌株耐药性和杀菌效率也发生了变化，那么添加谷氨酰胺后耐药性和杀菌效率发生变化的菌株占85％，即阳性率为85％。该结果与1.1实验中添加谷氨酰胺后细菌对氨苄青霉素敏感性提高结果表现出基本一致的现象，说明用该方法可以用来检测化合物是否可促进抗生素的杀菌效率。

表2用M9培养基稀释酶标板法检测谷氨酰胺促进抗生素杀菌效率

注：AMP浓度单位为mg/mL，glutamine浓度为20mM。

实施例2常规MIC方法和本发明MKC方法在测定添加谷氨酰胺后对多种抗生素杀菌效率比较

2.1用常规的MIC方法测定添加谷氨酰胺后多种抗生素对细菌的杀菌效率

1、实验方法

参照实施例1中1.2的方法制备20株临床耐药大肠埃希菌样本，在加入谷氨酰胺基础上，分别加入多种抗生素(抗生素名称见表3)，测定MIC。

表3实验中使用到的抗生素名称

2、实验结果

结果参见表4，由表可见，不管是哪种抗生素，添加谷氨酰胺后，其耐药性倍数均为1～2之间，也就是说采用常规的MIC方法无法正确测定添加谷氨酰胺后抗生素对细菌的杀菌效率。

表4常规MIC方法测定添加谷氨酰胺后多种抗生素对细菌的杀菌效率

注：抗生素浓度单位是mg/mL。

2.2采用MKC方法测定添加谷氨酰胺后多种抗生素对细菌的杀菌效率

1、试验方法

参照实施例1中1.3的方法制备20株临床耐药大肠埃希菌样本，加入谷氨酰胺后，再分别加入表3中的抗生素，测定MKC。

2、实验结果

结果参见表5，由表可见，对于AMX，倍数为4以上的菌株为16株，4株细菌倍数为1；按照4倍杀菌效率指标，那么添加谷氨酰胺后80％菌株可被检测出杀菌效率提高，即阳性率为80％。对于CZO，倍数为4以上的菌株为15株，3株细菌倍数为2，2株细菌变化倍数为1；按照4倍标准，那么阳性率为75％菌株，实际上倍数为2的菌株杀菌效率也发生了变化，合在一起阳性率为95％。对于CRO，倍数为4以上的菌株为19株，1株细菌倍数为2；按照4倍标准，阳性率为95％，加上倍数为2的菌株，全部菌株都可被检测出。对于CFP，倍数为4以上的菌株为13株，4株细菌倍数为2，3株细菌变化倍数为1；按照4倍标准，阳性率为65％，加上倍数为2的菌株，阳性率为为85％。对于CAZ，倍数为4以上的菌株为19株，1株细菌倍数为1；按照4倍标准，阳性率为95％菌株。对于MEM，倍数为4以上的菌株为19株，1株细菌变化倍数为1；按照4倍标准，阳性率为95％菌株。

然而，其余4种抗生素(FOX头孢西丁、GEN庆大霉素、CIP环丙沙星和TET四环素)的MKC值均小于2，其原因可能是这4种抗生素主要是抑制细菌的生长而不是裂解、杀死细菌，无法用本发明方法检测添加化合物后这些抗生素对细菌杀菌率提高情况。

表5 MKC方法测定添加谷氨酰胺后多种抗生素对细菌的杀菌效率

注：抗生素浓度单位是mg/mL。

上述结果说明，本发明方法可以用来检测促进抗生素杀菌效率提高的物质。值得注意的是，MKC方法仅适用于杀菌类抗生素，而静止期杀菌类和非杀菌类抗生素(如GEN，FOX，CIP，TET)不适合该方法。

实施例3采用MKC方法测定添加氨基酸后头孢哌酮-舒巴坦钠对临床耐药大肠埃希菌的杀菌效率

1、实验方法

参照实施例1中1.3的方法，随机选取了8株在添加了外源化合物后敏感性提高的临床耐药大肠埃希菌(包含一株模式大肠埃希菌K12)，在LB培养基中过夜培养，以8,000rpm离心5min收集细菌，用无菌生理盐水冲洗三次后，加入含10mM醋酸盐的M9(17.1g Na₂HPO₄·12H₂O，3g KH₂PO₄、1g NH₄Cl，0.5g NaCl溶解于1L超纯水中灭菌)培养基稀释至OD600＝1.0备用。先在96孔微孔板中加入100μL含有5mM氨基酸的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠(SCF)的M9培养基作为实验组，以无氨基酸的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠的M9培养基作为对照组，然后在96孔板的每个孔中加入100μL(含有1×10⁷CFU)细菌。混匀后37℃孵育8小时后，用肉眼观察微孔中细菌的存留情况，进行三次生物学重复。

