CN114209703B - AMPK抑制剂Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包虫病药物技术领域，是一种AMPK抑制剂Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用；本发明首次公开了Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用；体内和体外两方面的药效学实验数据，均表明AMPK抑制剂Compound C是一种高效的抗包虫病药物分子，对于囊型包虫病的治疗效果尤为显著，效果优于阿苯达唑代谢产物阿苯达唑亚砜，达到了很好的治疗效果。本发明所述AMPK抑制剂Compound C的新应用，可作为现有抗包虫病药物阿苯达唑的有效替代，为囊型包虫病的治疗提了一种新的药物治疗策略。
Description
技术领域
本发明涉及包虫病药物技术领域，是一种AMPK抑制剂Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。
背景技术
囊型包虫病（Cystic Echinococcosis，CE），是一种由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，E. granulosus）的幼虫感染所引起的一种慢性人畜共患寄生虫病。CE呈全球性分布，其中南美、中亚、地中海国家、东非地区以及中国的西部是CE的高发地区。据世界卫生组织报告称，每年全球因CE感染所花费的费用估计约为30亿美元，对人类健康和牲畜业发展造成巨大损害。
目前，人类CE的主要治疗方法包括手术、经皮治疗和苯并咪唑抗寄生虫治疗，抗寄生虫药物对于无法手术的患者或防止患者术后复发是必不可少的。世界卫生组织推荐的治疗CE的主要药物是阿苯达唑(ABZ)和甲苯达唑，但治疗效果不佳。因此，迫切需要开发治疗CE的新药。
腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种由α、β和γ亚基构成的丝/苏氨酸蛋白激酶，在能量代谢调节方面起到关键性作用。当机体发生能量应激时，AMPK直接磷酸化并参与多种代谢途径，以恢复能量平衡。AMPK活化对代谢的影响大致可分为两类：抑制合成代谢（减少ATP的消耗）和促进分解代谢（刺激ATP的产生）。对于寄生虫来说，宿主与寄生虫之间能量的动态相互作用是有效协调寄生虫不同发育阶段的必要条件，由于AMPK具有对于能量代谢调控的功能，因此，AMPK可能在寄生虫的生长发育过程中扮演了重要的作用。Loos等在E. granulosus中克隆出了EgAMPK，发现EgAMPK在E. granulosus的生长发育过程中高表达，并证明AMPK激活剂二甲双胍在体外和体外对E. granulosus感染均有一定的治疗效果。
自AMPK被研究人员发现以来，其激活剂的开发层出不穷，如二甲双胍、水杨酸、卡格列净等已在临床治疗中应用，但AMPK抑制剂的研发始终处于滞留阶段。Compound C又被称为Dorsomorphin，最初被默克公司的科学家鉴定为AMPK抑制剂，被用来描述AMPK激活剂二甲双胍的作用机制，是目前最主要的一种AMPK抑制剂。Compound C已在癌症等领域被证明其可以通过直接抑制AMPK活性，从而通过调控癌细胞糖代谢、脂质合成、细胞自噬等功能达到抑制癌细胞的生长发育。但目前还没有AMPK抑制剂Compound C作为药物治疗囊型包虫病的相关报道。
发明内容
本发明提供了一种AMPK抑制剂Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有常用治疗囊型包虫病的药物效果不佳；目前还没有AMPK抑制剂Compound C作为药物治疗囊型包虫病相关报道的问题。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种AMPK抑制剂Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：
上述包括治疗囊型包虫病的有效剂量的活性成分，活性成分为AMPK抑制剂Compound C。
上述AMPK抑制剂Compound C的体外浓度为12.5μmol/L至100μmol/L，体内剂量为10mg/kg至30mg/kg。
上述还包括医学上可接受的所述AMPK抑制剂Compound C的载体。
本发明首次公开了Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用；体内和体外两方面的药效学实验数据，均表明AMPK抑制剂Compound C是一种高效的抗包虫病药物分子，对于囊型包虫病的治疗效果尤为显著，效果优于阿苯达唑代谢产物阿苯达唑亚砜，达到了很好的治疗效果。本发明所述AMPK抑制剂Compound C的新应用，可作为现有抗包虫病药物阿苯达唑的有效替代，为囊型包虫病的治疗提了一种新的药物治疗策略。
附图说明
附图1为细粒棘球绦虫原头节（PSCs）经Compound C体外干预的存活率（viability）图。
附图2为DMSO组对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图。
附图3为Compound C干预组1对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图。
附图4为Compound C干预组2对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图。
