CN109908126A - 半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药化学技术领域,具体是半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜的药物、医疗器械或医用材料中的应用,所述的真菌是念珠菌、隐球菌、曲霉菌或马拉色菌,所述的抗真菌生物被膜为抑制真菌生物被膜的生长增殖/形成或用于抑制/破坏已形成的真菌生物被膜。本发明还涉及利用半胱氨酸在体外非治疗性抑制真菌生物被膜的方法。本发明所用的半胱氨酸能有效地抑制真菌生物被膜生长,应用于临床上抗真菌生物被膜。
Description
技术领域
本发明涉及医药化学技术领域,具体地说,是半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜药物、医疗器械或医用材料中的应用。
背景技术
半胱氨酸(cysteine)是生物体内一种常见的含硫氨基酸,其结构式如式(I)所示,分子式C3H7NO2S,分子量121.158。近年来,半胱氨酸在临床上的应用日益受到重视,可以有效地治疗放射性损害以及某些皮肤病。另外,由于半胱氨酸具有抗氧化作用,因此具有抗衰老的功效。
生物被膜是微生物与无活力物体或活组织表面接触而形成的一种聚集群体,由其自身产生的细胞外基质包裹着活菌细胞形成的微生态,具有高度耐药性的特异表型,是相对于单个分散游离状态真菌细胞而言的另一种独特的微生物生存方式。从患者体内取出的导管或生物装置表面可见真菌以生物被膜的形式黏附生长。对体外建立的真菌形成生物被膜的模型进行抗真菌药物敏感性实验时发现,菌株对常用药物均表现为高度耐药。因此,以生物被膜形式生长并表现出高度耐药性的体内导管或生物装置相关性真菌感染给临床治疗带来很大难度,迫使临床医师在进行抗真菌治疗的同时必须从患者体内取出导管或生物装置,从而影响到患者的预后。然而,现有技术中,具有抗真菌活性的药物往往不具备抗生物被膜活性,导致其被用于以生物被膜形式生长的真菌治疗时不能得到预期的效果。
发明内容
本发明人经过长期而深入的研究,意外地发现,半胱氨酸具有很好的抗真菌生物被膜活性,因此可以非常有效地用于预防真菌形成生物被膜,或抑制和破坏已形成的生物被膜。基于上述发现,发明人完成了本发明。
本发明的目的在于提供半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜药物、医疗器械或医用材料中的新用途。本发明的另一目的在于提供一种抗真菌生物被膜药物。本发明的第三个目的在于提供一种体外非治疗性抑制真菌生物被膜的方法。
为实现上述目的,本发明采取以下技术方案:
本发明的第一方面,提供半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜药物中的应用。
进一步的,所述的半胱氨酸为具有下式(I)结构的化合物:
进一步的,所述的药物还可以包括其他具有抗真菌或抗真菌生物被膜活性的药物组分。
进一步的,所述的药物为用于抑制真菌生物被膜的生长增殖(形成),或用于抑制(或破坏)已形成的真菌生物被膜的药物。
进一步的,所述的真菌为念珠菌、隐球菌、曲霉菌、马拉色菌中的一种或两种以上组合。
进一步的,所述的抗真菌生物被膜药物为涂抹剂、乳剂、膏剂、气雾剂、膜剂。
本发明所用的半胱氨酸能有效地抑制真菌生物被膜生长,最低有效施用浓度为5mg/L,能应用于临床上抗真菌生物被膜。
进一步的,当所述的抗真菌生物被膜药物为抗念珠菌生物被膜药物时,半胱氨酸在所述的抗念珠菌生物被膜药物中的有效浓度为≥5毫克/升或毫克/千克。
更进一步的,当所述的念珠菌生物被膜为成熟生物被膜时,半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥10毫克/升或毫克/千克。
进一步的,当所述的抗真菌生物被膜药物为抗新型隐球菌生物被膜药物时,半胱氨酸在所述的抗新型隐球菌生物被膜药物中的有效浓度为≥20毫克/升或毫克/千克。
更进一步的,当所述的隐球菌生物被膜为成熟生物被膜时,半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥40毫克/升或毫克/千克。
进一步的,当所述的抗真菌生物被膜药物为抗曲霉菌生物被膜药物时,半胱氨酸在所述的抗曲霉菌生物被膜药物中的有效浓度为≥40毫克/升或毫克/千克。
