CN112438975B - 糖尿病治疗药物在抑菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了糖尿病治疗药物在抑菌中的应用。本发明公开了糖尿病治疗药物SGLT2抑制剂坎格列净在如下B1)‑B6)中任一种应用：B1)抑菌和/抗菌；B2)抑制细菌生长；B3)抑制细菌糖摄取和/或乳酸产生成和/或ATP合成；B4)预防和/或治疗细菌感染所致疾病；B5)预防和/或治疗糖尿病足溃疡；B6)抑制糖尿病足感染。本发明提供了一种既能降血糖，同时还能抗菌的药物，具有很大的应用前景。

Description

糖尿病治疗药物在抑菌中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及糖尿病治疗药物在抑菌中的应用。

背景技术

糖尿病是一类以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病患者的数量逐年增加。根据国际糖尿病联合会(IDF)的数据，2015年约有4.15亿糖尿病患者，预计2040年将达到6.4亿。高血糖症有利于细菌存活，甚至快速生长。高、低毒力的葡萄球菌菌株均可引起软组织感染，并在糖尿病患者中持续存在并增殖，这表明糖尿病患者感染的频率更高。糖尿病患者的结核病感染率高于无糖尿病患者，此外，糖尿病足也是糖尿病患者的常见感染。糖尿病足溃疡是糖尿病的一种并发症，其发病率、死亡率和医疗费用都很高。根据国际糖尿病联合会2015年的患病率数据，每年有910-2610万人患有糖尿病足溃疡。需氧革兰氏阳性菌，特别是金黄色葡萄球菌，是糖尿病足感染的主要病原菌。

目前，有很多方法可以控制和治疗糖尿病足感染。对于感染部位的治疗，抗生素是控制感染程度和中度感染的常用药物。伤口感染是伤口愈合不良和截肢的一个已知因素。正确认识和使用抗生素对改善糖尿病足感染患者的预后具有重要意义。在许多情况下，为了减少细菌负担或防止包括抗微生物药在内的不良反应，通常在错过感染的情况下不成比例地使用抗生素。如果滥用抗生素，将导致抗生素耐药性、耐药菌和抗生素相关不良事件。

坎格列净(Canagliflozin)是一种存在于肾脏近曲小管钠-葡萄糖转运体(SGLT2)的抑制剂，可以抑制肾脏对葡萄糖的重吸收，从而促使葡萄糖随尿液排出，而发挥显著的降血糖作用。然而目前关于其是否具有微生物调节作用尚无相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供SGLT2抑制剂在抗菌及制备预防和/或治疗细菌感染所致疾病的产品中的应用。

第一方面，本发明保护SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐、酯的新用途。

本发明提供了SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐、酯在抑菌和/或抗菌中的应用或在制备抑菌和/或抗菌的产品中的应用。

本发明又提供了SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐、酯在抑制细菌生长中的应用或在制备抑制细菌生长的产品中的应用。

本发明还提供了SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐、酯在抑制细菌糖摄取和/或乳酸生成和/或ATP合成中的应用或在制备抑制细菌糖摄取和/或乳酸生成和/或ATP合成的产品中的应用。

本发明还提供了SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐、酯在制备预防和/或治疗细菌感染所致疾病的产品中的应用。

本发明还提供了SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐、酯在制备预防和/或治疗糖尿病足溃疡的产品中的应用或在制备抑制糖尿病足感染的产品中的应用。

第二方面，本发明还保护一种产品，其活性成分为SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐、酯；所述产品的功能为如下B1)-B6)中任一种：

B1)抑菌和/抗菌；

B2)抑制细菌生长；

B3)抑制细菌糖摄取和/或乳酸生成和/或ATP合成；

B4)预防和/或治疗细菌感染所致疾病；

B5)预防和/或治疗糖尿病足溃疡；

B6)抑制糖尿病足感染。

上述任一所述应用或产品中，所述抑菌为抑制细菌；所述抗菌为抗细菌。

上述任一所述应用或产品中，所述抑制细菌糖摄取为抑制细菌葡萄糖摄取。

上述任一所述应用或产品中，所述细菌所致疾病具体为金黄色葡萄球菌所致的糖尿病足溃疡。

上述任一所述应用或产品中，所述产品可为药物。本发明的产品(药物)可与其他具有预防和/或治疗功能的产品(药物)联合使用。需要的时候，在上述产品(药物)中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

