CN102973542B - 一种提高细菌对抗生素敏感性的小分子物质 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种小分子代谢物谷氨酰胺（Glutamine）的新功能。该小分子能够提高细菌包括耐药菌对抗生素的敏感性，从而克服细菌耐药性的问题。本发明所提供的小分子，比现有的只用抗生素在作为抗细菌耐药性药物的应用上，具有更好的效果以及更高的安全性和操作性。

Description

一种提高细菌对抗生素敏感性的小分子物质

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种提高细菌对抗生素敏感性的小分子物质-谷氨酰胺。

背景技术

抗生素的发明和应用对人类健康和生命的保护起到必不可少的作用。但近年来由于抗生素的滥用，又成为今天威胁人类健康、家禽家畜和水产养殖以及生态环境的关键因素。据卫生部统计，我国每年有8万人直接或间接死于滥用抗生素；因滥用抗生素所导致的机体损伤以及耐药病菌出现而造成的损失更是无法估量。我国临床分离的一些细菌对某些药物的耐药性已居世界首位，除耐青霉素的肺炎链球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、肠球菌、真菌等多种耐药菌外，进入我国仅20多年的喹诺酮类抗生素的耐药率已达60%－70%。

在畜牧养殖业方面，抗生素作为兽药必不可少，这是因为如果不使用兽药，禽类和家畜的养殖数量分别要增加25%和89%。然而，由于兽药的广泛使用甚至是滥用，尤其是亚剂量作促生长使用，使敏感菌大量死亡，耐药菌得以大量繁殖，促进和增强了细菌的耐药性。在控制水产养殖动物病害过程中,由于抗生素滥用所导致耐药菌株的不断出现和水产品质的急剧下降，对水产养殖业造成了极大危害。药物滥用导致水产品药物残留等食品安全问题，不仅直接影响出口创汇，而且还造成了病原微生物耐药性增加及养殖环境恶化，直接或间接影响生态环境。

由于在抗生素使用与病原菌耐药水平之间存在着一种宏观的量化关系，即一定范围内的抗生素使用可以导致病原菌整体耐药水平以及耐药菌感染率的变化，从而导致人和动物的肠道正常菌群暴露于抗生素而普遍产生耐药性，并通过粪便直接污染环境、水、食品，导致耐药菌不断增加，也使人体接触耐药菌的机会不断增加，因此耐药菌的种类非常广泛。这样一来，人体如果再获得耐药菌的感染治疗起来就比较困难。因此，控制目前已经广泛存在的耐药菌已成为一个重要的社会和科学问题。世界卫生组织2011年世界卫生主题日提出：控制细菌耐药，今天不行动，明天无药用。虽然抗生素的更新和发展速度随细菌耐药性的出现而不断加快，但一种新的抗生素投入使用后，很快就有相应的抗性菌株出现，加上抗生素研制的上市周期较长，导致新抗生素的出现明显落后于耐药菌株发生的被动局面。这些耐药菌株是对抗菌药物的研制开发及对细菌性疾病防治的一个巨大挑战。由此，发现新的抑制耐药菌的方法，对控制耐药菌引发的疾病、保障人们身体健康、促进生态养殖、保证食品安全均具有十分重要的意义。

已有研究发现，利用植物提取物、中药、免洗消毒剂等在体外对多重耐药菌具有较好的抑制作用。但这些都是复合成分，无法知道具体哪种物质起关键作用。新近有研究发现，利用小分子代谢物质如葡萄糖和果糖，能提高氨基糖苷类对革兰氏阴性（大肠埃希菌）和革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）持久态菌( persistence)的敏感性，并证明这种现象是氨基糖甙类抗生素所特有的，此结果进一步在小鼠体内得到了验证。持久态菌不是耐药菌，但具有对抗生素耐药的特性。迄今为止，尚无其他代谢物及其他抗生素的有关提高持久态菌对抗生素敏感性的报道，也无采用小分子代谢物提高细菌对抗生素敏感性的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供谷氨酰胺（Glutamine，Glu/ L-谷氨酰胺,CAS 56-85-9）作为一种提高细菌对抗生素敏感的小分子代谢物，达到抑制细菌包括耐药菌的目的的技术方法。

本发明通过基于GC/MS代谢组学的方法，对氨苄青霉素耐药菌（AMP-R）的所有小分子代谢物进行分析，发现谷氨酰胺在氨苄青霉素耐药菌中含量明显下降。进一步分析了谷氨酰胺在5大类抗生素代表种类耐药菌中的含量，发现在所有耐药菌中其含量均下降。这些结果提示谷氨酰胺可能可以作为提高耐药菌对抗生素敏感性的小分子代谢物质。

