CN111467391B - 香叶基黄酮a在制备促进伤口愈合的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及香叶基黄酮A在制备促进伤口愈合的药物中的用途。具体地，本发明涉及香叶基黄酮A在制备促进Ⅱ型糖尿病伤口愈合的药物中的用途。香叶基黄酮A能够有效促进伤口愈合，具有制备用于促进伤口愈合特别是防治糖尿病足的药物的潜力。

Description

香叶基黄酮A在制备促进伤口愈合的药物中的用途
技术领域
本发明属于医药领域，涉及香叶基黄酮A在制备促进伤口愈合的药物中的用途。具体地，本发明涉及香叶基黄酮A在制备促进Ⅱ型糖尿病伤口愈合的药物中的用途。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为明显症状的代谢性疾病，常分为I型、II型和妊娠糖尿病等[1]。I型糖尿病原名胰岛素依赖性糖尿病[2]，在儿童和青少年中发病率较高，也可于各种年龄发生。起病比较急剧，体内胰岛素绝对不足，容易发生酮症酸中毒，必须用胰岛素才能治疗，否则将危及生命。II型糖尿病原名叫成人发病型糖尿病[3]，多在35－40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。II型糖尿病患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果较差，即发生了胰岛素抵抗。
糖尿病常伴有并发症，例如糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病周围神经病变等。其中，糖尿病引起的伤口不易愈合着实困扰着糖尿病患者，严重影响他们的正常生活。糖尿病引起的伤口[4]一般可分为两类，第一是无溃疡性伤口，第二是溃疡性伤口，例如糖尿病足。这两类伤口均不易愈合。糖尿病患者因为长期处于持续高血糖状态，会发生一系列内分泌代谢紊乱，从而导致免疫力下降，再加上存在下肢血管和神经病变，导致足的感觉缺失或不敏感，使其脚部更容易受外伤。一般健康人群的皮肤伤口一般在3－7天左右就基本恢复了，大多数只需要简单消毒，包扎即可；烧伤烫伤类伤口需要一些提脓拔毒、去腐生肌的药膏来加速伤口愈合。但是，由于糖尿病患者的伤口需要区别于常人的精细清创及用药，常出现因处理不当导致的感染，使得伤口反复且更难以愈合，且目前尚未有特效药。
目前用于治疗糖尿病足的策略除了降糖，清创预防感染以外，多采用直接将药物外敷于患处的办法，例如活血舒筋膏，烂脚膏以及一些烧伤烫伤类药物，但也仅是略能缓解症状，无法根治。皮肤溃烂处常有革兰阳性球菌、阴性杆菌和厌氧菌等多种感染易同时存在，选用广谱抗生素，同时辅以甲硝唑抗厌氧菌。应用时间长，且长期使用抗生素会有抗药或耐药性。对于糖尿病足或者皮肤溃烂患者而言，非常需要的不是抗生素，而是具有超强的提脓拔毒、去腐生肌功效的特效药，且能够改善患处的内环境，为患处的再生长提供良好环境。一直以来，国内外人士从未停止寻找这种药物的脚步，但是收获甚微。
香叶基黄酮A(Cannflavin A)是从大麻中分离出的一种黄酮类化合物，其结构式[5]如下面的式A所示。香叶基黄酮A具有非成瘾性。目前对于香叶基黄酮A的药理作用研究甚少，有文献报道香叶基黄酮A参与微生物代谢，且具有抗菌、抗炎等性质[6]。
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糖尿病人本身机体防护能力被削弱，神经敏感性较低，使得其容易受外伤，且难以恢复，因此迫切需要开发新的能够有效治疗外伤的药物。
发明内容
本研究通过构建II型糖尿病的皮肤伤口感染模型，探究香叶基黄酮A的功效，发现连续给药组小鼠伤口愈合情况较好，明显优于对照的大豆异黄酮和槲皮素，且接近正常对照组恢复情况，从而发现香叶基黄酮A能够有效促进伤口愈合，特别是能够应用于糖尿病足的防治。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及选自如下的(1)－(2)中的任一项在制备促进伤口愈合、治疗或预防糖尿病足或者促进成纤维细胞增殖的药物中的用途：
(1)香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯；
(2)药物组合物，其包含有效量的第(1)项，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的用途，其中，所述伤口为无溃疡性伤口或溃疡性伤口；优选地，所述伤口为糖尿病患者(I型或II型糖尿病患者)的伤口例如糖尿病足。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的用途，其中，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞，例如人成纤维细胞或者NIH-3T3细胞。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的用途，其中，第(3)项中，所述药物组合物还包含有效量的选自下列成分中的一种或多种：