更进一步的,当所述的曲霉菌生物被膜为成熟生物被膜时,半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥80克/升或毫克/千克。
进一步的,当所述的抗真菌生物被膜药物为抗马拉色菌生物被膜药物时,半胱氨酸在所述的抗马拉色菌生物被膜药物中的有效浓度为≥20毫克/升或毫克/千克。
更进一步的,当所述的马拉色菌生物被膜为成熟生物被膜时,半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥40毫克/升或毫克/千克。
本发明的第二方面,提供半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜的医疗器械或医用材料中的应用。
进一步的,所述的医疗器械或医用材料包括:医疗导管(如输液管、导尿管)、输氧面罩、鼻氧管、钳、敷料、护创材料、可吸收性止血/防粘连材料、手术用品(如医用的钳、钩、或针)、植入物等。
进一步的,所述的医疗器械或医用材料的制备方法为:将包含灭菌有效量半胱氨酸的药物涂覆于医疗器械上或医用材料上,形成抗真菌生物被膜的医疗器械或医用材料。
进一步的,所述的灭菌有效量半胱氨酸的药物中半胱氨酸的最低有效浓度为5mg/L。
更进一步的,所述的医疗器械或医用材料的制备方法包括:(1)提供一医疗器械或医用材料;(2)将包含灭菌有效量半胱氨酸的药物涂覆于医疗器械或医用材料上,形成抗真菌生物被膜的医疗器械或医用材料。
进一步的,所述的抗真菌生物被膜的医疗器械或医用材料为抑制真菌生物被膜的生长增殖(形成)的医疗器械或医用材料,或抑制(或破坏)已形成的真菌生物被膜的医疗器械或医用材料。
本发明的第三方面,提供一种体外非治疗性抑制真菌生物被膜的方法,包括以下步骤:在需要抑制真菌生物被膜的场合,施用半胱氨酸,从而抑制真菌生物被膜。
本发明的第四方面,提供一种抗真菌生物被膜药物,所述的药物的活性成分为半胱氨酸。
进一步的,所述的药物还可以包括其他具有抗真菌或抗真菌生物被膜活性的药物组分。
进一步的,所述的药物为用于抑制真菌生物被膜的生长增殖(形成),或用于抑制(或破坏)已形成的真菌生物被膜的药物。
进一步的,所述的真菌为念珠菌、隐球菌、曲霉菌、马拉色菌中的一种或两种以上组合。
进一步的,所述药物为涂抹剂、乳剂、膏剂、气雾剂、膜剂。
进一步的,当所述的药物为抗念珠菌生物被膜药物时,半胱氨酸在所述的抗念珠菌生物被膜药物中的有效浓度为≥5毫克/升或毫克/千克。
更进一步的,当所述的念珠菌生物被膜为成熟生物被膜时,半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥10毫克/升或毫克/千克。
进一步的,当所述的药物为抗新型隐球菌生物被膜药物时,半胱氨酸在所述的抗新型隐球菌生物被膜药物中的有效浓度为≥20毫克/升或毫克/千克。
更进一步的,当所述的隐球菌生物被膜为成熟生物被膜时,半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥40毫克/升或毫克/千克。
进一步的,当所述的药物为抗曲霉菌生物被膜药物时,半胱氨酸在所述的抗曲霉菌生物被膜药物中的有效浓度为≥40毫克/升或毫克/千克。
更进一步的,当所述的曲霉菌生物被膜为成熟生物被膜时,半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥80克/升或毫克/千克。
进一步的,当所述的药物为抗马拉色菌生物被膜药物时,半胱氨酸在所述的抗马拉色菌生物被膜药物中的有效浓度为≥20毫克/升或毫克/千克。
更进一步的,当所述的马拉色菌生物被膜为成熟生物被膜时,半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥40毫克/升或毫克/千克。
菌株
本发明提供了一种半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜药物中的新用途。其中,所述的真菌可以是任何具有被膜的真菌,较佳的例子包括但并不限于:念珠菌、隐球菌、曲霉菌、马拉色菌等。
本发明的真菌可以位于生物体外,如需要灭菌的医疗器械内壁;也可以位于生物体内,其中,所述的生物包括但并不限于:人、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。