本发明通过添加谷氨酰胺后，各类耐药菌在所耐抗生素存在时生存率显著下降，说明谷氨酰胺可以提高耐药菌对相应所耐抗生素的敏感性。进一步发现，添加谷氨酰胺后，各类耐药菌在用氨苄青霉素处理时生存率也明显下降，说明这些耐药菌在添加谷氨酰胺后对氨苄青霉素的敏感性都得到了提高。作为对照组的非耐药菌也对抗生素的敏感性也得到提高。试验还发现青霉素类其他3种抗生素也具有类似的效果。此外，还证明谷氨酰胺可以提高大肠埃希菌对四环素、红霉素、克林霉素和利福平的敏感性。这些结果表明，可以通过抗生素与谷氨酰胺合用来提高细菌对抗生素敏感性的方法来达到治疗耐药菌和非耐药菌的目的，尤其氨苄青霉素联合谷氨酰胺具有普遍抑制耐药菌作用。

本发明通过添加葡萄糖后，氨苄青霉素耐药菌在用氨苄青霉素处理时生存率明显下降，说明葡萄糖可以提高氨苄青霉素耐药菌对氨苄青霉素的敏感性。进一步通过谷氨酰胺和葡萄糖两种物质联用的添加试验，发现这两种添加物质的作用具有明显的协同作用。

本发明采用构建体外细菌生物膜，通过谷氨酰胺和氨苄青霉素联用的方法，证明能有效清除生物膜细菌。进一步采用小鼠慢性尿道感染模型，于尿道中植入耐药菌（AMP-R）生物膜，然后注射谷氨酰胺和氨苄青霉素进行治疗。结果发现，添加物质的治疗组具有明显的杀菌效果。同时对肾脏组织中的细菌含量进行检测，结果发现谷氨酰胺和氨苄青霉素治疗组细菌数明显下降，说明两者联用能有效治疗细菌对肾脏的感染。这些结果说明，谷氨酰胺联合抗生素可以清除动物机体内的耐药菌。同时，本发明通过小鼠体内添加葡萄糖后，氨苄青霉素耐药菌在用氨苄青霉素处理时生存率明显下降，说明葡萄糖在动物体内可以提高氨苄青霉素耐药菌对氨苄青霉素的敏感性。进一步通过谷氨酰胺和葡萄糖两种物质联用的添加试验，发现这两种添加物质在动物体内的作用具有显著的协同作用。

综上所述，在抗生素中添加谷氨酰胺能够明显提高耐药菌和非耐药菌对抗生素的敏感性，为耐药菌的治疗提供了一种崭新的技术方法。

由此，发明公开并保护了谷氨酰胺在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。其可用于制备抑菌或杀菌的药物，进一步增强细菌或耐药菌对抗生素的敏感性。

同时，发明公开并保护了一种提高细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于将谷氨酰胺与抗生素联用。

所述的细菌包括但不限于为金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、迟钝爱德华菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌。因为这些细菌是常见人类和养殖动物致病菌，其中金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性菌，大肠埃希菌、绿脓杆菌、迟钝爱德华菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌为革兰氏阴性菌。这些细菌可以是耐药菌，也可以是非耐药菌。这些细菌为常见的病原菌，且常见其耐药菌株，同时大肠埃希菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌是研究细菌耐药的模式菌，故这些细菌为耐药和非耐药菌的较好代表菌。

所述的抗生素选自但不限于为氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、青霉素G、羧苄青霉素、头孢他啶、巴洛沙星、萘啶酮酸、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、四环素、利福平、克林霉素。因为氨苄青霉素为青霉素类抗生素，头孢他啶为头孢菌类抗生素（两者同为β-内酰胺类抗生素）；巴洛沙星和萘啶酮酸为喹诺酮类抗生素；庆大霉素和卡那霉素为氨基糖苷类抗生素；红霉素为大环内酯类抗生素；四环素为四环素类抗生素; 利福平为利福霉素类抗生素；克林霉素为林可酰胺类抗生素。这些包括了目前临床使用的主要抗生素类型。