具有提脓拔毒功效或去腐生肌功效的成分，以及抑制细菌或真菌的成分。
香叶基黄酮A的药学上可接受的盐，包括但不限于：有机铵盐、碱金属盐(钠盐、钾盐)、碱土金属盐(镁盐、锶盐、钙盐)等。
在本发明的一些实施方式中，香叶基黄酮A的药学上可接受的盐可以为香叶基黄酮A(CBD)与氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化锌、氢氧化钡、氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苯甲基苯乙胺、N-甲基葡糖胺哌嗪、三(羟基甲基)-氨基甲烷等形成的盐。
在本发明的一些实施方式中，香叶基黄酮A药学上可接受的酯可以为香叶基黄酮A与一个C0-C6烷基羧酸形成的单酯，也可以为香叶基黄酮A与两个相同或不同的C0-C6烷基羧酸形成的二酯，所述的C0-C6烷基羧酸可以是直链烷基羧酸、支链烷基羧酸或环烷基羧酸，例如HCOOH、CH3COOH、CH3CH2COOH、CH3(CH2)2COOH、CH3(CH2)3COOH、CH3(CH2)4COOH、(CH3)2CHCOOH、(CH3)3CCOOH、(CH3)2CHCH2COOH、(CH3)2CH(CH2)2COOH、(CH3)2CH(CH3)CHCOOH、(CH3)3CCH2COOH、CH3CH2(CH3)2CCOOH、环丙烷羧酸、环丁烷羧酸、环戊烷羧酸。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯，以及一种或多种药学上可接受的辅料，并且所述药物组合物还包含有效量的选自下列成分中的一种或多种：
具有提脓拔毒功效或去腐生肌功效的成分，以及抑制细菌或真菌的成分。
所述药物组合物的制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。所述的口服剂型可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
本发明的再一方面涉及一种组合药物产品，其包含独立包装的第一产品和第二产品，
其中，
所述第一产品选自如下的(1)－(2)中的任意一种：
(1)香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯；
(2)药物组合物，其包含有效量的第(1)项，以及一种或多种药学上可接受的辅料；
所述第二产品选自如下的一种或者多种：
具有提脓拔毒或去腐生肌功效的药物例如烂脚膏，以及抑制细菌或真菌的药物；
可选地，所述组合药物产品还包含说明书。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的组合药物产品，其中，所述抑制细菌或真菌的药物为选自磺胺银粉、红霉素软膏、紫药水和德维尔医用杀菌液体敷料中的一种或多种。
本发明的再一方面涉及一种在体外或在体内的促进成纤维细胞增殖的方法，包括施加给成纤维细胞以有效量的香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯的步骤；
优选地，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞，例如人成纤维细胞或者NIH-3T3细胞。在本发明的一个实施方案中，所述在体外的方法是非治疗目的的。
本发明的再一方面涉及一种促进伤口愈合、治疗或预防糖尿病足或者促进成纤维细胞增殖的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的涉及选自如下的(1)－(2)中的任一项的步骤：
(1)香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯；
(2)药物组合物，其包含有效量的第(1)项，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的方法，其中，所述伤口为无溃疡性伤口或溃疡性伤口；优选地，所述伤口为糖尿病患者的伤口例如糖尿病足。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的方法，其中，所述药物组合物还包含有效量的选自下列成分中的一种或多种：
具有提脓拔毒功效或去腐生肌功效的成分，以及抑制细菌或真菌的成分。
需要指出的是，活性成分香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯的剂量介于0.1－750mg/kg体重/天，更优选为7.5mg/kg－750mg/kg体重/天、50mg/kg－500mg/kg体重/天、50mg/kg－200mg/kg体重/天、75mg/kg－500mg/kg体重/天或者75mg/kg－200mg/kg体重/天，进一步优选为50mg/kg－150mg/kg体重/天，特别优选为75mg/kg－150mg/kg体重/天。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的方法，其中，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞，例如人成纤维细胞或者NIH-3T3细胞。