2、实验结果

结果参见表6，由表可知，对于肌苷(inosine)，倍数为4以上的菌株为8株，1株细菌倍数为2；按照4倍即为敏感性变化为指标，说明添加肌苷后提高细菌对抗生素敏感性的菌株占89％，即阳性率为89％，实际上倍数为2的菌株敏感性也发生了变化，合在一起阳性率为100％。对于甘氨酸(Glycine)，全部菌株倍数大于4，说明添加甘氨酸后可检测的阳性率为100％。对于丙氨酸(alanine)，倍数为4以上的菌株为8株，1株细菌倍数为2；按照4倍指标，阳性率为占89％，实际上倍数为2的菌株敏感性也发生了变化，合在一起阳性率为100％。对于谷氨酰胺(Glutamine)，倍数为4以上的菌株为7株，2株细菌倍数为2；按照4倍指标，说明阳性率为78％，实际上倍数为2的菌株敏感性也发生了变化，合在一起阳性率为100％。

同时发现，仅有一株临床耐药大肠埃希菌在添加亮氨酸(Leucine)后，MKC倍数为4，其余都为1；而添加异亮氨酸(Isoleucine)后，除1株MKC为2以外其余全部菌株的MKC倍数小于1。上述结果说明添加外源异亮氨酸和亮氨酸后，无法促进抗生素提高对细菌的杀菌效率。

表6多种氨基酸提高头孢哌酮-舒巴坦钠对临床耐药大肠埃希菌的杀菌效率

注：抗生素浓度单位是mg/mL。

实施例4采用MKC方法测定添加氨基酸后头孢哌酮-舒巴坦钠对临床肺炎克雷伯菌的杀菌效率

1、试验方法

参照实施例1中1.3的方法，随机选取10株在添加了外源化合物后敏感性提高的临床肺炎克雷伯菌(包括模式菌株ATCC700603)，在LB培养基中过夜培养，以8,000rpm离心3min收集细菌，用无菌生理盐水冲洗三次后，用加入含10mM醋酸盐、2mM硫酸镁与0.1mM氯化钙的M9(17.1g Na₂HPO₄·12H₂O，3g KH₂PO₄、1g NH₄Cl，0.5g NaCl溶解于1L超纯水中灭菌)培养基稀释至OD600＝1.0备用。先在96孔微孔板中加入100μL含有5mM的氨基酸的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠的M9培养基作为实验组，以无氨基酸的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠的M9培养基作为对照组，然后在96孔板的每个孔中加入100μL(含有1×10⁷CFU)细菌。混匀后37℃孵育8小时后，用肉眼观察微孔中细菌的存留情况，进行三次生物学重复。

2、实验结果

结果参见表7，由表可见，加入外源氨基酸后，全部菌株倍数大于4，说明阳性率为100％。同时发现，仅有一株临床肺炎克雷伯菌在添加(Isoleucine)后，MKC倍数为4，3株MKC为2，其余都为1；而添加亮氨酸(Leucine)后，2株MKC为2，其余菌株的MKC倍数小于1，说明添加外源异亮氨酸和亮氨酸后，无法促进抗生素对细菌的杀菌效率。

表7多种氨基酸提高头孢哌酮-舒巴坦钠对临床肺炎克雷伯菌的杀菌效率

注：抗生素浓度单位是mg/mL。

实施例5采用MKC方法测定添加氨基酸后头孢哌酮-舒巴坦钠对临床鲍曼不动杆菌的杀菌效率

1、实验方法

参照实施例1中1.3的方法，选取10株在添加了外源化合物后敏感性提高的临床鲍曼不动杆菌，在LB培养基中过夜培养，以8,000rpm离心3min收集细菌，用无菌生理盐水冲洗三次后，用加入含10mM醋酸盐的M9(17.1gNa₂HPO₄·12H₂O，3g KH₂PO₄、1g NH₄Cl，0.5g NaCl溶解于1L超纯水中灭菌)培养基稀释至OD600＝1.0备用。先在96孔微孔板中加入100μL含有5mM的氨基酸的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠的M9培养基作为实验组，以无氨基酸的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠的M9培养基作为对照组，然后在96孔板的每个孔中加入100μL(含有1×10⁷CFU)细菌。混匀后37℃孵育20小时左右，用肉眼观察微孔中细菌的存留情况，进行三次生物学重复。

2、实验结果

结果参见表8，由表可见，对于肌苷(Inosine)，倍数为4以上的菌株为8株，2株细菌倍数为2；按照4倍指标，可检测的菌株占80％，即采用该方法可检出的阳性菌株80％，实际上倍数为2的菌株敏感性也发生了变化，合在一起阳性菌株占100％。对于甘氨酸(Glycine)，倍数为4以上的菌株为9株，1株细菌倍数为2；按照4倍指标，可检测的阳性菌株占90％，2倍指标100％。