所述的谷氨酰胺与抗生素的剂量比例按重量计为1:0.0015-300。

应用上述方法来提高细菌对抗生素的敏感性时，谷氨酰胺的使用浓度为3mg-30g/次给药。

通过本发明所公开的内容，还可制备出一种新的抑菌或杀菌剂，该剂含有抗生素和谷氨酰胺；或者一种提高抗生素对耐药菌抑菌或杀菌作用的制剂，其主要成分为谷氨酰胺和抗生素。

尽管在本发明的实施例中，所列举的细菌包括金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、迟钝爱德华菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌。尤其是本发明多数验证试验是以大肠埃希耐药菌作为研究对象的。但是，这些细菌并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为1）大肠埃希菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌为研究耐药机制的模式菌。2）上述细菌分别属于革兰氏阴性和阳性细菌，其中金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性菌，大肠埃希菌、绿脓杆菌、迟钝爱德华菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌为革兰氏阴性菌。而所有人类和养殖动物病原菌均可以按照该染色进行分类，故上述细菌具有较好的代表性。3）细菌可以具有耐药和非耐药状态，即同一细菌的耐药和非耐药菌株，而本发明的对照菌株即为相对非耐药状态，在添加谷氨酰胺后亦提高了对抗生素的敏感性。因此，根据上述原理从这些菌种可以推知到更多的菌种也适宜于本发明的理念。

本发明实施例所列举的抗生素为氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、青霉素G、羧苄青霉素、头孢他啶、巴洛沙星、萘啶酮酸、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、四环素、利福平、克林霉素。但同样的，这些抗生素也并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为虽然抗生素的品种数以百计，但可以根据其化学结构和抗菌机制可以分类，相似化学结构的具有相同的抗菌机制，因此不需要一一进行验证。目前，临床常用抗生素分为：青霉素类抗生素，头孢菌类抗生素，喹诺酮类抗生素，氨基糖苷类抗生素，大环内酯类抗生素， 四环素类抗生素，利福霉素类抗生素和林可酰胺类抗生素。本发明所采用的氨苄青霉素属于青霉素类，头孢他啶属于头孢菌类，巴洛沙星和萘啶酮酸属于喹诺酮类，庆大霉素和卡那霉素属于氨基糖苷类，红霉素为大环内酯类抗生素；四环素为四环素类抗生素；利福平为利福霉素类抗生素；克林霉素为林可酰胺类抗生素。因此，具有很好的抗生素代表性。领域技术人员根据本发明的理念，可以容易地推知到，临床其余多种抗生素也同样能适用于本发明所述的方法。

发明同时发现谷氨酰胺和葡萄糖联用，在提高细菌对抗生素敏感性方面具有明显协同作用。

优选地，谷氨酰胺和葡萄糖的重量比为1:0.0001-10000。

优选地，所述的抗生素优选为选自氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、青霉素G、羧苄青霉素、头孢他啶、巴洛沙星、萘啶酮酸、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、四环素、利福平、克林霉素。

 附图说明

图1为耐氨苄青霉素大肠埃希菌（AMP-R）GC-MS的独立成分分析（A）、数据聚类分析（B）及代谢物含量分析（C）。

图2为10种耐药菌GC-MS样品中谷氨酰胺含量分析。

图3为添加谷氨酰胺提高耐药菌对自身相应抗生素的敏感性的结果。

图4为谷氨酰胺提高氨苄青霉素耐药菌AMP-R对AMP敏感性的结果。A为不同浓度抗生素、B为不同时间，C为不同谷氨酰胺浓度。

图5为添加谷氨酰胺提高多种大肠埃希菌耐药菌对氨苄青霉素敏感性的结果。

图6为添加谷氨酰胺提高大肠埃希菌及其耐药菌对多种抗生素敏感性的结果。A和B分别为大肠杆菌K12 BW25113及其耐药菌对青霉素类抗生素敏感性结果，C为大肠杆菌K12 BW25113对四环素、红霉素、克林霉素和利福平结果。

图7为谷氨酰胺提高多种细菌对氨苄青霉素敏感性的结果。

图8为谷氨酰胺和葡萄糖协同提高氨苄青霉素耐药菌对氨苄青霉素敏感性的结果。A为葡萄糖提高氨苄青霉素耐药菌对氨苄青霉素敏感性的结果，B和C为谷氨酰胺和葡萄糖协同作用的结果。

图9为谷氨酰胺以及葡萄糖联合氨苄青霉素对苄青霉素耐药菌AMP-R治疗效果的结果。A为对AMP-R生物膜、B和C分别为在小鼠体内尿道和肾脏中耐药菌的清除效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

大肠杆菌K12 BW25113抗生素耐药菌株的筛选

大肠埃希菌（Escherichia coli，E. coli）)是人和动物肠道中最常见的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。用两倍稀释法检测大肠埃希菌起始菌(Escherichia coli K12 BW25113)对10种抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。将10⁵菌落形成单位/毫升的起始菌分别在10种含1/2最小抑菌浓度的抗生素的LB液体培养基中37℃培养且连续传代10次，测定所获单克隆的最小抑菌浓度。结果发现，选择出的10种菌分别对10种抗生素的最小抑菌浓度分别是各自起始菌最小抑菌浓度的64倍（见表1），表明获得了10种耐药大肠埃希菌：庆大霉素耐药菌（GEN-R），庆大霉素耐药菌（AMP-R），巴洛沙星耐药菌（BLFX-R），卡那霉素耐药菌（KAN-R）, 萘啶酮酸耐药菌（NA-R）,头孢他啶耐药菌（ CAZ-R）,红霉素耐药菌（ER-R），氯霉素耐药菌（CAP-R），链霉素耐药菌（SM-R），四环素耐药菌（TET-R）。