本发明中：
术语“溃疡性伤口”是指因感染、循环障碍、肿瘤坏死及外伤等因素导致真皮或皮下组织的局限性缺损。例如，久治不愈，使生长的肉芽组织老化，创面停止缩小，可形成难治性溃疡。溃疡为皮肤或粘膜深层真皮或皮下组织的限局性缺损，其形态、大小及深浅可因病因和病情轻重而异。溃疡面常有浆液、脓液、血液或坏死组织。在本发明的一个实施方案中，所述溃疡性伤口为糖尿病足。
术语“无溃疡性伤口”或“非溃疡性伤口”是指普通的皮肤和软组织的损伤。只要伤口处理正确，不发生感染，“无溃疡性伤口”或“非溃疡性伤口”能够较快愈合。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
本发明中，如果没有特别说明，所述第一产品、第二产品仅仅是为了指代上的区分或者为了描述清楚，并不具有次序的含义。
发明的有益效果
香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯能够有效地促进伤口愈合，具有防治糖尿病足的潜力。
附图说明
图1A：造糖尿病模型小鼠空腹下初始血糖。其中control表示对照组，STZ表示实验组(II型糖尿病模型小鼠)。
图1B：造糖尿病模型后小鼠空腹血糖。其中control表示对照组，STZ表示实验组(II型糖尿病模型小鼠)。
图1C：造糖尿病模型前小鼠空腹下小鼠体重。其中control表示对照组，STZ表示实验组(II型糖尿病模型小鼠)。
图1D：造糖尿病模型后小鼠空腹体重。其中control表示对照组，STZ表示实验组(II型糖尿病模型小鼠)。
图2A-1：正常对照组第0天小鼠伤口愈合情况。
图2A-2：正常对照组第4天小鼠伤口愈合情况。
图2A-3：正常对照组第7天小鼠伤口愈合情况。
图2B-1：凡士林组给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图2B-2：凡士林组给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图2B-3：凡士林组给药第7天小鼠伤口愈合情况。
图2C-1：A药组给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图2C-2：A药组给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图2C-3：A药组给药第7天小鼠伤口愈合情况。
图2D-1：B药组给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图2D-2：B药组给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图2D-3：B药组给药第7天小鼠伤口愈合情况。
图2E-1：Cannflavin A组给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图2E-2：Cannflavin A组给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图2E-3：Cannflavin A组给药第7天小鼠伤口愈合情况。
以上图2A-1至图2E-3，每组均选择一只代表性小鼠，展示在第0、4、7天的伤口愈合情况。
图3：给药第0天、4天、7天各组小鼠伤口愈合度。
图4A：对照组菌落生长情况。
图4B：CannflavinA组菌落生长情况。其中，加入的Cannflavin A存在部分析出，终浓度参考范围约为0.05-0.1mg/ml。
图5A：正常皮肤伤口组织HE染色结果。
图5B：感染金黄色葡萄球菌后的皮肤伤口组织HE染色结果。其中箭头指示位置为存在炎性细胞浸润的位置。
图6A-1：正常对照组第0天小鼠伤口愈合情况。
图6A-2：正常对照组第4天小鼠伤口愈合情况。
图6A-3：正常对照组第7天小鼠伤口愈合情况。
图6B-1：凡士林组给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图6B-2：凡士林组给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图6B-3：凡士林组给药第7天小鼠伤口愈合情况。
图6C-1：实验组1给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图6C-2：实验组1给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图6C-3：实验组1给药第7天小鼠伤口愈合情况。