在本发明中,所用的真菌可以通过常规方法取得或培养,也可以通过市售途径得到,如从患有相应疾病的患者的体细胞或组织中分离,或从任何市售标准菌株的机构或公司,如ATCC购买得到。应理解,在本发明的实施例中所使用的菌株样本仅为示范性的例子,任何可形成生物被膜的真菌均可以用于测试本发明化合物的抗真菌生物被膜活性,而不受实施例范围的限制。
真菌生物被膜
生物被膜是微生物聚集群体,是微生物不可逆地与无活力物体或活组织表面接触,由自身产生的细胞外基质包裹着活菌细胞形成的微生态,其具有高度耐药性的特异表型,是相对于单个分散游离状态真菌细胞而言的另一种独特的微生物生存方式。
从患者体内取出的导管或生物装置表面,可观察到真菌以生物被膜的形式黏附生长。对体外建立的真菌形成生物被膜的模型进行抗真菌药物敏感性实验时发现,菌株对常用药物均表现为高度耐药。因此,以生物被膜形式生长并表现出高度耐药性的体内导管或生物装置相关性真菌感染给临床治疗带来很大难度,迫使临床医师在进行抗真菌治疗的同时必须从患者体内取出导管或生物装置,从而影响到患者的预后。通常,真菌生物被膜对一般抗真菌药物高度耐药,目前大多数有抗真菌活性的物质并不具有抗真菌生物被膜活性。
抗真菌生物被膜活性
本发明的半胱氨酸作用于真菌,可以有效地起到抑制真菌生物被膜的生长增殖的作用,或起到破坏已形成的真菌生物被膜的作用。
真菌在聚苯乙烯等材料表面形成生物被膜后,对多数抗真菌药耐药,具有抗酵母相真菌活性的中药单体化合物大多无抗真菌生物被膜活性。
经实验证明,半胱氨酸在体外具有显著的抗真菌生物被膜活性,不仅能抑制真菌生物被膜的粘附、生长增殖,而且对已形成真菌生物被膜具有抑制作用。
在本发明的实施例中:所述半胱氨酸在抗念珠菌生物被膜药物中的有效浓度为≥5毫克/升或毫克/千克;当所述念珠菌生物被膜为成熟生物被膜时,所述半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥10毫克/升或毫克/千克。
所述半胱氨酸在抗隐球菌生物被膜药物中的有效浓度为≥20毫克/升或毫克/千克;当所述隐球菌生物被膜为成熟生物被膜时,所述半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥40毫克/升或毫克/千克。
所述半胱氨酸在抗曲霉菌生物被膜药物中的有效浓度为≥40毫克/升或毫克/千克;当所述曲霉菌生物被膜为成熟生物被膜时,所述半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥80毫克/升或毫克/千克。
所述半胱氨酸在抗马拉色菌生物被膜药物中的有效浓度为≥20毫克/升或毫克/千克;当所述马拉色菌生物被膜为成熟生物被膜时,所述半胱氨酸在药物中的有效浓度为≥40毫克/升或毫克/千克。
应理解,在本发明的实施例中,仅写明了有效抑制真菌生物被膜的生长时,活性成分的最低浓度。结合本领域的公知常识可知,当抗真菌的活性药物组分浓度增大时,所述的抗真菌效果会有一定的改善。因此,任何本领域的技术人员在阅读了本说明书后,通过结合本领域的公知常识,均可以采用高于所述的最低浓度的剂量来抑制真菌生物被膜生长,这种改变同样落于本发明的公开范围内。
抗真菌生物被膜制品
本发明提供的抗真菌生物被膜活性化合物可以直接应用于生物体,也可用于制备药物或药物组合物,以及需要抑制真菌的医疗器械或医用材料。
所述的药物或药物组合物可以是任何剂型,如汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、膏药、茶剂、曲剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂,灸熨剂,膏剂、丹剂、微型胶囊、静脉乳剂、脂质体制剂、气雾剂、前体药制剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、软膏剂、橡胶硬膏、膜剂、海绵剂、离子透入剂、透皮吸收剂等;较佳地为涂抹剂,乳剂、膏剂、气雾剂、膜剂等剂型。