表1 10种大肠埃希菌在10种抗生素传代前后的最小抑菌浓度（MIC）

注：GEN：庆大霉素，AMP：氨苄青霉素，BLFX：巴洛沙星，KAN：卡那霉素，NA：萘啶酮酸，CAZ：头孢他啶，ER：红霉素，CAP：氯酶素， SM：链霉素，TET：四环素

实施例2

谷氨酰胺是耐氨苄青霉素大肠埃希菌关键的生物靶标物质

1. 耐氨苄青霉素大肠埃希菌GC-MS样品的制备

1) 细菌样品的制备：从固体LB平板上挑取大肠埃希菌起始菌(Escherichia coli K12 BW25113)和氨苄青霉素耐药菌（培养耐药菌的具体方法见实例1）的单菌落，接种于5毫升 LB培养基中，37℃200rpm培养16小时；按1：100（v/v）的比例接种于100毫升的LB液体培养基中，37℃培养至OD600值为1.0。

2）GC-MS样品的制备：取10毫升菌液，快速加入5 毫升冰冻甲醇骤冷样品，使细胞的代谢过程中止。4℃ 8000rpm离心3分钟收集菌体，尽量去除水份，并将菌体保存在2毫升冷甲醇中(Sigma)。

3）代谢物抽提：在2毫升样品中取相应体积，并加入10微升0.1 毫克/毫升核糖醇(Sigma)作为内标，在冰浴中超声破碎，超声强度为60%，每次超声6s，间隔6s，重复5次。超破后的样品于12 000 rpm 离心5分钟，将上清转移到1.5毫升离心管中，37℃真空离心干燥仪（Labconco,USA）中至完全干燥。

4）衍生化及GC-MS分析：在干燥后的样品中加入20毫克/毫升盐酸甲氧胺/吡啶(Sigma-Aldrich)溶液80微升混匀，37℃下肟化1.5小时；再加衍生化试剂MSTFA(Sigma) 80微升，混匀后在37℃反应0.5 h。取1微升衍生化的上清液到微量进样管，GC-MS分析(Trace DSQ II, Thermo Scientific)。

GC-MS分离条件:初始温度70℃(保持5min)，以2℃/min的速度匀速上升至270℃(保持5min)；进样量: 1微升，不分流进样；进样口温度:270℃；接口温度:270℃，离子源(El)温度:230℃；电离电压:70eV；四极杆温度:150℃；载气:高纯氦气；流速1.0毫升/分；扫描方式:全扫描，60-600m/z。

5）物质鉴定及数据处理：使用NIST质谱数据库2008版(NIST Mass Spectral Database，Thermo Scientific)对GC-MS分析的色谱峰所代表的代谢物进行物质鉴定。物质鉴定的过程基于所检测到的代谢物的El质谱碎片和数据库中所存储的标准物质的质谱信息的比对。对代谢物的EI-MS质谱信息的分析基于NIST AMDIS（Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System）软件进行。所得数据按照内标以及代谢物总量进行均一化处理。

2. 数据的ICA分析

运用在线网页http://metagenealyse.mpimp-golm.mpg.de进行独立成分分析(ICA, Independent Component Correlation Algorithm),在三种独立成分中IC01因子能很好的将起始菌对照组与氨苄青霉素耐药菌AMP-R 代谢组区分开（图1A）。将三种因子中所有代谢物的数据用R软件进行聚类分析，发现谷氨酰胺（Glutamine）代谢物在IC01中具有较大的权重，在区分样本中具有重要意义（图1B箭头标记）。进一步比较起始菌与氨苄青霉素耐药菌AMP-R间谷氨酰胺代谢物的含量，将其峰值作散点图（图1C），发现物质含量变化极显著（P<0.01）。这个结果提示谷氨酰胺可作为氨苄青霉素大肠埃希耐药菌关键的生物靶标物质。

实施例3

谷氨酰胺下调在大肠埃希菌的各类抗生素耐药菌中是普遍存在的

1. 各种抗生素大肠埃希耐药菌GC-MS样品的制备

培养大肠埃希菌起始菌(Escherichia coli K12 BW25113)及其10种耐药大肠杆菌菌株：GEN-R，AMP-R，BLFX-R，KAN-R,NA-R, CAZ-R, ER-R，CAP-R，SM-R和TET-R，样品制备过程参见实例2.1