附图5为Compound C干预组3对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图。
附图6为Compound C干预组4对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图。
附图7为细粒棘球绦虫囊泡（MTCs）经Compound C体外干预的存活率（viability）图。
附图8为DMSO组对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图。
附图9为Compound C干预组1对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图。
附图10为Compound C干预组2对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图。
附图11为Compound C干预组3对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图。
附图12为Compound C干预组4对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图。
附图13为囊型包虫病小鼠动物模型经Compound C体内治疗后囊泡重量图。
附图14为囊型包虫病小鼠动物模型经Compound C体内治疗后囊泡数量图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。 在本发明中AMPK抑制剂Compound C、阿苯达唑亚砜和二甲基亚砜均为现有公知公用；在本发明中AMPK抑制剂Compound C简称Compound C，阿苯达唑亚砜简称ABZSO，二甲基亚砜简称DMSO。
实施例1，该AMPK抑制剂Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。
实施例2，作为上述实施例的优化，包括治疗囊型包虫病的有效剂量的活性成分，活性成分为AMPK抑制剂Compound C。
实施例3，作为上述实施例的优化，AMPK抑制剂Compound C的体外浓度为12.5μmol/L至100μmol/L，体内剂量为10mg/kg至30mg/kg。
实施例4，作为上述实施例的优化，还包括医学上可接受的所述AMPK抑制剂Compound C的载体。载体可包括偶联AMPK抑制剂Compound C的抗体、靶向性重组蛋白、纳米颗粒以及外泌体中的至少一种。
对该AMPK抑制剂Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其实验如下：
一. AMPK抑制剂Compound C体外干预实验
1.1 Compound C体外干预实验
1.1.1实验目的：明确各药物浓度的Compound C对细粒棘球绦虫原头节和囊泡体外活性影响。
1.1.2实验分组（概述）
本次实验分为7组，分别为Compound C干预组1、Compound C干预组2、Compound C干预组3、Compound C干预组4、ABZSO干预组、阴性组和DMSO组；每组做3个复孔；实验周期为6天。
1.1.3母液配置
称取3.9949mg Compound C溶于1mL DMSO 中，充分混匀，制备母液①(药物浓度为10mmol/L)；取500μL母液①加入500μL DMSO，充分混匀，得到母液②(药物浓度为5mmol/L)；取500μL母液②加入500μL DMSO，充分混匀，得到母液③(药物浓度为2.5mmol/L)；取500μL母液③加入500μL DMSO，充分混匀，得到母液④(药物浓度为1.25mmol/L)。
称取0.422mg 阿苯达唑亚砜溶于1mL DMSO 中，充分混匀，制备ABZSO母液（浓度为1.5mmol/L）。
1.1.4细粒棘球绦虫原头节和囊泡培养液的配置
原头节培养液配置：取50mL胎牛血清和10mL双抗（青霉素-链霉素）加入至500mLRPMI1640培养基中，充分混匀。
囊泡培养液配置：取150mL胎牛血清，6mL双抗（青霉素-链霉素），8.4mL 30％葡萄糖溶液，54mL 5％酵母粉溶液，加入至390mL RPMI1640培养基，充分混匀。
1.1.5细粒棘球绦虫原头节和囊泡的收集和培养
原头节的收集和培养：在无菌条件下，从新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市华凌屠宰场获得的细粒棘球绦虫自然感染的绵羊肝脏中，取出细粒棘球绦虫原头节。无菌生理盐水清洗3次至5次后，经1%胃蛋白酶消化30min，再使用含2%双抗（青霉素-链霉素）的无菌生理盐水继续清洗多次，待其自然沉淀后弃去上清液，加入原头节培养液，于37℃，5％CO2条件下无菌培养。
囊泡的收集和培养：在无菌条件下，从细粒棘球绦虫原头节感染6个月后的C57BL/6雌性小鼠腹腔取出囊泡，无菌生理盐水清洗3次至5次后，再使用含2%双抗（青霉素-链霉素）的无菌生理盐水继续清洗3次至5次，待其自然沉淀后弃去上清液，加入囊泡培养液，于37℃，5％CO2条件下无菌培养。
1.1.6 Compound C干预组1、Compound C干预组2、Compound C干预组3、CompoundC干预组4、ABZSO干预组、阴性组和DMSO组的配置