所述的药物或药物组合物可直接用于生物体,也可制成涂覆剂而应用于各种需要抑制真菌的医疗器械或医用材料中,如涂覆于医疗器械或医用材料上以抑制真菌的活性。所述的医疗器械或医用材料可以是任何需要抑制真菌的医疗器械或医用材料,如外科手术器械、眼科手术器械、耳鼻喉科手术器械、口腔科设备、器具及手术器械、矫形外科(骨科)手术器械、妇产科用、计划生育手术器械、注射穿刺器械、烧伤(整形)科手术器械、普通诊察器械、临床检验分析仪器、医用化验和基础设备器具、体外循环及血液处理设备、植入材料、手术室、急救室、诊疗室设备及器具、病房护理设备及器具、消毒和灭菌设备及器具、医用冷疗、低温、冷藏设备及器具、口腔科材料、医用卫生材料及敷料、医用缝合材料及粘合剂、医用高分子材料及制品、介入器材等。
在另一优选例中,所述的医疗器械或医用材料包括但并不限于:医疗导管(如输液管、导尿管)、输氧面罩、鼻氧管、钳、敷料、护创材料、可吸收性止血/防粘连材料、手术用品(如医用的钳、钩、或针)、植入物等。
本发明优点在于:
本发明提供了一种有效的破坏真菌被膜的方法,本发明所用的半胱氨酸能有效地抑制真菌被膜生长,或者抑制已成熟生物被膜,能应用于临床上抗真菌生物被膜。
附图说明
图1.半胱氨酸抗白念珠菌95392生物被膜形成作用。(A)半胱氨酸抗白念珠菌生物被膜的增殖作用。(B)半胱氨酸抗白念珠菌成熟生物被膜作用。其中,横坐标为半胱氨酸浓度(mg/L),纵坐标为生物被膜形成率(%)。*代表P<0.05,**代表P<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1:抗真菌生物被膜剂的制备
取4g PVA、0.7g山梨甲酸、0.5g甘油加10ml水混匀,浸润溶胀后,加热至90摄氏度使溶解,加入研成极微粉的半胱氨酸,加水20ml,搅拌均匀后,在45摄氏度保温静置,除去气泡。将玻璃板预热至相同温度后,涂膜至厚度约为0.15mm,在70摄氏度干燥,脱模。
实施例2:抗真菌生物被膜乳剂的制备
取蒸馏水8ml置烧杯中,加4g胶粉配成胶浆,将胶浆转移到乳钵中再分次加入半胱氨酸,边加边研至初乳形成,然后用少量蒸馏水将初乳分次转移至量杯中,搅拌下滴加尼泊金乙酯醇溶液,最后加蒸馏水至全量,搅匀即得。
实施例3:抗真菌生物被膜膏剂的制备
取原料药物磨成微粉,按一定比例分别加入油相、水相、乳化剂、防腐剂基质,加热水浴搅拌混合,冷却至室温后再次搅拌使半胱氨酸与基质完全混合均匀得膏剂。
实施例4:抗真菌生物被膜气雾剂的制备
将半胱氨酸与水、乙醇按一定比例配置成溶液,在室温下灌入容器内,关紧阀门,然后通过压机压入一定量的抛射剂,待抛射剂液化后过滤压灌入容器内。
实施例5:抗真菌生物被膜医疗器械止血钳的制备
取实施例1-4任一所述的药物均匀涂覆于止血钳表面,使其形成一层抗真菌生物被膜保护涂层。
实施例6:半胱氨酸单用对不同白念珠菌菌株生物被膜的作用
材料和方法
1、试药
半胱氨酸:购自Sigma公司。
XTT:购自Sigma公司。
甲萘醌(menadione):购自Sigma公司。
半胱氨酸用无菌水配成10g/L溶液,受试药物于-20℃保存。实验前,将药物贮存液取出置35℃温箱融化,充分混匀。
XTT用灭菌的PBS配成0.5mg/ml的饱和溶液,用0.22μm孔径的滤器滤过除菌,甲萘醌用100%丙酮配成10mM溶液,XTT、甲萘醌于-80℃保存。实验前,将药物贮存液取出置4℃冰箱、35℃温箱梯度融化,充分混匀。
2、菌株
白念珠菌(Candida albicans)由长海医院真菌室提供,分别采自长海医院不同科室临床样本,并经形态学和生化学鉴定。
3、培养液
RPMI 1640培养液:RPMI 1640(Gibco BRL)10g,NaHCO3 2.0g,吗啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonic acid,MOPS)34.5g,加三蒸水900ml溶解,1N NaOH调pH至7.0,定容至1000ml,滤过除菌,4℃保存。
沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA):蛋白胨10g,葡萄糖40g,琼脂18g,加去离子水900ml溶解,加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml,调整pH至7.0,定容至1000ml,高压灭菌后4℃保存。
YPD培养液:酵母浸膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,加三蒸水900ml溶解,定容至1000ml,高压灭菌后4℃保存。