2.谷氨酰胺在大肠埃希菌各类抗生素耐药菌中下调是普遍存在的现象

将制备好的10种耐药菌样品进行GC-MS上样分析代谢物。根据GC-MS总离子流图中谷氨酰胺的保留时间，获取每种耐药菌谷氨酰胺峰与内标峰的峰面积数据，用相对峰面积(与内标峰的比值)表示代谢物的含量。10种耐药菌中谷氨酰胺的含量与大肠埃希菌起始菌(Escherichia coli K12 BW25113)中谷氨酰胺含量进行比较后的结果如图2所示：以起始菌中谷氨酰胺含量100%作为标准，10种耐药菌（GEN-R，AMP-R，BLFX-R，KAN-R,NA-R, CAZ-R,ER-R，CAP-R，SM-R，TET-R）中谷氨酰胺的相对含量分别为66.23%，0.62.22%，59.45%，57.58%，13.24%，57.45%，15.56%，0%，52.24%。这个结果说明谷氨酰胺代谢物含量下降在所有大肠埃希氏耐药菌中是普遍存在的。

实施例4

谷氨酰胺可提高大肠埃希菌及其耐药菌对抗生素的敏感性

1．添加谷氨酰胺提高大肠埃希耐药菌对相应所耐抗生素的敏感性

挑取6种大肠埃希耐药菌（GEN-R、AMP-R、BLFX-R、KAN-R、NA-R和CAZ-R）单克隆到100毫升LB液体培养基中，37℃200rpm培养16小时达饱和状态。收集20毫升菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以等体积0.85%生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9（含10mM 乙酸盐）基本培养基悬浮菌体，调菌液OD值为0.5，然后分别分装5毫升于试管中，再添加20mM 谷氨酰胺和自身耐药菌相应的抗生素（用量分别为：巴洛沙星8微克/毫升,庆大霉素50微克/毫升,萘啶酮酸160微克/毫升,头孢他啶160微克/毫升,卡那霉素160微克/毫升,氨苄青霉素160微克/毫升），37℃200rpm摇床中孵育4小时后，取100微升菌液进行活菌计数。结果（图3）发现，添加谷氨酰胺后，这6种耐药菌均可以提高对自身耐药菌抗生素的敏感性。而且试验中发现，在试验用抗生素浓度情况下，添加谷氨酰胺后最高可提高对抗生素的敏感性高达近200倍，如氨苄青霉素耐药菌（AMP-R）。因此，进一步对谷氨酰胺提高氨苄青霉素耐药菌对氨苄青霉素的敏感性进行深入研究。

2.谷氨酰胺提高氨苄青霉素耐药菌（AMP-R）对氨苄青霉素的敏感性

通过添加不同谷氨酰胺浓度或不同抗生素浓度以及在不同作用时间情况下，深入研究了氨苄青霉素耐药菌对氨苄青霉素敏感性提高的效果。

2.1 谷氨酰胺提高耐药菌敏感性具有抗生素浓度梯度效应

为了解在不同抗生素浓度时谷氨酰胺提高细菌对抗生素敏感性的作用，以20mM谷氨酰胺和分别添加20、40、80、60、240、320和400微克/毫升几个浓度的氨苄青霉素处理细菌，4小时后进行活菌计数，比较在同一个抗生素浓度情况下，添加谷氨酰胺和未添加谷氨酰胺后细菌的生存率。结果（图4A）发现，在加入谷氨酰胺前提下，随着氨苄青霉素浓度的升高，其对耐药菌杀菌效率的提高越显著，尤其当加入400微克/毫升氨苄青霉素抗生素时，可提高近200倍的杀菌效率。具体情况是：添加20mM谷氨酰胺后，当氨苄青霉素浓度为20微克/毫升时，耐药菌的杀菌效率提高了1.12倍（生存率由未添加的99.81%下降到添加后的89.09%），当氨苄青霉素浓度为40微克/毫升时，耐药菌的杀菌效率则提高到1.57倍（生存率由未添加的97.27 %下降到添加后的61.82%），当氨苄青霉素浓度依次为80、160、240、320和400微克/毫升时，耐药菌的杀菌效率分别提高了1.95倍（生存率由未添加的95.55%下降到添加后的49.09%）、7.66倍（生存率由未添加的93.72%下降到添加后的12.24%）、24.29倍（生存率由未添加的86.72%下降到添加后的3.57%）、137.78倍（生存率由未添加的83.51%下降到添加后的0.6%）和171.34倍（生存率由未添加的67.15%下降到添加后的0.39%）。

