CN104997799B - Drb在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了DRB在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用,以DRB杀灭细粒棘球蚴病的病原·细粒棘球蚴绦虫,具有显著的抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的效果,从而实现对细粒棘球蚴病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及DRB的药学效果和生物效果,属于药物化学领域。
背景技术
棘球蚴病(echinococcosis),又称做包虫病(hydatid disease),发生在棘球蚴绦虫的中绦期幼虫,常寄生于人体器官及其他动物体内,从而造成对人体健康和畜牧业发展危害性极大的寄生虫病,且该寄生虫病是人和牲畜共同患有。
据目前研究发现,棘球蚴绦虫存在许多种类。发生在我国多数为细粒棘球蚴病,又称为囊型包虫病(cystic echinococcosis,CE),以及多房棘球蚴病,又称为泡型包虫病(alveolar echinococcosis,AE)。这两种分型疾病分别由多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis,E.m)和细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)寄生在人体内部器官或者动物体内致病。
细粒棘球蚴可寄生在人体多个器官,以肝脏最为常见(占50-70%),其次为肺脏(占20%~30%)。现在的肝细粒棘球蚴病治疗方案中,手术治疗是首选,在术后予以药物辅助治疗。临床上手术采用的术式是闭合式肝包虫外膜内外囊完整摘除术,这种手术方法的优点在于手术创伤小、术后的并发症少和可根治性等,可降低肝包虫病的术后复发率。但是,手术过程中,还是存在头节泄露以及切除不完全等问题,手术后的复发率也由此而升高。鉴于这种情况,手术后的药物辅助治疗成为关键。
近年来,许多学者在抗包虫药物方面做了大量研究,例如吡喹酮、阿苯达唑、甲苯达唑等药物的作用进行了详细研究及临床效果观测。上述药物作为患者在术后使用的辅助治疗手段,其结果并不令人满意。更严重的是,有研究表明,在病人服用上述药物过程中,会产生严重的副作用,甚至对病人生命造成危害。
发明内容
申请人在Nrf2核转录因子研究过程中,发现Nrf2的抑制剂DRB可以有效抑制和杀灭原头节的生长,可用于细粒棘球蚴病的临床治疗。
在本发明中,DRB为5,6-Dichlorobenzimidazole 1-β-D-ribofuranoside,5,6-二氯苯并咪唑1-β-D-次黄嘌呤,CAS号53-85-0。
首先,本发明公开了DRB在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用。
上述的药物,既可以是将DRB作为活性成分,还可以是将DRB作为活性成分与其他辅料做成的各种制剂,例如常见的片剂、胶囊、滴丸、输液、冻干粉针等,对于药物剂型及其相应辅料的选择,本领域技术人员可根据需要进行调整。
上述的细粒棘球蚴病,既可以是动物体上的,也可以是人体上的,根据该症的临床发病部位,通常指的是囊性肝包虫病。
因此,本发明还公开了DRB在制备治疗囊性肝包虫病药物中的应用。
根据需要,可使用不同浓度的DRB,一般来说,为了有效的杀灭病原,DRB的浓度不低于25g/L。
针对常见的原头节生长密度,优选的,DRB的浓度为50-75g/L。
根据实际情况可以确定合理的用药时间,通常为连续用药三天及其以上。
在上述浓度下,对细粒棘球蚴原头节具有比较理想的抑制和杀灭效果。
在此基础上,本发明还公开了DRB作为细粒棘球蚴原头节抑制剂的应用。
本领域技术人员可以理解,在多种实验环境下,尤其是动物离体实验情况下,为了防止由于动物体内的细粒棘球蚴原头节在体外的生长和头节外溢,需要加入必要的抑制剂,例如20%高渗盐水等。
与上述类似,DRB的浓度不低于25g/L,优选的,DRB的浓度为50-75g/L。
附图说明
图1为不同浓度的DRB对细粒棘球蚴原头节形态的影响;
图2为不同浓度的DRB对细粒棘球蚴原头节活力的影响;
图3为DRB对细粒棘球蚴原头节表面超微结构的影响。
具体实施方式
为了说明DRB的应用效果,申请人进行了体外实验说明DRB对细粒棘球蚴原头节的杀灭效果。
实验1:DRB体外作用于细粒棘球蚴原头节的效果
取新鲜的自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏,清洁羊肝表面,用75%酒精消毒表面,无菌条件下抽取含原头节的囊液,移入无菌瓶中。用PBS(PH=7.2)清洗原头节3次至澄清,用0.1%伊红染液做染色排斥实验,98%以上拒染。肉眼观察原头节呈细白沙样均匀颗粒,活性好的原头节沉降速率快,活性不好的或者死亡的原头节沉降速率相对比较慢。