上述产品(药物)可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述产品(药物)可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

第三方面，本发明还保护抑制细菌生长的方法或抑制细菌糖摄取和/或乳酸生成和/或ATP合成的方法。

本发明提供的抑制细菌生长的方法或抑制细菌糖摄取和/或乳酸生成和/或ATP合成的方法包括用含有SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐、酯的培养基培养细菌的步骤。

上述任一所述应用或产品或方法中，所述细菌可为绿脓杆菌pseudomonasaeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或乳酸杆菌Lactobacillus sp.。

上述任一所述应用或产品或方法中，所述SGLT2抑制剂为坎格列净(Canagliflozin，简称CAN)，其CAS登录号为842133-18-0，分子式为C₂₄H₂₅FO₅S，分子量为444.52。结构式如式I所示。

本发明的优点如下：1)糖尿病作为一种慢性病，容易并发许多细菌感染等疾病，一种既能降血糖，同时还能抗菌的药物具有很大的应用前景，本发明将有可能为SGLT2抑制剂Canagliflozin的临床应用增加新的适应症；2)常见的抗菌药物大多存在药物滥用或耐药性的情况，不适合长期给药，缺乏理想药物，而本药物有可能成为防治相关感染性疾病的新成员。

附图说明

图1为不同浓度坎格列净作用下金黄色葡萄球菌菌落平板图。(a)0ug/mL；(b)30ug/mL；(c)40ug/mL；(d)50ug/mL；(e)100ug/mL。

图2为不同浓度坎格列净作用下绿脓杆菌菌落平板图。(a)0ug/mL；(b)40ug/mL；(c)80ug/mL；(d)100ug/mL；(e)120ug/mL。

图3为不同浓度坎格列净作用下乳酸杆菌菌落平板图。(a)0mg/mL；(b)0.12g/mL；(c)0.24g/mL；(d)0.48mg/mL；(e)0.96mg/mL。

图4为不同浓度坎格列净作用下大肠杆菌菌落平板图。(a)0mg/mL；(b)0.12g/mL；(c)0.24g/mL；(d)0.48mg/mL；(e)0.96mg/mL。

图5为液态培养下不同浓度坎格列净作用下目标菌株生长情况。(a)金黄色葡萄球菌(SA)；(b)绿脓杆菌P.eruginosa；(c)乳酸杆菌Lactobacillus sp.。数据表示为均数±标准差(n＝3)，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001 vs 0(坎格列净药物浓度为0的阴性对照)。

图6为不同浓度坎格列净对乳酸杆菌作用。(a)培养基葡萄糖含量；(b)培养基乳酸含量；(c)细菌ATP含量。数据表示为均数±标准差(n＝3)，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.01 vs0(坎格列净药物浓度为0的阴性对照)。

图7为金黄色葡萄球菌感染面积数据。(a)24h；(b)48h；(c)72h。^*P<0.05，^**P<0.01vs DM(n＝4)。Nor，正常对照组；DM，糖尿病对照组；CAN，糖尿病+CAN给药组。

图8为金黄色葡萄球菌感染面积局部图(n＝4)。Nor，正常对照组；DM，糖尿病对照组；CAN，糖尿病+CAN给药组。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的半数抑制浓度(IC₅₀)是指坎格列净Canagliflozin(CAN)抑制50％病原细菌生长时的浓度。

实施例1、体外坎格列净抗菌活性评价

一、实验材料

1、化合物：坎格列净Canagliflozin(CAN)是MedChemExpress(MCE)公司的产品，货号为HY-10451；二甲亚砜(DMSO)是生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。

2、细菌来源：绿脓杆菌pseudomonas aeruginosa(菌株编号：BNCC337005)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(菌株编号：BNCC186335)、乳酸杆菌Lactobacillus sp.(菌株编号：BNCC223759)、大肠埃希菌Escherichia coli(菌株编号：BNCC337004)均是北纳生物(BNCC)的产品。

3、细菌生物学试剂：MRS肉汤培养基、NBM培养基粉末、琼脂粉末均是青岛高科技工业园海博生物技术有限公司的产品。LB培养基配方：胰蛋白胨Tryptone 1g，酵母粉YeastExtract 0.5g，NaCl 1g，用100mL去离子水定容。