4、仪器
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂);
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)。
5、半胱氨酸抗白念珠菌生物被膜增殖实验
白念菌株接种至1ml YPD培养液,于30℃,200rpm振荡培养,活化16h,使真菌处于指数生长期后期。离心收集白念珠菌并用PBS缓冲溶液洗去YPD培养基,然后将白念珠菌细胞混悬于RPMI 1640培养基中并采用紫外分光光度计计数,调节菌浓度为1.0×106cells/ml。将菌液接种到96孔板1~11号孔,37℃恒温箱中静置培养1.5h后,洗弃上清液并用PBS缓冲溶液清洗两次。加入含不同浓度半胱氨酸的新鲜培养基,于37℃继续静置培养至24h后取出,XTT还原法测定生物被膜代谢活性。
6、半胱氨酸抗白念珠菌成熟生物被膜实验
白念菌株接种至1ml YPD培养液,于30℃,200rpm振荡培养,活化16h,使真菌处于指数生长期后期。离心收集白念珠菌并用PBS缓冲溶液洗去YPD培养基,然后将白念珠菌细胞混悬于RPMI 1640培养基中并采用紫外分光光度计计数,调节菌浓度为1.0×106cells/ml。将菌液接种到96孔板1~11号孔,37℃恒温箱中静置培养24h后,洗弃上清液并用PBS缓冲溶液清洗两次。加入含不同浓度半胱氨酸的新鲜培养基,于37℃继续静置培养24h。
7、SMIC值判定
白念珠菌于37℃培养24h后,取出生物被膜板,用PBS轻轻洗3次,每孔加入200mlXTT/menadione,避光,37℃孵育2-3h,取出生物被膜板,吸取100μl XTT/menadione至无菌96孔板中,用酶标分析仪于492nm测各孔OD值。与阳性对照孔比,以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为SMIC80(生物被膜生长80%被抑制时的药物浓度)。
8、实验结果
图1结果显示半胱氨酸对白念珠菌生物被膜的抑制作用。当半胱氨酸的浓度为5、10、20、40、80mg/L时,均表现出良好的抗白念珠菌生物被膜的增殖作用(图1A),当半胱氨酸的浓度为10、20、40、80、160mg/L时,均表现出良好的抗白念珠菌成熟生物被膜作用(图1B)。
表1结果显示:半胱氨酸抗白念珠菌生物被膜增殖(biofilm formation)作用的SMIC80值为20mg/L,半胱氨酸抗白念珠菌成熟生物被膜(mature biofilm)增殖作用的SMIC80值为40mg/L。
表1.半胱氨酸抗白念珠菌生物被膜的SMIC80值
菌株 | SMIC<sub>80</sub>(mg/L)biofilm formation | SMIC<sub>80</sub>(mg/L)mature biofilm |
白念珠菌22644 | 20 | 40 |
白念珠菌95392 | 20 | 40 |
白念珠菌98211 | 20 | 40 |
白念珠菌20631 | 20 | 40 |
白念珠菌20372 | 20 | 40 |
实施例7:半胱氨酸单用对不同新型隐球菌菌株生物被膜的作用
材料和方法
1、试药
半胱氨酸:购自Sigma公司。
XTT:购自Sigma公司。
甲萘醌(menadione):购自Sigma公司。
半胱氨酸用无菌水配成10g/L溶液,受试药物于-20℃保存。实验前,将药物贮存液取出置35℃温箱融化,充分混匀。
XTT用灭菌的PBS配成0.5mg/ml的饱和溶液,用0.22μm孔径的滤器滤过除菌,甲萘醌用100%丙酮配成10mM溶液,XTT、甲萘醌于-80℃保存。实验前,将药物贮存液取出置4℃冰箱、35℃温箱梯度融化,充分混匀。
2、菌株
新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)由上海长海医院真菌室提供,分别采自该医院不同科室临床样本,并经形态学和生化学鉴定。
3、培养液
DMEM高糖培养基:购自Invitrogen公司。
沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA):蛋白胨10g,葡萄糖40g,琼脂18g,加三蒸水900ml溶解,加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml,调整pH至7.0,定容至1000ml,高压灭菌后4℃保存。