2.2. 谷氨酰胺提高耐药菌敏感性具有时间效应

进一步在添加20mM谷氨酰胺和160微克/毫升氨苄青霉素时，分别在1-8小时内进行活菌计数，观察其杀菌效率与时间的关系。结果（图4B）发现，氨苄青霉素耐药菌在仅添加氨苄青霉素而不添加谷氨酰胺时，其活菌数在1-4小时基本不变，从5小时开始到7小时有所下降（生存率为74%），8小时时降为66.19%。而当在添加氨苄青霉素同时添加谷氨酰胺，则从1小时活菌数就开始下降（生存率为60.36%），而且随着时间的延长活菌数就越少。特别在4小时及以上时间时，细菌杀菌效率可提高8-22倍（相对生存率由94.27%-66.18% 降低到12.86%-2.99%）。

2.3 谷氨酰胺提高耐药菌敏感性具有谷氨酰胺浓度梯度效应

为研究谷氨酰胺浓度与杀菌效率之间是否存在梯度效应，以及其最佳杀菌浓度，我们在添加160微克/毫升氨苄青霉素基础上加入不同浓度的谷氨酰胺（0.625mM-20mM）作用4小时，然后进行活菌计数，并计算生存率，公式为添加不同浓度谷氨酰胺浓度时活菌数/不添加谷氨酰胺时活菌数×100%。结果（图4C）表明，对照组（即没有添加谷氨酰胺）的细菌生存率为94.33%，而随着添加添加谷氨酰胺浓度的升高，细菌的生存率从2.09%降低为0.17%，杀菌效率从45倍提高至550倍。

3.谷氨酰胺提高多种大肠埃希各类耐药菌对氨苄青霉素的敏感性

为研究添加谷氨酰胺后，不同抗生素耐药菌是否对氨苄青霉素的敏感性都得到了提高，进而按照实例2.1制备起始菌和8种耐药菌样品，分别添加20mM谷氨酰胺和400微克/毫升氨苄青霉素，作用4小时后统计活菌数量，计算生存率。结果（图5）发现包括起始菌在内，谷氨酰胺能明显提高所有耐药菌对氨苄青霉素的敏感性。起始菌添加谷氨酰胺后对氨苄青霉素敏感性提高了1.75倍（生存率由74.22%下降为42.3%），8种耐药菌对氨苄青霉素敏感性提高在4-36倍之间。

4.谷氨酰胺提高大肠埃希菌及其耐药菌对青霉素类抗生素的敏感性

为研究添加谷氨酰胺后，大肠埃希菌及其耐药菌是否对青霉素类抗生素都有作用效果，按照实例2.1制备起始菌和4种青霉素类耐药菌样品，分别添加20mM谷氨酰胺和四种青霉素（起始菌作用剂量分别为氨苄青霉素25微克/毫升，青霉素G 200微克/毫升，羟基青霉素20微克/毫升，羧苄青霉素100微克/毫升；四种耐药菌作用剂量分别为氨苄青霉素320微克/毫升，青霉素G 2560微克/毫升，羟基青霉素512微克/毫升，羧苄青霉素320微克/毫升），作用4小时后统计活菌数量，计算生存率。结果发现，谷氨酰胺能明显提高起始菌（图6A）和耐药菌（图6B）对四种青霉素的敏感性，起始菌添加谷氨酰胺后对青霉素类抗生素敏感性提高了38-1000倍，4种耐药菌对青霉素类抗生素敏感性提高在71-1900倍之间。

5.谷氨酰胺提高大肠埃希菌对其他抗生素的敏感性

为研究添加谷氨酰胺后，大肠埃希菌是否对青霉素类以外的其他抗生素有效，按照实例2.1制备起始菌（大肠杆菌K12 BW25113）样品，分别添加20mM 谷氨酰胺和对起始菌最小抑菌浓度的8倍的抗生素（抗生素分别为四环素，红霉素，克林霉素，利福平），作用4小时后统计活菌数量，计算生存率。结果（图6C）发现，谷氨酰胺均能提高起始菌对四种抗生素的敏感性1.5倍左右。

综上所述，添加谷氨酰胺不仅能提高大肠埃希耐药菌对自身抗生素的敏感性，而且也能显著提高多种抗生素大肠埃希氏耐药菌对氨苄青霉素的敏感性，青霉素类其他3种抗生素也具有类似的效果。作为对照组的非耐药菌也对抗生素的敏感性也得到提高。这些结果表明，可以通过抗生素与谷氨酰胺合用来提高细菌对抗生素敏感性的方法来达到治疗耐药菌和非耐药菌的目的，尤其氨苄青霉素联合谷氨酰胺具有普遍抑制耐药菌作用。