图6D-1：实验组2给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图6D-2：实验组2给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图6D-3：实验组2给药第7天小鼠伤口愈合情况。
图6E-1：实验组3给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图6E-2：实验组3给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图6E-3：实验组3给药第7天小鼠伤口愈合情况。
以上图6A-1至图6E-3，每组均选择一只代表性小鼠，展示在第0、4、7天的伤口愈合情况。
图7：给药第0天、4天、7天各组小鼠伤口愈合度。
备注：Lesion size是指伤口的大小，把第一天构建伤口作为100％，由于在后面愈合过程，小鼠存在自由活动的情况，伤口会有裂开之类的加重情况，伤口愈合度大于100％属于正常。
图8A-1：正常对照组第0天小鼠伤口愈合情况。
图8A-2：正常对照组第2天小鼠伤口愈合情况。
图8A-3：正常对照组第4天小鼠伤口愈合情况。
图8A-4：正常对照组第8天小鼠伤口愈合情况。
图8A-5：正常对照组第10天小鼠伤口愈合情况。
图8A-6：正常对照组第14天小鼠伤口愈合情况。
图8B-1：Ⅱ型糖尿病凡士林对照组给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图8B-2：Ⅱ型糖尿病凡士林对照组给药第2天小鼠伤口愈合情况。
图8B-3：Ⅱ型糖尿病凡士林对照组给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图8B-4：Ⅱ型糖尿病凡士林对照组给药第8天小鼠伤口愈合情况。
图8B-5：Ⅱ型糖尿病凡士林对照组给药第10天小鼠伤口愈合情况。
图8B-6：Ⅱ型糖尿病凡士林对照组给药第14天小鼠伤口愈合情况。
图8C-1：Ⅱ型糖尿病凡士林+A药组给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图8C-2：Ⅱ型糖尿病凡士林+A药组给药第2天小鼠伤口愈合情况。
图8C-3：Ⅱ型糖尿病凡士林+A药组给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图8C-4：Ⅱ型糖尿病凡士林+A药组给药第8天小鼠伤口愈合情况。
图8C-5：Ⅱ型糖尿病凡士林+A药组给药第10天小鼠伤口愈合情况。
图8C-6：Ⅱ型糖尿病凡士林+A药组给药第14天小鼠伤口愈合情况。
图8D-1：Ⅱ型糖尿病凡士林+B药组给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图8D-2：Ⅱ型糖尿病凡士林+B药组给药第2天小鼠伤口愈合情况。
图8D-3：Ⅱ型糖尿病凡士林+B药组给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图8D-4：Ⅱ型糖尿病凡士林+B药组给药第8天小鼠伤口愈合情况。
图8D-5：Ⅱ型糖尿病凡士林+B药组给药第10天小鼠伤口愈合情况。
图8D-6：Ⅱ型糖尿病凡士林+B药组给药第14天小鼠伤口愈合情况。
图8E-1：Ⅱ型糖尿病凡士林+Cannflavin A组给药第0天小鼠伤口愈合情况。
图8E-2：Ⅱ型糖尿病凡士林+Cannflavin A组给药第2天小鼠伤口愈合情况。
图8E-3：Ⅱ型糖尿病凡士林+Cannflavin A组给药第4天小鼠伤口愈合情况。
图8E-4：Ⅱ型糖尿病凡士林+Cannflavin A组给药第8天小鼠伤口愈合情况。
图8E-5：Ⅱ型糖尿病凡士林+Cannflavin A组给药第10天小鼠伤口愈合情况。
图8E-6：Ⅱ型糖尿病凡士林+Cannflavin A组给药第14天小鼠伤口愈合情况。
以上图8A-1至图8E-6，每组均选择一只代表性小鼠，展示在第0、2、4、8、10、14天的伤口愈合情况。
图9：给药第0－14天，各组小鼠伤口愈合度。
备注：Lesion size是指伤口的大小，把第一天构建伤口作为100％，由于在后面愈合过程，小鼠存在自由活动的情况，伤口会有裂开之类的加重情况，伤口愈合度大于100％属于正常。
图10：不同浓度CannflavinA处理后的细胞增殖曲线。*表示p<0.1，**表示p<0.01。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：II型糖尿病模型的构建
采用低剂量链脲佐菌素和高脂料联合使用构建II型糖尿病模型的方法[7]是目前较为成熟的方法，且具有耗时短、造模成功率高、重复性好、死亡率低等优点。
1.实验动物及分组
6－8周雄鼠(C57BL/6，购自维通利华)25只，体重均20g以上。