YPD培养液:酵母浸膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,加三蒸水900ml溶解,定容至1000ml,高压灭菌后4℃保存。
4、仪器
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂);
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)。
5、半胱氨酸抗新型隐球菌生物被膜增殖实验
新型隐球菌接种至1ml YPD培养液,于30℃,200rpm振荡培养,活化24h,使真菌处于指数生长期后期。离心收集白念珠菌并用PBS缓冲溶液洗去YPD培养基,然后将新型隐球菌细胞混悬于DMEM培养基中并采用紫外分光光度计计数,调节菌浓度为1.0×107cells/ml。将菌液接种到96孔板1~11号孔,37℃恒温箱中静置培养1.5h后,洗弃上清液并用PBS缓冲溶液清洗两次。加入含不同浓度半胱氨酸的新鲜培养基,于37℃继续静置培养至24h后取出,XTT还原法测定生物被膜代谢活性。
6、半胱氨酸抗新型隐球菌成熟生物被膜实验
新型隐球菌接种至1ml YPD培养液,于30℃,200rpm振荡培养,活化24h,使真菌处于指数生长期后期。离心收集白念珠菌并用PBS缓冲溶液洗去YPD培养基,然后将新型隐球菌细胞混悬于DMEM培养基中并采用紫外分光光度计计数,调节菌浓度为1.0×107cells/ml。将菌液接种到96孔板1~11号孔,37℃恒温箱中静置培养24h后,洗弃上清液并用PBS缓冲溶液清洗两次。加入含不同浓度半胱氨酸的新鲜培养基,于37℃继续静置培养24h。
7、SMIC值判定
新型隐球菌于37℃培养24h后,取出生物被膜板,用PBS轻轻洗3次,每孔加入200mlXTT/menadione,避光,37℃孵育2-3h,取出生物被膜板,吸取100μl XTT/menadione至无菌96孔板中,用酶标分析仪于492nm测各孔OD值。与阳性对照孔比,以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为SMIC80(生物被膜生长80%被抑制时的药物浓度)。
8、实验结果
表2结果显示:半胱氨酸抗新型隐球菌生物被膜增殖(biofilm formation)作用的SMIC80值为20mg/L,半胱氨酸抗新型隐球菌成熟生物被膜(mature biofilm)增殖作用的SMIC80值为40mg/L。
表2.半胱氨酸抗新型隐球菌生物被膜的SMIC80值
菌株 | SMIC<sub>80</sub>(mg/L)biofilm formation | SMIC<sub>80</sub>(mg/L)mature biofilm |
新型隐球菌423 | 20 | 40 |
新型隐球菌780 | 20 | 40 |
新型隐球菌551 | 20 | 40 |
新型隐球菌597 | 20 | 40 |
新型隐球菌216 | 20 | 40 |
实施例8:半胱氨酸单用对不同烟曲霉菌菌株生物被膜的作用
材料和方法
1、试药
半胱氨酸:购自Sigma公司。
XTT:购自Sigma公司。
甲萘醌(menadione):购自Sigma公司。
半胱氨酸用无菌水配成10g/L溶液,受试药物于-20℃保存。实验前,将药物贮存液取出置35℃温箱融化,充分混匀。
XTT用灭菌的PBS配成0.5mg/ml的饱和溶液,用0.22μm孔径的滤器滤过除菌,甲萘醌用100%丙酮配成10mM溶液,XTT、甲萘醌于-80℃保存。实验前,将药物贮存液取出置4℃冰箱、35℃温箱梯度融化,充分混匀。
2、菌株
烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)由上海长海医院真菌室提供,分别采自该医院不同科室临床样本,并经形态学和生化学鉴定。
3、培养液
RPMI 1640培养液:RPMI 1640(Gibco BRL)10g,NaHCO3 2.0g,吗啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonic acid,MOPS)(Sigma)34.5g,加三蒸水900ml溶解,1N NaOH调pH至7.0(25℃),定容至1000ml,滤过除菌,4℃保存。
沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA):蛋白胨10g,葡萄糖40g,琼脂18g,加三蒸水900ml溶解,加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml,调整pH至7.0,定容至1000ml,高压灭菌后4℃保存。
YPD培养液:酵母浸膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,加三蒸水900ml溶解,定容至1000ml,高压灭菌后4℃保存。
4、仪器
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂);
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)。
5、半胱氨酸抗烟曲霉菌生物被膜增殖实验
将烟曲霉菌菌接种至SDA斜面,35℃,培养一周。按本方法活化两次后,加适量RPMI1640培养液于SDA斜面,用吸管吹打菌落,使烟曲霉菌菌孢子游离于RPMI 1640培养液中,然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后,加RPMI 1640培养液调整孢子浓度至105cells/ml,将菌液接种到96孔板,37℃恒温箱中静置培养1.5h后,洗弃上清液并用PBS缓冲溶液清洗两次。加入含不同浓度半胱氨酸的新鲜培养基,于37℃继续静置培养至24h后取出,XTT还原法测定生物被膜代谢活性。
6、半胱氨酸抗烟曲霉菌成熟生物被膜实验
将烟曲霉菌菌接种至SDA斜面,35℃,培养一周。按本方法活化两次后,加适量RPMI1640培养液于SDA斜面,用吸管吹打菌落,使烟曲霉菌菌孢子游离于RPMI 1640培养液中,然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后,加RPMI 1640培养液调整孢子浓度至105cells/ml,将菌液接种到96孔板,37℃恒温箱中静置培养24h后,洗弃上清液并用PBS缓冲溶液清洗两次。加入含不同浓度半胱氨酸的新鲜培养基,于37℃继续静置培养至24h后取出,XTT还原法测定生物被膜代谢活性。
7、SMIC值判定
烟曲霉菌于37℃培养24h后,取出生物被膜板,用PBS轻轻洗3次,每孔加入200mlXTT/menadione,避光,37℃孵育2-3h,取出生物被膜板,吸取100μl XTT/menadione至无菌96孔板中,用酶标分析仪于492nm测各孔OD值。与阳性对照孔比,以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为SMIC80(生物被膜生长80%被抑制时的药物浓度)。
8、实验结果
表3结果显示:半胱氨酸抗烟曲霉菌菌生物被膜增殖(biofilm formation)作用的SMIC80值为40mg/L,半胱氨酸抗烟曲霉菌成熟生物被膜(mature biofilm)增殖作用的SMIC80值为80mg/L。
表3.半胱氨酸抗烟曲霉菌生物被膜的SMIC80值
菌株 | SMIC<sub>80</sub>(mg/L)biofilm formation | SMIC<sub>80</sub>(mg/L)mature biofilm |
烟曲霉菌638a | 40 | 80 |
烟曲霉菌533a | 40 | 80 |
烟曲霉菌965f | 40 | 80 |
烟曲霉菌509d | 40 | 80 |
烟曲霉菌505a | 40 | 80 |
实施例9:半胱氨酸单用对不同糠秕马拉色菌菌株生物被膜的作用
材料和方法
1、试药
半胱氨酸:购自Sigma公司。
XTT:购自Sigma公司。
甲萘醌(menadione):购自Sigma公司。
半胱氨酸用无菌水配成10g/L溶液,受试药物于-20℃保存。实验前,将药物贮存液取出置35℃温箱融化,充分混匀。
XTT用灭菌的PBS配成0.5mg/ml的饱和溶液,用0.22μm孔径的滤器滤过除菌,甲萘醌用100%丙酮配成10mM溶液,XTT、甲萘醌于-80℃保存。实验前,将药物贮存液取出置4℃冰箱、35℃温箱梯度融化,充分混匀。
2、菌株