倒置显微镜下观察原头节虫体呈内陷型,虫体结构饱满,呈椭圆形,结构清晰完整,钙颗粒清亮而明显。然后将原头节分装至含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中(青霉素100U/mL,链霉素100U/mL),置37℃、5%CO2培养箱内培养。
实验分组:RMPI-1640培养基空白对照组、25g/L DRB组、50g/L DRB组、75g/L DRB组,DMSO组。取六孔板,每孔设5mL体系,按以上分组,配好相应的培养液。
将在体外培养5天后的细粒棘球蚴原头节用PBS(pH=7.2)清洗3遍,每组培养液中加入约2000个原头节,置37℃,5%CO2孵育箱内培养,在倒置显微镜下观察TUDCA对细粒棘球蚴原头节形态和活力的影响。
数据统计方法:加药后24h开始,每组每天均匀抽取200μL培养液(平均含原头节约90-120个),用0.1%伊红染色15min,倒置显微镜下观察原头节的活力。活头节拒染、不着色,且有活动性;死亡或活力减弱的原头节红染着色,伴有结构破坏。计算每组每天平均死亡率。每隔4d换液一次(每组体系和浓度同第一次加药时),连续观察,直至最大作用浓度的原头节全部死亡。实验重复三次。
实验2:DRB作用后原头节表面结构的变化
在测活力的同时,随机取相对应的原头节做电镜,观察原头节超微结构的变化。PBS洗涤3次,每次5min;置4%戊二醛固定24h。将原头节放入浓度为50%、70%、80%、90%、100%的酒精内逐级梯度脱水,脱水时间分别为5min、10min、30min、1h至过夜,临界点干燥,真空喷金LOOA,在LEO1430VP扫描电子显微镜下观察原头节表层超微结构变化。
实验结果:
参考图1,倒置显微镜下观察,DMSO组和25g/l DRB处理组原头节散在分布,可见原头节活动。虫体结构饱满,呈椭圆形,结构清晰完整,钙颗粒清亮而明显(图1A-D)。50g/lDRB处理组作用原头节3天后(图1),原头节活动度较对照组减弱(图1E),6天后,头节活动度较正常对照组明显减弱,原头节虫体变小(图1F)。75g/l DRB处理组原头节3天后,出现虫体边缘不规整,空泡增多,钙颗粒明显减少(图1G),6天后,原头节虫体严重皱缩,顶突上的小钩排列紊乱,部分脱落,吸盘变型,内部结构消失(图1H)。
参考图2,不同浓度抑制剂DRB体外作用细粒棘球蚴原头节后,对原头节生长均有抑制作用。特别是高浓度DRB组对原头节的杀伤作用显著。DMSO组和25g/lDRB组对原头节的杀伤作用不明显。50g/l DRB组,从作用1天开始,原头节活力即开始下降,随着作用时间的延长,至作用第4天时,原头节活力下降一半。75g/l DRB组对原头节的杀伤作用更加显著,在作用至第6天时,原头节全部死亡。通过倒置显微镜观察,制作原头节活力曲线图,由下表可得,随着用药时间的延长和药物浓度的增加,DRB对原头节活力的抑制效果增强(图2)。
参考图3,通过扫描电镜观察,DMSO空白对照组和25g/l DRB组中原头节体态饱满充实,呈椭圆形,并且形态结构完整,没有观察到原头节结构显著变化(图3A、B)。抑制剂DRB处理组50g/l体外作用原头节3天后,原头节虫体表层出现轻微褶皱,但大体形态并未改变(图3C);抑制剂DRB处理组50g/l体外作用原头节6天后,原头节表层发生明显皱缩,虫体表面结构受到一定程度破坏,虫体形态发生改变。抑制剂DRB处理组75g/l体外作用原头节3天后,在电镜下观察到头节吸盘变型,头钩排列紊乱,虫体表层发生严重皱缩(图3E),抑制剂DRB 75g/L处理组作用6天,原头节虫体大部分凹陷,虫体结构严重破坏,甚至虫体溃解(图3F)。
综上可以看到,不同浓度DRB对体外细粒棘球蚴原头节均有抑制作用,浓度为75g/L的DRB对细粒棘球蚴原头节杀伤作用最明显,随着时间的延长,抑制作用显著增加(P<0.01。在证实DRB对原头节有抑制作用的基础上,探索不同浓度的DRB对细粒棘球蚴原头节的形态学影响。研究结果显示,DRB作用后,可导致体外细粒棘球蚴原头节的形态发生不同程度的改变。内陷型和外翻型原头节是虫体不同的存在形式。当条件适适宜时,原头节顶突内凹,可保护头钩、吸盘、微毛不受损害;当加入DRB后,外翻型的原头节增多。正常培养的细粒棘球蚴原头节生发层的微毛发育良好,数量多,附着并延伸入角质层内,可增加生发层与角质层的接触面积,有利于营养物质的吸收,在棘球蚴无血液供应的情况下仍可较快生长并不断形成育囊。
总而言之,DRB对体外细粒棘球蚴原头节有杀伤作用。
Claims (4)
1.DRB在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用。
2.根据权利要求1的应用,其特征在于DRB的浓度不低于25g/L。
3.根据权利要求2的应用,其特征在于DRB的浓度为50-75g/L。
4.DRB在制备治疗囊性肝包虫病药物中的应用。
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