对照组(control)：5只，腹腔注射0.1mmol/L，PH4.2的柠檬酸缓冲液。
实验组(STZ)：50只，腹腔注射1％链脲佐菌素；随机取25只统计。
2.模型制作方法
造模前分别检测小鼠空腹下初始血糖和小鼠体重，分别如图1A、图1C所示。
空腹下腹腔注射1％链脲佐菌素(50mg/kg)，链脲佐菌素由0.1mmol/L，pH 4.2的柠檬酸缓冲液配制而成，现用现配，注射1小时后给高脂料，并密切注意小鼠状态，根据小鼠状态适时补充胰岛素或葡萄糖(一般血糖过低时会出现萎靡，瘫软，严重的呼吸微弱甚至死亡，若出现此类情况应及时补充葡萄糖；血糖过高时，小鼠会出现尿频，眩晕，可通过检测血糖确定，严重者应适当补充胰岛素)，连续5天。
造模第6天，检测小鼠空腹血糖，未达199.8mg/dl的小鼠补一次链脲佐菌素，再检测空腹血糖。当小鼠血糖稳定在199.8mg/dl以上即为造模成功。
3.实验结果
分别如图1B、图1D所示。
结果显示，Ⅱ型糖尿病模型构诱导后的血糖和体重持续下降，血糖大于199.8mg/dl，且小鼠具有多饮水多排泄等糖尿病症状，造模成功。
实施例2：皮肤伤口愈合实验
1.实验方法
(1)皮肤伤口模型的构建
取C57野生成年雄鼠(C57BL/6，购自维通利华公司)，麻醉后背部脱毛，用6mm活检打孔器构建全皮层创口。注意消毒，预防感染。
(2)分组及给药方式
正常对照组：5只，不给药。
凡士林组：凡士林(医用凡士林，购自天津市致远化学试剂有限公司，下同)，5mg凡士林/只，5只。
A药组：10mg/只，10只(黄酮对照，A药为大豆异黄酮)。
B药组：10mg/只，10只(黄酮对照，B药为槲皮素)。
Cannflavin A组：Cannflavin A，10mg/只，10只。
后面4组的给药方式均为涂抹于伤口处，每天给药1次。由于凡士林是常用的软膏基质[8]，后面3组分别将A药、B药或Cannflavin A与5mg凡士林混合均匀后给药。
(3)检测方法
拍照记录给药第0天、4天、7天小鼠伤口愈合情况，并以1cm2作标尺，用PhotoShop软件进行伤口面积愈合度的计算。具体步骤如下：
对于伤口的愈合情况记录都是通过直接的拍照来完成的，本发明人在照片中照一个1cm2的标尺作为参考，然后用PhopoShop软件勾画出伤口面积，再用伤口面积除以这个标尺的面积，得到伤口相对面积。
愈合度＝S/S0×100％
其中，S表示现有伤口相对面积，S0表示初始伤口相对面积。
用1减去上述的愈合度，可获知愈合了多少。
2.实验结果
伤口愈合情况如图2A-1至2E-3所示。
伤口愈合度如图3所示。
结果显示：
(1)对照组、凡士林组、A药组、B药组、Cannflavin A组恢复状况均良好，伤口4天左右基本愈合，7天可完全愈合。
(2)在促进无细菌感染的创口的愈合度上，Cannflavin A与凡士林、A药、B药和对照没有显著性差异。不拘于理论的限制，对于正常健康的小鼠，在没有感染的情况下，机体的自我修复能力很强，较小的皮肤伤口即使不给药也会自行愈合，药物的效果难以得到充分体现。
实施例3：金黄色葡萄球菌感染的皮肤创口愈合实验(1)
糖尿病病人伤口不仅难愈合还容易感染，金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。本研究采用金黄色葡萄球菌构建糖尿病小鼠皮肤感染模型[8]，旨在更贴近人类伤口不易愈合的病症，使得研究更有意义。
1.实验方法
(1)模型制作方法
取作为对照的正常小鼠和按照实施例1方法构建的Ⅱ型糖尿病小鼠，麻醉且背部脱毛后，用6mm活检打孔器构建全皮层创口。接种1.5x106CFU/ml金黄色葡萄球菌。
(2)金黄色葡萄球菌制备方法
接种金黄色葡萄球菌1:100于LB液体培养基，37℃，220rpm，培养至指数生长期，检测OD 600，将菌液稀释至10-5、10-6倍，涂于固体无抗LB培养板上，37℃过夜培养，计算菌落单位数。
(3)分组及给药方式
正常对照组：不给药，5只。
凡士林组：凡士林，5mg凡士林/只，5只。
实验组1：Cannflavin A，0.15mg/只，5只。
实验组2：Cannflavin A，1.5mg/只，5只。
实验组3：Cannflavin A，15mg/只，5只。
上述5组均按照前述步骤(1)接种金黄色葡萄球菌。
后面4组的给药方式均为涂抹于伤口处，每天给药1次。后面3组分别将不同剂量的Cannflavin A与作为软膏基质的5mg凡士林混合均匀后给药。
(4)检测方法
拍照记录给药后小鼠伤口愈合情况，并以1cm2作标尺，用PhotoShop软件进行伤口面积愈合度的计算。具体方法同实施例2。
2.实验结果
(1)Cannflavin A抑制金黄葡萄球菌结果
如图4A、图4B所示。
OD600＝0.85时，菌落密度为1.2*109CFU/ml，Cannflavin A具有明显的抑制金黄葡萄球菌的作用。
(2)接种金黄色葡萄球菌后1天，伤口全皮层石蜡切片HE染色结果
如图5A、图5B所示。其中：