实施例5

谷氨酰胺提高多种细菌对氨苄青霉素的敏感性

挑取金黄色葡萄球菌（S.aureus），迟钝爱德华菌（EIB202，ATCC15947），B链球菌（B.streptococcus），绿脓杆菌（P.aeruginosa），大肠杆菌（E.coli K12 BW25113，E.coli K12，Y17），弧菌（溶藻弧菌V.alginolyticus，副溶血弧菌V.parahaemolyticus）等多种细菌单克隆到100mL LB液体培养基中，37℃或30℃200rpm培养16小时达饱和状态。分别收集20毫升各种细菌菌液，8000rpm离心5min，除去上清并以等体积0.85%生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9（含10mM 乙酸盐）基本液体培养基悬浮菌体，调菌液OD至0.5，然后分别分装5毫升于试管中，再添加20mM 谷氨酰胺和各自菌2倍最低抑菌浓度的氨苄青霉素，37℃200rpm摇床中孵育4小时后，取100微升菌液进行活菌计数，计算其生存率，结果见图7。由这些结果可以看出，添加谷氨酰胺后，这些细菌对氨苄青霉素的敏感性普遍都得到了提高。

实施例6

谷氨酰胺与葡萄糖可协同提高耐药菌对抗生素的敏感性

已有文献报道，葡萄糖能提高氨基糖苷类对革兰氏阴性（大肠埃希菌）和革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）持久态菌(persistence)的敏感性，并证明这种现象是氨基糖甙类抗生素所特有的。因此我们也对葡萄糖以及谷氨酰胺和葡萄糖联用时，氨苄青霉素耐药菌AMP-R对氨苄青霉素的敏感性进行了研究。

1.氨苄青霉素耐药菌样本的制备

挑取氨苄青霉素耐药菌AMP-R单克隆到100毫升LB液体培养基中，37℃200rpm培养16小时达饱和状态。收集20毫升菌液，8000rpm离心5分钟，除去上清并以等体积0.85%生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9（含10mM 乙酸盐）基本培养基悬浮菌体，调菌液OD至0.5，然后分装5毫升于试管中，备用。

2.葡萄糖可提高氨苄青霉素耐药菌AMP-R对氨苄青霉素的敏感性

在制备好的样本中添加160微克/毫升氨苄青霉素，同时添加不同浓度的葡萄糖，使其终浓度分别为0-20mM，37℃200rpm摇床中孵育4小时后，取100微升菌液进行菌落计数并计算生存率。结果（图8A）发现，对照组（即没有添加葡萄糖）的细菌生存率为94.33%，而添加葡萄糖后，随着添加浓度的升高，细菌的生存率从1.31%降低为0.27%，其杀菌效率从71倍提高至338倍。这个结果表明葡萄糖可以提高氨苄青霉素耐药菌AMP-R对氨苄青霉素的敏感性。

3.葡萄糖和谷氨酰胺可协同提高苄青霉素耐药菌对氨苄青霉素的敏感性

为进一步研究葡萄糖和谷氨酰胺联用时，氨苄青霉素耐药菌AMP-R对氨苄青霉素敏感性提高的效果，做了两组实验：一组在是制备好的样品中加入1.25mM葡萄糖基础上，加入谷氨酰胺使其终浓度分别为0-20mM。另一组是在制备好的样品中加入1.25mM谷氨酰胺基础上，加入葡萄糖使其终浓度分别为0-20mM。这两组细菌样品中均添加160微克/毫升氨苄青霉素。然后37℃200rpm摇床中孵育4小时后，取100微升菌液进行菌落计数并计算生存率。结果（图8B和C）发现，当在加入一种物质基础上，即使加入最低浓度的另一种物质，耐药菌的敏感性都得到了大幅度的提高，如先加入1.25mM葡萄糖再添加0.625mM谷氨酰胺，耐药菌敏感性提高了27倍，而先加入1.25mM谷氨酰胺再添加0.625mM葡萄糖，耐药菌敏感性提高了14倍。且随着加入另一种物质浓度的增加，耐药菌的敏感性逐渐增加，当另一种物质加入量增加到20mM时，耐药菌敏感性分别提高了提高了65倍（另加谷氨酰胺）和81倍（另加葡萄糖）。