4、生化试剂：增强型ATP检测试剂盒是上海碧云天生物技术有限公司的产品，货号为S0027；乳酸检测试剂盒是武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司的产品，货号为E-BC-K044-S；葡萄糖检测试剂盒是武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司的产品，货号为E-BC-K234-S。

5、实验耗材：9cm细胞培养板、细胞培养6孔板及96孔板、移液管均是GuangzhouJet Bio-Filtration Co.,Ltd公司的产品；1.5ml、2ml离心管均是赛默飞世尔科技(中国)有限公司的产品；2.5L厌氧培养罐和厌氧产气袋均是日本三菱瓦斯化学株式会社的产品。

二、实验方法

1、固态培养目标菌株及坎格列净作用评价

1)配制不同浓度坎格列净的固态培养基：在固态培养基的制备过程中加入1-1.5％的琼脂，高温灭菌冷却后得到固态培养基。倒平板前加热融化，冷却至60℃左右分别加入不同浓度的坎格列净，不同目标菌株培养基及药物终浓度分别如下：

NBM培养基中的坎格列净药物终浓度：0μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL；

MRS肉汤培养基中的坎格列净药物终浓度：0μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL；

LB培养基中的坎格列净药物终浓度：0μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL。

倒平板于6孔板(MRS肉汤培养基和NBM培养基)中、每孔约3mL，或9cm盘(LB培养基)中、每盘3mL，冷却凝固备用。

2)接种细菌：取30-50μL对数生长期的细菌稀释1000-10000倍均匀涂布于步骤1)制备的含有不同浓度坎格列净药物的平板上(金黄色葡萄球菌加入NBM固体培养基中，绿脓杆菌加入NBM固体培养基中，大肠埃希菌加入LB固体培养基中，乳酸杆菌加入MRS固体培养基中)，37℃、恒温培养箱中培养12h。其中，由于乳酸杆菌属于厌氧菌，将其置于厌氧罐中再放置于上述培养箱中。

2、液态培养目标菌株及坎格列净作用评价

1)菌株活化：将目标细菌菌株加入相应培养基在37℃下恒温培养活化菌株，即将金黄色葡萄球菌加入NBM培养基中，绿脓杆菌加入NBM培养基中，大肠埃希菌加入LB培养基中，乳酸杆菌加入MRS培养基中，37℃恒温培养箱中培养，活化菌株。

2)接种细菌：对于金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌，取对数生长的该目标菌株加入6孔板中，然后加入不同浓度的坎格列净，使其终浓度分别为：0mg/mL、0.015mg/mL、0.03mg/mL、0.06mg/mL、0.12mg/mL，37℃、恒温培养箱中培养12h。坎格列净用DMSO溶解，细菌生长的DMSO体积为0.5％。同时将不加DMSO的相同培养条件验证0.5％的DMSO对细菌的生长无影响。

对于乳酸杆菌，坎格列净终浓度分别为：0.12mg/mL、0.24mg/mL、0.48mg/mL、0.96mg/mL。由于乳酸杆菌属于厌氧菌，将其置于厌氧罐中再放入上述恒温培养箱中，其余步骤与金黄色葡萄球菌相同。实验结束，收集细菌培养液备用。

3、ATP检测方法

采用增强型ATP检测试剂盒检测乳酸杆菌ATP合成情况，具体步骤如下：

1)检测细菌样本收集：取15mL OD600＝1.0左右的乳酸杆菌悬浊液于4℃，10000rpm离心10min，收集细菌，用PBS重悬、离心三次，收集细菌重悬于15mL MRS培养基中。将不同药物浓度的坎格列净溶液(溶剂为DMSO)分别加入1mL上述重悬了细菌的MRS液态培养基中，使坎格列净终浓度分别为0mg/mL、0.12mg/mL、0.24mg/mL和0.48mg/mL。3次重复，设置空白对照，其中空白对照为等体积的DMSO。放入厌氧罐中，于37℃恒温培养3h，收集上述细菌悬浊液。