图5A不接种金黄色葡萄球菌，Ⅱ型糖尿病小鼠皮肤伤口组织结构完整；
图5B接种金黄色葡萄球菌后，Ⅱ型糖尿病小鼠皮肤伤口组织结构被严重破坏，存在炎性细胞浸润。
接种金黄色葡萄球菌后，皮肤组织结构被严重破坏，其中表皮层棘层较厚，角化层破碎，真皮层存在炎性细胞浸润(箭头指示位置)，同时毛囊结构被破坏。
(3)各组伤口愈合情况如图6A-1至6E-3所示。伤口愈合度如图7所示。
结果显示：Cannflavin A给药剂量为0.15mg/只时，无明显效果，与凡士林组无明显差异；给药剂量为1.5mg/只时，具有明显效果；给药剂量为15mg/只时，也具有明显效果，且与剂量为1.5mg/只时无显著差异。
实施例4：金黄色葡萄球菌感染的皮肤创口愈合实验(2)
1.实验方法
实验方法与实施例3相同，除了分组及给药如下：
正常对照组：不给药，5只。
Ⅱ型糖尿病凡士林对照组：凡士林，5mg凡士林/只，5只。
Ⅱ型糖尿病凡士林+A药组：10mg/只，10只(黄酮对照，A药为大豆异黄酮)。
Ⅱ型糖尿病凡士林+B药组：10mg/只，10只(黄酮对照，B药为槲皮素)。
Ⅱ型糖尿病凡士林+Cannflavin A组：1.5mg/只，10只。
上述5组均按照前述步骤(1)接种金黄色葡萄球菌。
后面4组的给药方式均为涂抹于伤口处，每天给药1次。后面3组分别将A药、B药或Cannflavin A与作为软膏基质的5mg凡士林混合均匀后给药。
2.实验结果
各组伤口愈合情况如图8A-1至图8E-6所示。
伤口愈合度如图9所示。
结果显示，Cannflavin A组愈合程度较糖尿病凡士林对照组以及A药、B药组具明显优势，且恢复状况接近正常对照组。
不拘于理论的限制，A药和B药都是黄酮类化合物，具有抑菌共性，但抑菌只能缓解症状，并不能帮助伤口愈合，Cannflavin A加速伤口愈合的能力应该是它特有的。
另外，一般情况下，小鼠无菌伤口基本不需要任何药物辅助，只要清理和消毒到位，基本不会恶化，是可以痊愈的，但是老鼠处于SPF级，人们生活环境不可能是SPF级，所以无法避免细菌感染，对老鼠接种金黄色葡萄球菌能够更好地模仿和接近人类患者的真实情况。
实施例5：CannflavinA促进皮肤伤口愈合的细胞实验
皮肤创伤修复需要经历几个不同时期，包括止血期、炎症期、增殖期以及重塑期，其中增殖阶段涉及成纤维细胞的增殖，以及在重塑阶段，成纤维细胞被巨噬细胞激活并分化为肌成纤维细胞，参与长时间的重塑过程。本发明人还研究了CannflavinA对于成纤维细胞增殖能力的影响，进一步探索CannflavinA促进伤口愈合的可能机理。
1.实验材料及仪器
实验细胞系--小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH-3T3)--购自国家实验细胞资源共享平台协和医院中心实验室
胎牛血清(FBS)--美国GIBCO公司
DMEM基础培养基--美国GIBCO公司
胰蛋白酶--美国Sigma-Aldrich公司
EDTA--美国Sigma-Aldrich公司
DMSO--美国Sigma-Aldrich公司
MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒-美国MP公司
细胞冻存管--康宁
台式离心机--美国eppendorf公司
CO2培养箱--日本三洋公司
电热恒温水浴锅--上海一恒科技有限公司
多功能微孔板检测仪—美国BIOTEK公司
2.实验方法
(1)细胞培养
细胞的复苏与培养：将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移入15ml离心管中，加入10ml预热的10％FBS的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，800rpm离心5min，弃上清液。在细胞沉淀中加入10ml的10％FBS的DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5％CO2的37度细胞培养箱中培养。次日更换新鲜培养基继续培养。
细胞传代：细胞密度达到80％－90％时，去培养基，5ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25％胰蛋白酶，放入细胞培养箱培育1－2min。显微镜下观察细胞状态,待细胞变圆、细胞间隙变大时将消化液吸掉,加入10％FBS的DMEM完全培养基终止消化,用移液器反复吹打混匀,根据实验需求按一定比例传代。
0.25％胰蛋白酶的配制：称取0.25g胰酶和0.03g EDTA溶于100ml PBS中,混匀,0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