实施例7

谷氨酰胺可明显提高氨苄青霉素耐药菌的体内清除效果

挑取氨苄青霉素耐药菌单克隆于LB培养基中过夜培养，按1：200转接至2毫升新鲜LB培养基中，并加入紫外灭菌的6mm PE-50生物导管，37℃培养箱中培养24小时，每天用1毫升LB培养基更换菌液，将导管连续培养3天。将制备的氨苄青霉素耐药菌生物膜用1毫升无菌生理盐水洗涤5遍后置于1.5mLEP管中。实验分为6组：生理盐水对照组、20mM 谷氨酰胺组、160微克/毫升氨苄青霉素组，160微克/毫升氨苄青霉素+20mM 谷氨酰胺，160微克/毫升氨苄青霉素+20mM 葡萄糖，160微克/毫升氨苄青霉素+20mM 谷氨酰胺+20mM葡萄糖，在37℃200rpm摇床中处理导管6小时后，超声波清洗15min将导管上的生物膜洗脱并充分混匀，梯度稀释后点板计数，细菌存活率计算公式为：每组活菌数/对照组活菌数×100%。5个实验组细菌生存率分别为96.03%，92.84%，8.08%，5.62%和1.58，结果见图9A，从此结果可以看出，1）单独使用谷氨酰胺和氨苄青霉素不能清除生物膜上的耐药菌，只有当二者联合使用时才可清除耐药菌，且其清除效率较明显，可提高11倍；2）在添加氨苄青霉素后，添加葡萄糖也可明显清除耐药菌，其效率提高16.5倍；3）当谷氨酰胺和葡萄糖联合使用时，其清除耐药菌效果明显优于仅使用一种物质，其效率又可提高分别5倍和3倍。

进一步以小鼠为试验动物，将耐药菌生物膜植入其尿道构建了小鼠慢性尿道感染模型，进行体内谷氨酰胺和葡萄糖体内耐药菌清除试验：将5周龄昆明雌性小鼠(约20克)尿道中植入培养3天形成氨苄青霉素耐药菌生物膜的6mm PE-50导管，48小时后，将小鼠分为6组，每组5只，分别为生理盐水对照组、100毫克/公斤谷氨酰胺组、320毫克/公斤氨苄青霉素组、320毫克/公斤氨苄青霉素加100毫克/公斤谷氨酰胺组、320毫克/公斤氨苄青霉素加100毫克/公斤葡萄糖组、320毫克/公斤氨苄青霉素加100毫克/公斤谷氨酰胺组加100毫克/公斤葡萄糖组。每只小鼠每日两次尾部静脉注射相应溶液，连续3天。最后一次24小时后，取导管管材于生理盐水中超声悬浮生物膜细菌，梯度稀释并平板计数，计算导管生物膜上的细菌存活率。计算公式为注射物质组活菌数/对照组活菌数×100%。5个实验组的细菌生存率分别为88.24%，76.81%，0.63%，1.19%和0.11%，结果见图9B。从这个结果可以看出，1）添加抗生素同时添加谷氨酰胺的试验组其生物膜上的耐药菌明显减少，与只添加谷氨酰胺和抗生素相比，分别减少了140和120倍。2）在添加抗生素时，添加葡萄糖也可明显清楚耐药菌，其效率提高65倍；3）当谷氨酰胺和葡萄糖联合使用时，其清除耐药菌效果明显优于只使用一种物质，其效率又可提高分别5倍和10倍。

同时，取每只小鼠的肾脏加入适量生理盐水充分研磨匀浆，平板计数检测肾脏组织中的细菌含量（活菌数/克）。统计结果（图9C）为：生理盐水组，100毫克/公斤谷氨酰胺组、320毫克/公斤氨苄青霉素组、320毫克/公斤氨苄青霉素加100毫克/公斤谷氨酰胺组、320毫克/公斤氨苄青霉素加100毫克/公斤葡萄糖组、320毫克/公斤氨苄青霉素加100毫克/公斤谷氨酰胺组加100毫克/公斤葡萄糖组的细菌数分别为16750，9113，9129，1107，660和193。分析比较后发现，1）添加抗生素同时添加谷氨酰胺的试验组肾脏的活菌数明显减少，与对照组、只添加谷氨酰胺和抗生素相比，分别减少了15、8和8倍。2）在添加抗生素时，添加葡萄糖也可明显清除耐药菌，其效率又提高13倍；3）当谷氨酰胺和葡萄糖联合使用时，其清除耐药菌效果明显优于只使用一种物质，其效率又可提高分别5倍和3倍。

综合以上动物试验结果说明，谷氨酰胺都可提高机体内氨苄青霉素耐药菌对青霉素的敏感性。而且谷氨酰胺和葡萄糖这两种物质的作用具有协同性，当联合使用时效果更佳。

Claims (4)

1.谷氨酰胺在制备提高细菌对抗生素敏感性药物中的应用。

2.谷氨酰胺和葡萄糖联用在制备提高细菌对抗生素敏感性药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的谷氨酰胺和葡萄糖的重量比为1：0.0001-10000。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗生素为选自氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、青霉素G、羧苄青霉素、头孢他啶、巴洛沙星、萘啶酮酸、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、四环素、利福平或克林霉素。