2)细菌浓度测定：于96孔板每孔加入上述细菌悬浊液200μL，使用酶标仪于600nm检测吸光度。

3)离心细菌悬浊液，弃上清，加入200微升裂解液裂解细胞。裂解后4℃、12000g离心5分钟，取上清，用于后续的测定。

4)加100微升ATP检测工作液到检测孔或检测管内。室温放置3-5分钟，在检测孔内分别加入20-100μL样品和稀释适当倍数的标准品，迅速用微量移液器混匀，至少间隔2秒后，用化学发光仪(luminometer)测定RLU值，重复三次。

5)根据标准样品浓度计算标准曲线，根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度。

4、葡萄糖检测方法

采用葡萄糖检测试剂盒检测培养基葡萄糖含量，具体步骤如下：

1)取200μL不同给药浓度下生长12h的乳酸杆菌悬浊液，4℃，10000rpm离心10min，收集上清。

2)空白管：取酶工作液2000μL，加入1.5mL的EP管中；

标准管：取酶工作液2000μL，加入1.5mL的EP管中；

测定管：取酶工作液2000μL，加入1.5mL的EP管中。

3)向步骤2中的空白管加入20μL双蒸水；

向步骤2中的标准管加入20μL 1.5mmol/L葡萄糖标准品；

向步骤2中的测定管加入20μL待测样品；

4)充分混匀，37℃孵育25min。

5)紫外可见光分光光度计，505nm，1cm光径石英比色皿，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

6)根据标准品浓度计算标准曲线，根据标准曲线计算出待测样品中葡萄糖含量。

5、乳酸检测方法

采用乳酸检测试剂盒检测培养基乳酸产量，具体步骤如下：

1)取200μL不同给药浓度下生长12h的乳酸杆菌悬浊液，4℃，10000rpm离心10min，收集上清，4℃备用。

2)空白管：2mL EP管中加入0.01mL双蒸水；

标准管：2mL EP管中加入0.01mL 3mmol/L乳酸标准品；

测定管：2mL EP管中加入0.01mL待测样品。

3)向步骤2的各管中，分别依次加入0.5mL酶工作液、0.1mL试剂三，混匀，37℃温育10min。

4)向步骤3各管中加入1mL试剂四，混匀。

5)紫外可见光分光光度计，530nm，1cm光径石英比色皿，双蒸水调零，测定各管OD值。

6)根据标准品浓度计算标准曲线，根据标准曲线计算出待测样品中乳酸含量。

三、实验结果

1、坎格列净对目标菌株生长的作用效果

将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乳酸杆菌和大肠杆菌分别在其相应的含有不同浓度坎格列净的固体和液体培养基中进行培养。

从固态涂板培养来看，坎格列净对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和乳酸杆菌的生长情况都有明显的抑制作用，金黄色葡萄球菌的IC50为0.2527mg/mL，绿脓杆菌的IC50为0.1020mg/mL，乳酸杆菌的IC50为0.9928mg/mL(图1-3)，而对大肠杆菌的生长没有明显的抑制作用(图4)。

从液态培养来看，坎格列净对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和乳酸杆菌的生长都有明显的抑制作用，同时也是对乳酸杆菌的有效浓度高于另外两种菌(图5)。液态培养与固态平板情况基本相符。

2、以乳酸杆菌为代表的坎格列净对其ATP生成、糖摄取、乳酸产量的影响

由于坎格列净对部分目标菌具有抑制作用，挑选乳酸杆菌进行进一步的研究。将不同浓度的坎格列净溶液加入乳酸杆菌培养体系中进行培养，培养后检测坎格列净对其ATP生成、糖摄取、乳酸产量的影响。

结果表明：随着坎格列净药物浓度的升高，培养基葡萄糖含量逐渐增多(图6(a))，即细菌糖摄取逐渐减少，同时乳酸产量逐渐减少(图6(b))，ATP合成也逐渐减少(图6(c))。说明坎格列净通过抑制细菌糖摄取和ATP合成的方式来抑制细菌的生长，从而发挥了抑菌的作用。

实施例2、小鼠体内抑菌模型建立制作及抑菌药效评价

一、实验材料

1、实验动物和食物：C57雄性小鼠(18g左右)(SPF级，许可证号：粤监证字，SCXK(粤)2013-0002)和SPF级食物均是广东省医学实验动物中心的产品。

2、化学试剂：

链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)是MedChemExpress的产品，货号为HY-13753。