同时结果发现，仅有2株临床菌添加亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)后，MKC倍数为2，阳性率仅占20％。

表8多种氨基酸提高头孢哌酮-舒巴坦钠对临床鲍曼不动杆菌的杀菌效率

注：抗生素浓度单位是mg/mL。

实施例6采用MKC方法测定添加氨基酸后头孢哌酮-舒巴坦钠对临床铜绿假单胞菌的杀菌效率

1、实验方法

参照实施例1中1.3的方法，选取10株在添加了外源化合物后敏感性提高的临床铜绿假单胞菌，在5ml LB培养基中过夜培养，以8,000rpm离心3min收集细菌，用无菌生理盐水冲洗三次后，用加入含2mM柠檬酸钠与1.2mM硫酸镁的M9(7g K₂HPO₄、3g KH₂PO₄、1g(NH₄)₂SO₄溶解到1L超纯水灭菌)培养基稀释至OD600＝1.0备用。先在96孔微孔板中加入100μL含有5mM的氨基酸的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠的M9培养基作为实验组，以无氨基酸的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠的M9培养基作为对照组，然后在96孔板的每个孔中加入100μL(含有1×10⁷CFU)细菌。混匀后37℃孵育20小时左右，用肉眼观察微孔中细菌的存留情况，进行三次生物学重复。

2、实验结果

结果参见表9，由表可见，对于丝氨酸(Serine)，全部菌株倍数为4；按照4倍指标，可检测的阳性菌株占100％。对于甘氨酸(Glycine)，倍数为4以上的菌株为7株，1株细菌倍数为2，2株细菌倍数为1；按照4倍指标，可检测的阳性菌株占70％，2倍指标可检测的阳性菌株为80％。

同时结果发现，仅有一株临床菌添加异亮氨酸(Isoleucine)后，MKC倍数为2，阳性率仅占20％。

表9多种氨基酸提高头孢哌酮-舒巴坦钠对临床铜绿假单胞菌的杀菌效率

注：抗生素浓度单位是mg/mL。

实施例7MKC方法中细菌最适数量实验

1、试验方法

参照实施例1中1.3的方法制备大肠埃希菌K12和1株临床耐药大肠埃希菌样本，将细菌进行不同稀释备用。先在96孔微孔板中加入100μL含有5mM的肌苷的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠(SCF)的M9培养基作为实验组，以无氨基酸的倍比稀释头孢哌酮-舒巴坦钠的M9培养基(17.1g Na₂HPO₄·12H₂O，3gKH₂PO₄、1g NH₄CI，0.5g NaCl溶解于1L超纯水中灭菌)作为对照组。然后再分别加入含有5×10⁶CFU，1×10⁷CFU，2×10⁷CFU，4×10⁷CFU)细菌100μL。混匀后37℃孵育8小时后，用肉眼观察微孔中细菌的存留情况，进行三次生物学重复。

2、实验结果

结果参见表10，由表可知，细菌数量为5×10⁶CFU，1×10⁷CFU，2×10⁷CFU，4×10⁷CFU时，K12和临床耐药大肠埃希菌17在添加肌苷后头孢哌酮舒巴坦钠对细菌的MKC都大于2。这个结果说明在细菌数量为5×10⁶CFU～4×10⁷CFU时，都可以检测出添加化合物后抗生素对细菌的杀菌效率。

表10本发明中MKC方法细菌数量实验结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法，其特征在于，将肉眼可见的细菌、待测物质、抗生素加入M9培养基中培养作为实验组，以相同条件下未加入待测物质作为对照组；肉眼无法观察到细菌的最低抗生素浓度为最低杀菌浓度，对照组最低杀菌浓度/实验组最低杀菌浓度≥2判定待测物质促进抗生素杀菌效率提高，为阳性。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养的条件为选择细菌的最适生长温度，孵育8～24小时。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述肉眼可见的细菌计数为5×10⁶CFU～4×10⁷CFU。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细菌包括大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌，和所述细菌的耐药菌。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抗生素为裂解细菌的杀菌型抗生素。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述抗生素包括青霉类抗生素、头孢类抗生素、碳青霉烯类抗生素。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述待测物质为生物活性小分子，分子量小于1000。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述M9培养基选择Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NH₄Cl、NaCl、K₂HPO₄、KH₂PO₄和(NH₄)₂SO₄中两种以上盐与水制成。

9.一种权利要求1～8所述检测促进抗生素杀菌效率提高的物质的方法构建的试剂盒。

10.权利要求9所述试剂盒在检测、筛选促进抗生素杀菌效率提高的物质中的应用。

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