细胞冻存：细胞密度达到80％－90％时，去培养基，5ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25％胰蛋白酶，放入细胞培养箱1－2min。加入5mlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管，800rpm离心5min，弃上清液。细胞沉淀用冻存液悬起混匀,分装到冻存管中,1ml/管,做好标记后用棉花包裹依次经4℃20分钟、-20℃2小时,-80℃过夜,最后放入液氮中长期保存。其中，冻存液的配制：70％的DMEM基础培养基+20％FBS+10％DMSO，其中DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
(2)采用四唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖。
MTT溶液的配制：称取0.5gMTT于100mlPBS中,配制成5mg/ml的MTT溶液。配制后即可使用，或直接-20℃避光保存，也可以根据需要适当分装后-20℃避光保存。
按照实验需要，96孔板每孔加入100微升约2000个细胞，分别设置溶剂对照组(即mock组，完全培养基，不加细胞)、0μM CannflavinA、5μM CannflavinA、10μM CannflavinA、20μM CannflavinA的实验组，8个重复孔。于含5％CO2的37℃细胞培养箱中培养48小时。
每孔加入20微升MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4小时。
每孔加入150微升DMSO，在细胞培养箱内再继续孵育，可以适当置于摇床助溶。直至在普通光学显微镜下观察发现蓝色结晶全部溶解。于多功能微孔板检测仪检测OD490nm，OD 490nm值越大反应出细胞增殖力越强。
3.实验结果
如图10所示。
结果显示：
完全培养基未添加CannflavinA的溶剂对照组的细胞增殖力明显低于添加5μM组和10μM组；
当CannflavinA达到20μM时与5μM时促进NIH-3T3增殖能力的作用基本相同，推测且10μM可作为最适浓度。
由此，本发明人推测CannflavinA在小鼠皮肤伤口恢复的促进作用与其促进成纤维细胞增殖相关。
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6.Ibrahim,A.K.,et al.,Microbial metabolism of cannflavin A and Bisolated from Cannabis sativa.Phytochemistry,2010.71(8-9):p.1014-9.
7.Ibrahim,A.K.,et al.,Microbial metabolism of cannflavin A and Bisolated from Cannabis sativa.Phytochemistry,2010.71(8):p.1014-1019.
8.de Moura,F.B.R.,et al.,Pro-Fibrogenic and Anti-InflammatoryPotential of a Polyphenol-Enriched Fraction from Annona crassiflora in SkinRepair.Planta Med,2018.
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (8)

1.选自如下的(1)－(2)中的任一项在制备促进伤口愈合的药物中的用途：
(1)香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯；
(2)药物组合物，其包含有效量的第(1)项，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述伤口为无溃疡性伤口或溃疡性伤口。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述伤口为糖尿病患者的伤口。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，第(2)项中，所述药物组合物还包含有效量的选自下列成分中的一种或多种：
具有提脓拔毒功效或去腐生肌功效的成分，以及抑制细菌或真菌的成分。
5.选自如下的(1)－(2)中的任一项在制备促进成纤维细胞增殖的药物中的用途：
(1)香叶基黄酮A或其药学上可接受的盐或酯；
(2)药物组合物，其包含有效量的第(1)项，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述哺乳动物成纤维细胞为人成纤维细胞或NIH-3T3细胞。
8.根据权利要求5所述的用途，其中，第(2)项中，所述药物组合物还包含有效量的选自下列成分中的一种或多种：
具有提脓拔毒功效或去腐生肌功效的成分，以及抑制细菌或真菌的成分。
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