细粒棘球绦虫原头节各分组配置：对于Compound C干预组1：在198μL的原头节培养液中加入2μL的母液①，充分混匀后得到Compound C干预组1（100μmol/L Compound C）；对于Compound C干预组2：在198μL的原头节培养液中加入2μL的母液②，充分混匀后得到Compound C干预组2（50μmol/L Compound C）；对于Compound C干预组3：在198μL的原头节培养液中加入2μL的母液③，充分混匀后得到Compound C干预组3（25μmol/L Compound C）；对于Compound C干预组4：在198μL的原头节培养液中加入2μL的母液④，充分混匀后得到Compound C干预组4（12.5μmol/L Compound C）；对于ABZSO干预组，在198μL的原头节培养液中加入2μL的ABZSO母液（浓度为1.5mmol/L），充分混匀后得到ABZSO干预组（15μmol/LABZSO）；对于阴性组：在198μL的原头节培养液中加入2μL原头节培养液得到阴性组；对于DMSO组，在198μL的原头节培养液中加入2μL DMSO得到DMSO组。
细粒棘球绦虫囊泡各分组配置：对于Compound C干预组1：在1980μL的囊泡培养液中加入20μL的母液①，充分混匀后得到Compound C干预组1（100μmol/L Compound C）；对于Compound C干预组2：在1980μL的囊泡培养液中加入20μL的母液②，充分混匀后得到Compound C干预组2（50μmol/L Compound C）；对于Compound C干预组3：在1980μL的囊泡培养液中加入20μL的母液③，充分混匀后得到Compound C干预组3（25μmol/L Compound C）；对于Compound C干预组4：在1980μL的囊泡培养液中加入20μL的母液④，充分混匀后得到Compound C干预组4（12.5μmol/L Compound C）；对于ABZSO干预组，在1980μL的囊泡培养液中加入20μL的ABZSO母液（浓度为1.5mmol/L），充分混匀后得到ABZSO干预组（15μmol/LABZSO）；对于阴性组：在1980μL的囊泡培养液中加入20μL原头节培养液得到阴性组；对于DMSO组，在1980μL的囊泡培养液中加入20μL DMSO，充分混匀得到DMSO组。
1.1.7实验步骤
Compound C体外干预原头节：原头节体外适应培养1周后，使用1%伊红染液染色法评估原头节的活性，通过3个平行试验要求原头节的活性> 90%。在无菌环境下，将形态完整的原头节铺于96孔板上(n=200/0.32cm2/孔，每组3个复孔)，然后分别加入Compound C干预组1（100μmol/L Compound C）、Compound C干预组2 （50μmol/L Compound C）、Compound C干预组3 （25μmol/L Compound C）、Compound C干预组4（12.5μmol/L Compound C）、ABZSO干预组（15μmol/L ABZSO）、阴性组和DMSO组并充分混匀。每24小时采用1%伊红染液染色法评价原头节的活性。利用扫描电镜观察原头节的超微结构变化。以DMSO组原头节的活性作为对照。整个药物干预实验重复三次。在实验过程中，每2天更换一次完整培养基，并补充药物。
Compound C体外干预囊泡：C57BL/6J雌性小鼠PSCs感染6个月后，从腹腔取出囊泡。无菌条件下，将形态完整的囊泡随机分配到6孔板(n=10-20/9.6cm2/孔，每组3个复孔)。然后分别加入Compound C干预组1（100μmol/L Compound C）、Compound C干预组2 （50μmol/L Compound C）、Compound C干预组3（25μmol/L Compound C）、Compound C干预组4（12.5μmol/L Compound C）、ABZSO干预组（15μmol/L ABZSO）、阴性组和DMSO组并充分混匀。每24小时观察囊泡的活性。囊泡的活性通过生发层的塌陷皱缩和超微结构来评估。利用扫描电镜观察囊泡的超微结构变化。整个药物干预实验重复三次。在实验过程中，每2天更换相同的完全培养基，并补充药物。
细粒棘球绦虫原头节（PSCs）经Compound C体外干预的存活率（viability）图见图1所示；第6天后DMSO组对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图见图2；第6天后Compound C干预组1对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图见图3；第6天后Compound C干预组2对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图见图4；第6天后Compound C干预组3对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图见图5；第6天后Compound C干预组4对细粒棘球绦虫原头节的扫描电镜图见图6；细粒棘球绦虫囊泡（MTCs）经Compound C体外干预的存活率（viability）图见图7所示；第5天后DMSO组对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图见图8；第5天后Compound C干预组1对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图见图9；第5天后Compound C干预组2对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图见图10；第5天后Compound C干预组3对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图见图11；第5天后Compound C干预组4对细粒棘球绦虫囊泡的扫描电镜图见图12。