PBS缓冲液：KH₂PO₄ 0.27g，Na₂HPO₄ 1.42g，NaCl 8g，KCl 0.2g，用1L水定容。

麻醉剂：10％乌拉坦注射液。

柠檬酸钠缓冲液：将2.10g柠檬酸加入双蒸水100ml配成柠檬酸母液，称为A液；将2.94g柠檬酸三钠加入双蒸水100ml配成柠檬酸钠母液，称为B液；将A、B液按1:1.32比例混合，调定溶液PH范围4.2-4.5。

STZ溶液：将链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)溶于0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液中，新鲜配制成浓度为10mg/mL的STZ溶液，注意避光。

二、实验方法

1、糖尿病模型建立：将实验组和对照组动物按体重均衡分组后，开始进行实验：

实验组：禁食24h后，每只C57小鼠皮下注射STZ溶液(溶剂为柠檬酸钠缓冲液)，注射剂量为100mg/kg(STZ质量/小鼠体重)，得到糖尿病模型小鼠；

对照组：禁食24h后，每只C57小鼠皮下注射等体积柠檬酸钠缓冲液，得到正常对照组小鼠。

2、造模5天后进行血糖检测(糖尿病模型组小鼠的血糖范围为15-25mmol/L，正常对照组小鼠的血糖范围为5-8mmol/L)，按照是否给药重新分为如下三组：

正常对照组Nor(2只)：每只正常小鼠皮下注射0.2mL PBS缓冲液。

糖尿病对照组DM(4只)：每只糖尿病模型小鼠皮下注射0.1mL对数生长期的金黄色葡萄球菌，同时每只在同一部位注射0.1mL的PBS缓冲液。

糖尿病+CAN给药组(4只)：每只糖尿病模型小鼠皮下注射0.1mL对数生长期的金黄色葡萄球菌，同时每只在同一部位注射0.1mL的0.06mg/mL的坎格列净混悬液(浓度选取依据液体培养的有效浓度，PBS缓冲液配制)。

给药处理24h后用游标卡尺量取感染部位长与宽，计算感染面积并拍照记录。给药处理48h后重复上述步骤，同时CAN组皮下注射0.1mL的0.06mg/mL的坎格列净混悬液，正常对照组和糖尿病模型组分别皮下注射等体积的PBS缓冲液，给药处理72h后量取感染部位长和宽，计算感染面积并拍照记录。

三、实验结果

结果表明：给予皮下注射坎格列净组(糖尿病+CAN给药组)小鼠的金黄色葡萄球菌感染面积与未皮下注射坎格列净的糖尿病对照组DM相比有显著下降，在注射坎格列净24h和再次注射坎格列净24h后，这些情况和体外细菌实验结果基本一致(图7)。图8为各组小鼠皮下感染金黄色葡萄球后局部肿大的图片，糖尿病+CAN给药组表现明显的抑制作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐在制备抑菌和/或抗菌的药物中的应用；

所述SGLT2抑制剂为坎格列净Canagliflozin；

所述菌为绿脓杆菌pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或乳酸杆菌Lactobacillus sp.。

2.SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐在制备抑制细菌生长的药物中的应用；

所述SGLT2抑制剂为坎格列净Canagliflozin；

所述细菌为绿脓杆菌pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或乳酸杆菌Lactobacillus sp.。

3.SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐在制备抑制细菌糖摄取和/或乳酸生成和/或ATP合成的药物中的应用；

所述SGLT2抑制剂为坎格列净Canagliflozin；

所述细菌为绿脓杆菌pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或乳酸杆菌Lactobacillus sp.。

4.SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗细菌感染所致疾病的药物中的应用；

所述SGLT2抑制剂为坎格列净Canagliflozin；

所述细菌为绿脓杆菌pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或乳酸杆菌Lactobacillus sp.。

5.一种抑制细菌生长的方法，包括用含有SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐的培养基培养细菌的步骤；所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法；

所述SGLT2抑制剂为坎格列净Canagliflozin；

所述细菌为绿脓杆菌pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或乳酸杆菌Lactobacillus sp.。

6.一种抑制细菌糖摄取和/或乳酸生成和/或ATP合成的方法，包括用含有SGLT2抑制剂或其药学上可接受的盐的培养基培养细菌的步骤；所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法；

所述SGLT2抑制剂为坎格列净Canagliflozin；

所述细菌为绿脓杆菌pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或乳酸杆菌Lactobacillus sp.。

Images