糠秕马拉色菌(Malasezzia furfur)由上海长海医院真菌室提供,分别采自该医院不同科室临床样本,并经形态学和生化学鉴定。
3、培养液
马拉色菌培养液:葡萄糖20g/L,牛胆盐4g/L,甘油1ml/L,单硬脂酸甘油酯0.5g/L,吐温20 0.4g/L,RPMI 1640 10g/L,滤过除菌,4℃保存。
4、仪器
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂);
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)。
5、半胱氨酸抗糠秕马拉色菌生物被膜增殖实验
将糠秕马拉色菌活化两次,加入马拉色菌液体培养基,调整孢子浓度至106cells/ml,将菌液接种到96孔板,37℃恒温箱中静置培养1.5h后,洗弃上清液并用PBS缓冲溶液清洗两次。加入含不同浓度半胱氨酸的新鲜培养基,于37℃继续静置培养至24h后取出,XTT还原法测定生物被膜代谢活性。
6、半胱氨酸抗糠秕马拉色菌成熟生物被膜实验
将糠秕马拉色菌活化两次,加入马拉色菌液体培养基,调整孢子浓度至106cells/ml,将菌液接种到96孔板,37℃恒温箱中静置培养24h后,洗弃上清液并用PBS缓冲溶液清洗两次。加入含不同浓度半胱氨酸的新鲜培养基,于37℃继续静置培养至24h后取出,XTT还原法测定生物被膜代谢活性。
7、SMIC值判定
糠秕马拉色菌于37℃培养24h后,取出生物被膜板,用PBS轻轻洗3次,每孔加入200ml XTT/menadione,避光,37℃孵育2-3h,取出生物被膜板,吸取100μl XTT/menadione至无菌96孔板中,用酶标分析仪于492nm测各孔OD值。与阳性对照孔比,以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为SMIC80(生物被膜生长80%被抑制时的药物浓度)。
8、实验结果
表4结果显示:半胱氨酸抗糠秕马拉色菌生物被膜增殖(biofilm formation)作用的SMIC80值为40mg/L,半胱氨酸抗糠秕马拉色菌成熟生物被膜(mature biofilm)增殖作用的SMIC80值为80mg/L。
表4.半胱氨酸抗糠秕马拉色菌生物被膜的SMIC80值
应理解,在本发明的实施例中,仅写明了有效抑制真菌生物被膜的生长时,活性成分的最低浓度。结合本领域的公知常识可知,当抗真菌的活性药物组分浓度增大时,所述的抗真菌效果会有一定的改善。因此,任何本领域的技术人员在阅读了本说明书后,通过结合本领域的公知常识,均可以采用高于所述的最低浓度的剂量来抑制真菌生物被膜生长,这种改变同样落于本发明的公开范围内。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的抗真菌生物被膜药物为涂抹剂、乳剂、膏剂、气雾剂、膜剂。
3.半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜的医疗器械或医用材料中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的抗真菌生物被膜的医疗器械或医用材料的制备方法为:将包含半胱氨酸的药物涂覆于医疗器械上或医用材料上,形成抗真菌生物被膜的医疗器械或医用材料。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用,其特征在于,所述的真菌为念珠菌、隐球菌、曲霉菌、马拉色菌中的一种或两种以上组合。
6.根据权利要求1-4任一所述的应用,其特征在于,所述的抗真菌生物被膜为抑制真菌生物被膜的生长增殖/形成,或抑制/破坏已形成的真菌生物被膜。
7.一种体外非治疗性抑制真菌生物被膜的方法,包括以下步骤:在需要抑制真菌生物被膜的场合,施用半胱氨酸,从而抑制真菌生物被膜。
8.根据权利要求书7所述的方法,其特征在于,所述的真菌为念珠菌、隐球菌、曲霉菌、马拉色菌中的一种或两种以上组合。
9.一种抗真菌生物被膜药物,其特征在于,所述的药物的活性成分为半胱氨酸。
10.根据权利要求9所述的药物,其特征在于,所述的药物还包括其他具有抗真菌或抗真菌生物被膜活性的药物组分。
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