如图1至图12所示，Compound C体外干预后，原头节和囊泡活性均显著下降，第6天时，Compound C干预组1和Compound C干预组2中原头节全部死亡，且各Compound C干预组干预4天后，原头节活性均低于ABZSO组。Compound C干预组1体外干预5天后，囊泡全部死亡。扫描电镜结果显示，相比于DMSO组，Compound C干预组中原头节顶突结构被破坏，顶突小钩、微绒毛消失，虫体损皱缩；囊泡生发层上的生发细胞显著减少或完全消失，以上结果说明Compound C是一种很好的细粒棘球绦虫的体外杀虫剂，且效果优于阿苯达唑亚砜。
二. AMPK抑制剂Compound C体内实验
1.Compound C小鼠药效学实验
1.1实验目的：探究腹腔注射不同剂量的Compound C对囊型包虫病小鼠动物模型的疗效。
1.2 实验内容
1.2.1 囊型包虫病小鼠动物模型建立：
（1）在无菌条件下，从新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市华凌屠宰场获得的细粒棘球绦虫自然感染的绵羊肝脏中，取出细粒棘球绦虫原头节，以腹腔注射的方式接种于每只小鼠，每只小鼠接种约2000只原头节。
（2）小鼠：C57BL/6小鼠，6至8周龄，体重18g至22g。
（3）造模时间：6个月。
（4）造模成功的判定标准：接种6个月后，对小鼠进行B超检测，病灶直径超过0.5cm即为造模成功。
（5）小鼠分组：溶剂组（0.5％ CMC-Na）、治疗组（Compound C高剂量组、Compound C中剂量组和Compound C低剂量组），共5组，每组10只。
1.2.2 囊型包虫病小鼠动物模型药物干预：
（1）选择40只造模成功的囊型包虫病小鼠动物模型，进入药效学实验。
（2）将40只小鼠随机分为溶剂组（0.5％ CMC-Na）、治疗组（Compound C高剂量组，给药剂量为30mg/kg；Compound C中剂量组，给药剂量为20mg/kg；Compound C低剂量组，给药剂量为10mg/kg）。采用腹腔注射，注射量0.1ml/10g，每天1次，给药28天。
（3）按照试验计划配制各浓度的药物：（同一组按同浓度不同药量给予）
Compound C高剂量组：精密称取90mg Compound C，溶于30mL 0.5％ CMC-Na溶液中，即为30mg/kg剂量。
Compound C中剂量组：精密称取60mg Compound C，溶于30mL 0.5％ CMC-Na溶液中，即为20mg/kg剂量。
Compound C低剂量组：精密称取30mg Compound C，溶于30mL 0.5％ CMC-Na溶液中，即为10mg/kg剂量。
溶剂组：精密称取150mg CMC-Na粉末，溶于30mL 生理盐水中。
上述4组配好的药液进行灭菌；灭菌完成后置于4℃冰箱保存，为实验备用。
（4） 腹腔注射给药28天后，经麻醉后，处死囊型包虫病小鼠，收集各组小鼠囊泡，称重并计数。囊型包虫病小鼠动物模型经Compound C体内治疗后囊泡重量见图13，囊型包虫病小鼠动物模型经Compound C体内治疗后囊泡重量见图14。
通过图13和图14可以看出，相对于模型组，各Compound C治疗组体内治疗囊型包虫病模型小鼠后，小鼠囊泡重量和数量均显著减少，说明AMPK抑制剂Compound C通过腹腔注射方式给药能够很好的治疗小鼠囊型包虫病，可作为现有抗包虫病药物阿苯达唑的有效替代，为囊型包虫病的治疗提了一种新的药物治疗策略。
综上所述，本发明首次公开了Compound C作为制备治疗囊型包虫病药物的应用；体内和体外两方面的药效学实验数据，均表明AMPK抑制剂Compound C是一种高效的抗包虫病药物分子，对于囊型包虫病的治疗效果尤为显著，效果优于阿苯达唑代谢产物阿苯达唑亚砜，达到了很好的治疗效果。本发明所述AMPK抑制剂Compound C的新应用，可作为现有抗包虫病药物阿苯达唑的有效替代，为囊型包虫病的治疗提了一种新的药物治疗策略。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
Claims (5)
1.一种AMPK抑制剂Dorsomorphin作为制备治疗囊型包虫病药物的应用。
2.根据权利要求1所述的AMPK抑制剂Dorsomorphin作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其特征在于包括治疗囊型包虫病的有效剂量的活性成分，活性成分为AMPK抑制剂Dorsomorphin。
3.根据权利要求1或2所述的AMPK抑制剂Dorsomorphin作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其特征在于AMPK抑制剂Dorsomorphin的体外浓度为12.5μmol/L至100μmol/L，体内剂量为10mg/kg至30mg/kg。
4.根据权利要求1或2所述的AMPK抑制剂Dorsomorphin作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其特征在于还包括医学上可接受的所述AMPK抑制剂Dorsomorphin的载体。
5.根据权利要求3所述的AMPK抑制剂Dorsomorphin作为制备治疗囊型包虫病药物的应用，其特征在于还包括医学上可接受的所述AMPK抑制剂Dorsomorphin的载体。
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